Apport de l’anatomo-cyto-pathologiepour le diagnostic et la stratégie de traitement

DIU D’ONCO-HÉMATOLOGIE DU SUJET ÂGÉ

4 février 2015Dr Jean-François Côté

Service d’ACP

PLAN� Introduction� Prélèvement

� Cytologique / histologique� Étapes techniques

� Pathologiste et cancer:� Dépistage � Diagnostic (outils utilisés)� Pronostic

� Aide à la thérapeutique� Exemple de stratégie

� Cancer du poumon

Introduction

« Les médecins pathologistes ont un rôleméconnu mais irremplaçable encancérologie tant dans le domaine deshémopathies que des tumeurs solides »

Plan cancer 2009-2013

If cancer is the answer,

tissue is the issue

ACPCarrefour de multiples spécialités

Chirurgie

Radiologie

Médecine

Biologie

Chirurgie

Radiologie

Médecine

Biologie

ACP

ACPCarrefour de multiples spécialités

Prélèvement

Prélèvementcytologique / histologique

� Réception du prélèvement dans les meilleurs délais (cyto/histo) + son bon d’envoi

� Enregistrement� Technique (obligatoire)� Examen des lames (microscope)� Compte-rendu+++� Archivage CR, blocs et lames� (Tumorothèque)

Transmission / réception du prélèvement cytologique ou histologique

+et / ou

Réception du prélèvementLe bon d’envoi

� Doit arriver en même temps que le prélèvement

� Correctement rempli� Identification du patient� Identification du médecin

prescripteur/préleveur� Acte opératoire� Siège du prélèvement� Renseignements cliniques +++� Signature du médecin

Prélèvement cytologique

� Liquides

� Physiologiques (LCR, urine)

� Épanchements des séreuses (pleurésie, ascite...)

� Lavages (broncho-alvéolaire)

� Grattage : muqueuses (buccale, génitale), frottis cervical

� Brossage : muqueuse bronchique

� Appositions de pièces opératoires (thyroïde, ganglion lymphatique,…)

� Ponction à l’aiguille, +/- contrôle radiologique :

� Masse ou organe plein /kyste: gg (EBUS), nodule sein, thyroïde…

Appositions sur lames

Technique des liquides

� Cytocentrifugation� Sur lame de verre

pastille� Séchage à l’air (MGG)

ou � fixation alcool-éther

ou spray laque fixante (Papanicolaou)

� Inclusion en paraffine du culot de centrifugation (cytobloc): histologie

Prélèvement histologique

� Pièce fraîche:� Pièces opératoires +++/Biopsies (peau,

rein,…)� Doit être acheminée dès que le

prélèvement est fait� Sinon technique sous vide «tissu safe»

à garder au frigo� Permet congélation pour extraction

ADN, ARN, clonalité, technique IF et IH

� (Examen extemporané)

Repérage des lésions/degré d’extension,(prélèvements pour congélation tumorothèque)

Pièce fraîche (sein)

*Examen extemporané

� URGENCE, ACP de garde� Justifié s’il peut modifier le geste

opératoire / éviter les inconvénients d’une ré-intervention

� Échantillon non fixé (état frais): transmettre rapidement +++

� Macroscopie, cytologie, +/- avec coupe histologique à -20°C au crysotat et coloration rapide (bleu de Toluidine ou HE)

*Examen extemporané

� Cryostat = technique rapide de coupe sur tissu congelé (remplace l’inclusion en paraffine) mais artéfacts +++

� Diagnostic de présomption = altérations cellulaires et tissulaires / biais d’échantillonnage

� À valider par histologie définitive après fixation et inclusion en paraffine

*Examen extemporané

Prélèvement histologique

� Pièce fixée� Taille adaptée

� En quantité suffisante � 10 fois le volume de la pièce

� Correctement identifié (étiquette)� Formol

Fixation Formol tamponné 10%

Conservation de l’échantillon (pièce op.)

Préparation à l’échantillonnage macroscopique

24-48 Heures

Macroscopie (prélèvement histologique après fixation)

• Binôme pathologiste / technicien • +/- schémas et photos• Pièce mesurée, pesée, encrée…•Sélection des territoires à prélever pour examen histologique•Prélèvements de 2 x 0,3 cm d’épaisseur max.

Mise en cassette (Ex. biopsie)

B 20090209

Automate « over night »

Technique prélèvement histologique après fixation

� Mise en cassette J1� Déshydratation (alcool)� Solvants (xylène)� Imprégnation

� (paraffine liquide 56 °C)

� Enrobage J2� Coupe (microtome) 3 à 5 µm� Etalement des coupes sur lames� Coloration

Automate/nuit

Inclusion en paraffine (enrobage) J2

Technique de coloration (prélèvement histologique après fixation)

� Coloration standard (HE ou HES)� Colorant basique nucléaire

� (hématéine, hématoxyline)

� Colorant acide cytoplasmique � (éosine, érythrosine…)

� +/- safran qui se fixe sur collagène

Technique prélèvement histologique après fixation

Plateau de lames Détail de lames

Montage lames avec lamelles de verreMicroscope optique +++Scanner de lames (Lames virtuelles)

Compte-rendu

� Écrit� Description des lésions� Interprétation� Conclusion : diagnostic ou

hypothèses diagnostiques� En fonction des lésions et des

renseignements cliniques� Tumeurs: éléments pronostiques

(grade, stade…)

Pathologiste et cancer

Pathologiste et Cancer

�Rôle pathologiste:� Dépistage� Diagnostic (outils utilisés)� Pronostic

Pathologiste et Cancer

� Dépistage (exemples)� Cancer du col utérin : frottis

cervico-vaginaux� Cancer de la prostate : TR, PSA

+/- biopsies� Cancer du sein : mammographie

+/- biopsies� …

Ex.: Cancer du col utérinCytologie Frottis cervico-utérin

Normal Pathologique

Coloration : Papanicolaou

Standard Sextant : Sensibilité : 69 %

Sextant LatéralSensibilité: 85 %

( p = 0.003 )

Dix carottes : Sensibilité : 96 %

Douze carottes : Sensibilité : 100 %

Qualité de l’échantillon : nombre de biopsies

AFU recommande 12 carottes biopsiques + ciblées

L’échantillon reste minime : 0,001% volume prostatique

apex

centre

base

Ex. Cancer prostate:Obtenir un diagnostic optimum sur les biopsies

Petit Foyer de cancer

sur biopsie

Petit cancer sur la

prostatectomie?

Pathologiste et Cancer

� Dépistage � Diagnostic

� Macroscopique� Microscopique :

� Technique standard : colorations + HES� Immunohistochimie : anticorps � Autres techniques : FISH, Cytogénétique

� Tumeur primitive : � Épithéliale : carcinome� Conjonctive : sarcome� Lymphoïde : lymphome� …

� Tumeur secondaire : retrouver le cancer primitif

Carcinome papillaire

Carcinome tubulo-kystique

Macroscopie (tumeur du rein)

Carcinome rénal à cellules claires

Le diagnostic en pathologie est encoreaujourd’hui surtout

morphologique

Aspect typique d’un carcinome rénal à cellules claires

Microscopie (HE, HES,…)

Colorations spéciales

� Histochimie:� Mise en évidence de

constituants cellulaires à partir de leur composition chimique et affinités tinctoriales :

� PAS, Bleu Alcian, Perls, Rouge congo, réticuline…

Immunohistochimie (IHC)

� Technique complémentaire� Mise en évidence de sites antigéniques

(récepteur, cluster de différenciation, facteur de transcription…) par l’utilisation d’un anticorps spécifique couplé à un chromogène (réaction enzymatique) ou à un fluorochrome (IF)� Coupe de tissu fixé et inclus en paraffine +++� Cytologie� Coupe de tissu congelé

� IF directe: microscope à fluorescence

Immunohistochimie

Analyse in situ des protéines :Immunohistochimie (en routine depuis fin années 80)

Immunohistochimie (exemples)

Marquage nucléaireMarquage membranaire

Marquage cytoplasmique

Autres analyses

� Sur tissus fixés et inclus en paraffine : Analyses in situ

(= sur lame histologique) � ARN, ADN : HIS, FISH, CISH

� Sur tissus congelés : analyses moléculaires � Analyses « en tubes » PCR, en gel

Western blot, séquençages, etc…� Biopuces � NGS,…

ADN

ARN

Protéine

Hybridation in situ (+/- en routine)

� Propriétés d’hybridation de l’ADN ou de l’ARN

� Mise en évidence de translocation et d'amplification de gènes.

� De délétions chromosomiques ou de surexpression

FISH (Fluorescence in situ

Hybridisation)

SISH (Silver in situ Hybridisation)

Exemple d’amplificationavec la sonde HER2

CISH (Chromogenic in situHybridisation)

Apports de l’IHC en cancérologie

1- Déterminer la nature ou l’origine d’une tumeur dans une démarche algorithmique

2- Mieux visualiser certains éléments cellulaires ou certaines lésions mal identifiables sur l’HES

3- Marqueurs spécifiques d’organes, utiles si métastases inaugurales

4- Marqueurs histopronostiques / test compagnon et thérapie ciblée

5- Peut être nécessaire dans la définition OMS d’une tumeur

AE1AE3, CD 45, PS100

Tumeur indifférenciée

AE1AE3 : cytokératines → tumeur épithéliale

CD45 : antigène commun leucocytaire → lymphome

PS100 : protéine du tissu neuro-ectodermique

(nerfs, mélanocytes) → tumeurs nerveuses, mélanome

1- Déterminer la nature ou l’origine d’une tumeur dansune démarche algorithmique

AE1AE3,CD 45, PS100

Tumeur indifférenciée

AE1/AE3

CD 45

PS100

AE1/AE3

CD 45

PS100

AE1/AE3

CD 45

PS100

-

-

-

-

-

+ -

-

+

AE1/AE3

CD 45

PS100 -

-

+

Sarcome Mélanome Lymphome Carcinome

Carcinome embryonnaire (CD30)

Choriocarcinome (B HCG)

(HMB45, Melan A) (CD3, CD20,…) (CK7, CK20,…)

PS100 Cytokératine

Mélanome nodulaireHMB45Melan A

Carcinome peu différenciéAdénocarcinome de site inconnu

CHCCarcinome rénalADK prostate

ADK colorectal

ADK poumonCarcinome seinCarcinome endomètreCarcinome thyroïdeCarcinome cholangiocellulaireCarcinome non mucineux ovaireCarcinome urothélial

Carcinome mucineux ovaireCarcinome urothélialCarcinome pancréatique *Carcinome gastriqueCarcinome biliaire

CK7 - CK20 -

CK7 + CK20 -

CK7 + CK20 +

CK20 +CK7 -

Exemples : Recherche de micrométastases dans le(s) ganglion(s) sentinelle(s) :

- pour le sein- pour le col utérin- pour mélanome

Rechercher un contingent neuro-endocrine

2- Mieux visualiser certains éléments cellulaires oucertaines lésions mal identifiables sur l’HES

Micrométastases,ganglion sentinelle

Carcinome métastatique d’origine inconnue

• biopsie du site métastatique (os, poumon, foie, …)ex. histologique standard < 100 $

• batterie complète d’anticorps < 2000 $ prédiction du site 67% (DeYoung, 2000)

• imagerie, endoscopies, etc… 17 973 $site trouvé : 4 / 56 (Schapira, 1995)

3- Marqueurs spécifiques d’organes, utiles si métastases inaugurales

Anticorps « spécifiques » d’organe

PSA ou PSAP parfois plus sensible: Prostate

TTF1: poumon,thyroïde (+ thyroglobuline)

Hepar 1 : foie (CHC)

Mammoglobin/ GCDFP-15 : sein

Exemple de métastase (os)

Métastase osseuse d’un adénocarcinome peu différencié, PSA+ (prostate)

Histopronostique / test compagnon

� Ex. : Adénocarcinome du sein:� Récepteurs hormonaux:

� R Œstrogènes� R Progestérone (Tt: hormonothérapie)

� Récepteur C-erb2 (Tt: Herceptin)

4- Marqueurs histopronostiques / Test compagnon et thérapie ciblée

Cerb2 (HER-2)Récepteur RO

Lumière

Muqueuse

5- IHC peut être nécessaire dans la définition OMS d’une tumeur stromale

Positivité des cellules tumorales avec anti C-KIT (CD117) ou DOG1, marqueur diagnostique→ Tt par GlivecTumeur stromale gastrique

Pathologiste et Cancer

� Dépistage � Diagnostic � Pronostic

� Scores histopronostiques : plus le score est élevé, plus le cancer est agressif (peu différencié)

� Classification pTNM (tumor, Node, Metastasis)

� Immunohistochimie pronostique

Rôle du pathologiste dans l’évaluation des critères pronostiques d’une tumeur

� Les critères histo-pronostiques utilisées pour la prise en charge des cancers ont été enrichis à partir du début des années 1970

� Pronostic affiné depuis l’apparition de critères immuno histochimiques

� Année 2000 : application des outils de la génomique et la protéomique pour permettre l’établissement d’un pronostic individuel (médecine personnalisée)

Paramètres histopathologiques influençant le pronostic

� Taille tumorale� Ex: Epaisseur tumorale du mélanome (indice

de Breslow) mesurée au microscope =principal facteur pronostique depuis plus de30 ans!

� Scores histopathologiques (exemples)

� Gleason: adénocarcinome prostate� Elston-Ellis : carcinomes mammaires� grading histopathologique des sarcomes des

tissus mous et des os (FNCLCC)� Marqueurs (IHC)

� Index de prolifération Ki-67 et TNE

Facteurs histopronostiques etClassification pTNM

� Taille tumorale� Type histologique� Grade de différenciation

tumorale� Degré d’extension� Statut ganglionnaire et

métastatique à distance� Emboles vasculaires

tumoraux� Index mitotique� Qualité de l’exérèse

Statut ganglionnaire

� Examen histopathologique standard� Pièces opératoires / curage ganglionnaire

systématique ou complémentaire � Soit après repérage du ganglion(s)

sentinelle(s) : IHC

� Examen extemporané d’un ganglion suspect ou d’un groupe ganglionnaire permet de guider le traitement chirurgical et d’éviter la morbidité d’une ré-intervention ou d’un curage ganglionnaire inutile

Aide à la thérapeutique

Aide à la thérapeutique

� Proposition thérapeutique� Réponse au traitement (ypTNM)� Exemples de marqueurs IHC indispensables :

� Récepteurs hormonaux (cancer du sein)� Her-2 (cancer du sein/estomac) → Herceptin°� C-KIT/DOG1 (tumeurs stromales) → Glivec°� ALK/EML4 → Crizotinib°

� Biologie moléculaire� Accès à des thérapies ciblées innovantes par

test compagnon : AcSé

Facteurs pronostics et prédictifs, l’exemple du sein (HER2)

� Pronostic

� HER2 : chez les patiente N+ est de mauvais pronostic.

� Ki67 : index élevé est de moins bon pc

� Prédictif

� HER2 surexpression et réponse à l’HERCEPTINE.

� Ki67 : index élevé, prédictif de réponse à la chimiothérapie néoadjuvante

Biologie moléculaire

Exemple de thérapie ciblée dans le cancer du poumon et EGFR

EGFR en routine depuis 2010

� depuis AMM pour Iressa® (géfitinib)Patients atteint d’un CBNPC localement avancé ou métastatique ET Mutation activatrice du récepteur à l’EGF (EGF : facteur de croissance épidermique)

� Un biomarqueur des mutations somatiques de la tumeur (acquises par l’ADN tumoral+++)

« Biopathologie »

Rôle transversal fondamental du pathologiste : de la réception du prélèvent à l’analyse moléculaire, dont le résultat est conditionné

par la qualité de l’échantillon transmis

Pathologiste

� Diagnostic +++� Test EGFR:

� +/- Désarchivage� Envoi à un pathologiste

associé à une plateforme de génétique moléculairepour l’étude pré analytique +/-extraction d’ADN

ADN tumoral

� Pièce opératoire: Matériel tumoral+++� Faible quantité sur biopsie!

Inclusion en

paraffineDiagnostic

HistologiqueAdK invasif

Congélation

(Tumorothèque)

Le circuit d’une pièce opératoire

Envoi plateformePour examen pré-analytique

Fixation en Formol

Macroscopie

Pièce à l’état frais

Désarchivage

INCa: http://www.e-cancer.fr/

Étapes pré analytiques

1- Contrôle de la richesse cellulaire +++- sélection du bloc

2- Récupération matériel tumoral3- Extraction de l’ADN tumoral

Contrôle de la richesse cellulaire+++

Sélection d’une zone riche en cellules tumoralesEstimation du % de cellules tumorales

Récupération matériel tumoral

+/- Macro dissection

Matériel stérile / éviter contamination

Lame blanche

3 coupes épaisses 10 à 20 µm ou prise directe

Extraction de l’ADN tumoral

Déparaffinage

Digestion par la protéinase K

Extraction utilisant une colonne d’affinité

ADN

Transmission de l’ADN tumoral

� Au biologiste moléculaire� Nom et coordonnées du

prescripteur pour résultats� % de cellules tumorales pour

valider (>20%)� Concentration

Analyse par le Biologiste Moléculaire

� Identification des mutations

1. Sharma SV, Bell DW, Settleman J, et al. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nat Rev Cancer 2007;7:169-812. Rosell R, Moran T, Queralt C, et al. Screening for epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. N Engl J Med 2009;361:958-67.

Le spectre des mutations de l’EGFRUne prévalence de 10 à 16,6% de mutations dans la population caucasienne (1,2)

D’après Sharma SV, et al. (1)

et KRAS (20%)

Accès à des thérapies ciblées innovantes par des tests compagnons

� AcSé� CBNPC: ROS1, C-MET, PDL-1…� Carcinome rénal: ALK, C-MET,…

� Prescription d’AcSé par clinicien� Test compagnon: IHC, FISH et

biologie moléculaire

Exemple de stratégie

Cancer du poumon

Cancer du Poumon

� Un homme de 65 ans, tabagique, consulte pour une opacité pulmonaire périphérique, unique, non symptomatique, de découverte fortuite lors d'un bilan systématique.

� Pas d’adénopathie.

Cancer du Poumon

� 1) Quels sont les examens anatomo-pathologiques qui vont être pratiqués dans un premier temps?� Fibroscopie bronchique (Aspi+biopsies)

� 2) Si ces examens sont négatifs, quel examen conseillez-vous? � Biopsie sous scanner� Si ADNP: EBUS « stagging »

Biopsie sous scanner

Biopsie sous scanner:Adénocarcinome pulmonaire invasif

Anti TTF1+ Bleu Alcian+

Suite Cas

� Si biopsie sous scan non contibutive ou impossible à réaliser

� Mais forte suspicion de malignité!

Résection chirurgicale « wedge » + Examen extemporané

� Nodule périphérique� Malin vs bénin� Tumeur primitive vs métastase

� La petite taille de la lésion n’est pas une contre-indication à l’examen extemporané� 2 possibilités:

Pas de chirurgie complémentaire1ère: soit une métastase d’un adénocarcinome colique

Résection chirurgicale complémentaireavec curage

2e soit un adénocarcinome pulmonaire avec une composante bronchioloalvéolaire

� Pièce fraîche J0� +/- Congélation tumorothèque� Fixation formol 24 à 48 hres� Macroscopie à J1 ou J2� Automate� Blocs J2 ou J3� Coupes: lames� Microscopie: CR avec diagnostic, limites

et stade pTNM, R? etc…� Si demande du clinicien: test compagnon IHC /

Biologie moléculaire

Ce qu’il faut retenir

� Importance des renseignements cliniques� Pour éviter errance diagnostique� Pour diminuer le nombre des examens (donc la

pénibilité et le coût)

� Missions des anatomo-pathologistes� Dépistage

� Diagnostic tumeur primitive et/ou secondaire� Pronostic

� Aide à la Thérapeutique (proposition thérapeutique, appréciation de la réponse au traitement, thérapie ciblée)

� RCP

� Recherche

Remerciements

Dr Peggy DARTIGUES, IGRDr Mathilde SIBONY, Hôpital CochinDr Julie GONIN, CH St-NazairePathologistes de la Faculté médecine Paris Descartes