Applicazioni genetica umana e molecolare II parteDr. Stefania GonfloniStefania.Gonfloni@uniroma2.itStudio 4319

BIOTECNOLOGIE MOLECOLARIPrincipi e tecnicheTerry A. BrownBIOTECNOLOGIA MOLECOLAREPrincipi e applicazioni del DNA ricombinanteBernard R. Glick Jack J.PasternakGENETICA UMANA E MOLECOLAREStracan T. Read A.P.

Che cos’è la clonazione dei geni?

1. Frammento di DNA con il gene da clonare viene inserito in un Vettore2. Il vettore trasporta il gene all’interno della cellula ospite3. Il vettore si moltiplica all’interno della cellula ospite producendonumerose copie uguali non solo a se stesso ma anche del gene chetrasporta4. Quando la cellula ospite si divie, alla progenie vengono passate copie della molecola di DNA ricombinante ed il vettore simoltiplica ulteriormente5. Dopo un grande numero di divisioni cellulari, si produce una colonia, o clone costituita da cellule identiche.

La PCR

Espressione genicacon promotori forti e regolabili

Vettori per l’espressione dei geni

ptac: ibrido funzionale dai promotori trp (-35) e lac (-10)

Integrazione del geneclonato nel sito cromosomico

b. subtilis

Vettore di espressione eucariotico

p:unità di trascrizione eucariotica

Metodo per ottenere sequenze di cDNA a lunghezza completa

Saggio di protezione dalla nucleasi S1

SAGE

Screening multiplo dell’espressione genica

Immunoblotting(Western blotting)

Immunocitochimica

Espressione della -tubulina in uncervello di un embrione di topo di 12, 5 giorni

Immunofluorescenza

Proteina a fluorescenza verde come etichetta fornisce un modo utile perseguire l’espressione delle proteine

Identificazione di sequenze di regolazione mediante l’uso di geni Indicatori e le interazioni tra DNA e proteine

Analisi delle delezioni nella regionie promotore del gene umano per Il fattore VIII

Footprinting mediante DnasiI

Saggio di ritardo nel gel

I sistemi “a doppio ibrido”e a “singolo ibrido”in lievito

Phage display

Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei pronuclei

La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa puo’inattivare un predeterminato gene cromosomico all’internodi una cellula integra“Hit and run”

La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata per introdurre nel DNA piccole mutazioni

“Tag and exchange”

Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di undato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto

Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP

Gene trapping

Clonazione animale