Lluis M. Mir, D.Sc.

Laboratoire de Vectorologie et Thérapeutiques Anticancereuses

UMR 8203 CNRS, Université Paris Sud et

Institut Gustave-RoussyVillejuif (Paris) - France

Applications m édicales des impulsions électriques

Journées URSI France 2012 – 3 et 4 Avril 2012, Paris

Laboratoire Européen Associésur l’Electroporation en Biologie et M édicine

(LEA EBAM)

Applications médicales des champs

électromagnétiques

Trois grands types d’applications

1. Courants électriques (continus ou impulsionnels) directement appliqués au corps (électrodes avec contact)

2. Energie électrique, magnétique ou électromagnétique appliquée par des électrodes sans contact avec le corps

3. Energie électrique, magnétique ou électromagnétique appliquée par des électrodes en contact direct avec le corps

1. Courants électriques (continus ou impulsionnels) Effets relativement bien connus, parmi lesquels:

1. Déplacement électrophorétique de protéines (récepteurs) à la surface des cellules

2. Orientation de la migration des cellules ou des neurites

3. Régulation de la division cellulaire, de la différentiation cellulaire (?)

4. Variations du potentiel transmembranaire et induction de potentiels d’action

5. Modification de l’endocytose des cellules vvvvvvvvvvvvvvvvvvvv

6. Modification de la perméabilité des cellules (« électroporation » classique et/ou « supraporation »)

1. Courants électriques (continus ou impulsionnels) Effets relativement bien connus, parmi lesquels:

1. Déplacement électrophorétique de protéines (récepteurs) à la surface des cellules

2. Orientation de la migration des cellules ou des neurites

3. Régulation de la division cellulaire, de la différentiation cellulaire (?)

4. Variations du potentiel transmembranaire et induction de potentiels d’action

5. Modification de l’endocytose des cellules (Courants faibles)

6. Modification de la perméabilité des cellules (« électroporation » classique et/ou « supraporation »)Courants de forte intensité délivrés sous forme d’impulsions de très courte durée et de haut voltage

Courants électriques directement appliqués au corps

Courants de forte intensité délivrés sous forme

d’impulsions de très courte durée et de haut voltage

1. Chocs électriques pour la dépression

2. Défibrillation cardiaque

3. Electrochimiothérapie

4. Thérapie génique non virale

5. Electroporation irréversible pour le traitement du cancer et l’arythmie cardiaque

Courants électriques directement appliqués au corps

Courants de forte intensité délivrés sous forme

d’impulsions de très courte durée et de haut voltage

1. Chocs électriques pour la dépression

2. Défibrillation cardiaque

3. Electrochimiothérapie

4. Thérapie génique non virale

5. Electroporation irréversible pour le traitement du cancer et l’arythmie cardiaque (impulsions d’une durée dans la gamme des microsecondes et des millisecondes)

6. Recherches actuelles pour des applications futures (impulsions ultracourtes d’une durée dans la gamme des nanosecondes)

Modélisation électrique d ’une cellule

L’application d’impulsions électriques courtes et intenses aux cellules vivantes induit des modifications

de la différence de potentiel transmembranaire

Au-delà d’un potentiel transmembranaire de 0.2 à 0.4 volts, des structures transitoires de perméation sont générées

au niveau de la membrane cellulaire

Electroporation ou électroperméabilisation

Electrotransfert de Gènes

Electrochimiothérapie

Stérilisation d’aliments

(inactivation des microbes)

Electroporation Irréversible

pour l’ablation de tumerus

Extraction de jus ou de sucre

(Betterave, raisin …)- +

Schultheiss et al. 2002 – Davalos et al. 2005

Medical and industrial applicationsIntroduction |

100 V/mm

20 V/mm

Un nouveau concept

Bléomycine seule

Bléomycine +

impulsions électriques

Concentration de bléomycine (logarithme)

Eff

ica

cité

de

clo

na

ge

(e

n %

de

s co

ntr

ôle

s)

Résultats de la

première expérience

Des souris ont été « guéries »(plus de 200 jours de survie

de la souris SANS réapparition de la tumeur inoculée)

dès la première expérience, après un seul traitement,

sur deux modèles tumoraux différents

Conditions électriques:

8 impulsions de 1500 V/cm et

100 µs

à la fréquence de répétition de

1 Hz (1 IE/s)

Electrodes:

Bléomycine: injectée par voie

intramusculaire 30 minutes

avant les IE

Day 0

Day 20

Day 2

Day 30

Un exemple provenant d’un laboratoire irlandais qui a reproduit nos expériences ultérieurement

(modèle: cancer du rein humain)

Avant30 jours après

3 jours après

« pendant »

1er essai clinique, à l’IGR (Mir et al 1991,

Berehradek et al. 1993)

L’expérimentation clinique

Définition de

l’électrochimiothérapie antitumorale

La potentialisation locale

au moyen

d’impulsions électriques perméabilisantes

de l’activité antitumorale

d’un médicament anticancéreux non perméant

ayant une forte activité intrinsèque.

• Arrêt immédiat du saignement; disparition du nodul e en approx. 10 semaines

Les marques des aiguilles sur la peau normale révèl ent la sélectivité de l’ECT

Mélanome malinAvant

Après 1 mois Après 6 mois

Marty et al, Eur. J. Cancer Supplement 2006, 4 :3-13

Métastases cutanées de cancer du seinAvant 2 mois après l’ECT

Electrochimiothérapie (ECT)

La technologie Cliniporator ™

(issue du projet européen “Cliniporator”)

La technologie Cliniporator ™

(issue du projet européen “Cliniporator”)

Bilan final de l’étude ESOPE

4,7%10,5%11,1%

73,7%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Réponsescomplètes

Réponsespartielles

Sans changement

Progression

pour

cent

ages

Résultats de l’étude du projet européen ESOPE (IGR, Villejuif, France; IO, Ljubljana, Slovenia;

UCCC, Cork, Ireland, Herlev H., Copenhagen, Denmark) Patients: 110 - Nodules avec un suivi complet: 171

Objective Response Rate: 85%No Response: 15%

Indications actuelles de l’ECT

Toute métastase cutanée et sous-cutanée indépendamment de

l’histologie de la tumeur primaire – en particulier, métastases de

mélanome et de mélanome en transit, récurrences locales du

cancer de sein, carcinomes de la tête et du cou, …

Le traitement est efficace, sûr, et peut être réalisé en hôpital de

jour, en une seule séance. Il peut être répété. L’ECT peut être faite

dans des zones déjà traitées par radiothérapie, ou lorsqu’un

traitement local est souhaité mais que la chirurgie est difficile ou

impossible (par exemple, en néoadjuvance, pour réduire le

volume tumoral et permettre l’ablation chirurgicale). L’ECT permet

de sauver des organes ou des fonctions.

Diss émination actuelle de l’ECT•

Plus 80 centres de traitement du cancer équip és aujourd ’hui dans l’Union Europ éenne

•

Depuis la publication des procédures opérationnelle s standard (Nov. 2006, Eur J Cancer Suppl. – num éro spécial « electrochimiothérapie »)

- 300 patients traités en 2007- environ 700 patients traités en 2008- environ 1500 patients traités en 2009

ECT est remboursée dans 6 pays de l’UE

Electrochemotherapy 1 st International Users’ Meeting: Nov. 19 - 20, 2010 in Bologna - ITALY

Electrochemotherapy 2 nd International Users’ Meeting: March 1 - 2, 2013 in Bologna - ITALY

Métastases osseusesPositionnement des électrodes (par courtoisie du Pr. Mercuri et des Drs. Bianchi et Campanacci de l’Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologne, Italie)

January: ECT

March: 5 wks post ECT

December

Par courtoisie du Pr. Mercuri et des Drs. Bianchi et Campanacci de l’Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologne, Italie)

M&*)JM>',/)3)37K"'P

Par courtoisie du Dr. D. Soden, duPr G. O'Sullivan et leurs collègues de Cork, Irlande

Electrodes Endoscopiques

nsPEF area

T ≈ 1 – 300 ns

E ≈ 10 – 50 kV/cm

NanopulsesDispositif expérimental

Paramètres électriques

Temps de montée (10 % - 90 %) ≈ 350 ps

Temps de descente (10 % - 90 %) ≈ 1.7 ns

Largeur à mi-hauteur ≈ 10.8 ns

Champ électrique : 1 - 6 MV/m

Densité de courant : 0.5 - 3 A/mm2

Exemples de mesures

1 : FID Nanopulseur : 10 ns, 3-10 kV, HNB 50 Ω

2 : Système d’exposition

3 : Extracteur BARTH : 100:1, DC–6 GHz, 2.5 kV, N 50 Ω

4 : Sonde de voltage : 10 : 1, DC-6 GHz, 3 kV SMA 50 Ω

5 : Oscilloscope Lecroy : DC–8 GHz,40 Gs/s, 8 bits

Dosimétrie

⇒ Le réchauffement global modifie la conductivité du milieu et donc l’amplitude du pulse appliqué

Evolution de l’amplitude de l’impulsion en fonction du taux de répétition

Cuvette: 1mm

Milieu: SMEM

Volume: 60 µL

E Initial: 4.4 kV/mm

Conclusion : le suivi permanent de l’amplitude des impulsions permet de

détecter le réchauffement de l’objet biologique avec une bonne sensibilité

Fréquence de répétition et Artéfacts

⇒ Les expériences ultérieures ont été réalisées à 10 Hz

Effet de l’amplitude des impulsions

Expériences effectuées avec 300 impulsions de 10 ns à 10 Hz

Effet du nombre d’impulsions

Expériences effectuées avec des impulsions de 10 ns et de 4 MV/m à 10 Hz

Effect of the number of pulsesPulses: 4 kV/mm, 10 ns, 10 Hz Medium: SMEM

Internalization of Bleomycin|

15 µm

Control 1000 nP300 nP

15 µm

Control

3 nP 1000 nP

300 nP

Expériences effectuées avec des impulsions de 10 ns et de 4 MV/m à 10 Hz

Effet du nombre d’impulsions

Bléomycine : une méthode pour détecter la permeabilisation réversible des cellules

Effet du nombre d’impulsions

Expériences effectuées avec des impulsions de 10 ns et de 4 MV/m à 10 Hz

Effet du nombre d’impulsions

Expériences effectuées avec des impulsions de 10 ns et de 4 MV/m à 10 Hz

Courbe des cellules exposées à la bléomycine et aux impulsions:

La survie cellulaire est en % par rapport à un contrôle exposé uniquement à la bléomycine

Effet du nombre d’impulsions

Expériences effectuées avec des impulsions de 10 ns et de 4 MV/m à 10 Hz

Impulsion unique, sans bleomycine

Expériences avec une seule impulsion

Amplitude du champ appliqué : 11 mV/m

Impulsion unique 10 ns

Conclusions

1.L’électrochimiothérapie est une nouvelle approche antitumorale qui est en train d’être incorporée dan s l’arsenal de lutte contre le cancer; elle utilise des impulsions électriques microsecondes en combinaison avec un m édicament anticancéreux non perm éant

2.L’électrotransfer des acides nucléiques qui utili se des impulsions électriques « millisecondes » ou des combinaisons d’impulsions « microsecondes » et « millisecondes » est testée dans des essais cliniques

3. La technologie des impulsions « nanosecondes »est e n cours de développement

RemerciementsTous les membres de l’équipe, particulièrement qui ont participé dans le

développement de l’électrochimiothérapie (S. Orlowski, J et M. Belehradek, B.

Poddevin, O. Tounekti, G. Pron, G. Sanz, J. Gehl, L. Ramirez, T. Kotnik, D. Cujkati, S.

Corovic, …) et les membres de l’équipe qui ont développé d‘autres applications de

l’électroporation (F. André, A. Silve, M. Breton, B Al Sakere, R. Davalos, N. Mahrour,

M. Moisescu, M-A de Ménorval, C. Calvet, I Leray, …)

Tous les collègues français, en particulier les cliniciens de l’IGR et les Drs P.Lévêque,

B.Le Pioufle, J.Teissié, B.Trétout, C.Poignard, R.Vézinet, MP. Rols, M.Tarek, C.Laux…

De très nombreux collègues de l’UE ou hors UE

Les financeurs: CNRS, Université Paris-Sud

I.Gustave Roussy, Commission Européenne

ANR (projets Nanopulsebiochip, Intcell,

Memove, Ipsioat), DGA, ARC, AFM, Ligue…

Merci beaucoup de votre attention