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Application des
techniques isotopiquesmodernes pour la
caractérisation de produits alimentaires
et de boissons
THÈSE DE DOCTORAT
Discipline : Chimie analytiqueSpécialité : Sciences Agro-alimentaires
présentée et soutenue publiquement par
Giovanni CALDERONE
Institute for Healthand Consumer Protection
EUROPEAN COMMISSION
Joint Research CentreDIRECTORATE-GENERAL
Université de NantesFaculté des Sciences et des Techniques
École Doctorale - Chimie Biologie
RapporteursM. ARNAUD Maurice, Nestlé SA Nutrition Vevey, SuisseM. BERTRAND Alain, Professeur Université Bordeaux II
ExaminateursM. GUILLOU Claude, Joint Research Centre Ispra, Italie
Mme. LEES Michèle, Eurofins Scientific SA NantesM. NAULET Norbert, Professeur Université de NantesM. REMAUD Gérald, Professeur Université de Nantes
Directeur de ThèseM. NAULET Norbert
le 18 mars 2005, devant le jury ci-dessous
Commission EuropéenneCentre Commun de Recherche (DG JRC)Institut de Santé et Protection des Consommateurs (IHCP)Unité Exposition Physique et Chimique (PCE) / BEVABSVia Enrico Fermi, TP 740I-21020 Ispra (VA), Italie
Tel.: +0039 0332 78 5668Fax: +0039 0332 78 9303
Email: [email protected]: http://ihcp.jrc.cec.eu.int/
http://hosting.jrc.cec.eu.int/pce/
Éditeur: Giovanni CalderonePhoto: The Natural History Museum (London), JRC (Ispra)Cover: José-Joaquín Blasco
Legal NoticeNeither the European Commission nor any person acting on behalf of the Commissionis responsible for the use that might be made of the information contained in this production.
SPI nº 04.216
Version revisée
© European Communities, 2004
Reproduction authorisée si la source est mentionnée
Imprimée en Italie
MISSION DU CCR
Le Centre commun de recherche a pour mission de fournir une aide scientifique ettechnique adaptée au client pour la conception, l’élaboration, la mise en oeuvre et lesuivi des politiques de l'Union européenne. En tant que service de la Commissioneuropéenne, il agit comme centre de référence scientifique et technologique pourl'Union. Proche du processus d'élaboration des politiques, il sert l'intérêt commun desÉtats membres tout en étant indépendant des intérêts particuliers, privés ou nationaux.
3
Remerciements
Ce travail est le fruit de trois années de recherche menées au sein des laboratoires
du BEVABS/CCR à Ispra (Italie) en collaboration avec le Laboratoire d'Analyse
Isotopique et Electrochimique de Métabolismes de l'Université de Nantes.
Je tiens à remercier Monsieur le Professeur Norbert Naulet de l'Université de
Nantes pour avoir accepté de diriger ma thèse et pour sa disponibilité me permettant ainsi
de progresser professionnellement et humainement.
Je remercie également Messieurs Claude Guillou et Fabiano Reniero pour m’avoir
accueilli aux laboratoires du CCR, pour leurs toujours stimulants défis et précieux conseils
et surtout pour m’avoir laissé une complète autonomie de gestion de mes recherches.
Je suis très flatté que Monsieur Maurice Arnaud du Centre de Recherche de Nestlé
et Monsieur le Professeur Alain Bertrand de l’Université de Bordeaux aient accepté de
juger ma thèse. Je suis aussi très heureux de retrouver dans le jury Monsieur Gérald
Remaud de l’Université de Nantes et Madame Michèle Lees d’Eurofins qui, avec Eric
Jamin, m’ont introduit dans le monde des isotopes stables il y a quelques années.
Je suis redevable aussi envers Madame Margaret Holland et Messieurs Franco
Cazzaniga et Giuseppe Gilberti du BEVABS pour leur extraordinaire travail (ce n’est pas
facile d’aller en quête de centaines de vieilles bouteilles empoussiérées). Même
reconnaissance pour Madame Catherine Jouitteau, du LAIEM, qui a été, elle aussi, une de
mes « voix » françaises.
Un « muchas gracias » à Monsieur José-Joaquín Blasco-Muñoz pour avoir valorisé
et représenté graphiquement les contenus de mon travail.
Un remerciement particulier à Monsieur Umberto Traldi, technicien spécialisé de
Thermofinnigan-Milano qui grâce à sa promptitude et sa compétence a résolu tous les
problèmes techniques et par qui j’ai appris à maîtriser des appareils parfois non
« collaborant ».
4
Je veux exprimer ma sympathie à tous mes collègues qui se sont alternés et avec
lesquels on a rigolé et on s’est confortés pendant les longues journées de travail au
laboratoire : Francesca, José Manuel « Chema », Veronica, Ana Isabel, Mauro, Agnieszka,
Rosa Maria et Andri et Fayçal pour leur compagnie. A Mesdames Adriana Ciceri et Eva
Åhs de l’administration de l’unité PCE qui, grâce à leur gentillesse et à leur énergie, m’ont
toujours simplifié les obstacles bureautiques.
Je remercie enfin toutes les personnes qui ont pu contribuer à la réalisation de ce
mémoire parce qu’un travail de recherche et de publication n’est jamais le travail d’une
seule personne.
Merci à Alain et Ivan pour m’avoir depuis longtemps accueilli chez eux en
devenant, de facto, ma famille en France.
Il mio più grande affetto va alla mia famiglia tutta, ai miei amici sparpagliati in giro
per l’Italia e il mondo e ad Alberto, per avermi mostrato fiducia e per avermi sostenuto
moralmente (e a volte anche fisicamente), sempre.
5
Table des matières
Remerciements......................................................................................................................3
Table des matières ................................................................................................................5
Liste des tableaux ...............................................................................................................13
Liste des figures ..................................................................................................................16
Liste des abréviations et des sigles ....................................................................................20
Introduction .........................................................................................................................27
English abstract ....................................................................................................................29
Bibliographie .......................................................................................................................30
Chapitre I
Isotopes stables
1. Historique.........................................................................................................................33
1.1. Applications ..............................................................................................................34 1.1.1. Domaine alimentaire : « food » ...........................................................................34
1.2. Rapport isotopique et déviation ..............................................................................35
1.3. Facteurs de variabilité .............................................................................................36 1.3.1. Effets isotopiques physiques................................................................................36 1.3.2. Effets isotopiques chimiques ...............................................................................38 1.3.3. Autres effets isotopiques......................................................................................40
2. Carbone : Indices sur l’origine botanique......................................................................41
3. L’azote et sa variabilité dans la nature ...........................................................................47
4. Deutérium et oxygène : Origine géographique ..............................................................51
Bibliographie .......................................................................................................................58
6
Chapitre II
Techniques et méthodes
1. Introduction ..................................................................................................................... 71
1.1. Les différentes techniques de spectrométrie de masse isotopique....................... 71
2. Aspects généraux de la SMRI ......................................................................................... 72
2.1. Quelques définitions................................................................................................. 73
2.2. La spectrométrie de masse ...................................................................................... 74 2.2.1. Que sont les isotopomères ? ................................................................................ 75
2.3. Mesures SMRI des rapports isotopiques des éléments légers.............................. 77 2.3.1. Mesure du rapport 2H/1H ..................................................................................... 77 2.3.2. Mesure du rapport 13C/12C................................................................................... 78 2.3.3. Mesure du rapport 15N/14N .................................................................................. 79 2.3.4. Mesure du rapport 18O/16O .................................................................................. 80
3. (CF-)GC-C-IRMS............................................................................................................ 81
3.1. Principes de la GC-C-IRMS ................................................................................... 81 3.1.1. Séparation et réactions......................................................................................... 82 3.1.2. Systèmes de piégeage .......................................................................................... 83 3.1.3. Vannes de déviation des gaz................................................................................ 83
3.2. Applications .............................................................................................................. 84 3.2.1. Applications en agroalimentaire.......................................................................... 84 3.2.2. Applications futures............................................................................................. 86 3.2.3. Nos études en GC-C-IRMS ................................................................................. 86
3.3. Les limites ................................................................................................................. 87
4. EA-IRMS ......................................................................................................................... 88
4.1. Principes de l’EA-IRMS : réaction, systèmes de piégeage et séparation............ 89
4.2. Nos applications dans le domaine alimentaire ...................................................... 89
5. TC-EA IRMS ................................................................................................................... 91
5.1. Principes du TC-EA-IRMS ..................................................................................... 91 5.1.1. Nos conditions opératoires .................................................................................. 92
5.2. Interférences et limites ............................................................................................ 92
5.3. Applications .............................................................................................................. 93
6. RMN du deutérium.......................................................................................................... 94
7
7. Notions statistiques ..........................................................................................................94
7.1. Quelques définitions de statistique élémentaire ....................................................94
Bibliographie .......................................................................................................................96
Chapitre III
Caractérisation du glycérol des vins européens :
approche par l’isotope stable du carbone (Characterization of European wines glycerol: stable carbon isotope
approach)
1. Introduction ...................................................................................................................104
1.1. Stable Isotope Ratio Methods in Food .................................................................105
1.2. EU Wine Data-Bank: BEVABS role ....................................................................106
2. Materials and methods ..................................................................................................107
2.1. Samples....................................................................................................................107
2.2. Sample preparation................................................................................................107
2.3. Continuous Flow GC-C-IRMS..............................................................................108
2.4. Determination of concentration of glycerol .........................................................111
3. Results ............................................................................................................................113
4. Conclusions....................................................................................................................114
Bibliographie .....................................................................................................................120
8
Chapitre IV
Mesure de δ13C de CO2 de boissons gazeuses par CG-C-
SMRI : mise au point de la méthode et applications (Analysis of the 13C natural abundance of CO2 gas from sparkling drinks by
GC-C-IRMS: validation of the method
Contribution of GC-C-IRMS technique to sparkling drinks authentication: 13C/12C ratio determination on CO2)
1. Background ................................................................................................................... 126
1.1. Carbon dioxide sources ......................................................................................... 127
2. Experimental ................................................................................................................. 127
2.1. Gas sampling .......................................................................................................... 127
2.2. GC analyses ............................................................................................................ 129
2.3. Continuous Flow GC-C-IRMS configuration and 13C/12C ratio measurement129
3. Results ............................................................................................................................ 130
3.1. Correction of data .................................................................................................. 133
4. Conclusions: method ..................................................................................................... 134
5. Introduction ................................................................................................................... 136
5.1. Stable isotope ratio methods in food .................................................................... 136
5.2. Rapid measurement of the 13C content of CO2 ................................................... 137
5.3. Fermented beverages ............................................................................................. 137 5.3.1. Sparkling and semi-sparkling wines.................................................................. 137 5.3.2. Beers .................................................................................................................. 138 5.3.3. Fermented fruit juices and hydromel................................................................. 139
5.4. Sparkling waters .................................................................................................... 139
5.5. Soft-drinks .............................................................................................................. 140
6. Materials and methods .................................................................................................. 140
6.1. 13C/12C of ethanol ................................................................................................... 140
7. Results ............................................................................................................................ 141
9
7.1. Market samples ......................................................................................................141 7.1.1. Sparkling wines..................................................................................................141 7.1.2. Beers ..................................................................................................................142 7.1.3. Sparkling waters ................................................................................................143 7.1.4. Soft-drinks .........................................................................................................146
8. Conclusions: applications .............................................................................................147
Bibliographie .....................................................................................................................149
Chapitre V
Caractérisation multi-isotopique d’éthanols d’origine
diverse : mesures de δ 18O et de δ 2H par TC/EA
1. Introduction ...................................................................................................................153
1.1. Fermentation alcoolique ........................................................................................154
1.2. Sucres de céréales et miels .....................................................................................154
1.3. Boissons fermentées ...............................................................................................154
1.4. Boissons spiritueuses ..............................................................................................157
2. δ 2H et δ 18O ...................................................................................................................157
2.1. Techniques de mesure ............................................................................................157
3. Matériels et méthodes ....................................................................................................158
3.1. Echantillons ............................................................................................................158
3.2. Fermentation ..........................................................................................................158
3.3. Distillation d’alcool ................................................................................................159
3.4. Déshydratation .......................................................................................................159
3.5. Mesures de δ18O et δ2H par TC/EA ......................................................................159
3.6. Autres mesures .......................................................................................................163 3.6.1. 13C-SMRI ...........................................................................................................163 3.6.2. 2H-RMN.............................................................................................................163 3.6.3. 18O-SMRI...........................................................................................................163
4. Résultats et discussion ...................................................................................................164
10
4.1. Miels ........................................................................................................................ 164
4.2. Sucres de céréales................................................................................................... 168
4.3. Boissons alcoolisées ................................................................................................ 172 4.3.1. Whisky/Whiskey ............................................................................................... 172 4.3.2. Rhums et Tequilas ............................................................................................. 175
4.3.2.1. Cas de la fausse Tequila / Ethanols synthétiques........................................ 175 4.3.3. Sakés.................................................................................................................. 177 4.3.4. Vodkas, Gins, liqueurs....................................................................................... 178 4.3.5. Spiritueux de fruit .............................................................................................. 180
4.4. Vins.......................................................................................................................... 183 4.4.1. Oxygène de l’éthanol et oxygène de l’eau......................................................... 183 4.4.2. Influences géographiques : δ2H et δ18O............................................................. 183 4.4.3. Variations annuelles de 18O et 2H ...................................................................... 186 4.4.4. Carbone-13 ........................................................................................................ 187
4.5. Bières ....................................................................................................................... 192
5. Conclusions ................................................................................................................... 192
5.1. Technique................................................................................................................ 192
5.2. Interprétation ......................................................................................................... 193
Bibliographie ..................................................................................................................... 194
Chapitre VI
Contribution à l’authentification de l’arôme de pomme : 13C du butan-1-ol mesuré par GC-C-IRMS
1. Introduction ................................................................................................................... 201
1.1. Réglementations pour la protection de la santé publique .................................. 202
1.2. Notre approche pour la caractérisation de l’arôme de pomme ......................... 202
2. Matériel et méthodes ..................................................................................................... 202
2.1. Système CG-C-SMRI............................................................................................. 203
2.2. Autres mesures ....................................................................................................... 203
3. Résultats......................................................................................................................... 205
11
4. Discussion ......................................................................................................................205
4.1. Technique ................................................................................................................205
4.2. Interprétation .........................................................................................................206
Bibliographie .....................................................................................................................208
Chapitre VII
Conclusions et perspectives ...................................................................................................................................213
Annexes
Annexe A
Les techniques isotopiques dans les règlements CE
Introduction .......................................................................................................................221
Annexe B
GC-C-IRMS : Calibration du CO2 comme gaz de référence
1. Standards .......................................................................................................................227
1.1. En pratique .............................................................................................................227
2. Elaboration des données ...............................................................................................228
12
Annexe C
TC-EA : Nos conditions opératoires
1. L’appareil....................................................................................................................... 233
2. Carbone vitreux (Glassy Carbon) ................................................................................. 233
3. Configurations............................................................................................................... 234
3.1. Echantillons solides ................................................................................................ 234
3.2. Echantillons liquides .............................................................................................. 234
4. Température................................................................................................................... 237
5. Gaz de référence ............................................................................................................ 237
6. Débit d’hélium ............................................................................................................... 239
7. Remarques ..................................................................................................................... 239
Annexe D
Tableaux des vins soumis à l’analyse du glycérol (Chapitre III)
et de l’éthanol (Chapitre V) .................................................................................................................................. 243
13
Liste des Tableaux
Chapitre I
Tableau 1: Abondance naturelle moyenne, référence internationale utilisée et autres
données des principaux isotopes stables des éléments les plus utilisés dans l’authenticité des aliments ............................................................................................37
Tableau 2: Fractionnement dans certaines réactions enzymatiques ....................................41
Tableau 3 : Exemples des plantes les plus communes des trois groupes décrits ................44
Tableau 4: Processus à l’origine du fractionnement isotopique de l’azote .........................50
Chapitre II
Tableau 1 : Réactions mises en jeu et gaz obtenus pour utilisation en SMRI.....................73
Chapitre III
Table 1: EU wine-producer Countries and composition of our samples. Number of genuine
wines, expressed as white/red/rosé.............................................................................107
Table 2: Comparison of glycerol concentrations in five BIPEA wines ..........................113
Table 3: Comparison of glycerol δ13C values by GC-C and EA-IRMS techniques..........115
Table 4: Concentration and 13C content of glycerol in wines particularly rich in glycerol..... ………………………………………………………………………………………115
14
Chapitre IV
Table 1: Injection of CO2 reference gases to validate the method .................................... 133
Table 2: 13C content of headspace CO2 and ethanol of sparkling wine samples............... 142
Table 3: 13C content of headspace CO2 and ethanol of beer samples................................ 144
Table 4: 13C content of headspace CO2 from sparkling water samples............................. 145
Table 5: 13C content of headspace CO2 from fizzy drink samples .................................... 146
Chapitre V
Tableau 1 : Définition et description de certaines boissons spiritueuses en accord avec le
règlement européen N°1576/89 (extrait).................................................................... 156
Tableau 2 : Analyses isotopiques d’un échantillon de tequila d’origine suspecte............ 176
Tableau 3 : Analyse multi-isotopique d’échantillons de saké........................................... 177
Tableau 4 : Variation des teneurs moyennes en 18O et 2H des vins des deux récoltes...... 187
Tableau 5 : Analyse multi-isotopique d’échantillons de bières ........................................ 191
Schéma 1 : Ethanol et origine des hydrogènes .................................................................. 166
Chapitre VI
Tableau 1 : Liste des échantillons et résultats des analyses isotopiques........................... 206
15
Annexe B
Tableau 1 : Calibration de CO2 contre le « FID-mix » Varian..........................................229
Annexe D
Tableau 1 : Liste des vins de la récolte 1998 ....................................................................244
Tableau 2 : Liste des vins de la récolte 1999 ....................................................................247
16
Liste des Figures
Chapitre I
Figure 1 : Variabilité isotopique du 13C dans plusieurs formes du carbone en relation à son
cycle dans l’environnement.......................................................................................... 41
Figure 2 : Diagramme de composés et standards de référence contenant du carbone et leur distribution au long de l’échelle δ13C........................................................................... 42
Figure 3 : Différentes physiologies des tissus foliaires....................................................... 44
Figure 4 a et b : Schéma simplifié des cycles photosynthétiques C3 et C4........................ 45
Figure 5 : Modèle du fractionnement du 13C des plantes et chez les mammifères herbivores qui s’en nourrissent ...................................................................................................... 47
Figure 6 : Diagramme de composés et standards de référence contenant de l’azote et leur distribution dans l’échelle δ15N.................................................................................... 48
Figure 7 : Modèle du fractionnement de l’azote entre les plantes et les animaux .............. 49
Figure 8 : Carte des valeurs moyennes de δ18O des précipitations des années 1992/93..... 52
Figure 9 : Effet de la température sur le fractionnement de l’oxygène dans une masse de vapeur d’eau ................................................................................................................. 53
Figure 10 : Schématisation du fractionnement de l’hydrogène des eaux météoriques ....... 54
Figure 11 : Diagramme de composés et standards de référence contenant de l’hydrogène et leur distribution dans l’échelle δ2H.............................................................................. 56
Figure 12 : Diagramme de composés et standards de référence contenant de l’oxygène et leur distribution dans l’échelle δ18O............................................................................. 57
Chapitre II
Figure 1 : Schéma d’un système SMRI : exemple du CO2 ................................................. 76
17
Figure 2 : Belemnitella americana dans un dessin et son rostre fossilisé : le carbonate PDB. .............................................................................................................................79
Figure 3 : Configuration de notre chromatographe en phase gazeuse, couplé à un auto sampler et à une interface de combustion.....................................................................82
Figure 4 : Schématisation des diverses parties d’un système couplé GC-C-IRMS, en configuration double, carbone/azote.............................................................................85
Figure 5 : Schématisation du système couplé EA-IRMS, en configuration double, CO2/N2.. ………………………………………………………………………………………..90
Figure 6 : Notre appareil de TC-EA, configuré pour l’analyse d’échantillons liquides ou solides ...........................................................................................................................92
Figure 7 : Schéma du système de pyrolyse TC-EA.............................................................93
Chapitre III
Figure 1: Structure of glycerol...........................................................................................104
Figure 2: Structure of 1,5-pentanediol (1,5-PD)................................................................104
Figure 3 : Temperature program set up to separate glycerol from the other wine components.................................................................................................................109
Figure 4: Scheme of GC-C-IRMS configured for δ13C analyses. .....................................110
Figure 5: IRMS-Chromatogram of 1,5-pentanediol and glycerol from wine....................112
Figure 6: δ13C values of glycerol samples by GC- and EA-IRMS to test linearity...........115
Figure 7: δ13C of glycerol vs. δ13C of ethanol, for 1998 and 1999 wines of 4 EU Countries.....................................................................................................................116
Figure 8: Correlations of glycerol concentration (g/L) versus ethanol content (% V/V) of wines...........................................................................................................................118
Chapitre IV
Figure 1: Transfer of headspace gas into a crimped vial with cleaning of volume ...........128
Figure 2: Scheme of GC-C-IRMS configured for δ13C analyses of CO2..........................131
18
Figure 3: Typical chromatogram of a CO2 sample analysis by IRMS. δ13C is the mean value over 5 repetitions in one run ............................................................................. 132
Figure 4: δ13C values trend of subsequent injections from the same vial containing CO2 134
Chapitre V
Figure 1 : Schématisation de la fermentation du glucose ................................................. 155
Figure 2 : Programme-type avec plusieurs injections d’un échantillon d’éthanol analysé en TC-EA (logiciel Isodat 2.0)........................................................................................ 160
Figure 3 : Spectrogramme de la mesure du rapport 2H/1H de l’éthanol............................ 161
Figure 4 : Spectrogramme de la mesure du rapport 18O/16O de l’éthanol ......................... 162
Figure 5 : δ18O et δ2H des éthanols issus de miels et classés par origine botanique......... 165
Figure 6 : δ18O et δ2H des éthanols issus de miels en fonction de leur origine géographique ………………………………………………………………………………………165
Figure 7 : δ18O et δ13C des éthanols issus de miels et classés par origine botanique........ 166
Figure 8 a et b : Combinaison des résultats (D/H)1 en fonction de δ18O et distribution de (D/H)2 des éthanols issus de miels et classés par origine botanique.......................... 167
Figure 9 : Combinaison des résultats δ18O et δ2H des éthanols issus de sucres de céréales et classés par origine botanique.................................................................................. 168
Figure 10 : Combinaison des résultats δ13C et δ2H des éthanols issus de sucres de céréales et classés par origine botanique.................................................................................. 170
Figure 11 : Combinaison des résultats δ18O et δ13C des éthanols issus de sucres de céréales et classés par origine botanique.................................................................................. 170
Figure 12 a et b : Combinaison des résultats (D/H)1 en fonction des δ18O et distribution de (D/H)2 des éthanols issus de sucres de céréales et classés par origine botanique...... 171
Figure 13 a, b et c: Combinaison des résultats δ2H, δ13C et δ18O des whiskys analysés.. 173
Figure 14 a et b : Combinaison des résultats δ2H, 13C et 18O pour rhums et tequilas....... 174
Figure 15 : Combinaison des mesures de 18O et 2H confirmant l’origine suspecte d’une tequila analysée par le laboratoire des Douanes de Paris........................................... 176
Figure 16 a, b et c: Combinaison des résultats δ2H, δ13C et δ18O des spiritueux analysés179
Figure 17 : Combinaison de δ18O et δ2H de boissons alcoolisées dérivées de fruits ........ 181
19
Figure 18 a et b : Combinaison des mesures de 2H, de 13C et de 18O sur boissons alcoolisées dérivées de fruits ......................................................................................182
Figure 19 a et b : Combinaison des δ18O de l’éthanol et de l’eau des vins analysés ........184
Figure 20 a et b : Combinaison des δ18O et δ2H de l’éthanol des vins analysés...............185
Figure 21 : Variation de l’18O et du 2H des vins des deux récoltes ...................................188
Figure 22 a et b : Combinaison des δ18O et δ13C de l’éthanol des vins analysés..............189
Figure 23 a et b : Combinaison des δ13C et δ2H de l’éthanol des vins analysés ...............190
Chapitre VI Figure 1 : Chromatogramme de l’arôme de pomme..........................................................204
Annexe B
Figure 1 : Chromatogramme des alcanes du « FID-mix ».................................................228
Figure 2 : Répétitivité des mesures de calibration du CO2................................................229
Annexe C
Figure 1 : Configuration du système TC-EA pour échantillons solides............................235
Figure 2 : Configuration du système TC-EA pour échantillons liquides ..........................236
Figure 3 : Test de stabilité du TC-EA pour les mesures de δ18O. .....................................238
20
Liste des symboles et des sigles
AE-SMRI
Analyseur Elémentaire – Spectrométrie
de Masse des Rapports Isotopiques,
En anglais, voir EA-IRMS.
AOP
Appellation d'Origine Protégée. En
anglais, Protected Designation of
Origin (PDO).
BEVABS
Bureau Européen des Vins, Alcools et
Boissons Spiritueuses.
BIPEA
Bureau Interprofessionnel d’Etudes
Analytiques.
C3
Voie de photosynthèse de Calvin-
Bassham dit aussi C3.
C4
Voie de photosynthèse de Hatch-Slack
dit aussi C4.
CAM
Voie de photosynthèse dit du
Crassulacean Acid Metabolism.
CE
Communeauté Européenne.
CG-C-SMRI
Chromatographie en phase Gazeuse –
Combustion – Spectrométrie de
Masse des Rapports Isotopiques. En
anglais, voir GC-C-IRMS.
COFAWS
Acronyme du projet : « Confirmation of
the Origin of Farmed And Wild
Salmon and other fish ».
EA-IRMS
Elemental Analyzer – Isotope Ratio
Mass Spectrometry. En français,
voir AE-SMRI.
EEA
European Economic Area. En français
EEE, Espace Economique
Européen.
EU
European Union.
FID
Flame ionization detector. Détecteur à
ionisation de flamme (DIF).
21
GC-C-IRMS
Gas Chromatography – Combustion –
Isotope Ratio Mass Spectrometry.
En français, voir CG-C-SMRI.
GISP
Greenland Ice Sheet Precipitation.
IAEA
International Atomic and Energy
Agency, Vienne.
IGP
Indication Géographique Protégée. En
anglais, Protected Geographical
Indication (PGI).
IRMS
Isotopic Ratio Mass Spectrometry.
En français, voir SMRI.
OIV
Organisation (ex Office) International
de la Vigne et du Vin.
PAC
Politique Agricole Commune.
PSI
Pound-force per Square Inch. Unité de
pression. 1 PSI = 6.894757 kPa
RMN-FINS ®
Résonance Magnétique Nucléaire -
Fractionnement Isotopique Naturel
Spécifique. En anglais, voir SNIF-
NMR.
SLAP
Standard Light Antarctic Precipitation.
SMRI
Spectrométrie de Masse des Rapports
Isotopiques. En anglais, voir SMRI
SNIF-NMR
Site-specific Natural Isotopic
Fractionation – Nuclear Magnetic
Resonance. En français, voir RMN-
FINS.
STG
Spécialité Traditionnelle Garantie. En
anglais, Traditional Speciality
Guaranteed (TSG).
TC-EA
Total Combustion-Elemental Analyzer,
Analyseur Elémentaire à Combustion
Totale, couplé à un spectromètre de
masse de rapport isotopique.
UE
Union Européenne.
V-CDT
Vienna-Cañon Diablo Troilite.
V-PDB
Vienna-Pee Dee Belemnite. Standard de
référence international pour le rapport
22
13C/12C et, plus rarement, pour le
rapport 18O/16O.
V-SMOW
Vienna-Standard Mean Ocean Water,
Eau Océanique Moyenne Standard.
Standard de référence international
pour les rapports 2H/1H et 18O/16O.
1,5-PD
1,5-pentanediole.
‰
Pour mille.
Introduction
Introduction
27
Introduction
a détection des fraudes et l’authenticité des produits agro-alimentaires a
toujours été, et continue à être, une question ouverte. Ces délits posent un
problème à la fois de santé publique et de pertes économiques aux dépens des producteurs
honnêtes. Il n’y a presque pas de produits (vin, fromage, boissons alcoolisées ou non, etc.)
qui ne soient pas de potentielles cibles de falsification.
Aujourd’hui encore cela peut déclencher de vraies guerres commerciales entre les
pays producteurs. Dans le passé chaque pays édictait ses propres règlements, à présent
l’harmonisation est imposée par le Communauté Européenne (CE) dans le marché unique.
D’ailleurs, c’est sur la base de « cahiers des charges de production », qui
définissent les propriétés physico-chimiques d’un produit, les procédures et les zones
géographiques de production délimitées, que certaines marques de qualité sont concédées à
un producteur. Un vin supérieur de qualité supérieur peut être caractérisé par une
Appellation d’Origine Contrôlée (A.O.C.) ou même une Appellation d’Origine Contrôlée
et Garantie (A.O.C.G.). Depuis 1992, de nouvelles marques et logos de qualité [1] peuvent
être appliqués aux autres catégories de produits, afin d’en protéger la réputation et
sauvegarder le consommateur des imitations.
L
Introduction
28
Les dernières lignes guides de la Politique Agricole Commune (PAC), encouragent
l’agriculture et l’élevage biologiques [2, 3] et définissent une marque et un logo de qualité
spécifiques (mars 2000).
Suite à différents scandales et aux dangers pour la santé des citoyens (notamment
question ESB, plus connue au grand publique sous le nom « vache folle »), le concept de
traçabilité des produits s’impose [4-6] et s’ajoute aux recherches traditionnelles de fraudes
et falsification.
Un des outils analytiques de plus en plus utilisé dans les vingt dernières années, est
l’analyse des rapports entre isotopes stables de bioéléments – 2H/1H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S – contenus dans un produit ou dans un composant de ce même produit.
Depuis environ quinze ans, la Communauté Européenne et d’autres organismes
internationaux ont adopté l’analyse isotopique pour détecter des contrefaçons de produits
tels que vins, jus de fruits et miels [7] et pour contrôler et garantir l’authenticité de ceux-ci.
En fait, la combinaison des mesures du fractionnement isotopique naturel
spécifique par résonance magnétique nucléaire (RMN-FINS, en anglais SNIF-NMR) du
proton, 2H/1H, du rapport 13C/12C par spectrométrie de masse de rapports isotopiques
(SMRI ou, en anglais, IRMS) sur l’éthanol distillé, et du rapport 18O/16O sur l’eau,
permettent de révéler la dilution avec de l’eau et les ajouts frauduleux de sucre dans les
moûts et dans les jus de fruits. De même, les ajouts de sucre dans le miel sont détectables.
Les mêmes techniques peuvent être utilisées pour la détermination de l’origine
géographique d’un produit.
∗∗∗ Mon travail de thèse, conduit dans les laboratoires du BEVABS (Bureau Européen
des Vins, Alcools et Boissons Spiritueuses) de la Commission Européenne à Ispra (Italie),
se situe dans ce cadre, comme contribution aux recherches qui visent à la possible
utilisation des analyses des rapports isotopiques là où l’authenticité, l’origine botanique et
géographique, deviennent un facteur économique et de santé publique.
Bien que la plupart de nos travaux s’inscrive dans des Projets Européens aux buts
bien fixés, une autre part importante est constituée de recherche originale, visant à la
caractérisation et à la détermination isotopique de plusieurs produits agroalimentaires, en
soutien à la politique européenne sur la qualité.
Introduction
29
Les matrices qui font l’objet de nos études sont nombreuses et diverses : le glycérol
dans le vin, pour l’utiliser comme sonde possible de qualité ; l’éthanol dans les boissons
spiritueuses ; l’anhydride carbonique dans les boissons pétillantes, etc..
Les isotopes considérés dans nos travaux, sont le deutérium, le carbone-13, l’azote-
15 et l’oxygène-18. Les techniques – et donc les appareillages – utilisées pour les mesures,
sont multiples : d’abord la Chromatographie Gazeuse - Combustion couplée à la
Spectrométrie de Masse des Rapports Isotopiques (CG-C-SMRI, GC-C-IRMS), pour 13C/12C et 15N/14N dans des molécules cibles.
Un Analyseur Elémentaire couplé à la SMRI (AE-SMRI, en anglais EA-IRMS), a
été utilisé pour les mesures de 13C/12C et 15N/14N sur produits bruts et un appareil RMN
pour les teneurs spécifiques en deutérium dans l’éthanol.
Finalement, une toute nouvelle technique a été testée et mise au point pour
déterminer les rapports 2H/1H et 18O/16O dans l’éthanol : l’Analyseur Elémentaire à
Combustion Totale (TC-EA) couplé à la SMRI.
∗∗∗ English abstract
The studies included in this PhD thesis are a contribution to isotopic
characterisation of different foodstuff matrices and to the setting up of new methods of
isotope ratio mass spectrometry (IRMS) techniques applied to food authentication and to
detection of frauds, in the frame of European Union quality policies.
Hyphenated techniques of gas chromatography, elemental analyser and total
combustion elemental analyser coupled to IRMS (respectively: GC-C-IRMS, EA-IRMS,
TC/EA-IRMS) – and deuterium nuclear magnetic resonance (2H-NMR) in support – were
used to measure ratios 1H/2H, 13C/12C, 15N/14N and 18O/16O of raw food samples or of
target components, such as glycerol from wine, n-butanol from apple flavour, ethanol of
spirits and CO2 from sparkling wine.
Keywords: Food authentication, EU quality policy, traceability, stable isotope ratio, mass
spectrometry, deuterium, hydrogen-2, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-18, δ2H, δ13C, δ15N, δ18O,
IRMS, GC-C-IRMS, TC/EA, EA-IRMS, 2H-NMR, (D/H), glycerol, Botrytis cinerea, sparkling
drinks, carbon dioxide, CO2, wine, beer, cider, effervescent water, soft-drinks, spirits, ethanol,
sugars, cereals, honey, apple aroma, n-butanol
30
Bibliographie 1 Pour les marques de qualité, AOP/IGP/STG : Règlements (CEE) n° 2081/92 et n° 2082/92 du 14 juillet 1992 2 Règlement (CEE) n° 2092/91 du 24 juin 1991 pour l’agriculture et règlement CE n° 1804/1999 relatif au secteur animal. Documents sur la Réforme de la Politique Agricole Commune (PAC) sur le site Internet de la Direction Générale de l’Agriculture (DG-AGRI) : http://europa.eu.int/comm/agriculture/index.htm 3 S. Mann – Why organic food in Germany is a merit good, Food Policy, 2003, 28, 459–469 4 Libro bianco sulla sicurezza alimentare – Bruxelles, 12.1.2000, COM (1999) 719 def. 5 Règlement (CE) n° 178/2002 du Parlement européen et du Conseil du 28 janvier 2002 6 H. Przyrembel – Food labelling legislation in the EU and consumers information, Trends in Food Science & Technology, 2004, 15, 360–365 7 G. Calderone, C. Guillou, N. Naulet – Utilisation réglementaire des analyses isotopiques des aliments - Dix ans d'expérience européenne, L’actualité chimique, 2003, 8-9, 20-22 (voir Annexe A de cette thèse)
Chapitre I
Chapitre I
33
Isotopes stables
1. HISTORIQUE
a démonstration de l’existence des isotopes remonte à 1913, quand J.J.
Thompson [1], en expérimentant sur des tubes remplis de néon, met en évidence
deux des trois isotopes de ce gaz, ayant des masses atomiques de 20 et 22. F.W. Aston [2] en
découvrant le troisième isotope, le 21Ne, confirme les résultats de Thompson six ans après. La
même année (1913), F. Soddy [3] et A. Fleck introduisent le terme isotope, du grec ισος isos,
même, et τοπος topos, lieu. Ce terme décrit bien la propriété des éléments qui, bien que de
masses différentes, se situent au même endroit dans le tableau périodique des éléments de
Mendeleïev, parce qu’ils possèdent la même structure électronique et le même nombre de
protons. Les isotopes sont donc des atomes d’un même élément qui diffèrent par le nombre de
neutrons dans le noyau. Ce que nous appelons la masse atomique d’un élément n’est autre que
la masse moyenne des isotopes mélangés dans les rapports présents dans la nature.
A partir des études d’Aston [4], la recherche sur les isotopes – et les moyens pour les
mesurer – commence. Nos spectromètres de masse sont basés sur les instruments conçus par
Aston et Dempster. En une dizaine d’années, entre 1925 et 1935, les isotopes des éléments
L
Chapitre I
34
légers ont tous été découverts. En 1950, Nier [5] conduit ses études sur le premier spectromètre
de masse dédié aux mesures des rapports isotopiques du carbone, de l’azote et de l’oxygène.
∗∗∗ D’abord, ce sont les géochimistes et les paléo-océanographes qui se sont intéressés à
l’application des isotopes stables. L’étude de molécules simples de la surface du globe, eau et
dioxyde de carbone, a permis de mieux connaître les cycles globaux des éléments, les
systèmes hydrothermaux et les roches. H. Craig introduit la notion, fondamentale, de
référence isotopique [6, 7]. Dans les mêmes années, l’azote devient aussi l’objet d’études [8].
Plus tard, biologistes et botanistes développent de nouvelles théories sur les processus
biochimiques dans la nature sur la base des mesures d’abondance naturelle des isotopes
stables contenus dans la matière organique des plantes. Trois différentes voies
photosynthétiques sont mises en évidence, la C3 (Calvin-Bassham), la C4 (Hatch-Slack) et
celle dite CAM (Crassulacean Acid Metabolism), dont on verra plus loin dans ce chapitre les
effets de fractionnement sur la variabilité naturelle.
1.1. Applications
De nos jours, les analyses isotopiques sont de plus en plus variées et trouvent des
applications dans de nombreux domaines : études de biologie végétale et animale à travers le
carbone [9-19] , l’azote [20-25] ou l’oxygène [26-28] ; géochimie [8, 29-32], archéologie et
anthropologie [31, 33-36] ; pharmacologie [37-39] et sciences forensiques [40-45], y compris les
substances stupéfiantes [46-54]. Les isotopes stables sont aussi de plus en plus utilisés dans les
études environnementales [55-64] et d’écologie animale [40, 65, 66, beaucoup d’autres travaux].
1.1.1. Domaine alimentaire : « food »
Enfin, le sujet qui nous intéresse le plus est l’application des isotopes stables dans le
domaine des produits agro-alimentaires [31, 67], en anglais « food ».
De nombreuses matrices alimentaires sont l’objet d’investigations en terme de contenu
isotopique. La caractérisation par analyse isotopique de composants de différentes origines
biosynthétique ou géographique, a permis de détecter plusieurs types de fraudes alimentaires,
autrement difficilement contrôlables. Elle a, en outre, contribué à typifier des produits
Chapitre I
35
destinés à recevoir des marques de qualité – AOP (Appellation d'Origine Protégée), IGP
(Indication Géographique Protégée) et STG (Spécialité Traditionnelle Garantie).
Les études pionnières sur les boissons fermentées, concernent les vins [68,69], vinaigres [70-72], boissons spiritueuses [73, 74] et bières [75, 76]. Par la suite, des études ont été conduites sur
les jus de fruit [77-80], miels [81-83], huiles [84-86], mais aussi sur les arômes [87-91], extraits de
plantes à infusion [92-95] et sirop d’érable [96]. Diverses références sur les règlements de la CE
et des organismes internationaux qui décrivent les méthodes isotopiques utilisées pour
l’authentification de vins, jus de fruit, miel, sont reportées dans l’Annexe A.
Dernièrement, les méthodes analytiques isotopiques ont trouvé des applications dans
des études de matrices bien plus complexes que les molécules simples, que sont l’éthanol ou
la vanilline. Des produits d’origine animale ont été analysés : lait [97,98], fromages [99-103],
viande [104-106] et poisson [107, 108].
Andreas Rossman a publié, en 2001, une revue de synthèse [109] qui couvre, pour les
vingt-cinq dernières années, les différentes utilisations et les résultats des mesures de teneurs
isotopiques des éléments légers afin de caractériser et d’authentifier une grande variété
d’aliments.
1.2. Rapport isotopique et déviation
Dans la matière organique, les principaux composants élémentaires sont H, C, N et O.
Ils se présentent sous forme d’isotopes stables – H, D (2H) ; 12C, 13C ; 14N, 15N ; 16O, 17O, 18O
– mais aussi instables – T (3H), 14C –. Pour ces éléments, dans la nature, c’est la forme légère
qui prédomine.
Les pourcentages des éléments les plus concernés dans le domaine alimentaire sont
reportés dans le Tableau 1. Le soufre et le strontium, bien qu’ils ne soient pas pris en
considération dans les travaux de cette thèse, peuvent offrir des informations importantes sur
l’origine d’un produit. Le strontium, qui ne fait pas partie des éléments dits légers, est de plus
en plus utilisé pour vérifier l’origine géographique [110-112] de produits de l’agriculture.
Les différences de proportion entre l’isotope lourd et le plus abondant, le léger, sont
toujours faibles, ainsi le 13C est toujours présent à environ 1.1 % du carbone total. En 1950
McKinney introduit [113] une notation spéciale, qui permet de manipuler plus facilement les
rapports isotopiques.
Chapitre I
36
Il est introduit le δ13C (delta), qui exprime en ‰, pour mille, la déviation du rapport 13C/12C d’un échantillon par rapport à celui d’un standard international pris comme référence :
Equation 1 échantillon13
standard
Rδ C = -1 1000R
⎛ ⎞⎜ ⎟⎝ ⎠
i où 13
12
CR=C
Ainsi, au lieu de dire que le rapport 13C/12C est de 0.011158 pour le CO2
atmosphérique et de 0.011237 pour le PDB (la référence internationale) ou, ce qui serait la
même chose, que l’écart entre les deux est de 80 atomes de 13C par million d’atomes de
carbone, on calcule que le δ13C du CO2 atmosphérique par rapport au PDB est de -7 ‰.
1.3. Facteurs de variabilité
La variabilité naturelle des abondances isotopiques dans les molécules organiques est
due aux diverses propriétés physico-chimiques de l’isotope léger par rapport à l’isotope lourd
d’un élément.
Les effets isotopiques deviennent visibles dès lors qu’ils produisent un fractionnement,
c'est-à-dire un enrichissement ou un appauvrissement d’un isotope par rapport à l’autre. Ils
sont de plusieurs natures et origines : de ceux à plus simple rationalisation, classés comme
physiques et chimiques, à ceux moins prévisibles, présents surtout dans les réactions
biologiques.
1.3.1. Effets isotopiques physiques
Les grandeurs physiques liées à la masse sont, bien sûr, affectées par la différence de
masse entre les isotopes. Un isotope léger d’un élément se déplace plus rapidement que
l’isotope lourd. Selon la loi de Graham pour les gaz, la vitesse d’expansion d’un gaz est
inversement proportionnelle à la racine carrée de sa masse. Par exemple, dans le cas de
l’hydrogène cette différence est très marquée, puisque le deutérium a une masse double de
celle de l’hydrogène de masse 1. A cause de cela, la différence de vitesse sera plus grande
entre les molécules de H2, « légères », qu’avec celles contenant du deutérium, et un
fractionnement isotopique sera observé.
Chapitre I
37
Tableau 1: Abondance naturelle moyenne, référence internationale utilisée et autres données
des principaux isotopes stables des éléments les plus utilisés dans l’authenticité des aliments (pourcentages et rapports d’après les références [114], [109] et [115])
Elément Isotope Abondance relative (%)
Référence internationale et
Rapport isotopique (R) Molécule
1H 99.9855 Hydrogène
2H (D) 0.0145
V-SMOW (Vienna-Standard Mean Ocean
Water) 2H/1H = 1.5576 · 10-4
H2O
12C 98.892 Carbone
13C 1.108
V-PDB (*) (Vienna-Pee Dee Belemnite) 13C/12C = 1.1237 · 10-2
CaCO3
14N 99.6337 Azote
15N 0.3663
AIR(Azote atmosphérique) 15N/14N = 3.6765 · 10-3
N2
16O 99.7586 17O 0.0375 Oxygène 18O 0.2039
V-SMOW (Vienna-Standard Mean Ocean
Water) ou V-PDB 18O/16O = 2.0052 · 10-3 - 2.0672 · 10-3
H2O ou
CaCO3
32S 95.015 33S 0.750 34S 4.215
Soufre
36S 0.02
V-CDT (#) (Vienna-Cañon Diablo Troilite) 34S/32S = 4.41509 · 10-2
Ag2S
84Sr 0.56 86Sr 9.86 87Sr 7.02
Strontium
88Sr 82.56
NIST SRM 987 (National Institute of
Standards and Technology) 87Sr/86Sr = 0.710340 (§)
SrCO3
(*) Le PDB n’est plus disponible et d’autres matériaux de référence internationaux sont utilisés. Cesstandards sont distribués par l’IAEA, International Atomic and Energy Agency ou le NIST.
(#) Le CDT originel était le FeS obtenu d’un météorite de fer. Ce standard primaire a été substitué par leV-CDT, Ag2S, à cause de son homogénéité insuffisante.
(§) Pour le strontium, le rapport absolu est utilisé plus souvent que la notation δ87Sr rapporté à uncertain standard.
Chapitre I
38
Les fractionnements isotopiques d’origine physique se rencontrent couramment lors
d’étapes de séparation ou de purification. La centrifugation, technique de séparation qui
fonctionne grâce à la différence de masse des composants en suspension, est le phénomène
fractionnant le plus souvent rencontré. Elle est, en fait, utilisée dans l’industrie afin d’enrichir
ou appauvrir isotopiquement un composé.
Un autre phénomène qui induit un fractionnement isotopique est la diffusion. Elle tend
à égaliser des concentrations dans un milieu liquide, des pressions dans un gaz, ou encore
intervient lors du passage à travers une membrane.
Bien sûr, les effets isotopiques peuvent jouer sur la volatilité d’un produit [116].
1.3.2. Effets isotopiques chimiques Au cours d’une réaction quelconque, chimique, biochimique ou dans les changements
d’état, les différences de masse peuvent avoir une influence sur la vitesse de réaction (effet
cinétique) ou sur l’état énergétique du système (effet thermodynamique) [117].
Effets isotopiques cinétiques
On parle d’effets isotopiques cinétiques lorsque le fractionnement d’un élément est dû
à l’influence des différences de masse atomique des isotopes sur la vitesse d’une réaction.
Cela peut être dû à deux causes : la première parce que les molécules contenant les isotopes
plus légers sont plus mobiles que celles contenant les isotopes lourds.
Le deuxième facteur est dû aux liaisons chimiques qui sont plus fortes avec les atomes
lourds qu’avec les atomes légers correspondants. Ainsi, par exemple, la probabilité de rupture
de liaison est plus grande pour l’isotope 14N que pour le même composé contenant 15N. Donc,
si au cours d’une réaction chimique, il y a une étape de rupture d’une liaison X-N, très
probablement le produit final sera appauvri en 15N par rapport au produit de départ.
Mathématiquement, cela se démontre par la relation qui combine ces deux facteurs,
masse et force de liaison (en forme d’énergie d’activation), avec les constantes de réaction,
dans l’Equation 2, où k est la constante de vitesse de la réaction, µ est la masse réduite, E est
l’énergie d’activation et l’astérisque se réfère à l’espèce la plus lourde. T est la température
absolue et R la constante des gaz parfaits.
Chapitre I
39
Equation 2 ( )
RTEE
ekk
∗−−∗
∗ =µµ
D’après cette équation, l’effet cinétique dépend de la différence d’énergie d’activation
entre les deux espèces isotopiques et n’est pas affecté par le type particulier de cinétique. Le
rapport des constantes cinétiques, dans la plupart des cas, est supérieur à l’unité (µ* > µ et
E* > E) et donc les produits de réaction seront enrichis en isotope léger (k > k*).
En outre, on parlera d’effet isotopique cinétique primaire ou secondaire, selon que
l’effet de l’isotope affecte directement la vitesse de réaction à cause de la rupture d’une de ses
liaisons ou si l’influence sur la vitesse ne s’exprime pas directement avec une modification de
ses liaisons.
Effets isotopiques thermodynamiques
L’effet isotopique thermodynamique est lié à la différence d’énergie libre entre
espèces à composition isotopique différente : les espèces plus lourdes possèdent une énergie
libre inférieure, et cela rend le système plus stable. Ainsi, la constante d’équilibre pour les
espèces les plus lourdes est plus faible, ce qui explique leur plus grande inertie à réagir et
donc leur tendance à se concentrer dans les phases condensées.
La règle générale pour prévoir l’effet thermodynamique et ses conséquences sur le
fractionnement isotopique est que l’isotope lourd se retrouve préférentiellement dans le
composé chimique dans lequel il est le plus fortement lié. Un exemple, l’accumulation de
l’isotope 13C dans l’ion bicarbonate [116] :
13 12 - 12 13 -2(g) 3(aq) 2(g) 3(aq)CO +H CO CO +H CO⎯⎯→←⎯ K=1.0092 (0 °C)
A 0 °C, donc, l’équilibre est en faveur de l’échange du 12C de l’ion bicarbonate avec le 13C du CO2 en phase gazeuse.
Chapitre I
40
Parallèlement, un autre équilibre se produit entre le CO2 et l’eau [118] à température
ambiante :
18 18 16 162(g) 2 (l) (g) 2 (l)CO +H O C O O +H O⎯⎯→←⎯ K=1.041 (25 °C)
Dans ce cas, la réaction d’échange conduit l’18O des molécules d’eau à s’accumuler
dans le CO2, notamment celui de l’atmosphère. Cette réaction d’échange est mise à profit
pour mesurer la teneur en 18O de l’eau à partir du CO2 avec lequel elle a été préalablement
équilibrée.
Le même type d’équilibre et d’effet thermodynamique explique le fractionnement
isotopique entre eaux marines, eaux de surface et nuages, qui se forment par évaporation de
ces eaux. Ainsi, à 25 °C, la vapeur en équilibre avec le liquide est appauvrie en deutérium
d’environ un facteur 0.96 [119]. On verra plus loin ce type de mécanisme, à propos du
fractionnement de l’oxygène et du deutérium dans la nature.
Le même effet isotopique de nature thermodynamique, analogue à celui des mers et
des nuages, est retrouvé : lors des distillations, la composition isotopique des différentes
fractions recueillies varie au fur et à mesure de l’avancement.
1.3.3. Autres effets isotopiques
Les effets isotopiques cinétiques et thermodynamiques rendent compte des
fractionnements produits au cours de chaque réaction, chimique ou biochimique, des
processus de diffusion, adsorption, évaporation et en général, d’un quelconque changement
d’état. Par contre, d’autres situations de fractionnement peuvent être provoquées par des
phénomènes qui altèrent l’équilibre d’une réaction, tels que le changement instantané de la
température ou le déplacement d’un réactif ou d’un produit de réaction. Ce type de
fractionnement de « non équilibre » n’est pas prévisible selon des règles prédéterminées.
Les réactions enzymatiques, processus irréversibles, provoquent des fractionnements
de ce type, souvent de grande importance. Ce sont, en fait, les réactions enzymatiques qui ont
lieu dans la nature qui nous intéressent le plus et que nous exploitons grâce à la variabilité
qu’elles induisent en terme de fractionnement de produits biochimiques. Dans le Tableau 2
quelques exemples de ces réactions sont reportés.
Chapitre I
41
Tableau 2: Fractionnement dans certaines réactions enzymatiques [120]
Réactions Degré de fractionnement (‰)
Photosynthèse 2 2 2 6 12 66 CO +6 H O 6 O +C H O 2
13 13sucres COδ C - δ C -17 /-5
Réduction du sulfate - +2 4 2 2H SO +8 e +8 H H S+4 H O
4 2
34 34SO H Sδ S - δ S +20/30
Méthanogènes - +4 2 2CH +2 H O CO +8 e +8 H
4 2
13 13CH COδ C - δ C -80
2. CARBONE : INDICES SUR L’ORIGINE BOTANIQUE
La nature nous offre une grande gamme de valeurs δ13C, et donc du fractionnement
isotopique auquel le carbone est soumis. La Figure 1 indique comment le carbone est
concerné par le fractionnement isotopique pendant son cycle. La Figure 2 montre la
distribution de valeurs δ13C de plusieurs composés et standards de référence.
Figure 1 : Variabilité isotopique du 13C dans plusieurs formes du carbone en relation à son
cycle dans l’environnement [117]
δ13C (‰)
Chapitre I
42
Les deux processus fondamentaux du cycle du carbone qui provoquent un
fractionnement isotopique, sont l’assimilation du carbone par les organismes vivants et les
changements entre l’atmosphère et l’hydrosphère. Tandis que le premier phénomène
Figure 2 : Diagramme [121] de composés et standards de référence contenant du carbone et
leur distribution au long de l’échelle δ13C
Chapitre I
43
provoque un appauvrissement en 13C (dit effet isotopique biologique), l’autre produit un
enrichissement en 13C.
Un troisième processus, qui se produit à plus petite échelle mais qui nous intéresse
beaucoup, est le fractionnement lié aux métabolismes des végétaux et des animaux.
Le premier processus, le plus important, est l’assimilation du carbone de l’anhydride
carbonique par les plantes lors de la photosynthèse. Le 13C du CO2 fractionne principalement
lors de sa transformation à sucres :
Lors de la photosynthèse, la formation des liaisons C–C est favorisée si les atomes de
C sont plus légers et plus mobiles. Ainsi, on trouvera que les produits organiques, dérivés des
plantes (cellulose, sucres, métabolites secondaires) sont moins riches en 13C et ils auront des
valeurs de δ13C plus faibles que celle du CO2 atmosphérique, notamment
δ13C plantes < -7 ‰ (vs PDB) (-7 ‰ est la valeur δ13C du CO2 atmosphérique).
Trois cycles photosynthétiques principaux ont été identifiés et caractérisés, sur la base
de leurs différentes manières d’assimiler le CO2. Ces trois groupes de plantes se caractérisent
par des δ13C bien différents.
Ces trois groupes (C3, C4 et CAM) se distinguent par des différences de conformation
des tissus foliaires (voir Figure 3), qui influencent la concentration du CO2 entrant. Ces voies
photosynthétiques différentes sont représentées de manière simplifiée dans les schémas de
Figure 4 a et b.
La principale voie d’assimilation est celle qui a lieu dans la plupart des plantes, décrite
par Calvin et Bassham [122], elle est aussi dite C3, parce que l’anhydride carbonique est fixé
d’abord pour donner un composé intermédiaire à trois atomes de carbone.
Le CO2 atmosphérique, une fois entré dans le cytoplasme, se combine au ribulose-
1,5diphosphate (RuBP), sous l’action de la ribulose-1,5diphosphatecarboxylase (ou Rubisco)
à la lumière, et donne deux molécules d’acide phosphoglycérique (premier produit stable
synthétisé). C’est ce composé à trois atomes de carbone qui a donné son nom au mécanisme
C3.
2 2 2 6 12 66 CO +6 H O 6 O +C H O 2
13 13sucres COδ C - δ C -17 /-5 ‰
Chapitre I
44
Le cycle C3 est typique des espèces originaires des zones froides ou tempérées, des
exemples sont reportés dans le Tableau 3. Les composés des plantes C3 montrent une gamme
de variation de δ13C à peu près comprise entre -22 et -32 ‰.
Un deuxième mécanisme de fixation du CO2 est celui dit «cycle de Hatch et Slack»,
qui l’ont étudié [124], ou C4 en analogie avec le cycle C3 : dans ce cas les premiers composés
intermédiaires synthétisés à partir du CO2 sont à quatre atomes de carbone. La fixation initiale
du CO2, sous l’action de la phosphoénolpyruvate (PEP) carboxylase, conduit à l’acide
oxaloacétique qui est immédiatement converti en acides malique et aspartique. Ces acides (à
quatre atomes de carbone) sont ensuite décarboxylés et le CO2, d’abord stocké dans les parois
cellulaires, est libéré et puis repris par la RuBP pour suivre le cycle de Calvin.
Figure 3 : Différentes physiologies des tissus foliaires
Les différences dans la
physiologie des tissus foliaires et
donc pour l’assimilation de la
CO2 atmosphérique, expliquent
la variation entre les valeurs des
rapports isotopiques des
métabolites des plantes C3, C4 et
CAM. (Image re-élaborée d’après [123])
Tableau 3 : Exemples des plantes les plus communes des trois groupes décrits. Plus de 95%
des plantes appartiennent au groupe des plantes C3 ; moins d’1% sont des plantes C4
plantes C3 plantes C4 plantes CAM
Betterave, blé, cacahouètes, noix de coco, orge, palm, pommes de terre, prune, raisin, riz, seigle, soja
haricots, tournesol
Canne, maïs, millet, sorgho
Agaves, ananas, cactus,
vanille
Chapitre I
45
Figure 4 a et b : Schéma simplifié des cycles photosynthétiques C3 (haut) et C4
Cycle C3
Acide oxaloacétique (4C)
Phosphoénol
pyruvate carboxylase
Acide
pyruvique
Acide
phosphoénolpyruvique
Acides malique et aspartique
(4C)
Triose phosphate
(3C)
Acide 3-phosphoglycérique
(3C)
Ribulose–5
phosphate
Ribulose-1,5diphosp
hate (5C)
Transformations successives des
sucres phosphates
(2C, 3C, 4C, 5C, 6C, 7C)
Amidon, sucres (δ13C ~ -33/-22 ‰)
Hexose phosphate (6C)
ATP
H2O, CO2 (δ13C ~ -7 ‰)
ATP, NADPHStomate dans la feuille
CO2 atm.
Amidon, sucres (δ13C ~ -15/-10 ‰)
ATP
CO2 (δ13C ~ -7 ‰)
CO2, H2O
Stomate dans la feuille
CO2 atm.
Chapitre I
46
Le cycle C4 est surtout celui des plantes d’origine tropicale. Bien qu’elles soient en
minorité (Tableau 3), elles sont parmi les espèces les plus intensivement cultivées par
l’homme. Les plantes C4 montrent des valeurs de δ13C comprises entre -9 et -16 ‰, elles sont
donc bien plus riches en 13C que les plantes C3.
Finalement, le troisième groupe de plantes est celui dit CAM (Crassulacean Acid
Metabolism), dont le cycle a été mis en évidence par Whelan, Sackett et Benedict [125, 126]. Ces
plantes possèdent les deux mêmes enzymes que les plantes des groupes C3 et C4, mais elles
alternent ces mécanismes pendant le jour et la nuit. Le CO2 est initialement fixé par la PEP
carboxylase en acides C4, pendant la nuit. Le jour, le CO2 libéré se fixera au RuBP, selon le
cycle C3. Il existe des espèces CAM facultatives et d’autres obligées, c'est-à-dire qui peuvent
ou non passer d’un mécanisme à l’autre quand les conditions deviennent favorables.
Les plantes les plus connues appartenant au groupe des CAM, comme les cactus, les
agaves, sont originaires de lieux désertiques. D’autres plantes typiques sont l’ananas
(broméliacée) et l’orchidée de la vanilline (Vanilla planifolia). Comme on peut s’y attendre,
l’intervalle de valeurs de δ13C est plus étendu et se superpose à celui des plantes C3 et C4
(voir en Figure 5), allant de -30 à -10 ‰.
Il faut ajouter que la composition isotopique du CO2 atmosphérique, à laquelle on
attribue une valeur moyenne de -7 ‰, peut sensiblement changer d’une zone à l’autre. Par
exemple, dans les forêts denses, la valeur de δ13C peut descendre à -11 ‰ à cause de la
contribution de l’anhydride carbonique produit par décomposition de la matière organique.
Dans les endroits très habités, la valeur peut diminuer encore, de 2 à 8 ‰, parce que le CO2
technogénique, provenant de la combustion des combustibles fossiles (pétrole, charbon) est
plus pauvre en 13C, et sa contribution abaisse donc la valeur totale de δ13C du CO2 des villes
et centres industriels et donc influence la composition isotopique des plantes dans les environs [127,128]. La valeur moyenne de δ13C du CO2 atmosphérique montre aussi des variations [129] au
cours des années.
Les autres facteurs qui influencent la composition isotopique des plantes peuvent être
la disponibilité en eau, l’humidité relative, la température, dans la mesure où ils peuvent agir
sur l’ouverture des stomates. Une faible disponibilité en eau provoque, chez les plantes C3,
une fermeture des stomates, sous le stress hydrique, et cela conduit à un enrichissement
isotopique. Ce même effet pour les plantes C4 est de signe opposé.
Chapitre I
47
3. L’AZOTE ET SA VARIABILITE DANS LA NATURE Le réservoir naturel de N2 est l’azote moléculaire de l’air, qui en contient presque
80%. Environ 0.4 % de cet N2 est composé de l’isotope 15N. L’azote est transformé dans ses
nombreuses formes et états d’oxydation surtout par des processus physiques et par l’action de
microorganismes qui métabolisent les composés azotés en azote inorganique (nitrate et
ammoniaque) et azote organique (aminoacides et protéines).
Le composé standard de référence est l’azote moléculaire de l’air. Donc, presque tout
l’azote accessible à la surface de la planète a la valeur δ15N = 0 ‰. La variabilité naturelle se
situe donc autour de cette valeur, comme le montre la Figure 6.
Figure 5 : Modèle du fractionnement du 13C des plantes et chez les mammifères herbivores
qui s’en nourrissent (d’après une figure dans [130])
CAM
δ 13C (‰)
13C/12C
C3 C4
Chapitre I
48
Figure 6 : Diagramme [121] de composés et standards de référence contenant de l’azote et leur
distribution dans l’échelle δ15N
Le Tableau 4 récapitule les différents processus qui donnent lieu au fractionnement de
l’azote dans la nature. Une première différentiation parmi les δ15N des plantes est produite par
le fait qu’elles fixent ou non de l’azote atmosphérique. Comme le montre la Figure 7, tandis
que les légumineuses ont des valeurs très proches de zéro, les espèces souterraines (pommes
Chapitre I
49
de terre, carottes) montrent des valeurs plus élevées, car leur source d’azote provient du sol,
donc de formes azotées déjà fractionnées, telles les nitrates.
La même figure donne une idée du fractionnement de l’azote présent dans la chaîne
trophique, plus on monte dans cette chaîne, plus fort est l’enrichissement en 15N (+3 ‰ à
chaque étape [131, 22]). L’isotope le plus léger étant le plus facile à éliminer, l’15N s’accumule
dans les tissus. Ainsi, les animaux carnivores ont des valeurs de δ15N plus élevées que celles
des herbivores, dont ils se nourrissent. Ce genre de mécanisme, pourrait donner des indices
sur le régime alimentaire d’un animal, pour dépister, par exemple, si un bœuf a été élevé à
l’aide de farines d’origine animale ou plutôt avec un régime végétal, ou encore si un poisson
est sauvage ou d’élevage.
Le fractionnement isotopique de l’azote dépend aussi d’autres facteurs tels que la
profondeur et la pente du sol, ses perméabilité et salinité. En outre, la dégradation des
biomasses organiques apporte un fort enrichissement en 15N (de +10 à +30 ‰).
Figure 7 : Modèle du fractionnement de l’azote entre les plantes et les animaux (d’après une
figure dans [130])
15N/14N
N2-fixateurs Non N2-fixateurs
δ 15N (‰)
Chapitre I
50
Tableau 4: Processus à l’origine du fractionnement isotopique de l’azote (d’après une table
synoptique de [132])
Processus Description Degré de fractionnement
Fixation
Des réactions qui transforment l’azote
moléculaire de l’air en autres formes azotées :
o l’activité bactérienne, par exemple de
l’enzyme nitrogénase chez les plantes
légumineuses;
o processus physiques qui produisent des
températures élevées (décharges électriques,
incendies)
o activités humaines (production d’énergie,
d’engrais chimiques, agriculture)
–3/+1 ‰
(pour plantes légumineuses) [133]
Assimilation
Processus d’incorporation des composés azotés
(NOx, NH3) par les microorganismes ou les
plantes. D’abord les oxydes d’azote sont réduits
en ammonium et ensuite incorporés dans le
matériel organique.
L’assimilation favorise l’incorpo-
ration de 14N par rapport à 15N,
avec un fractionnement moyen de
–0.5 ‰
Ce fractionnement est néglige-
able dans les plantes.
Dissimilation Réactions métaboliques qui exploitent l’azote
assimilé
Minéralisation Réactions de transformation de l’azote organique
du sol en ammonium. ±1 ‰
Nitrification Processus d’oxydation à plusieurs étapes qui
produit du nitrate à partir d’ammonium. -12/-29 ‰
Volatilisation Réaction de volatilisation de l’ammonium sous
forme de gaz du sol à l’atmosphère (plus
marquée dans les sols alcalins)
+20 ‰
Dénitrification Réaction de réduction des nitrates en N2. Enrichissement en 15N
Chapitre I
51
Le facteur principal de fractionnement dans l’agriculture est la pratique de la
fertilisation. En fait, les engrais artificiels sont fabriqués à partir de l’N2 de l’air, par le
procédé Haber de production d’ammoniaque, mais aussi d’urée, de nitrate d’ammonium et de
nitrate de potassium. Ces produits de synthèse possèdent des teneurs en 15N très faibles, entre
-0.2 et +2 ‰, d’après des mesures réalisées dans notre laboratoire sur plusieurs fertilisants du
commerce, alors que les engrais d’origine animale (fumiers) ont des valeurs de δ15N
supérieures à +5/+8 ‰.
Les valeurs de δ15N des plantes sont généralement corrélées aux valeurs des nitrates et
de l’ammonium présents dans le sol de culture, en tenant compte de la somme des
phénomènes de fractionnement vus précédemment, y compris le fractionnement lié aux
processus d’assimilation de l’azote des composés organiques [134] pendant le métabolisme
végétal.
4. DEUTERIUM ET OXYGENE : ORIGINE GEOGRAPHIQUE Les eaux, marines et météoriques, constituent le seul réservoir d’hydrogène et une
partie de celui d’oxygène sur la planète, ainsi ces deux éléments ont un destin commun et ce
sont les mêmes processus qui fractionnent leurs isotopes lourds stables, respectivement le
deutérium et l’oxygène-18.
Le fractionnement cinétique de ces isotopes lourds, 2H ou D et 18O, est exactement
similaire à celui du carbone, c'est-à-dire que l’on observe un fractionnement dû à la plus
grande vitesse de diffusion des molécules légères.
La cause majeure de fractionnement de l’eau, et de ses isotopes, est le changement
d’état physique, entre les phases liquide et vapeur, par évaporation et condensation. De
manière très simple : les isotopes plus lourds sont extraits plus difficilement, de la phase
liquide jusqu’à la phase gazeuse et, de plus, ils se condensent plus facilement. En outre, les
équilibres de phase sont influencés par la température.
Ainsi, la variabilité des valeurs δ18O et δ2H (ou δD) des eaux météoriques est liée aux
cycles d’évaporation des océans et des condensations successives qui engendrent les
précipitations. La composition isotopique de l’eau océanique (de -1 à 0.7 ‰ [120]) est proche
de celle du standard de référence V-SMOW, pour lequel les valeurs δ2H et δ18O sont nulles
(voir Tableau 1).
Chapitre I
52
Figure 8 : Carte des valeurs moyennes de δ18O des précipitations des années 1992/93 [135]
Chapitre I
53
La Figure 8 représente la distribution, au niveau mondial, des valeurs moyennes de
δ18O des précipitations, pour les années 1992/93. Cette illustration montre une caractéristique
très importante : l’abondance isotopique de l’oxygène-18 (et du deutérium) dans les eaux est
corrélée à la situation géographique.
Provoqué par l’influence de la température, on peut constater un effet latitude sur le
fractionnement : plus on s’approche de pôles, plus les eaux météoriques sont pauvres en 18O
et 2H (valeurs de δ ‰ plus négatives : δ18O -50 ‰ et δ2H -495 ‰ en Antarctique). Bien sûr, il
y a des exceptions, des déviations, dues aux courants océaniques chauds, par exemple le long
de la côte orientale de l’Amérique du Sud à celle de l’Océan Atlantique, allant du Mexique à
la Scandinavie.
La Figure 9 montre l’effet direct de la température sur la variabilité des valeurs de
δ18O dans les masses d’eau évaporées des mers.
Figure 9 : Effet de la température sur le fractionnement de l’oxygène dans une masse de
vapeur d’eau [120]
Chapitre I
54
Les déviations à l’effet latitude, sont provoquées par l’effet continental, comme le
montre la Figure 10 dans le cas du fractionnement de l’hydrogène des précipitations. Cet
effet intéresse les masses d’eau qui, en se déplaçant de la surface de la mer vers le continent,
subissent les effets topographiques et les caractéristiques spécifiques du climat.
Il en résulte que les précipitations, tout au long des côtes, sont enrichies en isotopes
lourds par rapport aux régions continentales, plus froides (appauvrissement moyen en 18O
d’environ -2.8 ‰ tous les 1000 km de distance aux côtes [136]).
Figure 10 : Schématisation du fractionnement de l’hydrogène des eaux météoriques (adaptation sur d’un original fourni gracieusement par Thermo-Italia)
Une autre contribution géographique au fractionnement, est l’effet de l’altitude : une
fois à l’intérieur du continent, les masses d’eau s’appauvrissent encore, en δ18O de -0.15 à
-0.5 ‰ pour chaque augmentation de 100 m d’altitude.
La variation de valeurs de δ2H et δ18O provoquée par l’alternance des saisons n’est pas
non plus négligeable. Pendant la période estivale, l’augmentation de température conduit à un
enrichissement en isotopes lourds, surtout sur les continents.
Les eaux des nappes phréatiques ont une composition isotopique comparable à celle de
la moyenne annuelle des précipitations, elles dépendent donc des facteurs géographiques
(latitude, altitude, distance des océans ou continentalité), mais pas des facteurs saisonniers.
OCEAN CONTINENT
-94 ‰ Vapeur
-110 ‰ Vapeur
-126 ‰ Vapeur
-14 ‰ Pluie
-30 ‰ Pluie
δ2H = 0
Chapitre I
55
∗∗∗ Dans les végétaux, contrairement au carbone, la composition isotopique en 2H et 18O
de l’eau végétale n’est pas strictement liée à l’origine botanique. Pour le fractionnement chez
les plantes et leurs métabolites, il faut tenir compte des types de fractionnement vus
précédemment, surtout dans le cas de l’hydrogène dont l’eau est la seule source pour la
photosynthèse.
Apparemment la discrimination provoquée par les enzymes du métabolisme des
plantes peut être négligée [137] et ce n’est que dans les feuilles que se produit un
fractionnement isotopique, causé par l’évapotranspiration. Cet effet est encore une fois
influencé par la température et l’humidité relative.
Ainsi, une plante « aérienne » comme la vigne présente une plus forte
évapotranspiration que la betterave à sucre, qui est une plante souterraine. Ceci se traduit par
un plus fort enrichissement en deutérium dans les sucres photosynthétisés par la vigne que
dans ceux issus de la betterave. Ceci est mis à profit par la méthode RMN-FINS qui mesure
l’enrichissement site par site de l’alcool de fermentation.
Les plantes utilisent les eaux de surface venant des précipitations, de rivières ou des
infiltrations dans le sol. En conséquence, on peut s’attendre à ce que les δ2H et δ18O de l’eau
du végétal soient une empreinte de l’origine géographique d’un produit agricole. Des
variations d’une année à l’autre, fonction de la pluviométrie et du climat sont prévisibles. Cela
reste valide s’il n’y a pas ajout d’eau d’autre origine ou élimination d’eau pendant le
processus de production, comme dans les jus de fruit, ou le fromage par exemple.
Il est bon de préciser que dans le cas de l’oxygène, les plantes utilisent aussi comme
source le CO2 et l’O2 de l’air. Comme ces deux sources ont des valeurs δ18O presque
constantes au niveau planétaire – de +40.3 à +42.5 ‰ [138], selon la latitude et l’altitude, pour
CO2 et de +23.5 à +23.8 ‰ [139, 140] pour O2 – la teneur en 18O de l’eau dans les plantes n’est,
en première approximation, influencée que par celle des eaux absorbées.
Par contre, l’incorporation d’oxygène dans les composés organiques lors des différents
processus métaboliques est accompagnée d’un fort fractionnement isotopique. Par exemple, le
δ18O de la cellulose est très bien corrélé avec celui de l’eau foliaire mais avec un
enrichissement d’environ +27 ‰, à cause des fractionnements isotopiques qui se produisent
lors du passage de l’oxygène aux groupes carboxyliques [26].
Chapitre I
56
Le diagramme de la Figure 11 montre la variabilité des valeurs de δ2H de composés et
de standards de référence hydrogénés. On peut remarquer que la plupart des composés
possèdent des valeurs négatives sur l’échelle V-SMOW.
La Figure 12 montre la distribution des valeurs de δ18O de plusieurs types de
composés et produits standards, par rapport aux deux échelles, V-SMOW et V-PDB.
Figure 11 : Diagramme [121] de composés et standards de référence contenant de l’hydrogène
et leur distribution dans l’échelle δ2H
Chapitre I
57
Figure 12 : Diagramme [121] de composés et standards de référence contenant de l’oxygène et
leur distribution dans l’échelle δ18O
58
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68
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Chapitre II
Chapitre II
71
Techniques et méthodes
1. INTRODUCTION
es mesures des rapports isotopiques ont été réalisées sur différents appareils et
avec des protocoles variables, elles vont être décrites globalement dans ce
chapitre. Les aspects plus spécifiques à chacune d’elles seront abordés dans les chapitres
suivants, au fur et à mesure des besoins.
1.1. Les différentes techniques de spectrométrie de masse isotopique
Il existe plusieurs techniques pour mesurer les propriétés isotopiques de la matière,
mais toutes mesurent le rapport masse/charge, ou m/z, des ions, lesquels peuvent être produits
de différentes manières : par impact électronique ou ionisation chimique, par action ionisante
d’un plasma couplé inductivement (torche ICP), ou encore par effet de laser ou d’autres
modes d’ionisation.
Les ions produits doivent être accélérés et déviés opportunément pour qu’ils se
séparent sur la base de leur rapport m/z et soient détectés. La séparation des trajectoires est
réalisée par action d’un champ électrique ou magnétique, ou les deux combinés. Les ions
L
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72
peuvent aussitôt être différenciés grâce à des quadrupôles, ou encore par résonance
cyclotronique ou par d’autres dispositifs analyseurs.
Après séparation les ions doivent être détectés. Dans ce but, on utilise des détecteurs
qui vont transformer en signal mesurable la quantité d’ions qui les atteignent. Il existe des
détecteurs à plaques photographiques, d’autres à multiplicateurs d’électrons ou de photons, ou
bien encore des cylindres ou cages de Faraday.
Le choix d’une technique ou d’une autre, aussi bien que de l’utilisation d’un appareil,
dépend des particuliers isotopes concernant nos études. Même si ne l’on considère que le
rapport isotopique, les techniques de mesure des rapports entre les isotopes du strontium ou
ceux du bore sont bien différentes que celles pour les mesures de l’oxygène ou du carbone.
Dans le domaine alimentaire, la technique la plus utilisée est la SMRI – Spectrométrie
de Masse de Rapports Isotopiques, en anglais IRMS, Isotopic Ratio Mass Spectrometry –
c’est celle que nous avons presque exclusivement utilisée en plus de la Résonance
Magnétique Nucléaire (RMN, en anglais NMR, Nuclear Magnetic Resonance).
2. ASPECTS GENERAUX DE LA SMRI La SMRI est la technique que nous avons principalement utilisée pour mesurer les
rapports de 2H/1H, 13C/12C, 15N/14N et 18O/16O. Les mesures spécifiques du deutérium dans
l’éthanol ont été réalisées en utilisant la RMN-FINS du deutérium.
Pour mesurer la teneur isotopique d’éléments de composants d’une matrice liquide,
solide ou gazeuse, il est nécessaire d’obtenir un gaz simple, compatible avec le dispositif
analyseur et le détecteur.
Le Tableau 1 résume sur quel type de matrice on peut réaliser des analyses de teneur
isotopique et quelles sont les réactions ou les manipulations nécessaires pour obtenir ce gaz
simple.
Ce tableau est une schématisation classique des réactions qui sont à la base des
méthodes SMRI et elles seront détaillées dans le paragraphe 1.1.
Dans la partie dédiée à la technique TC-EA seront décrites les innovations et les
importantes simplifications pour le travail de laboratoire, en particulier pour les mesures des
valeurs de δ2H et δ18O.
Chapitre II
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Tableau 1 : Réactions mises en jeu et gaz obtenus pour utilisation en SMRI
SMRI : gaz « compatibles » pour les mesures
Matrice Réaction Gaz Rapports
isotopiques
Rapport des
masses mesurées
Eau/Organique réduction/pyrolyse H2 2H/1H ou D/H 3/2
Organique combustion 13C/12C 45/44
Eau équilibration CO2
18O/16O 46/44
Organique combustion + réduction N2 15N/14N 29/28
Organique/Eau Pyrolyse CO 18O/16O 30/28
Organique combustion
de BaSO4 (*) SO2 34S/32S 66/64
(*) Le sulfate de baryum est obtenu par oxydation du soufre contenu dans la matrice et donc précipité. Une autre méthode utilise le dérivé SF6, gaz qui permet des mesures plus précises (le fluor ne possède qu’un isotope) mais qui pose de gros problèmes de sécurité pendant sa manipulation. On peut aussi maintenant utiliser une combustion en ligne avec des réactifs spécifiques qui évitent la formation de SO3.
2.1. Quelques définitions
Les gaz simples utilisés pour les mesures peuvent être préparés à l’aide de lignes de
préparation dédiées dans lesquelles sont réalisées les réactions et la purification du gaz
concerné. Il s’agit du mode hors ligne (off-line) : le gaz pur ainsi obtenu est introduit dans le
spectromètre au travers d’un module d’introduction double (dual inlet) qui permet aussi
d’utiliser un gaz de référence de teneur isotopique connue.
Ce gaz de référence est souvent un standard de travail (working standard)
préalablement calibré à l’aide d’une référence internationale.
Le gaz à analyser peut aussi être préparé en ligne (on-line), par exemple à l’aide d’un
analyseur élémentaire (AE, en anglais EA, Elemental Analyser), il est alors acheminé
automatiquement dans le spectromètre par un flux de gaz vecteur (hélium). Un tel système,
Chapitre II
74
fonctionnant en flux continu (continuous flow), a l’avantage d’être entièrement automatisé et
de permettre un grand nombre d’analyses dans des conditions de préparation strictement
répétables.
Presque toutes les mesures présentées dans cette thèse ont été faites en mode on-line –
sauf quand nous avions déjà un gaz (notamment CO2 de boissons pétillantes), prêt pour être
mesuré – et en flux continu grâce au couplage à un analyseur élémentaire (AE-SMRI) ou à un
chromatographe en phase gazeuse relié pour une interface de combustion au spectromètre
(CG-C-SMRI).
2.2. La spectrométrie de masse
Les molécules gazeuses provenant de l’échantillon sont introduites dans la source où
elles sont ionisées par impact électronique, grâce à un filament qui émet des électrons.
+- -M + e M e+ 2⎯⎯→ i
Les radicaux-cations obtenus peuvent se fragmenter mais en SMRI on utilise des
paramètres de source qui privilégient leur formation car c’est sur ces radicaux-cations que
seront réalisées les mesures.
La SMRI est dédiée aux mesures de rapports isotopiques, il n’y a donc pas de spectre
mais la précision est cruciale pour mesurer de petites variations de teneurs isotopiques. Cette
précision est atteinte grâce à la comparaison permanente entre les rapports isotopiques du
composé à mesurer et d’un composé de référence. De plus, les différents champs et tensions
appliqués sont constants et garantissent ainsi un rendement d’ionisation lui-même constant.
La partie détection est constituée de cages de Faraday qui collectent simultanément
tous les ions isotopomères de masses différentes. Cette détection simultanée par des
collecteurs indépendants contribue largement à la précision de la mesure puisque toutes
variations au niveau de la source affectent de la même manière chacun des isotopomères.
Le signal électrique généré proportionnel à la quantité d’ions, est amplifié, envoyé à
l’ordinateur et traité par le logiciel qui pilote en outre toutes les parties du système. Nos
Chapitre II
75
systèmes proviennent de ThermoFinnigan, et les logiciels utilisés sont Isodat NT version 2.0,
sous Windows NT pour piloter le Delta Plus et sous Windows XP pour le Delta Plus XP.
Le processus qui vient d’être décrit est schématisé dans la Figure 1 et consiste en 5
étapes successives :
1. Introduction du gaz (obtenu ou non par réaction) ;
2. Ionisation par impact électronique sous vide ;
3. Séparation des ions par un champ électromagnétique en fonction de leur masse ;
4. Détection des ions de masse différente par les cages de Faraday ;
5. Génération d’un signal électrique.
2.2.1. Que sont les isotopomères ?
Les isotopomères – ou isomères isotopiques – sont l’équivalent des isotopes au niveau
moléculaire, c'est-à-dire des molécules avec la même structure chimique et composition
élémentaire mais des masses différentes dues aux substitutions isotopiques [1]. Les
isotopomères ont un poids moléculaire qui varie avec le nombre de neutrons dans le noyau
des atomes constitutifs. Un terme qui est parfois utilisé comme synonyme de isotopomère est
isotopologue. Dernièrement il a été suggéré [2] d’éliminer ce terme au profit du premier.
Par exemple, des isotopomères de l’anhydride carbonique sont : 12C16O2 de masse 44 ; 12C16O17O et 13C16O2 de masse 45 ; 12C16O18O, 12C17O2 et 13C17O16O de masse 46.
Il est statistiquement peu probable que deux isotopes naturellement peu abondants se
trouvent dans la même molécule. Les deux derniers isotopomères cités sont donc négligeables
lorsqu’on travaille en abondance naturelle.
Pour une détermination la plus correcte possible du rapport 13C/12C dans un
échantillon – mais cela vaut également pour les isotopes des autres éléments -, il faut tenir
compte des contributions que tous les isotopomères apportent. Les logiciels qui transforment
les signaux électriques pour calculer le rapport entre les isotopes, introduisent
automatiquement des facteurs de correction pour éliminer ces contributions indésirables.
La plus commune pour la mesure du δ13C est celle publiée par Craig [3] en 1957 qui
tient compte des isotopomères possibles et de l’abondance relative naturelle de l’17O.
Chapitre II
76
Figure 1 : Schéma d’un système SMRI : exemple du CO2 (adaptation sur un original gentiment
fourni par Thermo-Italia)
Sour
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Aim
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O, 12
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Gaz
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C17
O16
O)
Gaz
Chapitre II
77
2.3. Mesures SMRI des rapports isotopiques des éléments légers
Ci-dessous sont décrites les méthodes les plus fréquemment utilisées pour mesurer les
rapports isotopiques des éléments légers. Dernièrement le progrès technologique a permis de
simplifier les manipulations de laboratoire souvent longues et même de réaliser en routine des
analyses impossibles jusqu’à maintenant.
Une attention particulière sera portée aux techniques que nous avons le plus utilisées
par rapport aux éventuelles méthodes plus classiques.
2.3.1. Mesure du rapport 2H/1H
Les δ2H (ou δD) sont mesurés, en off-line, à partir de l’eau d’échantillons soit
d’origine météorique soit obtenue des matrices organiques, par extraction, lyophilisation ou
combustion. Classiquement, l’eau est transformée en H2 gazeux par réduction.
Parmi les réducteurs les plus souvent utilisés et un peu par ordre chronologique on
peut citer l’uranium, le zinc, le manganèse et le chrome. L’H2 produit est introduit
directement dans le spectromètre, à travers le « dual-inlet ».
Nos mesures de δ2H de l’eau, mais principalement de l’éthanol, ont été conduites
utilisant un système TC-EA couplé à l’IRMS. L’avantage de cette nouvelle technique est la
possibilité de mesurer aussi le rapport isotopique du deutérium contenu dans n’importe quelle
matrice organique.
Le seul produit réactif, le carbone vitreux à haute température (1350-1450 °C),
favorise la réaction de pyrolyse qui conduit à la formation d’H2, CO et N2, l’excès éventuel de
carbone se dépose dans le réacteur.
Les cages de Faraday collectent les ions de m/z 2 et 3 et on obtient le rapport des
masses 3/2.
Contrairement aux mesures off-line, les mesures par TC-EA sont en flux continu, ainsi
la quantité de H2 introduit dans la source comme référence est telle que la réaction
+• + •2 2 3H + H H + H⎯→ qui porte à la formation de l’ion H3
+ doit être prise en compte.
Cette espèce chargée est isobare (c'est-à-dire, elle a le même rapport m/z) avec 1H-2H
et apporte une contribution pour la masse 3. La correction apportée à cette interférence est
Chapitre II
78
nommée le « facteur H3+ » [4, 5] et doit être renouvelée pour tout changement de bouteille d’H2
de référence.
Une autre interférence pourrait être due à l’ion He2+, de masse 2, mais qui n’est pas
encore suffisamment étudié [6].
Les valeurs δ2H sont exprimées par rapport au V-SMOW, proposé comme référence
en 1978 par Gonfiantini [7].
Comme référence pour nos mesures de δ2H en TC-EA on utilise de l’H2 en bouteille,
calibré par rapport aux eaux V-SMOW, GISP (Greenland Ice Sheet Precipitation) et SLAP
(Standard Light Antarctic Precipitation).
Les rapports (D/H)i spécifiques par site dans la molécule, par exemple les rapports
(D/H)I et (D/H)II des deux groupes de protons aliphatiques dans l’éthanol sont mesurés par
Résonance Magnétique Nucléaire du deutérium, directement sur le produit liquide.
L’échelle est en ppm, partie par million, et la référence est la TMU, tétraméthylurée.
2.3.2. Mesure du rapport 13C/12C
Le rapport 13C/12C est mesuré sur le CO2 qui peut être obtenu de plusieurs manières :
a. off-line :
i. par acidification des carbonates et carbone inorganique dissous ;
ii. par oxydation de matériel organique avec des oxydants forts (CuO) suivie d’une
séparation cryogénique des gaz formés (H2O, CO2, N2) ;
iii. par collection du gaz libre, par exemple CO2 d’origine géochimique ou de
fermentation.
b. on-line, par combustion, en excès d’oxygène, de matrices organiques, par exemple à
l’aide d’un analyseur élémentaire. Les gaz produits (N2, CO2) sont séparés par GC et
ainsi acheminés l’un après l’autre dans la source.
Les systèmes GC-C-IRMS apparus plus récemment permettent de travailler sur des
mélanges et de mesurer soit le δ13C soit le δ15N de chaque composé.
Chapitre II
79
Les détecteurs collectent les ions de masse 44, 45 et 46 pour obtenir le rapport des
masses 45/44. Mais, comme déjà mentionné, il faut tenir compte de l’effet provoqué par
l’isotopomère 12C16O17O de masse 45, contribuant pour environ 7% [6]. La correction la plus
commune est celle introduite par Craig [3].
Il en existe d’autres et celle appliquée par défaut par le logiciel Isodat NT est la
correction de Santrock [8] qui a été introduite par Santrock, Studley, et Hayes en 1985. Les
auteurs [9] ont reconsidéré l’analyse par MS du CO2, et introduit les nouvelles informations
sur la co-variation naturelle de l’17O et l’18O, ils ont ainsi obtenu des formules plus précises
que celles classiques de Craig.
En 1953 Craig [10] introduit la référence internationale pour les valeurs δ13C : le PDB,
ou Pee Dee Belemnite, le carbonate marin du rostre fossilisé de Belemnitella americana
(représentée en Figure 2). Ce carbonate est désormais épuisé et a été remplacé par d’autres
matériaux calibrés par rapport au PDB lui-même.
Comme référence pour les mesures de δ13C on utilise du CO2 en bouteille, calibré par
rapport à des standards de référence fournis par l’IAEA ou des matériaux à composition
isotopique certifiée par rapport au PDB.
Les études des teneurs spécifiques par site du carbone, sont conduites par 13C-RMN [11,
12].
Figure 2 : Belemnitella americana dans
un dessin (gauche) et son rostre fossilisé :
le carbonate PDB.
2.3.3. Mesure du rapport 15N/14N
Le gaz utilisé pour mesurer le δ15N est l’azote moléculaire. Les réactions utilisées sont
l’oxydation en oxyde NOx, suivie par une réduction pour donner N2. Les manipulations
préparatoires dépendent de la forme chimique dans laquelle se trouve l’azote.
Chapitre II
80
La procédure off-line pour matrices organiques (pulpes, tissus, etc.) est la même que le
cas du carbone vu précédemment. Pour mesurer l’azote de nitrate et d’ammonium dissous en
milieu aqueux, des distillations et piégeages sont nécessaires [13] pour isoler les espèces
azotées.
Les mesures on-line procèdent comme pour le carbone, en utilisant les mêmes
techniques d’EA et GC-C-IRMS. La plupart de nos analyses 15N ont été réalisées sur des
produits agroalimentaires (farines, chair de poisson, engrais, etc.) par EA.
On a aussi utilisé le couplage GC-C-IRMS à l’occasion d’un projet visant à choisir des
produits azotés utilisables comme standards. Dans le cas du GC-C-IRMS, un piège
cryogénique à azote liquide est nécessaire pour piéger le CO2.
Le CO2 dans la source donne des radicaux-cations CO2+· mais par fragmentation ils
produisent un peu de CO+ isobare avec N2+· (masse 28) interférant ainsi dans l’analyse. En
fait, le détecteur collecte les masses 28 de 14N-14N, 29 de 15N-14N, et 30 de 15N-15N pour
mesurer le rapport 29/28.
La référence internationale pour le δ15N est l’azote moléculaire de l’atmosphère,
introduit en 1983 par Mariotti [14]. Pour nos mesures nous utilisons N2 en bouteille, calibré
contre des standards de référence certifiés fournis par l’IAEA.
2.3.4. Mesure du rapport 18O/16O
Les mesures classiques d’18O de l’eau sont réalisées off-line, elles font appel à
l’équilibration entre le CO2 et l’H2O, qui conduit à une accumulation de l’18O dans
l’anhydride carbonique. Après la purge de l’espace de tête de la fiole contenant l’échantillon,
un volume déterminé de CO2 aux teneurs isotopiques connues, est introduit sur le liquide
(eau, mais aussi vin ou d’autres échantillons liquides), et laissé sous agitation à température
contrôlée, pour une certaine période. La réaction d’échange est la suivante :
16 16 18 18 16 16(g) 2 (l) (g) 2 (l)C O O +H O C O O +H O⎯⎯→←⎯
Dans nos laboratoires, le système de mesure, utilisé en routine sur les vins, est en
partie automatisé grâce à un appareil d’équilibration couplé à un SMRI et piloté par un
Chapitre II
81
logiciel. Le logiciel pilote aussi le piégeage cryogénique du CO2 équilibré et sa mesure en
SMRI.
A côté de ces mesures classiques de δ18O, pour nos dernières études on a conduit des
mesures de δ18O sur échantillons liquides (eaux, huiles et éthanol distillé de boissons
alcoolisées) et sur solides (grains de café, chair de poisson) en mode on-line, au moyen d’un
système récent, le TC-EA couplé à la SMRI, de façon très similaire aux mesures de δ2H.
La réaction de pyrolyse, en présence de carbone vitreux, produit le monoxyde de
carbone, CO. Les isotopomères concernés sont 12C16O de masse 28 et 12C18O de masse 30 et
le rapport est le 30/28.
La présence d’azote dans la source est à proscrire car N2 produit des ions de masse 28
et la réaction entre N2 et CO peut produire NO+·, de masse 30, or ce sont ces deux masses qui
sont détectées. C’est pourquoi l’azote ne peut pas être utilisé comme gaz de référence et on est
obligé d’introduire du CO, bien plus dangereux.
Les standards internationaux pour δ18O sont le V-SMOW et le V-PDB, mais c’est
presque exclusivement par rapport au premier que les valeurs sont reportées.
Notre CO gazeux de référence a été calibré contre les eaux V-SMOW, GISP et SLAP.
3. (CF-)GC-C-IRMS L’idée de mesurer les rapports isotopiques sur les composés issus d’un mélange
organique en utilisant la chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de
masse, au moyen d’un four de combustion, date de la fin des années 70 [15, 16]. Dix ans après,
en 1988, apparaissent les premiers appareils en flux continu (CF-GC-C-IRMS) dans le
commerce.
Le fonctionnement général décrit ci-dessous concerne les configurations et les
conditions spécifiques utilisées sur nos appareils Thermo-FinniganMat (voir Figure 3), et ne
sont pas forcément les mêmes pour tous les constructeurs.
3.1. Principes de la GC-C-IRMS
La méthode de la GC couplée à la SMRI se base sur la capacité de séparation de la
colonne chromatographique – ou l’isolation d’une molécule cible d’ intérêt – d’un mélange
Chapitre II
82
plus ou moins complexe, en couplage avec un système de combustion qui nous permet de
mesurer les rapports 13C/12C et 15N/14N.
3.1.1. Séparation et réactions
Le GC utilise normalement l’hélium comme gaz vecteur (carrier gas). Tout composé
élué de la colonne capillaire, passe par un four de combustion à haute température (940 °C),
contenant des fils torsadés d’oxydes de métaux (NiO, CuO et Pt), réoxydés périodiquement
avec O2 gazeux. A une telle température, les fils relarguent l’oxygène qui transforme la
matière organique en CO2, H2O et NOx.
Figure 3 : Configuration de notre chromatographe en phase gazeuse, couplé à un auto
sampler et à une interface de combustion
Four d’oxydation
Chapitre II
83
Un deuxième four, à 640 °C, contenant du cuivre en fil, réduit les oxydes d’azote en
azote moléculaire et élimine l’excès d’O2.
Les deux fours sont des tubes, longs de 30 cm et très étroits (0.125 mm le diamètre)
réalisés en matériel céramique.
3.1.2. Systèmes de piégeage
Le piégeage de l’eau est indispensable pour éviter la contamination de la source
d’ionisation. De plus, l’eau présente dans la source peut protoner le CO2 en HCO2+ qui
interfère à la masse 45. Le piège utilisé est une membrane hygroscopique de Naphion qui
élimine l’eau à la sortie du système de fours, juste avant l’entrée dans le spectromètre.
Lors des mesures 15N, un autre piège cryogénique à azote liquide est utilisé pour
bloquer le CO2.
3.1.3. Vannes de déviation des gaz
Le système (représenté en Figure 4) est en outre doté d’une vanne pour empêcher que
des substances non désirées arrivent au four d’oxydation. Cette vanne, dite de backflush,
dévie, par exemple, les grosses quantités de solvant en sortie de la colonne. Cela permet
d’augmenter la durée de vie du four et aussi de limiter les interférences dans l’IRMS. Elle
peut être aussi utilisée pour isoler des autres composants celui qui nous intéresse.
La vanne de backflush est aussi ouverte durant les processus de régénération du four
de combustion par passage d’O2 afin que ce gaz n’atteigne pas le four de réduction ni la phase
de la colonne chromatographique, et surtout, qu’il n’atteigne pas la source d’ionisation.
En plus, pour isoler complètement le spectromètre du chromatographe, il y a aussi une
vanne dite open split, qui, si elle est ouverte, dévie totalement l’effluent de la colonne dans
l’atmosphère.
L’interface de combustion comprend aussi les vannes pour l’introduction de l’oxygène
de régénération du four de combustion et celle du CO2 et du N2 de référence.
Dans la configuration de notre GC, nous avons renoncé à l’utilisation du FID (flame
ion detector, le détecteur à ionisation de flamme) pour avoir un signal plus important et
surtout pour limiter les points critiques et rendre la méthode plus robuste.
Chapitre II
84
3.2. Applications
Les revues de synthèse de W.A. Brandt (1996 [17]) et de W. Meier-Augenstein
(1999 [18]) récapitulent les applications de la GC-C-IRMS dans plusieurs domaines.
Archéologie, géochimie, études environnementales, criminalistique, pharmacologie,
authenticité et produits alimentaires sont présentés. Nos activités ont été focalisées sur les
applications dans le domaine alimentaire.
3.2.1. Applications en agroalimentaire
Le tout début des applications GC-C-IRMS dans le domaine alimentaire date de 1984
et est dû à Bricout et al. [19] qui s’intéressaient à l’authentification des aliments et des additifs
alimentaires.
Dès lors, la technique s’est développée et a trouvé de nombreuses utilisations
routinières et commerciales pour dépister l’origine naturelle ou synthétique d’arômes et de
parfums. Les premiers travaux ont été réalisés sur la vanilline, qui est certainement l’arôme le
plus diffusé dans l’industrie, aussi bien alimentaire que dans les domaines pharmaceutique et
cosmétique.
Au Chapitre VI de cette thèse, il sera montré comment la GC-C-IRMS peut contribuer
à étudier l’origine naturelle de l’arôme de pomme.
Les dernières publications dans ce domaine – concernant l’authentification de boissons
spiritueuses, vins [20], arômes [21-26], acides organiques [27, 28] et jus de fruit [29] – montrent
encore les potentialités du système de chromatographie gazeuse couplé à la spectrométrie de
masse de rapports isotopiques au moyen de la combustion.
Dans tous les domaines (environnement, géochimie, alimentaire et autres) il est clair
que la combinaison des résultats obtenus sur plusieurs éléments (H, C, N, O, S) apporte des
informations des plus en plus précises.
Cette tendance a abouti à l’utilisation d’un couplage GC et IRMS au moyen d’un
pyrolyseur en ligne. Cette nouvelle technique est souvent appelée GC-pyr-IRMS, GC-P-
IRMS ou GC-C/P-IRMS si couplée à la combustion, et encore GC-TC dans ses récentes
variantes commercialisées.
Chapitre II
85
Figure 4 : Schématisation des diverses parties d’un système couplé GC-C-IRMS, en
configuration double, carbone/azote (d’après un original gentiment fourni par Thermo-Italia)
Chapitre II
86
3.2.2. Applications futures
Une très vaste littérature, comme le montre la collection d’articles recueillis pour la mise à
jour de la bibliographie de cette thèse, indique un intérêt grandissant pour la technique GC-C-
IRMS en recherche médicale. Cet intérêt est en partie dû à la facilité d’utilisation des isotopes
stables en remplacement des isotopes radioactifs [30]. Dans de nombreux travaux [30-36] la
technique est appliquée à des métabolites animaux ou humains après assimilation de produits
enrichis en 13C (voir études de T. Brenna et de V.P. Carnielli [37, 38] dans le domaine de la
néonatologie). Souvent les métabolites étudiés sont des dérivés d’acides gras et d’acides
aminés.
La littérature, d’ailleurs, nous offre plusieurs exemples d’applications sur des matrices
contenant des graisses animales ou végétales [39, 40], des acides aminés libres ou du matériel
protéique [41, 42], qui, après extraction et dérivation appropriées [18, 43-45], peuvent être injectés,
séparés et oxydés/pyrolysés pour mesurer les rapports isotopiques des quatre éléments
principaux.
Vu la forte similitude des matrices agro-alimentaires et de celles rencontrées en
recherche médicale, il est envisageable d’utiliser les mêmes méthodes pour analyser les
huiles, la chair animale ou des matrices alimentaires complexes.
Le récent développement [46] du couplage d’un GC avec un pyrolyseur pour mesurer
δ2H et δ18O on-line et en flux continu, nous permettrait de réaliser des corrélations
multiéléments pour les éthanols, les huiles et graisses et les protéines d’origine animale ou
végétale.
Une application courante dans les hôpitaux est celle du breath test ou 13C-urea breath
test, au moyen duquel il est possible de détecter la présence d’ulcérations gastriques
provoquées par la bactérie Helicobacter pylori par simple collection et injection du CO2
expiré, après ingestion d’urée enrichie en 13C. Nous avons adapté cette méthode au domaine
de l’authentification alimentaire et en particulier pour mesurer les abondances naturelles en 13C du CO2 des boissons pétillantes. Cette étude sera développée dans le Chapitre IV.
3.2.3. Nos études en GC-C-IRMS
Des travaux en GC-C-IRMS sont présentés dans cette thèse. Dans le Chapitre III on
discute les résultats des mesures de δ13C pour la caractérisation du glycérol sur un grand
Chapitre II
87
nombre de vins européens et qui ont été publiés [47] dans le Journal of Agriculture and Food
Chemistry.
Comme indiqué précédemment, on a mis au point une méthode qui permet une
détermination rapide de la teneur naturelle en 13C du CO2 présent dans les boissons gazeuses.
On a aussi fait des mesures de δ15N dans le cadre d’un projet européen, le
GC-C-IRMS-CRM [48], visant à tester et, éventuellement, établir un groupe de composés
utilisables comme standards de référence pour les mesures 13C et 15N, par les techniques GC
et EA.
3.3. Les limites
Clairement, le grand avantage de la GC-C-IRMS par rapport à l’EA-IRMS est de faire
les mesures sur les molécules individuelles. Par contre, la robustesse et la précision de la
technique EA n’est pas encore atteinte par la GC-C-IRMS.
Dans les dix dernières années plusieurs auteurs ont étudié les performances du système
GC couplé à l’IRMS, lors de mesures δ13C : de l’interface de combustion [49], à la
comparaison entre appareils de différentes marques [50], jusqu’à l’acquisition et l’élaboration
des données [51-53].
L’article de W. Meier-Augenstein [18] énumère une série de problèmes, observations et
remèdes possibles. Nous avons pour notre part observé certains des problèmes décrits, surtout
durant les mesures du 13C du glycérol.
La difficulté la plus évidente pour cette molécule peu volatile et très polaire était la
distorsion du pic dans le chromatogramme. Une telle asymétrie conduisait à de grosses erreurs
d’intégration du signal et donc de calcul du δ13C par le logiciel. Au début, nous utilisions
l’Isodat 1.5 sous Concurrent DOS ; dès le passage à la version Isodat NT, on a éliminé cet
inconvénient.
Il y a déjà dix ans, J. Goodman et J.T. Brenna [51, 54] avaient suggéré des algorithmes
d’intégration permettant de mieux prendre en compte les signaux asymétriques ou superposés.
La meilleure solution reste l’amélioration de la séparation chromatographique des
composants d’un mélange. Dans ce but la chromatographie en phase gazeuse à haute
résolution (HRcGC, High-Resolution Gas-Chromatography) est parfois utilisée.
Chapitre II
88
Il s’agit en fait de sous-systèmes GC (ou GC deux dimensions) qui permet d’améliorer
la résolution GC [55, 56].
La moindre précision du GC-C-IRMS par rapport à l’EA, d’après notre expérience, est
principalement due à la complexité du système qui offre beaucoup plus de possibilités de
points faibles.
A la suite de nombreuses discussions avec les spécialistes de l’usine ThermoFinnigan
de Brême, nous avons apporté des modifications au système initial et amélioré les
performances :
• Tous les raccords métalliques, susceptibles d’interaction physique ou chimique avec
les composés, ont été remplacés par des raccords en verre désactivé produits par BGB-
Analytik AG (Suisse).
• Le raccord colonne-four de combustion a été modifié de manière à positionner la
sortie de colonne en contact direct des oxydants du four.
• Utilisation systématique de pré et post colonne en silice désactivée
Une autre incertitude est liée à l’absence de composés standard de référence. En
pratique, on calibre les gaz de référence interne contre des substances dont la composition
isotopique est acceptée et connue (de mesures par EA, par exemple) mais non certifiée. Plus
de détails sur notre procédé de calibration du CO2 de référence sont reportés dans l’Annexe C.
Dans les applications courantes en GC-C-IRMS, il n’a pas été développé, jusqu’à
présent, de méthode pour mesurer les δ34S.
4. EA-IRMS L’analyseur alimentaire fut le premier système on-line couplé avec l’IRMS. Il peut
fonctionner en conditions opératoires de combustion ou de pyrolyse, permettant de mesurer
les teneurs isotopiques des éléments constitutifs sur l’échantillon dans sa totalité.
L’échantillon peut être solide ou liquide, organique ou minéral pourvu que ses
éléments soient complètement convertis en gaz analysables.
Dans ce paragraphe on décrira l’application de la technique EA-IRMS en mode
combustion.
Chapitre II
89
4.1. Principes de l’EA-IRMS : réaction, systèmes de piégeage et séparation
Le schéma de fonctionnement est représenté dans la Figure 5. Les échantillons –
solides, sertis dans des capsules d’étain, ou liquides, injectés par un système automatique –
sont brûlés en présence d’un excès d’oxygène, dans la colonne d’oxydation, tube en quartz
rempli d’agents oxydants (Cr2O3 et Co3O4). La réaction, très rapide, est dite combustion
éclair, flash combustion en anglais, car le métal des capsules contribue à une augmentation
instantanée de la température, qui est réglée à 1050 °C. Les gaz de combustion, transportés
par l’hélium, sont CO2, H2O, N2 et NOx.
Une seconde colonne, identique à la précédente mais contenant du cuivre métallique à
650 °C, réduit les oxydes d’azote en azote moléculaire et retient l’excès d’O2.
L’eau est retenue dans un piège, un tube contenant du Mg(ClO4)2, dit anhydrone. Le
même piège contiendra aussi du NaOH supporté sur silicates (soda lime), afin de limiter la
quantité de CO2 durant les analyses de δ15N. En fait, comme le contenu en carbone dans une
matrice organique est en général beaucoup plus élevé que celui en azote, un pic résiduel de
CO2 pourrait se superposer à celui de l’azote, même si les cages de Faraday sont réglées pour
mesurer les masses 28, 29 et 30. Ce sont en fait les cations CO+ issus de la fragmentation de
CO2+· qui interfèrent avec N2.
CO2 et N2 sont séparés par une colonne chromatographique maintenue à 65 °C. La
phase solide de cette colonne GC est constituée de Porapak Q.
Le détecteur de l’IRMS mesure le rapport des ions de masse 46, 45 et 44 pour les
valeurs δ13C et celui des ions de masse 30, 29 et 28 pour les valeurs δ15N. La mesure des
teneurs des deux isotopes, peut être conduite dans la même analyse, grâce à la méthode du
peak jumping.
4.2. Nos applications dans le domaine alimentaire
La technique de l’analyseur alimentaire couplée à l’IRMS est celle de référence pour
les analyses des contenus isotopiques de toute matrice alimentaire et dont plusieurs d’entre
elles sont utilisées dans un cadre législatif (voir Annexe A). Les mesures de δ13C des éthanols
distillés des vins européens font partie des analyses de routine au BEVABS. Pour nos études,
en outre, nous avons appliqué cette analyse aux distillats de boissons spiritueuses et de bières,
pour une caractérisation multi-isotopique de ces produits.
Chapitre II
90
Figure 5 : Schématisation du système couplé EA-IRMS, en configuration double, CO2/N2
Con
FLO
Con
FLO
GC
65 °
C
Pièg
e po
ur C
O2
(Sod
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me)
Anal
yse
d’N
2
C u i v r e
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d’o
xyda
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Four
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ctio
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0 °C
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O3
Co
Co 33
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ClO
4)2
Pièg
e po
ur H
2O(A
nhyd
rone
)
NaO
H
CO
2N
2IR
MS
IRM
S
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Gaz
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Chapitre II
91
Les mesures de 15N ont été conduites sur des produits de l’agriculture et des engrais de
différentes origines pour étudier ceux qui sont vendus issus de l’agriculture biologique. On a
aussi déterminé des teneurs en 13C et 15N de la chair de saumon pour mettre en évidence les
relations avec leur alimentation et leur provenance géographique, dans le cadre du projet
européen COFAWS [57].
5. TC-EA IRMS Le TC-EA (Total Combustion–Elemental Analyser, en français Analyseur Elémentaire
par Combustion Totale) est l’un des plus récents appareils commercialisés pour mesurer les
rapports isotopiques par spectrométrie de masse. Ce système (voir en Figure 6 les photos de
notre appareil Thermo Finnigan, configuré pour l’analyse d’échantillons liquides ou solides),
en couplage avec un SMRI, permet la détermination de δ2H et δ18O en flux continu sur
matrices inorganiques (principalement eau) et organiques. La nouveauté de cette technique,
par rapport aux méthodes classiques de détermination des rapports 2H/1H et 18O/16O, est sa
facilité, qui, étant on-line, n’implique aucune préparation préliminaire des gaz à mesurer et
permet des mesures en routine sur de grandes quantités d’échantillons.
5.1. Principes du TC-EA-IRMS
La réaction de « pyrolyse » qui se produit dans le réacteur, est la suivante :
t > 1400°C2
y2x y zC H O z CO + H + x-z C⎯⎯⎯⎯→
Cette réaction générale ne tient pas compte de l’éventuelle présence d’azote dans le
composé. Le tube en alumine (Al2O3) ne contient qu’un excès de carbone amorphe, en forme
allotropique de glassy carbon, ou carbone vitreux, auquel l’oxygène se combine.
Elués par le flux d’hélium, les gaz produits sont séparés par une courte colonne
chromatographique pour gaz, en acier, remplie de tamis moléculaires. D’abord l’H2 et puis le
CO, sortent de la colonne, et atteignent le spectromètre, qui mesure les rapports des masses 2
et 3 pour la détermination de δ2H et des masses 28, 29 et 30 pour δ18O (voir Figure 7).
Chapitre II
92
Figure 6 : Notre appareil de TC-EA, configuré pour l’analyse d’échantillons liquides
(gauche) ou solides (réélaboration de photos gentiment fournies par Thermo-Italia)
5.1.1. Nos conditions opératoires
Les conditions d’utilisation conseillées par la firme productrice de notre appareil
TC-EA, ont été modifiées et adaptées à nos exigences. En particulier, la température du tube
de réaction est toujours réglée à 1450 °C, pour n’importe quelle matrice et n’importe quel
élément analysé. Une description plus détaillée de nos conditions d’utilisation et de la
calibration des gaz de référence est insérée dans l’Annexe C.
5.2. Interférences et limites
Les interférences possibles dues aux masses isobares durant les analyses des rapports 2H/1H et 18O/16O ont été déjà décrites, respectivement, dans le paragraphe 2.3.1 à la page 77 et
dans le paragraphe 2.3.4 à la page 81.
Pour notre part nous avons constaté des difficultés [58] lors de la présence d’azote dans
la matrice étudiée, notamment pour le KNO3, l’acide glutamique ou des matrices complexes
telles que grains de café ou farine de soja. Il y a une forte influence due à N2 produit par la
pyrolyse et qui sort juste avant le CO sans en être bien séparé.
Chapitre II
93
Figure 7 : Schéma du système de pyrolyse TC-EA (d’après un original gentiment fourni par Thermo-
Italia)
On peut arriver à isoler le pic N2 – mais pas suffisamment pour éliminer son
interférence – lorsqu’on réduit la température de la colonne GC. Il faudra, à notre avis,
approfondir l’étude des analyses des matrices contenant de l’azote, si l’on veut mesurer le
rapport 18O/16O.
5.3. Applications
La plupart des applications du TC-EA, pour la détermination de δ2H aussi bien que de
δ18O, sont encore liées aux études géologiques des eaux. Il n’y a pas beaucoup d’exemples,
actuellement, d’applications de cette technique dans le domaine alimentaire, par contre elle
est employée en nutrition et pour étudier le métabolisme énergétique avec l’eau doublement
marquée [59].
(H2 or CO)
Chapitre II
94
G. Versini et collaborateurs ont communiqué [60] la possibilité d’utiliser la pyrolyse par
TC-EA pour mesurer aussi le δ13C, sur la base du rapport des masses 29/28 (13C16O)/(12C16O).
Ces déterminations sont en bon accord avec celles mesurées par combustion, en EA-IRMS,
sur la base du rapport 45/44.
Des mesures de teneurs en deutérium et en oxygène-18 sur l’alcool distillé du saké ont
été réalisées [61] et corrélées à celle du 13C. Nous avons aussi appliqué cette technique pour la
mesure des éthanols d’origines diverses et d’huiles végétales.
6. RMN DU DEUTERIUM Lors de nos études, nous avons aussi utilisé l’analyse par résonance magnétique
nucléaire du deutérium – analyse routinière dans les laboratoires du BEVABS – pour
déterminer le rapport (D/H)I et (D/H)II de l’éthanol. L’appareil utilisé est un Brüker AXR 400
à 400 MHz.
Nous ne développons pas ici les détails de cette technique qui ne fait pas l’objet
principal de ce travail de thèse. Rappelons simplement qu’elle permet de mesurer les teneurs
en deutérium site par site dans une molécule et qu’elle est souvent utilisée, en complément de
l’IRMS dans les études d’authentification [62, 63].
7. NOTIONS STATISTIQUES La détermination d’un rapport isotopique quelconque n’est jamais issue d’une seule
mesure mais d’au moins deux répétitions. Dans le cas d’analyses assez rapides, notamment
celles automatisables par utilisation d’un passeur automatique d’échantillons (d’ici en avant
autosampler), on calcule la moyenne sur quatre ou cinq injections.
7.1. Quelques définitions de statistique élémentaire
Le plus souvent nous utilisons la moyenne arithmétique, qui permet de caractériser le
centre de la distribution des fréquences d'une variable quantitative en considérant toutes les
observations et en leur attribuant le même poids.
Elle est obtenue en prenant le rapport de la somme des valeurs par leur nombre n :
Chapitre II
95
Equation 1 ∑=
=n
iiXnX
1 1
La variance est une mesure de dispersion d'une distribution, définie comme la somme
des carrés des écarts à la moyenne arithmétique divisée par le nombre d'observations :
Equation 2 ( )2
1 1 ² ∑
=−=
n
ii XXnσ
L'écart-type σ, ou en anglais standard deviation, SD, correspond à la racine carrée de
la variance, soit :
Equation 3 ( )2
1
σ
n
ii
X X
n=
−=
∑
Toutefois, pour n petit, ce qui est toujours notre cas, l'expression la plus appropriée fait
apparaître n-1 à la place de n au dénominateur. Elle donne une valeur moyenne indépendante
de la taille de la population. Par la suite, lorsque nous parlerons de SD, il s'agira donc de
l'écart-type défini par l'expression suivante :
Equation 4 ( )2
1
SD 1
n
ii
X X
n=
−=
−
∑
96
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Chapitre II
97
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Chapitre II
98
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Chapitre II
100
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Chapitre III
Chapitre III
103
Caractérisation du glycérol des vins européens :
approche par l’isotope stable du carbone
e glycérol est un de composants du vin reconnu pour sa propriété d’améliorer le
goût et la perception générale du vin. La fermentation alcoolique des sucres est
la principale responsable de sa présence dans les boissons fermentées, mais en plus de cette
production naturelle, son origine peut être due à des champignons. L’addition frauduleuse de
glycérol dans le vin est interdite par les règlements de l’Union Européenne (UE).
Nos travaux de caractérisation du glycérol par voie isotopique de nombreux de vins,
s’inscrivaient dans un projet de partenariat européen plus vaste. Ce projet comprenait aussi
l’évaluation des méthodes traditionnelles d’analyse, en particulier de certains produits
secondaires formés lors du procédé industriel de synthèse du glycérol.
Nous avons collaboré à la mise au point et la validation ultérieure des mesures de δ13C
du glycérol, soit extrait, soit isolé par chromatographie en phase gazeuse. L’extraction et la
purification du glycérol, pratiquées par microdistillation (protocole mis au point à l’occasion
d’un stage chez Eurofins France en 1999-2000), était une étape plutôt longue mais,
heureusement, évitable dans le cas du vin, grâce à l’utilisation de la GC.
Ce chapitre est une version plus complète de l’article publié sur le Journal of
Agricultural and Food Chemistry (auteurs : G. Calderone, N. Naulet, C. Guillou, F.Reniero)
d’octobre 2004, n° 52, p.5902-5906.
L
Chapitre III
104
Characterization of European wines glycerol: stable
carbon isotope approach
ABSTRACT: Glycerol of about 170 European wines was analyzed using gas
chromatography-combustion-isotope ratio mass spectrometry technique. 13C/12C isotopic ratio
measurements were performed to characterize glycerol’s δ13C values of genuine wine samples
from European Union wine-producing countries. Glycerol was also successfully dosed using
an internal reference, 1,5-pentanediol.
1. INTRODUCTION lycerol, the IUPAC name of which is propane-1,2,3-triol, commercially known
as glycerin, is the simplest triol (see Figure 1) and occurs in nature both in a
bound form and as a free molecule. It is present mostly in the form of a triglyceride in all
natural fats and oils. As a free molecule, it is also produced during alcoholic fermentation: the
degradation of sugars by yeast yields ethanol, carbon dioxide, and glycerol. In wine, it is the
most abundant product after water and ethanol and is predominant [1] among several polyols
found there, including erythritol, arabitol, mannitol, sorbitol, meso-inositol, and 2,3-
butanediol.
Figure 1: Structure of glycerol. Figure 2: Structure of 1,5-pentanediol (1,5-PD).
CH2-OH
CH2-OH
CH-OH
CH2-OH
(CH2)3
CH2-OH
G
Chapitre III
105
Glycerol concentrations in wine typically range from 4 to 16 g/L [2], but higher values,
up to 21 g/L [3], are not unusual, especially in white wines from “noble rot” infected grape
musts. It is well-known that grapes infected with some fungi, Botrytis cinerea in particular,
produce musts rich in glycerol, when normal musts contain glycerol in only trace amount.
Glycerol could contribute to the mouth feel properties and smoothness of wine [4, 5]. It
is also an important contributor to the sugar-free extract of wine, an index on which is based a
quality scaling of wines in some European countries.
Therefore, for such reasons, glycerol is sometimes fraudulently added to wine to
disguise poor quality [6]. As this practice is not permitted by European Commission (EC)
regulations [7], the European “Glycerol Project” [8] aimed to study possible methods to detect
addition of synthetic or natural – but exogenous – glycerol. Besides classical chemical
analysis, the project tested methodologies based on stable isotope ratio measurements.
1.1. Stable Isotope Ratio Methods in Food
Extensive studies on plant metabolism [9-11] and natural fractionation of stable isotopes
enabled access to an extremely useful tool in the fight against fraud in the food products
domain. Stable isotope ratio methods are based on the measurement of stable isotope contents
(2H, 13C, 15N, 18O, 34S) of a product or of a specific component such as an ingredient or a
target molecule of the product.
The determinations, carried out using isotope ratio mass spectrometry (IRMS) and/or
nuclear magnetic resonance (NMR) techniques, can provide information on botanical and
geographical origins, which are often considered to be important characteristics of many food
products both by the consumer and by European regulations.
Routinely, isotopic ratio analyses to test origin of flavors and aromas, honeys [12, 13]
and fruit juices have been adopted in industrial production as well [14]. The European Union
(EU) has adopted analyses of 2H/1H, 13C/12C, and 18O/16O in its regulations [15, 16] as official
methods to test the authenticity of wine and alcoholic beverages.
Pioneer studies on stable isotope properties of glycerol have been performed [17-20]
with the aim of eventually using this molecule as another independent probe in food origin
determination. Our study is the first to perform δ13C analyses on a very large variety of wine
Chapitre III
106
samples from all of the different EU wine-producing countries and to test the routine use of
the GCC-IRMS technique.
1.2. EU Wine Data-Bank: BEVABS role
BEVABS is the Bureau Européen des Vins, Alcools et Boissons Spiritueuses or
European office for Wine, Alcohol and Spirit Drinks, which has, among others, the task to put
together the data measured by each country, validate them, and build and maintain the so-
called EU Wine Data Bank.
This Wine Data Bank is a very rich collection (12.000 samples through 1998)
constituted of experimental wines, starting from vintage 1991 up to now. Wines are produced
by official laboratories, collecting grapes from their vine-growing areas and fermenting them
in compliance with EC Regulation 2347/91.
For each vintage, BEVABS performs on the 10% of reference samples measurements
of D/H ratio, by 2H-NMR, and of 13C/12C ratio, by elemental analyzer IRMS (EA-IRMS), on
distilled ethanol, and of 18O/16O ratio on the wine water, to perform the wine-DB validation.
The wine samples investigated in this work belongs to the EU Wine Data Bank.
Chapitre III
107
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Samples
δ13C measurements were performed on 171 wines, chosen and collected among the
samples of the BEVABS Wine Data Bank. Wines have been selected following several
criteria: the geographical origin inside each country; a representation, if possible, of different
types – white and red varieties; and the widest possible range of δ13C values measured on
correspondent ethanol.
Two vintages have been considered, 1998 and 1999. A complete list of all wine
samples measured in this work, are included in the Annexe D of this thesis.
The official wine-producing EU countries are nine and are listed in Table 1, which
also shows the composition of our sampling.
Table 1: EU wine-producer Countries and composition of our samples. Number of genuine
wines, expressed as white/red/rosé. Total: 81 samples for 1998 and 90 for 1999.
Geographical origin and variety of wines
Country Austria France Germany Greece Italy Lux. Portugal Spain UK
1998 6/1/0 13/1/1 10/1/0 3/0/2 10/4/1 4/0/0 4/6/0 3/5/2 4/0/0Vintage
1999 7/5/0 5/3/6 9/0/1 3/3/0 11/3/2 4/0/0 7/7/0 5/5/0 4/0/0
2.2. Sample preparation
The preparation of wine samples was as follows: after filtration over Waters 0.2 µm
filters and a dilution (ratio 1:4) with a solution of ~0.7 g/L of 1,5-pentanediol (1,5-PD, see
Figure 2) (Lancaster) in ethanol, samples were ready for injection. The use of the diol
allowed the accurate determination of the glycerol concentration.
Chapitre III
108
2.3. Continuous Flow GC-C-IRMS
The separation of glycerol from the wine matrix was achieved using a Varian 3400 gas
chromatograph, equipped with a Chrompack WCOT fused silica capillary column filled with
bonded polyethylene glycol (CP-WAX57CB, 25m length, 0.25mm i.d., 0.20µm film
thickness). Isotope ratio measurements were performed, in continuous flow, using a
FinniganMat Delta Plus (Bremen, Germany) mass spectrometer, coupled in line with the gas
chromatograph through a FinniganMat GC combustion interface.
Helium Alphagaz 2 was used as carrier gas, and the pressure at the head of the column
was set to 20 psi. Particular attention was paid to using only a deactivated silica capillary,
deactivated press fit connectors, and a three-way splitter (“Y” splitter, instead of a T-Valco
valve) manufactured by BGB Analytik-AG, as suggested by Thermo of Bremen, to avoid
effluent interaction with metals, reducing isotopic fractionation.
Sample solutions (0.3 µL) were injected (10 µL Hamilton syringe) in the column,
using an A200S FinniganMat autosampler, in split mode. The injector temperature was set to
270 °C. The temperature program was set as follows: initial column temperature, 120 °C;
holding time, 2 min; temperature increased at a rate of 10 °C/min, until the final value of 220
°C; final holding time, 2 min. Each run took 14 min, not considering the necessary time of
cooling. Figure 3 shows this temperature program.
After the chromatographic separation, the effluent undergoes a combustion and a reduction
step, passing through the oxidation and the reduction ovens. Components other than the
glycerol, namely, the solvent, were vented with a back-flush valve during the run, to avoid
oven spoiling and interferences in chromatograms.
The combustion oven consisted of a 30 cm long ceramic tube in which three thin
(0.125 mm diameter) braided wires were placed: one of nickel, one of copper, and one of
platinum. This tube was kept at a temperature of 960 °C, and a flow of oxygen was
periodically introduced inside the oven to reoxidize the copper. The task of this oven was to
combust the organic compounds coming from the gas chromatograph to CO2, H2O, and, if
they contained nitrogen, NOx. Eventual nitrogen oxides were reduced to N2 in the reduction
oven, at 640 °C, which consisted of an identical ceramic tube, but filled only with copper.
Water produced during the combustion was eliminated by a water-removing trap, consisting
of a Naphion membrane.
Chapitre III
109
Figure 3 : Temperature program set up to separate glycerol from the other wine components
In our case, only glycerol was oxidized, producing CO2 and H2O. Carbon dioxide,
carried by the helium stream, arrived at the IRMS source for 13C/12C analysis. Here CO2
molecules were ionized and ions collected by three different Faraday cups depending on their
m/z of 44, 45, or 46. Figure 4 shows a schematic drawing of the GC-C-IRMS configuration
we used.
Isotope ratios are usually expressed as relative deviations δ per mille (‰) with respect
to a standard:
Equation 1 1000C)C/(
C)C/(C)C/(CδPDB
1213PDB
1213sample
1213
PDB13 ⋅
−=
For 13C/12C the international standard is PDB (Pee Dee Belemnite, limestone), a
calcium carbonate. During 13C/12C analyses, a reference CO2 gas is introduced, which is
calibrated against other PDB-calibrated international standards, the PDB itself being
exhausted for many years. Our CO2 was formerly calibrated against international IAEA
Chapitre III
110
standards for 13C using our EA-IRMS system, which consists of a Carlo Erba EA (Milan,
Italy) coupled to a Finnigan Mat Delta S mass spectrometer.
Figure 4: Scheme of GC-C-IRMS configured for δ13C analyses.
The gas chromatograph and the mass spectrometer system were piloted using the
Thermo Isodat NT 1.5 software suite. The same software processed data acquired to calculate
the δ13C values against our CO2 gas reference. CO2 pulse peaks were introduced into the
IRMS source, five at the start and one at the end of each injection of wine. The software
applied by default the “CO2 Santrock” correction to calculate the deviations.
Each wine sample was injected three times, and a BIPEA (Bureau Interprofessionnel
d’Etudes Analytiques) wine was included as reference to bracket every batch of six wines, to
evaluate eventual drift of values. In the case of glycerol, we accepted as repeatable a standard
deviation (SD) value of <0.6‰. Thus, samples with SD ≥ 0.6‰ were repeated.
Another control over each single run was made using the 1,5-PD, the internal
reference already used to determine the concentration of glycerol. This compound, showing a
very good repeatability for 13C/12C measurements, hinted at the validity of the injection and
combustion step. The δ13C value for our 1,5-PD was -31.2‰ by GC-C-IRMS and -30.52‰ by
EA-IRMS analysis. An incoherent value for the internal reference was considered to be a clue
to a problem occurring in that run.
Chapitre III
111
2.4. Determination of concentration of glycerol
We successfully solved the problem of easily dosing glycerol in a huge quantity of
wine samples, using in the analytical method the “internal standard” 1,5-PD. This compound
is, in fact, structurally similar to glycerol, but less polar. Its retention time was 500 s, whereas
that for glycerol was 680 s, as shown in Figure 5.
The formula we used to calculate the concentration from the experimental data was:
Where:
a. The sub-index “Sample” in CXSample, indicates the concentration % (w/V) of X
species in the sample;
b. CglycSt and C1,5PDSt indicate the concentration of glycerol and of 1,5-PD in the
standardization solution to measure the St
St
glyc
1,5PD
SS
ratio;
c. SSample is the experimental surface value of the peaks, measured and given, by
integration, in V•s by the IRMS instrument.
In order to have comparable peaks, in our GC-C-IRMS system, the concentration of
1,5-PD in solution was almost halve of that of glycerol. A solution of 2 g/L in glycerol and of
1 g/L in 1,5-PD gave comparable peaks.
For calibration measurements, final concentrations in samples were: C1,5PDSt = 0.053 %
and CglycSt = 0.098 %. During the routine measurements, C1,5PDSample = 0.053 %.
Two glycerol solutions have been used to test this method. Assuming that the typical
concentration of glycerol is 4-10 g/L in dry wine, the two solutions prepared, should represent
this range. The first solution containing 4.0 g/L is lower than the content observed in most of
the wines, gave an experimental concentration of 3.6 g/L (SD 0.2, n=8). The second solution
(8.0 g/L), whose glycerol amount was more similar to real wines, gave a value of 7.9 g/L (SD
0.3, n=8).
Equation 2
St St SampleSample Sample
St St Sample
glyc 1,5PD glycglyc 1,5PD
1,5PD glyc 1,5PD
C S SC CC S S
= ⋅ ⋅ ⋅
Chapitre III
112
Figure 5: IRMS-Chromatogram of 1,5-pentanediol and glycerol from wine
1,5-
pent
aned
iol
Chapitre III
113
Also, seven genuine, already dosed, wines (Table 2) were injected to test the method.
These wines were chosen among our BIPEA alcoholic beverage sample data bank.
3. RESULTS Preliminary study has been performed on four synthetic wine solutions (water-ethanol-
glycerol), prepared using glycerol samples from different origins and with a δ13C value
already determined by EA-IRMS. Values obtained by GC-C- and EA-IRMS are reported in
Table 3. The results of both techniques, plotted on graph, show perfect linearity, as can be
seen in Figure 6, and no particular deviation between these two different systems has been
observed. Almost the totality of wines showed no overlapping between 1,5-PD and other wine
components, except sometimes in sweet wines, because of by-products from combusted
sugars.
The range of glycerol concentration observed in our samples was quite typical, mostly
5 to 15 g/L. Just few remarkable samples gave very low – from 1.5 to 5 g/L – or very high
values – from 18 to 23 g/L – values (Table 4).
Not surprisingly, these wines were produced from Semillon and Gewürztraminer
varieties that are, as is well-known, among the grapes that most benefit from the action of the
B. cinerea fungus.
Two of BIPEA wines were considered to be blind samples, as their concentration was
not available in archives. Our results have successively been confirmed by the BIPEA’s
scientific and technical staff.
Table 2: Comparison of glycerol concentrations in five BIPEA wines (a)
BIPEA wines Feb-99 Nov-99 Feb-00 Sep-01 Nov-01 Mar-97 May-97
Type White Rosé White Red White Red Red
BIPEA range 6.2 - 8.4 4.8 - 6.6 5.7 - 7.7 6.3 - 8.5 4.6 - 6.2 n.d. n.d.
BIPEA mean value 7.3 5.4 6.7 7.4 5.4 7.2 (b) 6.6 (b)
Conc. by GCC-IRMS 6.4 5.4 6.7 7.8 5.4 7.4 6.2 (a) BIPEA determinations were performed by HPLC and/or enzymatic analysis. Concentrations are given
in g/L. n>3 and SD < 0.6 . (b) Personal communication from BIPEA’s scientific and technical responsible.
Chapitre III
114
Figure 7 shows that for genuine wines, the correlation between δ 13C of glycerol and δ
13C of ethanol from the same source is quite good (R = 0.90). As expected, glycerol is more
depleted in δ 13C than ethanol, because of a major isotope fractionation on position 1 during
the biosynthesis [17]. The average difference δ13Cglycerol - δ13Cethanol is -2.1 ‰, very close to
-2.3‰ that is the value reported by Weber in a controlled and not inhibited fermentation
medium, but the range we observed is very wide, -4.1 to -0.1 ‰. Nevertheless, we observed
an enrichment in 13C in wines with a high content of glycerol. In these cases, in fact, the
difference δ13Cglycerol - δ13Cethanol is not negative. For a few wines, very rich in glycerol, the
differences of values observed were positive and in the range 0.3–0.85‰ (Table 4). In these
cases a strong contribution is supposed to be given by exogenous glycerol, metabolite of B.
cinerea, through a different biosynthetic pathway (as explained below), affecting the global
δ13C value. Figure 8 shows that glycerol concentration and ethanol content of wines are in
good correlation. Logarithmic trend is slightly (R = 0.75) better than linear one (R = 0.70).
4. CONCLUSIONS
In conclusion, the advantages of the online GC-C-IRMS technique to measure δ13C on
glycerol, with respect to offline methods, are the following:
• GC-C-IRMS offers easy sample preparation, it is not time-consuming, it has good
repeatability, and it does not show isotopic effect.
• Injection in column is totally machine-controlled, so that the analysis is feasible on a
routine scale.
• Measurements of 13C/12C are truly performed on target molecule under study, not on
bulk product which could include impurities.
• Furthermore, we expect that the same sample preparation used for GC-C-IRMS, could
be suitable to perform online measurements of δ2H and δ18O on glycerol with a gas
chromatography-total combustion-elemental analyzer (GC-TC-EA, based on
pyrolysis) system.
• The use of an internal reference as 1,5-PD, offers the double benefit of allowing in the
same measurement both the determination of glycerol concentration and a control
over the validity of the run itself.
Chapitre III
115
Table 3: Comparison of glycerol δ13C values by GC-C and EA-IRMS techniques (a)
Origin Commercial glycerin Vegetal glycerin Maize oil Cheese
GC-C -27.04 -22.65 -15.39 -28.33
EA -27.67 -22.60 -15.22 -28.13 (a) Values of δ13C are expressed in ‰ vs. PDB. n>3, SD< 0.6 for GC-C-IRMS; n=3, SD < 0.1 for EA-
IRMS.
Figure 6: δ13C values of glycerol samples by GC- and EA-IRMS to test linearity
GC vs EA δ13C values of glycerol's
R = 0,999
-32,0
-26,0
-20,0
-14,0
-32,0 -26,0 -20,0 -14,0
δ13C by GC-C-IRMS [‰] vs. PDB
δ13C
by
EA-IR
MS
[‰] v
s. P
DB
Table 4: Concentration and 13C content of glycerol in wines particularly rich in glycerol.
(a) Concentrations are given in g/L, δ13C is in ‰ vs. PDB. (*) SD>0.6
Country Grape variety Glycerol (a) δ13Cglycerol (n=3) δ13Cethanol ∆δ
Austria Gewürztraminer 19.8 -28.4 -28.70 0.35
Austria Gewürztraminer 23.3 -27.5 -28.10 0.65
France Semillon 22.8 -24.5 (*) -25.30 0.85
Italy Frappato 18.0 -25.65 -25.94 0.30
Chapitre III
116
Figure 7: δ13C of glycerol vs. δ13C of ethanol, for 1998 and 1999 wines of 4 EU Countries.
France
R = 0,92 (*)
-30
-29
-28
-27
-26
-25
-24
-32 -31 -30 -29 -28 -27 -26 -25 -2413C glycerol [‰] vs. PDB
13C
eth
anol
[‰] v
s. P
DB
1998 1999
X red wine+ rosé wine
[glyc] =22,8g/L
(*) R calculated excluding the wine containing a high amount of glycerol.
Italy
R = 0,90
-30
-29
-28
-27
-26
-25
-33 -31 -29 -27 -2513C glycerol [‰] vs. PDB
13C
eth
anol
[‰] v
s. P
DB
1998 1999
X red wine+ rosé wine
Chapitre III
117
The reported values of δ13C for ethanol were measured on distillates, using EA-IRMS.
Portugal
R = 0,85
-30
-29
-28
-27
-26
-25
-24
-23
-32 -31 -30 -29 -28 -27 -2613C glycerol [‰] vs. PDB
13C
eth
anol
[‰] v
s. P
DB
1998 1999
X red wine
Spain
R = 0,91
-30
-29
-28
-27
-26
-25
-33 -32 -31 -30 -29 -28 -2713C glycerol [‰] vs. PDB
13C
eth
anol
[‰] v
s. P
DB
1998 1999
X red wine+ rosé wine
Chapitre III
118
Figure 8: Correlations of glycerol concentration (g/L) versus ethanol content (% V/V) of
wines
[glycerol] vs. % ethanol
Linear trend: R = 0,70
5
7
9
11
13
15
17
19
21
0 5 10 15 20 25
[glycerol]
Tq e
than
ol
1998 1999
X red wine+ rosé wine
[glycerol] vs. % ethanol
Log trend: R = 0,75
5
7
9
11
13
15
17
19
0 5 10 15 20 25
[glycerol]
Tq e
than
ol
1998 1999
X red wine+ rosé wine
Chapitre III
119
∗∗∗ For the purpose of this research, we did not separate the isotopic contribution of
glycerol produced as metabolite by Botrytis and that from normal alcoholic fermentation, by
Saccharomyces cerevisiae. We performed measurements on the sum of endogenous and
exogenous glycerol. To discern the single contribution, an indirect analysis on the base of the
amount of gluconic acid, which is a specific metabolite produced by Botrytis, would the
proportions of glycerol [21] produced, respectively, by Saccharomyces and Botrytis to be
determined.
As glycerol δ13C values are more positive for Semillon and Gewürztraminer wines
with respect to those of nonbotrytisized wines, glycerol produced by B. cinerea should have a
higher content in 13C, with the effect of increasing the overall δ13C value of glycerol in wine.
This could be explained by the fact that B. cinerea uses tartaric [22] and malic acids [23,
24] of grape for its metabolism, to synthesize gluconic acid and then to excrete glycerol. In
fact, tartaric and malic acids contained in must and wine have higher δ13C values [25] than
sugars metabolized by yeast to produce ethanol.
In the case of sweet wines, gas chromatography was not sufficient to adequately
separate glycerol from other components that become as concentrated as glycerol. This issue
should be solved optimizing the chromatographic conditions for the specific cases.
Even if these parameters do not seem efficient to determine the geographical origin or
the adulteration of a wine, this work shows interesting correlations between glycerol and
ethanol and as already observed for the multielement stable isotope approach [18], it could be a
relatively reliable technique to check if a wine has not been adulterated.
120
Bibliographie 1 J. Ribéreau-Gayon, Y. Glories, A. Maujean, D. Dubourdieu – In: Handbook of Enology. The Microbiology of Wine and Vinifications. Vol. II. (1st ed.), 1998, John Wiley and Sons, Ltd., New York. 2 P.G. Garoglio – In: La Nuova Enologia (III ed.), 1965, Istituto di Industrie Agrarie, Firenze, 456 3 E. Kielhöfer, G. Würdig – Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A, 1961, 114, 376-397 4 H. Nieuwoudt, B. Prior, I. Pretorius, F. Bauer – Glycerol in South African Table Wines: An Assessment of its relationship to wine quality, South African Journal for Enology and Viticulture, 2002, 23, 1, 22-30 5 H. Nieuwoudt, B. Prior, I. Pretorius, F. Bauer – Glycerol and wine quality: Fact and fiction, Wynboer, 2002, 9, 9, 96-101 6 I. Pretorius – Yeast, 2000, 16, 675-729 7 E.C. Regulations n° 822/87, appendix IV 8 Project N° GRD-2000-25034, Contract N° G6RD-CT-2000-00416, “Determination of Glycerol in wine – comparison and validation of existing methods” 9 A.M. Calvin, J.A. Bassham, In: The photosyntesis of carbon compounds, Benjamin, New York, 1962 10 M.D. Hatch, C.R. Slack, Annual Revue of Plant Physiology, 1962, 21, 141 11 T. Whelan, W.M. Sackett, C.R. Benedict, Plant Physiology, 1973, 51, 1051 12 Eurofins Scientific, France – personal communication 13 A. Rossmann – Determination of stable isotope ratios in food analysis, Food reviews International, 2001, 17, 3, 347-381 14 CEN/TC 174 n° 108, n° 109, n° 110, 29 Feb. 1996 15 E.C. Regulation n° 2676/90, Official Journal of the European Communities, 1990, n° L 272, vol. 33, p. 64, and latest emendations. 16 G. Calderone, C. Guillou, N. Naulet – Utilisation réglementaire des analyses isotopiques des aliments - Dix ans d'expérience européenne, L’actualité chimique 2003, 8-9, 20-22
Chapitre III
121
17 D. Weber, H. Kexel, H.-L. Schmidt – 13C-pattern of natural glycerol: origin and practical importance, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1997, 45, 2042-2046 18 A. Rossmann, H.-L. Schmidt, A. Hermann, R. Ristow – Multielement stable isotope ratio analysis of glycerol to determine its origin in wine, Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A, 1998, 207, 237-243 19 G. Fronza, C. Fuganti, P. Grasselli et al. – Determination of 13C content of glycerol samples of different origin, Journal of Agriculture and Food Chemistry., 1998, 46, 477-480 20 B.-L. Zhang, S. Buddrus, M. Trierweiler, G.J. Martin – Characterization of glycerol from different origins by 2H- and 13C-NMR studies of site-specific natural isotope fractionation, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1998, 46, 1374-1380 21 B. Holbach, R. Woller, Wein-Wissenschaft, 1976, 31, 202-214 22 B. Donèche – Métabolisme de l’acide tartrique du raisin par Botrytis cinerea - premiers résultats, Sciences des aliments, 1990, 10, 589-602 23 B. Donèche – Carbohydrate Metabolism and Gluconic Acid Synthesis by Botrytis cinerea, Canadian Journal of Botany, 1989, 67, 10, 2888-2893 24 L. Perez, M.J. Valcarcel, P. Gonzales, B. Domecq – Influence of Botrytis Infection of the Grapes on the Biological Ageing Process of Fino Sherry, American Journal of Enology and Viticulture, 1991, 42, 1, 58-62. 25 D. Weber, A. Rossmann, S. Schwarz, H.-L. Schmidt – Correlations of carbon isotope ratios of wine ingredients for the improved detection of adulterations - I. Organic acids and ethanol, Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A, 1997, 205, 158-164
Chapitre IV
Chapitre IV
125
Mesure du δ 13C de CO2 de boissons
gazeuses par CG-C-SMRI :
mise au point de la méthode et applications
l’occasion d’une notre collaboration à un « ring-test » 1 – ou test circulaire – dont le
but était de proposer à l’Organisation (ex-Office) International de la Vigne et du Vin
(OIV) de possibles méthodes pour mesurer le rapport 13C/12C du CO2 des vins mousseux,
nous avons proposé et mis au point l’analyse du CO2 par simple injection directe de l’espace
de tête du vin en GC-C-IRMS.
Ensuite nous avons amélioré cette méthode, d’abord pour la rendre plus automatisée et
aussi pour obtenir une meilleur répétabilité des mesures et enfin, nous avons testé sa validité
sur une gamme plus vaste de produits. A côté des vins mousseux et demi mousseux nous
avons analysé la teneur en 13C du CO2 contenu dans des bières, un cidre, des eaux gazeuses et
d’autres boissons pétillantes du commerce. Ce chapitre est une version qui réunit deux
articles : le premier (auteurs : G. Calderone, N. Naulet, C. Guillou, F. Reniero, A.I. Blanch
Cortes) paru sur Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2005, 19, 701-705 et le
second soumis au Journal of Agricultural and Food Chemistry (auteurs : G. Calderone, N.
Naulet, C. Guillou, F. Reniero).
1 “OIV collaborative study: 13C-IRMS analyses of CO2 in sparkling wines” (jan. 2003-mar.2004), organisé par Prof. Gemma Rauert du Departament de Quimica Analitica de l’Universitat de Barcelona et Dr Ana Isabel Blanch du Laboratorio Arbitral Agroalimentario – Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentation-Madrid
A
Chapitre IV
126
Analysis of the 13C natural abundance of CO2 gas
from sparkling drinks by GC-C-IRMS:
validation of the method
1. BACKGROUND tudies on plant metabolism and natural fractionation of stable isotopes, have
enabled access to an extremely useful tool in the fight against fraud in the food
products domain. Stable isotope ratio methods are based on the measurement of stable isotope
contents (2H, 13C, 15N, 18O) of a product or of a specific component such as an ingredient or a
target molecule of the product. The determinations can be carried out using isotope ratio mass
spectrometry (IRMS) techniques and they provide information on the botanical and
geographical origins which are often considered important characteristics of many food
products both by consumers and European regulations. Wider details about the detection of
botanical origin through isotopic ratio tools and their use in food analysis will be given in the
second part of this chapter.
Continuous flow gas chromatography-combustion (GC-C) coupled to IRMS (GC-C-
IRMS) is a relatively young technique which allows on-line measurements of the carbon-13
and nitrogen-15 content of many matrices in different fields [1]. Samples are injected into a
chromatographic column; the separated compounds are oxidized over a combustion oven to
CO2, H2O and NOx (if nitrogen is present). For 13C/12C measurements, CO2 is the gas
analyzed in the IRMS system and it bears the information about the 13C abundance of each
isolated molecule.
S
Chapitre IV
127
The GC-C-IRMS technique to measure the 13C/12C ratio of CO2 is used in the medical
field, for the qualitative yes-or-not test 13C-Urea Breath Test – based on the use of 13C-
enriched urea – to detect the presence of the bacterium Helicobacter pylori in the stomach.
Because of the strong activity of the urease enzyme of H. pylori, urea ingested is
hydrolyzed into ammonia and carbon dioxide. Transported by the blood stream, CO2 will get
to the lungs and then exhaled. If 13C-labelled urea is ingested, the breath will result enriched
in 13CO2. In this practice the usefulness of the GC separation is only to get pure CO2 in the
IRMS source.
On the other hand, the natural abundance δ13C value of CO2 can be an interesting
probe of the origin of the gas itself, for instance in sparkling alcoholic and non-alcoholic
drinks. For several fermented products carbon dioxide must reflect the botanic origin of
sugars from which the gas is originated. The European Union (EU) legislation [2] does forbid
the use of exogenous carbonic anhydride in semi-sparkling and sparkling wines, whose
category includes French Champagne, Italian Spumante and Spanish Cava. However, specific
national regulations are in force about carbonation of other fermented products such as beer,
cider or hydromel. Labeling of bottled carbonated waters as well must be in compliance with
EU regulations [3].
1.1. Carbon dioxide sources
As regards industrial CO2 sources, carbon dioxide gives a large range of δ13C values,
depending on the production plant: if originated from treatment of limestone in kiln δ13C is
around 0 ‰, while from combustion of natural gas it may go down to -75‰. CO2 can also be
recovered as a by-product from a fermentation process and reutilized, and then it could show
δ13C values very similar to the fermented products under analysis.
2. EXPERIMENTAL
2.1. Gas sampling
Aliquots of gas were normally collected through a 25 mL syringe, just by plunging a
long strong iron needle through the cork of unopened bottles when possible. CO2 pressure
Chapitre IV
128
spontaneously filled the syringe with the headspace gas. In case of products closed with
plastic caps or canned, the container was refrigerated to 2-4° C, in order to increase CO2
solubility in the liquid.
Once cooled, it was quickly transferred into a 500 mL Schott glass bottle, closed with
a holed screw cap that included 2 silicone septa. The spume which is produced very often in
some products (especially wines and beers) helped cleaning the bottle from the air inside and
the shaking increased gas pressure above the liquid. At room temperature, the gas was then
extracted as explained above, using a normal needle. In the case of industrially produced
carbon dioxide, stocked in cylinders, it was sampled by filling the syringe through the pipe
slot into the syringe. The gas was transferred from the syringe into 2 mL vials suitable for the
autosampler of our GC system. The vials used to store the gas, were previously crimped with
Teflon-silicone septum caps. To flush out the air inside – and thus the atmospheric CO2 – a
second needle was plunged into the septum as a vent, as schematized in Figure 1.
Figure 1: Transfer of headspace gas into a crimped vial with cleaning of volume
F
lush
ed a
ir fr
om v
ial
Headspace gas
from wine,
containing CO2 to
inject
* Note that vial is not in scale with syringe.
Chapitre IV
129
2.2. GC analyses
CO2 was purified and separated by using a gas chromatograph connected to the IRMS
by means of a combustion interface. A Varian 3400 (U.S.A.) gas chromatograph was used,
equipped with a Chrompack WCOT fused silica capillary column filled of bonded
polyethylene glycol (CP-WAX57CB, 25 m length, 0.25 mm i.d., 0.20 µm film thickness).
Similar results were obtained with a HP-INNOWax capillary column (cross linked
polyethylene glycol, 30 m x 0.25 mm, film thickness 0.5 µm).
Particular attention was put in mounting only deactivated silica capillaries, to avoid
the interaction of the effluents with metals, so to reduce isotopic fractionation. The
temperature of the column was kept at 50 °C.
The injections were totally automatic by mean of an A200S autosampler. 1 µL of gas
was directly introduced into the column by means of a 10 µL cemented-needle Hamilton
syringe, in high flow (ca 150 mL/min) split conditions. These conditions allowed reaching an
intensity of peaks (m/z 44 and 45) in the range of 5000-8000 mV. Helium Alphagaz 2 was
used as carrier gas and the pressure at the head of column was set to 20 PSI. The injector
temperature was set to 100 °C. Each sample was analyzed in 5 replications and the total run
time for each analysis was of about 500 sec.
2.3. Continuous Flow GC-C-IRMS configuration and 13C/12C ratio measurement
The gas chromatograph was coupled to a Thermo Finnigan (Bremen, Germany) Delta
Plus XP mass spectrometer coupled in line through a FinniganMat GC Combustion Interface.
In a classical GC-C-IRMS analysis after chromatographic separation each eluate is
submitted to a combustion and a reduction step, passing through the oxidation and the
reduction ovens. The combustion oven consisted of a 30 cm long ceramic tube filled with 3
thin (0.125 mm the diameter) braided wires: one of nickel, one of cupper and one of platinum.
The reduction oven consisted in an identical ceramic tube, but filled only with cupper wires.
Usual temperatures for 13C/12C or 15N/14N analyses are 960 °C for the oxidation oven and
640° C for the reduction oven. In this work, both ovens were kept at 100 °C, as we already
Chapitre IV
130
have CO2 gas and no reaction was considered to happen in them. A water removing trap was
also in line which consisted in the hygroscopic Naphion membrane.
Carbon dioxide, carried by the helium stream, arrived to the IRMS source for 13C/12C
analysis. Here the CO2 molecules were ionized and the ions collected by 3 different Faraday
cups depending on their m/z ratio of 44, 45 and 46. Figure 2 shows a schematic drawing of
the GC-C-IRMS configuration we used.
Isotope ratios are usually expressed as relative deviations δ ‰ (delta per mille)
compared to a standard. For 13C/12C the international standard is PDB (Pee Dee Belemnite,
limestone), a calcium carbonate.
Equation 1 1000C)C/(
C)C/(C)C/(CδPDB
1213PDB
1213sample
1213
PDB13 ⋅
−=
The gas chromatograph and the mass spectrometer system were piloted using the
Thermo Isodat NT 2.0 software under Windows XP operative system. The same software
allowed the acquisition of data and the calculation of the δ13C values against our CO2 gas
reference. Three reference CO2 pulse peaks were introduced into the IRMS source before the
first injection of CO2 sample. The software applied by default the “CO2 Santrock” correction
algorithm to calculate the deviations.
3. RESULTS
Measurements were performed on CO2 from several origins: fermented drinks,
mineral waters, non alcoholic fizzy drinks and industrial carbon dioxide from cylinder. δ13C
of each sample was calculated as the mean value of 5 injections in a single run. Figure 3
shows the resulting chromatogram of one analysis. The method was validated injecting the
reference CO2 itself (CO2-Ref.) in column, with an attributed δ13C value of -26.50 ‰.
The repeatability was very good, with a Standard Deviation SD < 0.1 ‰. Every CO2-
Ref. sample always revealed more positive δ13C values, of around 0.3-0.5 ‰, in respect to
assigned values (see Table 1).
Chapitre IV
131
Figure 2: Scheme of GC-C-IRMS configured for δ13C analyses of CO2
Chapitre IV
132
Figure 3: Typical chromatogram of a CO2 sample analysis by IRMS. δ13C is the mean value
over 5 repetitions in one run
Chapitre IV
133
3.1. Correction of data
As the system introduced some influence (such as isotope fractionation) whose effect
is seen as enrichment in the heavier isotope, 13C, a correction factor appeared necessary to
obtain more accurate analysis on real samples on the basis of reference gas self-comparing.
The order of this factor was calculated as the mean value of 15 injections from 3 different
aliquots of CO2-Ref. collected into vials and measured as usual against pulses of the same gas
used as reference, introduced from cylinder directly into the IRMS. The correction factor was
-0.4 ‰ and was systematically added to correct δ13C of real samples.
Table 1: Injection of CO2 reference gases to validate the method
Validation of method
Origin δ13C SD δ13Creal – δ13Cmeasured
Cylinder CO2-Ref. vial 1 -26.05 0.02 -0.45
Cylinder CO2-Ref. vial 2 -26.25 0.06 -0.29
Cylinder CO2-Ref. vial 3 -25.95 0.03 -0.55
Values of δ13C are expressed in ‰ vs. PDB (n=5)
δ13Creal of CO2-Ref. = -26.50 ‰
Also the trend of δ13C values all along several CO2 injections from the same vial was
considered. After 20 injections, as shown in Figure 4, the maximum difference was 0.2 ‰,
that is the same order of SD and, in any case, the auto sampling step did not appear as the
most influencing process if measurements are performed in a short time delay after sample
preparation.
Chapitre IV
134
To test the method on real samples, products on the market were bought and their CO2
was analyzed. This part of the analyses performed is discussed in the second part of the
chapter
Figure 4: δ13C values trend of subsequent injections from the same vial containing CO2
Trend of δ13C value
-26.5
-26.0
-25.5
1 6 11 16 21Injection
δ13C
[‰] v
s PD
B
4. CONCLUSIONS: METHOD
Previous methods [4-6] based on the isolation of pure carbon dioxide, before injecting it
into the mass spectrometer, required several steps for purifying headspace gas from water and
ethanol (whose mass 46 is isobaric and interfering in analysis with some CO2’s isotopomers: 12C16O18O, 12C17O2 and 13C17O16O) including cryogenic distillation process and cold traps. In
addition, analyses were performed in dual inlet mode. Even the continuous flow method
previously described [7] required a dedicated on-line system with a cryogenic trap and a
vacuum line. On the contrary, with the GC-C-IRMS technique, capillary columns, at the
temperature set for this analysis and due to their polar stationary phase, acted as a trap for
water and ethanol possibly present in the headspace, therefore the main component eluted was
the CO2.
Chapitre IV
135
The GC-C-IRMS method we tested offers some clear advantages, even more
remarkable if we consider the ever more spreading diffusion of this system:
• It requires no purification steps before analysis;
• It is very simple and rapid (less than 10 min per sample);
• It offers good repeatability (SD < 0.1‰);
• Further, each CO2 sample can be injected many times from the same vial without
introducing errors.
The correction method can be improved, for instance bracketing a batch of samples
with a CO2 gas of known isotopic composition (working standard), in order to compensate
eventual drift or influences from the GC apparatus. But, at the moment, the proposed method
is sufficiently precise to control the compliance with regulations and labeling.
∗∗∗
Chapitre IV
136
Characterization of sparkling drinks by GC-C-IRMS
analysis of 13C/12C ratio data on CO2
5. INTRODUCTION
arbonated drinks are among the mostly marketed foodstuff in the world. Carbon
dioxide is a magic ingredient which gives drinks a sourer and a more pleasant
taste. Bubbles characterize several beverage products, either naturally present or added: wine,
beer, water, cider, hydromel, soft-drinks, etc.. Its pureness grade, concentration and origin in
beverages are strictly regulated in EU.
5.1. Stable isotope ratio methods in food
In the last twenty years, the measure of the stable isotope content has showed its
convenience as a tool in the fight against fraud in the food products domain [8]. These methods
are based on the measurement of the stable isotope ratio (2H/1H, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O, 34S/32S) of a product or of a specific component such as an ingredient or a target molecule of
the product. The determinations can be carried out using nuclear magnetic resonance (NMR)
and/or isotope ratio mass spectrometry (IRMS) techniques and they can provide information
on the botanical and geographical origins.
Since 15 years [9], the EU and the OIV have adopted analyses of 2H/1H, 13C/12C and 18O/16O in their regulations [10, 11] as official methods to assure the authenticity of wine. In the
same way, industrial production has implemented the use of routinely isotope ratio analyses
C
Chapitre IV
137
also to assess the origin of flavors and aromas, honeys [12] and fruit juices [13]. Focusing only
on the naturally distributed 13C/12C ratio, a wide range of δ13C values is observed, thus the
headspace CO2 of a product can be an interesting probe of its authenticity, especially if in
combination with isotopic data of other components, such as ethanol in fermented drinks.
5.2. Rapid measurement of the 13C content of CO2
The aim of this study is that of illustrating an easy technique to analyze the 13C/12C
ratio in natural abundances of CO2, whose use as a probe to characterize and test beverages
origin is currently limited because of the technical difficulties to collect and purify the gas.
So we set up a method to measure the 13C natural abundances of CO2, by direct
injection of the gas into our current GC-C-IRMS system having the exigency to appreciate
small differences in the 13C content, to possibly have a tool to verify that sparkling beverages
are in compliance with regulations and labeling.
5.3. Fermented beverages
It is well known that plants can be classified into three groups depending on the
photosynthetic path followed in sugar synthesis: C3 or Calvin cycle [14], C4 or Hatch-Slack
cycle [15] and CAM (Crassulacean Acid Metabolism) [16, 17]. C3 species such grape and beet
contain sugars with a lower 13C content than the sugar from C4 plants like cane sugar and
maize. This difference is maintained in the 13C content of the fermentation products of sugars,
ethanol and CO2. CAM species are in-between C3 and C4, so the 13C content of their
metabolites. Therefore, in fermented products carbon dioxide must reflect the botanical origin
of sugars from which the gas is produced.
5.3.1. Sparkling and semi-sparkling wines
Sparkling and semi-sparkling wines – whose category includes French Champagne
(approximately 262 million bottles produced in 2002, out of a total of 442 million bottles of
vins moussants), Italian Spumante (approx. 250 million bottles in 2002) and Spanish Cava
(approx. 230 million bottles in 2002 [18]) – are traditionally produced by a second
fermentation that originates from added sugar to already fermented wine, directly in bottles
Chapitre IV
138
(Champenois or Champagne method) or in tanks (Charmat Process). An industrial
gasification is possible, the carbonation, by direct injection of “food grade” CO2. EU
legislation [11] does forbid the use of any exogenous carbonic anhydride in semi-sparkling and
sparkling wines.
Earlier studies on the 13C content of CO2 and ethanol from sparkling wines [4, 6] have
shown δ13C values in a range of -17 to -28‰ for CO2 from C3 plant sugars (beet, grape) and
of around -9‰ if added sugars are from C4 plants (cane, corn). δ13C values below -30‰ or
above -7‰ can be indicative of a gasified wine. Consequently, the 13C/12C isotope ratio of
CO2 in sparkling wine is governed by the type of sugar used in the second fermentation (C3
and/or C4) or by the isotopic composition of the added industrial CO2.
5.3.2. Beers
Despite the countless varieties of this beverage, beer is defined all over the world
essentially as the fermentation product of musts prepared of malted barley, yeasts
(Saccharomyces carlsbergensis or S. cerevisiae), water and hops, as flavoring agent. Malted
barley can be substituted with other cereals (wheat, rice or corn) in variable percentage,
depending on the specific national regulations. Actually, among the EU and the European
Economic Area (EEA) countries, there is no unique law that regulates production of beer, but
each country is obliged to the mutual acceptance. However, European national regulations are
mostly modeled on the old German Reinheitsgebot (originally enacted in 1516) or
“Germany’s Beer Purity Law” [19] that imposed strict brewing standards.
From the economical point of view [20], according to estimations, in 1998 global beer
consumption in 68 countries surveyed reached 123.4 billion liters, with the Americas being
the largest market with a consumption of 44.9 billion liters. In 2000 the global consumption in
EU was about 30 billion liters, with an average annual consumption of 76 liters per capita,
going from 125 liters per person in Germany and Ireland, to 28 in Italy. This estimation did
not consider the Eastern-Central European production, where the consumption was around 55
liters per capita in 2003, with a peak of 159 liters per person in Czech Republic.
Due to the high quantity of amides, beer is rich in carbonic anhydride, being in a
continuous state of fermentation. Even so, CO2 addition may occur in order to strengthen
poorly carbonated beers, in mix with nitrogen to help foaming or spilling procedures, and, as
Chapitre IV
139
in wine as well, to prevent fungal and bacterial growth. The interests to test the 13C content of
CO2 in beers could be two: 1) in analogy with sparkling wines, to authenticate the natural and
not exogenous origin of the gas, as many countries forbid industrial carbonation; 2) to
confirm the composition in label, if reported, since cheaper ingredients (corn, millet or
sorghum, depending on the country) or even sugars could be added to accelerate the
fermentation process and reduce costs.
Previous studies [21-23] have applied stable isotope ratio techniques to the authenticity
of beers, but the 13C-IRMS analysis of CO2 had not been considered yet.
5.3.3. Fermented fruit juices and hydromel
Other minor fermented beverages are cider and perry (or Perry pear cider), derived,
respectively, from apple and pear juice, and hydromel which is obtained from fermentation of
honey in water. Cider is principally produced in specific regions of England, France, Spain, in
Scandinavian countries and in the USA, where today it is mostly a non-alcoholic beverage.
National legislations can vary, but as European quality policies protect geographical
origin [24], traditional recipes and production methods of foodstuff [25], we must consider
genuine only those ciders, perries and hydromels which are not adulterated with extraneous
carbon dioxide or sugars (added to promote a second fermentation), whereas carbonation is
permitted in the USA.
5.4. Sparkling waters
Classification and labeling of bottled mineral waters as well must be in conformity
with EU regulations [3, 26]. With regard to sparkling waters, they fall into three categories:
1. "naturally carbonated", when the water content of carbon dioxide from the spring after
decanting, if any, and bottling is the same as at source;
2. "fortified with gas from the spring" if the content of carbon dioxide from the water table
or deposit after decanting, if any, and bottling is greater than that established at source;
3. "carbonated" if carbon dioxide is added of an origin other than the water table or deposit
from which the water comes.
Italy is the largest bottled water consumer in Western Europe, with total volume sales
of 10.2 billion liters in 2003 [27], so it is perhaps the largest consumer in the World, with 177
Chapitre IV
140
liters per person of annual consumption, whereas the French consume approximately 133
liters per capita, Belgians 124, Germans 101, Americans 76, Canadians 30 and the Dutch 19.
Sparkling waters represent 35% of total bottled water consumption in Italy, with a growing
trend mostly for waters labeled as “lightly carbonated” and “naturally sparkling”, considered
healthier than industrially carbonated waters because of a negative image regarding high
levels of sodium. The commercial value of naturally carbonated waters is usually higher than
artificially carbonated ones, and then a rapid control of CO2 origin could help in authenticity
assessment.
5.5. Soft-drinks
For soft-drinks it is usually required the use of industrial “food grade” carbon dioxide,
destined to human consumption. Nevertheless, some country, as Italy, requires the indication
of the production plant in label.
Although consumption of fizzy drinks in the EU are decreasing as this product type is
increasingly perceived as unhealthy, in antagonism with bottled waters and with fruit juices.
Still the market is enormous and it was estimated, in 2003, that 93 % of the Swedish and
Americans consumed soft drinks, while in Great Britain this percentage reached 79 %, in
France 74 %, in Poland 71% and in Germany a lower, but still high 61 %.
6. MATERIALS AND METHODS Samples of several types of beverages have been analyzed. Besides the 13C/12C ratio of
headspace CO2, also the 13C content of ethanol distilled from fermented drink samples was
measured. The details of experimental procedures for the analyses of the 13C/12C ratio of CO2
and the GC-C-IRMS configuration have been previously explained in paragraph 2.
6.1. 13C/12C of ethanol
Fermented products were distilled using Cadiot columns with rotating band, that allow
to collect ethanol with a final alcoholic strength > 92 % w/w. The adopted conditions of this
step are such no to induce any isotopic fractionation. This distillation method is that
prescribed by EU regulations for wine analyses [10].
Chapitre IV
141
13C/12C ratio measurements on ethanol’s were performed by our routine EA-IRMS
system, composed of a Carlo Erba (Milan, Italy) elemental analyzer coupled, through a
ThermoFinnigan Mat ConFLO interface, to a ThermoFinnigan Delta Plus mass spectrometer.
Each ethanol was injected 3 times, and the first injection was systematically discarded in the
mean δ13C value. The Standard Deviation SD was < 0.2 ‰.
7. RESULTS Measurements were performed on CO2 from several drinks: we bought in different
European countries 45 samples including fermented drinks, mineral waters, non-alcoholic
fizzy drinks, new “slightly alcoholic” products, covering as much as possible the assortment
of sparkling beverages present on the market. The δ13C of each sample was calculated as the
mean value of 5 injections in a single run.
7.1. Market samples
Results are given in Table 2 (wines), in Table 3 (beers), in Table 4 (waters) and in
Table 5 (soft drinks).
7.1.1. Sparkling wines
As expected, we can distinguish two kinds of sparkling wines, depending on the added
sugars for the second fermentation. For wines probably added with C3 (beet) sugars, the δ13C
range is -19.23 to -21.12 ‰ for CO2 and -27.2 to -26.3 ‰ for ethanol, with a regular
difference δ13CCO2 – δ13Cethanol of about 7 ‰ (SD 0.75), very close to the 6.6 ‰ value reported
by Weber [28] in a controlled but not inhibited fermentation medium (beet glucose).
As example of the second wine type, sample Spumante 3 showed a CO2 δ13C value of
-9.7 ‰, next to the reported [6, 29] values for sparkling wines added with cane sugar (C4 plant).
The 13C content of ethanol seemed not particularly affected by added sugar, showing a value
of -25.8 ‰, only slightly more positive than for C3-added wines, indicating moreover that
sugar was probably added, as imposed by EU norms [2], in the already fermented wine and not
in the must.
Chapitre IV
142
The cider sample as well was put in Table 2, even if it is not a product with added
sugar, since its 13C properties superimposed to those of wine samples, with a negative shift of
approximately 2 ‰ over the averages of C3-added wines. This lower values for an apple (C3
plant) derived product were absolutely in the range of ethanol δ13C we observed for ethanol
distilled from Calvados spirit (obtained from cider) and many genuine European wines.
Table 2: 13C content of headspace CO2 and ethanol of sparkling wine samples
Sparkling wines and cider
Sample Origin δ 13C CO2 δ 13C ethanol ∆δ
Sparkling 1 Veneto, N-E Italy -19.23 -27.2 7.9
Sparkling 2 Minho, N Portugal -19.50 -26.3 6.8
Spumante 1 Veneto, N-E Italy -19.43 -26.4 7.0
Spumante 2 Veneto, N-E Italy -21.12 -27.2 6.1
Spumante 3 Veneto, N-E Italy -9.68 -25.8 16.1
Cider Normandie, N-W France -22.17 -28.9 6.7
Values of δ 13C are expressed in ‰ vs. PDB.
For CO2 δ 13C values measurements by GC-C-IRMS SD < 0.1 ‰ (n=5).
For ethanol δ 13C measurements by EA-IRMS SD < 0.2 ‰ (n=2).
7.1.2. Beers
In the case of beer, the GC-C-IRMS measurement of CO2 hopefully could help to
verify that products are in conformity with the ingredients declared in label. On the base of
δ13C values of CO2 and of ethanol, we can distinguish our samples (Table 3) in three groups:
1. beers 9, 10, 16, and 17 having CO2 δ13C > -21 ‰. This could be a clue of C4-plant
ingredients (perhaps maize: Italian regulations do not impose to specify beer composition
Chapitre IV
143
in label, but these two beers were produced in Northern Italy, where corn is widely
cultivated) in the two first samples, and is a confirmation of maize use for the latter two.
The presence of C4-plant ingredients is also confirmed by the relatively high values of
ethanol δ13C (-21.8 to -17.5 ‰), except for beer 16 (-24.0 ‰);
2. beers 1, 2 and 6 with very negative CO2 δ13C values, < -30 ‰, but their δ13C ethanol
values (-27.8 to -27.0 ‰) were still in the C3 plants range. These negative values for CO2
could be an indication of industrial carbonation (as confirmed by the producer of our Irish
beer sample, added of carbon dioxide and nitrogen to improve froth) or possibly of the
particular process, if we consider both the double malt beers. For these last, further,
ethanol δ13C had not discriminating values;
3. the remaining beers with intermediate CO2 δ13C values, between -27.99 and -21.41 ‰
and very close δ13C values for ethanol, around -26.5 ‰. In the group of the four Czech
beers, sample 13 had a more positive δ13C value for ethanol (-21.1 ‰) indication of
possible addition of corn sugar, as permitted by Czech Republic regulations, until a limit
amount of 30 %.
7.1.3. Sparkling waters
The group of waters (listed in Table 4) labeled as naturally carbonated showed a δ13C
range of -4.5 to 1.05 ‰, values compatible with natural CO2, with an important exception:
sample Naturally sparkling 5 clearly appeared as mislabeled, showing a CO2 δ13C value of
-42.1 ‰, typical of industrial carbonation. The possible explication could be that, since the
same producer bottles both naturally sparkling and carbonated water, it was hopefully an error
in the packaging step.
In the same group, the sample Naturally sparkling 9 of bottled water from Nepi (VT-
Italy), had confirmation of its CO2 13C content, δ13C -1.12 ‰, in a recent work of mapping [30]
of geothermic parameters and thermal and cold springs with also associated CO2 vents in
central-southern Italy. This paper, in fact, reported a δ13C value of -1.30 ‰ for CO2 vents in
Nepi.
For the water samples labeled as carbonated, the interpretation of data for the first 4
carbonated waters could be ambiguous, as their CO2 13C contents were still compatible with
naturally sparkling waters.
Chapitre IV
144
Table 3: 13C content of headspace CO2 and ethanol of beer samples
Beers
Sample Origin Declared type/
composition δ13C CO2 δ13C ethanol ∆δ
Beer 1 Belgium double malt -32.29 -27.0 5.3
Beer 2 France double malt,
12% alcohol -31.34 -27.1 4.2
Beer 3 Germany Weißbier,
wheat/barley -21.41 -26.7 -5.3
Beer 4 Germany Weißbier,
wheat/barley -27.99 -26.7 1.3
Beer 5 Germany Weißbier,
wheat/barley -26.13 -26.0 0.1
Beer 6 Ireland barley -30.39 -27.8 2.6
Beer 7 Italy rice/barley -23.64 -25.5 -1.8
Beer 8 Italy pure malt -26.31 -26.7 -0.3
Beer 9 Italy n.d. -20.96 -21.8 -0.8
Beer 10 Italy n.d. -20.29 -19.9 0.3
Beer 11 Czech Republic barley -24.83 -25.8 -1.0
Beer 12 Czech Republic barley -24.23 -25.6 -1.4
Beer 13 Czech Republic barley -22.52 -25.7 -3.2
Beer 14 Czech Republic barley -23.66 -21.1 2.6
Beer 15 Poland n.d. -24.43 -25.8 -1.4
Beer 16 Spain barley/rice/maize -20.31 -24.0 -3.7
Beer 17 Mexico maize/rice/barley -17.37 -17.5 -0.2
Values of δ13C are expressed in ‰ vs. PDB.
For CO2 δ13C values measurements by GC-C-IRMS SD < 0.1 ‰ (n=5).
For ethanol δ13C measurements by EA-IRMS SD < 0.2 ‰ (n=2).
Chapitre IV
145
This could be explained with the carbonation with CO2 from thermal treatment of
carbonates or from CO2 collected from other sparkling water sources, as occurred for sample
Carbonated 1, labeled in Italy as “addizionata” and not as “frizzante naturale”. On the other
hand, both the samples at bottom of the list showed unambiguous δ13C values (-29.1 and -54.1
‰) typical of added industrial CO2, in conformity with the label.
Table 4: 13C content of headspace CO2 from sparkling water samples
Sparkling waters
Sample Origin/bottling plant δ13C CO2
Naturally sparkling 1 Vergèze, France -4.35
Naturally sparkling 2 Gerolstein, Germany -3.33
Naturally sparkling 3 Roma, Italy -3.32
Naturally sparkling 4 Vicopisano (PI), Italy -4.49
Naturally sparkling 5 Roma, Italy -42.10
Naturally sparkling 6 Riardo (CE), Italy -0.38
Naturally sparkling 7 San Gemini (TR), Italy -2.95
Naturally sparkling 8 Anguillara Sabazia (RM), Italy 1.05
Naturally sparkling 9 Nepi (VT), Italy -1.12
Carbonated 1 San Pellegrino Terme (BG), Italy -5.12
Carbonated 2 * Caslino al Piano (CO), Italy 1.33
Carbonated 3 * Caslino al Piano (CO), Italy -3.30
Carbonated 4 Popoli (PE), Italy 2.12
Carbonated 5 San Giorgio in Bosco (PD), Italy -29.24
Carbonated 6 Crodo (VB), Italy -54.15
Values of δ13C are expressed in ‰ vs. PDB.
For CO2 δ13C values measurements by GC-C-IRMS SD < 0.1 ‰ (n=5).
Chapitre IV
146
Table 5: 13C content of headspace CO2 from fizzy drink samples
Soft- and slightly alcoholic drinks
Sample Production plant δ13C CO2
Cola 1 Nogara (VR), Italy -5.00
Cola 2 * Caslino al Piano (CO), Italy 2.08
Soda * Caslino al Piano (CO), Italy 1.89
Tonic water Scorzè (VE), Italy -7.29
Rum base S. Mariano C.se (CO), Italy -39.68
Vodka base Turin, Italy -33.73
Panaché (lemonade + beer) Hochfelden, France -29.26
Values of δ13C are expressed in ‰ vs. PDB.
For CO2 δ13C values measurements by GC-C-IRMS SD < 0.1 ‰ (n=5).
7.1.4. Soft-drinks
Analyses were performed to measure δ13C of CO2 from soft drinks (Table 5). These
examples are reported to demonstrate how the different production plants – which, according
to some national regulations, must be clearly indicated in label – could be discriminated on
the base of the 13C fingerprint of industrial food grade CO2 they use for the carbonation of
beverages. The same product manufactured in different plants could show isotopically
different CO2, but different drinks produced in the same plant, should have the same 13CO2, at
least in the same period of production.
Four samples, labeled as coming from the same production plant, were marked with an
asterisk: Carbonated 2 and 3 from waters in Table 4, Cola 2 and Soda from soft-drinks in
Table 5. While δ13C values of 3 out of them were comparable – Carbonated 2, 1.3 ‰, Soda,
1.9 ‰ and, Coca 2, 2.1 ‰ – the second water, Carbonated 3, had a fairly different δ13C,
-3.3 ‰. We can only suppose that perhaps the producer indicated in label did use different
Chapitre IV
147
CO2 suppliers or CO2 from different suppliers to carbonate the two waters or even that the
bottling was not made in the indicated plant.
The 3 last samples of Table 5 are examples of slightly alcoholic drinks, essentially
prepared with an alcoholic drink diluted in carbonated waters and added with flavors (beer,
but also martini, rum and vodka in the newest modern beverages aimed at younger people).
Their strong negative δ13C values of CO2 (around -30‰) reflected the use of the sparkling
water to produce them, as correctly labeled.
8. CONCLUSIONS: APPLICATIONS
In the case of headspace CO2 from sparkling wines, it has been confirmed the
helpfulness of comparing δ13C of this gas to that of ethanol to authenticate the production
method or to detect irregular carbonation, thus the GC-C-IRMS technique could be used
routinely and with efficacy in a possible implementation of CO2 analysis in existing
regulations. More extensive studies on ciders and perries could be of interest for the
authentication of these products which are minor but quite diffused in many regions.
Due to the innumerable varieties of beers and to a strong fragmentation of the
regulations in the different countries, it is not possible at the moment to draw important
conclusions from only CO2 analysis, also because of the low number of samples. Also the
differences δ13CCO2 – δ13Cethanol were too dispersed. Nevertheless, thanks to the rapidity of 13C/12C ratio determinations in CO2 by GC-C-IRMS to characterize beers makes the subject
worthy of future deeper studies.
As demonstrated in one of the samples, 13C/12C analysis on CO2 could be an
immediate test to discriminate addition of exogenous industrial carbon dioxide in sparkling
waters. Mineral waters are also listed until 2014 among the protection of geographical
indications and designations regulation [24] and isotopic analysis of CO2, beside 18O of water
could be a probe of authenticity. Nevertheless, the support of up-to-date mapping of isotopic
properties of sources from where water is extracted to be bottled surely would bring to more
truthful responses in ambiguous cases. This database of water sources could be built in a
Chapitre IV
148
relatively short period, as any source must be listed and analyzed in many biological,
chemical-physical and geological properties at most every 5 years [26].
The isotopic fingerprints of CO2 could give an indication about the production plant of
fizzy drinks, whose location is obligatorily specified in label following some national
regulations.
For any kind of sparkling beverages, the GC-C-IRMS technique we studied could be
an effective method to rapidly measure the 13C natural abundance in CO2, although, in
general, the CO2 analysis can not give a ultimate response, because of the multiplicity of
industrial CO2 sources – let us consider for instance the use of CO2 recovered from
fermentation processes in industrial carbonation which might mislead our responses in the
analysis of fermented products – but it can be very useful in combination with other isotopic
data.
149
Bibliographie 1 W. Meier-Augenstein – Review: Applied gas chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1999, 842, 351-371 2 CE Regulation N° 1493/1999 of 17 May 1999 on the common organisation of the market in wine 3 Council Directives 80/777/EEC and 80/778/EEC of 15 July 1980 on “the approximation of the laws of the Member States relating to the exploitation and marketing of natural mineral waters” and “relating to the quality of water intended for human consumption” 4 J. Dunbar – Use of 13C/12C ratios for studying the origin of CO2 in sparkling wines, Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 1982, 311, 578-580 5 R. Guilluy, F. Billion-Rey, C. Pachiaudi, S. Normand, J.P. Riou, E.J. Jumeau, J.L. Brazier – On-line purification and carbon-13 isotopic analysis of carbon dioxide in breath: evaluation of on-line gas chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 1992, 259, 193-202 6 I. González-Martin, C. González-Pérez, E. Marqués-Macías – Contribution to the study of the origin of CO2 in sparkling wines by determination of the 13C/12C isotope ratio. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1997, 45, 1149-1151 7 M. Boner, H. Förstel – Office International de la Vigne et du Vin, FV 1152 8 A. Rossmann – Determination of stable isotope ratios in food analysis, Food Reviews International, 2001, 17, 3, 347-381 et références mentionnées dans la revue 9 G. Calderone, C. Guillou, N. Naulet – Utilisation réglementaire des analyses isotopiques des aliments - Dix ans d'expérience européenne, L’actualité chimique, 2003, 8-9, 20-22 (voir Annexe A de cette thèse) 10 E.C. Regulations: N° 2676/90, Official Journal of the European Communities, 1990 determining Community methods for the analysis of wines, N° 822/97 O.J.E.C., 1997 N° L 117/10 and N° 440/2003, O.J.E.C., 2003 L 66/15 11 OIV - Résolution OENO/SCMA/00/177 "Détermination du rapport isotopique de l'éthanol", 2001 12 Association of Official Analytical Communities, Official Methods of Analysis of AOAC International, Methods 998.12 (former 978.17) and 998.18 (former 991.41) 13 Comité Européen de Normalisation – Technical Commission 174: 29-02-1996, CEN/TC174 N° 108, N° 109 and N° 110 14 A.M. Calvin, J.A. Bassham – The photosynthesis of carbon compounds, Benjamin, New York, 1962
Chapitre IV
150
15 M.D. Hatch, C.R. Slack – Photosynthetic CO2-fixation pathways, Annual Reviews of Plant Physiology, 1970, 21, 141-162 16 T. Whelan, W.M. Sackett, C.R. Benedict – Enzymatic fractionation of carbon isotopes by phosphoenolpyruvate carboxylase from C4 plants, Plant Physiology, 1973, 51, 1051-1054 17 M.M. Bender, I. Rouhani, H.M Vines, C.C. Jr. Black – 13C/12C ratio changes in cassulacean acid metabolism plants, Plant Physiology, 1973, 52, 427-430 18 Estimation by http://www.darapri.it/ (wine producers) 19 BGBl. Bundesgesetzblatt Teil I. Preliminary German Beer Law Part 1. 1993, 1399-1401 20 Internet survey. Sources: ERC Statistics International (1999), Svenska Bryggareföreningen (Swedish national brewers association) (2000), The Economist (2003) 21 G.J. Martin, M. Benbernou, F. Lantier – Application of site-specific natural isotope fractionation (SNIF-NMR) of hydrogen to the characterization of European beers. 1984 22 J.M. Franconi, N. Naulet, G.J. Martin – Natural factors of site-specific isotope fractionation of hydrogen in the fermentation products (ethanol and water) of barley, Journal of Cereal Science, 1989, 10, 69-80 23 J. Renée Brooks, N. Buchmann, S. Phillips, B. Ehleringer, R.D. Evans, M. Lott, L.A. Martinelli, W.T. Pockman, D. Sandquist, J.P. Sparks, L. Sperry, D. Williams, J.R. Ehleringer – Heavy and light beer: a carbon isotope approach to detect C4 carbon in beers of different origins, styles, and prices, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2002, 50, 6413-6418 24 Regulation (EEC) No 2081/92: protected designations of origin and geographical indications 25 Regulation (EEC) No 2082/92: traditional specialities guaranteed 26 Council Directive 96/70/EC of 28 October 1996 amending Directive 80/777/EEC 27 Internet survey. Sources: Istat (Italian National Office for Statistics, 2003), Euromonitor International, ACNielsen-Food (2001) 28 D. Weber, H. Kexel, H.-L. Schmidt – 13C-pattern of natural glycerol: origin and practical importance, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1997, 45, 2042-2046. 29 L.A. Martinelli, M.Z. Moreira, J.P.H.B. Ometto, A.R. Alcarde, L.A. Rizzon, E. Stange, J.R. Ehleringer - Stable carbon isotopic composition of the wine and CO2 bubbles of sparkling wines: detecting C4 sugar additions, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2003, 51, 2625-2631 30 A. Minissale – Review: Origin, transport and discharge of CO2 in central Italy, Earth-Science Reviews, 2004, 66, 89–141
Chapitre V
Chapitre V
153
Caractérisation multi-isotopique
d’éthanols d’origine diverse :
mesures de δ 18O et de δ 2H par TC/EA
1. INTRODUCTION
andis que l’alcool éthylique d’origine diverse, en particulier celui de vin, est
connu sous l’aspect des rapports isotopiques du carbone-13 (13C-IRMS) et de la
distribution spécifique du deutérium (2H-SNIF), il existe peu d’études sur la caractérisation de
ses teneurs en oxygène-18 et deutérium total. La limitation dans l’utilisation de ces isotopes
stables est principalement due à des problèmes techniques, aujourd’hui en voie d’être résolus.
Ce chapitre décrit nos études qui visent à :
1. mettre au point la technique de mesure de routine par TC/EA IRMS des rapports
isotopiques 2H/1H et 18O/16O sur la molécule d’éthanol et collaborer à la validation de
la méthode ;
2. contribuer à la caractérisation d’éthanol issu de différentes origines botanique (miels,
sucres, vins, boissons spiritueuses, etc.), géographique et climatique ;
3. éventuellement interpréter les valeurs δ18O et δ2H en corrélation avec d’autres données
isotopiques.
T
Chapitre V
154
1.1. Fermentation alcoolique
La fermentation alcoolique est le processus biochimique par lequel des levures, en
conditions anaérobiques (absence d’oxygène), transforment les sucres principalement en
alcool éthylique et dioxyde de carbone gazeux (C6H12O6 2 C2H6O + 2 CO2). Beaucoup
d’autres métabolites secondaires, parmi lesquels le glycérol, sont produits en même temps.
Les levures les plus efficaces appartiennent à l’espèce Saccharomyces cerevisiae, mots du
grec et du latin qui signifient « champignon du sucre » « de la bière ». Bien que le processus
fermentaire, spontané, soit exploité depuis toujours par l’homme – le mot même alcool est
d’origine arabe, dénommant le produit issu de la fermentation – ce n’est qu’en 1857, après les
longues études de Louis Pasteur, que ce processus est scientifiquement attribué à l’action des
levures [1]. Une schématisation du cycle fermentaire est montrée en Figure 1.
1.2. Sucres de céréales et miels
Depuis longtemps les sucres et les produits sucrés [2-13] sont étudiés du point de vue des
rapports isotopiques. Des méthodes officielles [14-16] basées sur l’analyse des rapports
isotopiques sont utilisées pour authentifier miels et jus de fruits. La détection de sucres
frauduleusement ajoutés dans les vins, les miels ou les jus de fruits est une demande courante
pour des motivations d’ordre surtout économique et de qualité dans l’Union Européenne
(UE). L’UE a mis en place des règlements pour les sucres CEE 73/437 [17] et pour les miels
dans la directive 74/409 [18].
Comme il a été indiqué dans le paragraphe 2 du Chapitre I, les sucres d’origine
botanique différente ont des teneurs différentes en 13C, ainsi la mesure IRMS des rapports 13C/12C permet de distinguer un sucre de plante C3 (betterave, raisin) d’un sucre issu d’une
plante C4 (maïs, canne) ou CAM (ananas). Les propriétés concernant les isotopes 2H et 18O ne
sont pas bien connues.
1.3. Boissons fermentées
Différentes boissons peuvent être issues d’ingrédients divers : le vin à partir du moût
de raisin par l’action de S. cerevisiae, le cidre par fermentation de jus de pomme inséminé par
S. apiculatus, la bière à partir d’orge ou d’autres céréales maltées, sous l’action de S.
Chapitre V
155
carlsbergensis, etc.. Le vin est déjà très bien caractérisé soit par l’éthanol [19-21] soit par l’eau
qui le constituent [22, 23]. Ainsi les analyses isotopiques 2H-NMR, 13C-IRMS sur l’alcool
distillé et 18O-IRMS sur l’eau ont été adoptées comme méthodes officielles dans les
règlements communautaires [24, 25].
Figure 1 : Schématisation de la fermentation du glucose
Glucose
2 ATP Glycolyse
Pyruvate
Autres métabolites
Ethanol + CO2
Fermentation
Sans O2
Respiration
Avec O2
34 ATP
Chapitre V
156
Tableau 1 : Définition et description de certaines boissons spiritueuses en accord avec le
règlement européen N°1576/89 (extrait)
Définition des distillats (CE N. 1576/89)
Catégorie Issu de / ingrédients caractéristiques Lieu de fabrication
Rhum Sucre du jus de la canne Caraïbes/Espagne
Eau-de-vie de céréales Céréales Allemagne/Luxembourg
Whisky (ou whiskey) Céréales/malt Ecosse/Irlande/Espagne
Eau-de-vie de fruit (kirsch, slivovic, mirabelle, etc.)
Fruits charnus
(avec ou sans noyaux) Europe
Eau-de-vie de vin Vin Europe
Brandy Vin Europe
Marc Marcs de raisin Europe
Grappa Marcs de raisin Italie
Marc de fruit Marcs de fruit Europe
Gin Alcool agricole
Baies de genièvre Europe
Boissons anisées Alcool agricole
Anis/fenouil/arômes Europe
Vodka Alcool agricole rectifié -
Liqueurs Alcool agricole/sucre/arômes -
Plusieurs études [26, 27] ont mis en corrélation les propriétés isotopiques du rapport 18O/16O de l’eau du vin par IRMS et la distribution spécifique du deutérium dans l’éthanol par 2H-NMR avec les données géographiques et météorologiques.
Les bières aussi ont été étudiées [28-30] sous l’aspect de la caractérisation isotopique de
l’éthanol (13C-IRMS et 2H-SNIF-NMR) et du matériel brut après lyophilisation (13C-IRMS).
Dans le Chapitre IV nous avons mesuré la teneur en 13C du CO2 de l’espace de tête et de
l’éthanol distillé de plusieurs échantillons de bière.
Chapitre V
157
1.4. Boissons spiritueuses
Suite à un processus de distillation, les produits fermentés aboutissent aux boissons
spiritueuses qui sont très enrichies en éthanol par rapport au produit de départ. Dans l’UE la
définition rigoureuse de tout type de distillat est donnée dans le règlement CEE n°1576/89 [31].
Ce règlement, dont une synthèse est montrée dans le Tableau 1, définit toute boisson
spiritueuse, son origine géographique, les ingrédients autorisés, l’obligation d’utilisation
d’éthanol agricole (donc non synthétique) pour certaines préparations.
Parmi les spiritueux les plus diffusés et commercialisés, plusieurs ont fait l’objet
d’études isotopiques pour la caractérisation de l’éthanol : distillats de vin [32-35] – brandy,
cognac, grappa et similaires –, whisky [36, 37], saké [38], exclusivement en 13C et 2H-SNIF. Ce
n’est que ces dernières années qu’il a été aussi analysé l’18O dans la tequila [39] et dans
différents éthanols distillés [40]. On est encore au début de l’utilisation de cette analyse.
2. δ 2H ET δ 18O
Les causes de fractionnement isotopique naturel de l’hydrogène et de l’oxygène ont
été décrites dans le paragraphe 4 du Chapitre I. En bref, la distribution du deutérium et de
l’oxygène-18, contenus dans les eaux, suit les phénomènes climatiques et les situations
géographiques des terroirs. Pour les glucides, le fractionnement de ces deux éléments chez les
végétaux n’a pas été systématiquement étudié, il n’existe donc pas de corrélation avec
l’origine botanique. Ce n’est que récemment que des recherches sur le fractionnement
métabolique de l’oxygène-18 chez les plantes ont été publiées [41-46], ainsi que certains aspects
biochimiques du fractionnement de l’hydrogène durant la fermentation [47, 29, 48, 49].
L’enrichissement en 18O d’environ 27 ‰ [41] dans les celluloses par rapport aux
sources d’oxygène de la plante (eau, oxygène de l’air et CO2) est sûrement lié à l’eau des
feuilles, et donc, probablement, à la typologie de la plante même.
2.1. Techniques de mesure
Jusqu’à présent, la technique habituelle de mesure de δ18O sur des matrices solides et
liquides utilisait une chaîne composée d’un analyseur élémentaire (AE) traditionnel couplé à
Chapitre V
158
un spectromètre de masse de rapports isotopiques. L’AE était constitué d’une colonne de
pyrolyse au lieu d’une colonne d’oxydation. Les plus hautes températures accessibles étant de
l’ordre de 1100 °C, la réaction qui produit le monoxyde de carbone gazeux n’était pas
toujours quantitative.
Ce dernier problème est apparemment résolu par le développement de nouvelles
technologies qui permettent d’atteindre des températures suffisamment hautes, supérieures à
1400 °C, avec une amélioration de la reproductibilité des mesures. D’autres détails techniques
sont présentés aux paragraphes 2 et 5 du Chapitre II et dans l’Annexe C.
Une difficulté persiste : c’est le manque de références certifiées (avril 2004 l’IAEA a
commercialisé deux acides benzoïques de δ18O connus, l’IAEA-601 et l’IAEA-602). La
technique TC/EA n’est pas encore largement diffusée ce qui ne permet pas de faire des
comparaisons interlaboratoire. Dans notre laboratoire, nous avons étudié des échantillons
solides et liquides, sur plusieurs matrices [50] et nous venons d’initier un « ring-test »
préliminaire avec des participants de plusieurs pays, pour tester et valider l’analyse du rapport 18O/16O de l’éthanol mesuré par cette nouvelle technique.
3. MATERIELS ET METHODES
3.1. Echantillons
Nous avons tout d’abord réalisé des mesures de δ18O, puis de δ2H (deutérium total) sur
quelques 400 échantillons d’éthanols de plusieurs provenances :
1. de la fermentation de miels et de sucres obtenus de céréales de différentes origines
botaniques et géographiques ;
2. de boissons spiritueuses, de la banque du BEVABS et du marché;
3. de produits fermentés du commerce (bières, vins, cidres) ;
4. de vins européens ;
5. d’éthanols commerciaux, synthétiques ou non spécifiés.
3.2. Fermentation
Des sucres de céréales et miels ont été fermentés pour obtenir les éthanols
correspondants. En particulier pour la fermentation des sucres, de l’eau isotopiquement
Chapitre V
159
contrôlée avait été utilisée, avec une valeur D/H d’environ 155.76 ppm (valeur D/H du
SMOW). Après l’ajout de 1 g de levure de S. cerevisiae, la solution avait été laissée à incuber
à 22 °C, jusqu’à disparition des sucres (concentration inférieur à 1 g/L, par bandes Clinitest).
3.3. Distillation d’alcool
La distillation des produits fermentés (principalement des vins) est une activité de
routine au BEVABS. Elle est effectuée en utilisant des colonnes à bande tournante de type
Cadiot afin de collecter l’éthanol de titre alcoolique supérieur à 92 % m/m dans des
conditions ne provoquant pas de fractionnement isotopique. Cette méthode est celle prescrite
par les règlements UE pour l’analyse des vins [24].
3.4. Déshydratation
Avant de mesurer les rapports 18O/16O et 2H/1H par TC/EA, tout distillat a été séché
pour éliminer l’eau résiduelle qui interférerait dans la mesure avec ses oxygène et hydrogènes.
Des tamis moléculaires de 3 Å (de chez Fluka, activés pendant au moins 24 h dans un
four à 260 °C) ont été utilisés. 3 mL de l’échantillon ont été traités trois fois avec environ 1 g
de tamis, pendant 30 min. Le reste de l’alcool (environ 1 mL) a été filtré à l’aide d’un filtre
Waters de 0.2 µm pour retenir les poussières des tamis.
3.5. Mesures de δ18O et δ2H par TC/EA
La configuration de nos appareils et les conditions opératoires sont expliquées en
détail dans l’Annexe C de cette thèse.
Chaque échantillon a été injecté cinq fois, un volume d’environ 0.2 µL pour la mesure
de la teneur totale en deutérium et d’environ 0.5 µL pour celle en oxygène-18. Un exemple de
programme des temps utilisés est indiqué en Figure 2. Le temps total de mesure a été
d’environ 1200 sec (20 min).
Les Figure 3 et en Figure 4 montrent les chromatogrammes résultants,
respectivement, de l’analyse du deutérium et de l’oxygène 18.
Chapitre V
160
Figure 2 : Programme-type avec plusieurs injections d’un échantillon d’éthanol analysé en
TC-EA (logiciel Isodat 2.0)
Les éthanols ont été organisés en serie de 10 échantillons, séparés par un éthanol de
référence de travail (working standard, WS) précédemment étalonné. Les valeurs moyennes
de tout échantillon ont été corrigées sur la base de ce WS, en considérant comme linéaire
l’éventuelle dérive des deux échantillons de WS consécutifs, selon l’équation suivante:
Equation 1 ( ) WS WSδ corrigé δ mesuré WS10+1
tête queuetêten n n⎛ ⎞
⎜ ⎟⎝ ⎠
∆ − ∆= − ∆ + •
∆WS est la différence (δ WS mesuré – δ WS « réel »). Toute valeur δn, de
l’échantillon de position n dans le batch délimité par les deux échantillons de WS en tête et en
queue, est ainsi recalculée.
L’écart-type SD pour les mesures de δ2H était inférieur à 2 ‰ et pour δ18O inférieur à
0.3 ‰.
Chapitre V
161
Figure 3 : Spectrogramme de la mesure du rapport 2H/1H de l’éthanol
Chapitre V
162
Figure 4 : Spectrogramme de la mesure du rapport 18O/16O de l’éthanol
Chapitre V
163
3.6. Autres mesures
En plus de l’oxygène-18 et du deutérium total, pour certains échantillons, les teneurs
en carbone-13 et la distribution en deutérium ont aussi été mesurées et, pour les vins, la teneur
en oxygène-18 de l’eau.
3.6.1. 13C-SMRI
Nous avons réalisé les mesures du rapport 13C/12C de l’éthanol sur notre chaîne EA-
IRMS de routine, qui est composée d’un analyseur élémentaire Carlo Erba (Milan, Italie),
interfacé au spectromètre de masse ThermoFinnigan Delta Plus à travers le ConFLO
ThermoFinnigan Mat. Chaque échantillon d’alcool a été injecté trois fois, mais la première
injection a systématiquement été rejetée pour le calcul de la valeur moyenne de δ13C. L’écart-
type SD était inférieur à 0.2 ‰. Les valeurs δ13C ont été corrigées comme les δ18O et δ2H par
l’Equation 1.
3.6.2. 2H-RMN
Les mesures du deutérium par RMN ont été réalisées avec le spectromètre Brüker
ARX400, équipé d’une sonde spécifique pour deutérium, d’un système de verrouillage
champ-fréquence et d’un passeur d’échantillons. Les valeurs D/H sont calculées et exprimées
en ppm en utilisant comme étalon interne la tétraméthylurée (TMU) certifiée avec une valeur
D/H par l’Institut des Matériaux et Mesures de Référence (IRMM) de l’UE à Geel (Belgique).
3.6.3. 18O-SMRI
Les mesures de routine sur l’eau des vins ont été réalisées au moyen d’un appareil
d’équilibration qui facilite l’échange d’18O entre l’eau et le dioxyde de carbone de référence
introduit sur l’espace de tête du vin. L’équilibreur est couplé à un SMRI, un Delta S de
ThermoFinnigan MAT (Brême, Allemagne) , où le CO2 équilibré arrive et y est mesuré. La
méthode utilisée est celle prescrite par les règlements UE pour l’analyse des vins [24]
Chapitre V
164
4. RESULTATS ET DISCUSSION
4.1. Miels
Nos échantillons de miels sont une partie de ceux analysés pour un projet [51] qui visait
à appliquer les analyses isotopiques pour la détection des fraudes.
Les valeurs δ18O et δ2H des échantillons de miels analysés ont été présentées en
fonction de leurs origines botanique (Figure 5) et géographique (Figure 6).
Le rapport 18O/16O d’un miel non adultéré sera très proche de celui du nectar de la
plante originaire, qui peut être C3 ou C4, et il n’est pas fortement affecté par les eaux
d’irrigation. Par comparaison des deux figures, on peut en fait vérifier qu’une distinction en
fonction de l’origine botanique est possible, malgré une dispersion non négligeable, alors que
la provenance géographique des miels ne permet pas de les regrouper.
Sur la Figure 5 il est possible de constater que les miels d’acacia (sauf un, français),
de colza (sauf un, français) et de bruyère ont des distributions δ18O-δ2H bien définies. Les
miels de châtaigne et de tournesol montrent une variation en deutérium plutôt limitée, mais
une grande disparité en oxygène-18. Les miels issus des agrumes montrent les valeurs δ2H et
δ18O les plus élevées.
Les rapports 13C/12C des éthanols sont situés dans une échelle de valeurs très limitée
de moins de 5 ‰. En Figure 7 les δ13C sont présentés en fonction des δ18O et l’on voit une
distribution similaire à celle δ2H-δ18O – miels d’acacia, de colza et de bruyère séparés,
agrumes et tournesol dispersés – mais avec une superposition plus évidente, due à l’échelle de
δ13C plus étroite que celle de δ2H. Cela est en partie dû à notre sélection d’échantillons qui
proviennent tous de plantes C3.
Comme on s’y attendait, la corrélation entre δ18O et (D/H)1 (Figure 8 a) est
superposable à celle entre δ18O et δ2H (Figure 5), et la distribution des valeurs (D/H)2
(Figure 8 b) est dans l’ensemble assez limitée.
∗∗∗
Chapitre V
165
Figure 5 : δ18O et δ2H des éthanols issus de miels et classés par origine botanique
Ethanol issu de miel : origine botanique, 18O et 2H
-300
-280
-260
-240
-220
15.0 17.0 19.0 21.0 23.0 25.0 27.0δ 18O [‰] vs. V-SMOW
δ 2 H
[‰] v
s. V
-SM
OW
Acacia Agrumes Bruyère Châtaigne Colza Eucalyptus Romarin Tilleul Tournesol
Figure 6 : δ18O et δ2H des éthanols issus de miels en fonction de leur origine géographique
Ethanol issu de miel : origine géographique, 18O et 2H
-300
-280
-260
-240
-220
15.0 17.0 19.0 21.0 23.0 25.0 27.0
δ18O [‰ ] v s. V-SMOW
δ2 H [
‰]
vs. V
-SM
OW
Allemagne Angleterre Danemark Espagne France Hollande Italie Portugal
Chapitre V
166
Figure 7 : δ18O et δ13C des éthanols issus de miels et classés par origine botanique
Ethanol issu de miel : origine botanique, 18O et 13C
-29.0
-26.0
-23.0
15.0 17.0 19.0 21.0 23.0 25.0 27.0
δ 18O [‰] vs. V-SMOW
δ 13
C [‰
] vs.
V-S
MO
W
Acacia Agrumes Bruyère Châtaigne Colza Eucalyptus Romarin Tilleul Tournesol
En fait, au cours du processus de fermentation, les sources d’hydrogène pour la biosynthèse
de la molécule d’éthanol sont différentes [43, 47-49] : les hydrogènes du méthyle (H1)
proviennent du sucre métabolisé par les levures, en conséquence les valeurs (D/H)1 sont liées
aux sucres fermentés. Au contraire les hydrogènes du méthylène (H2) sont fournis par le
milieu de réaction, donc les valeurs (D/H)2 sont influencées par le contenu en deutérium de
l’eau de fermentation (voir Schéma 1). Comme les fermentations de nos miels ont été
conduites dans la même eau, les valeurs du (D/H)2, pour nos échantillons, se situent dans un
intervalle très réduit (entre 120 et 125 ppm).
H du sucre du départ Schéma 1 : Ethanol et
origine des hydrogènes
CH3
CH2 OH
(D/H)1
(D/H)2
H de l’eau du milieu
Chapitre V
167
Figure 8 a et b : Combinaison des résultats (D/H)1 en fonction de δ18O et distribution de
(D/H)2 des éthanols issus de miels et classés par origine botanique
Ethanol issu de miel : origine botanique, 18O et (D/H)1
85
90
95
100
105
110
15.0 17.0 19.0 21.0 23.0 25.0 27.0δ 18O [‰] vs. V-SMOW
(D/H
) 1 [p
pm] v
s. T
MU
Ethanol issu de miel : origine botanique, 18O et (D/H)2
115
120
125
130
135
140
15.0 17.0 19.0 21.0 23.0 25.0 27.0δ 18O [‰] vs. V-SMOW
(D/H
) 2 [p
pm] v
s. T
MU
Chapitre V
168
Figure 9 : Combinaison des résultats δ18O et δ2H des éthanols issus de sucres de céréales et
classés par origine botanique
Ethanol issu de céréales : origine botanique, 18O et 2H
-260
-240
-220
-200
-180
19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0δ 18O [‰] vs V-SMOW
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Blé Maïs 10%/blé 90% Maïs 70%/blé 30% Maïs 80%/blé 20% Maïs Orge Pomme de terre
4.2. Sucres de céréales
Les échantillons analysés proviennent d’un précédent projet [52] visant à déterminer la
présence de glucose exogène dans le glucose de maïs. Ce sont des sucres issus de céréales de
plantes C3 (blé, orge et pomme de terre) et C4 (maïs) et des mélanges maïs/blé.
Les éthanols issus de ces échantillons se différencient assez bien dans toutes les
corrélations de rapports isotopiques mesurés, sauf pour le (D/H)2 (Figure 12 b), pour la raison
invoquée car le milieu de fermentation était constitué par de l’eau isotopiquement contrôlée
avec une valeur D/H d’environ 155.76 ppm.
Le maïs (Figure 9) montre des teneurs en 18O plus faibles – δ18O compris entre 19.5 et
20.3 ‰ – mais les plus riches en deutérium, entre -200 et -190 ‰. Le blé a les teneurs en 18O
les plus hautes, > 22 ‰, et des valeurs de δ2H autour de -220 ‰. L’orge se situe entre ces
Chapitre V
169
deux extrêmes pour l’18O – entre 20 et 22 ‰ – mais est le plus pauvre en 2H. Dans cette
corrélation, la pomme de terre – un seul échantillon – se situe très proche de l’orge.
Les mélanges de maïs et blé 10/90 et 70/30 ne sont pas différentiables des autres
échantillons purs, conformément au composant prédominant. Un problème est posé par le
mélange déclaré 80 % maïs / 20 % blé, car sa teneur élevée en 18O n’est pas cohérente avec
celles des deux composés séparés. On écartera la possibilité d’inversion des numéros (donc
proportion inversée), parce qu’en Figure 10, mais aussi en Figure 11, il est évident que
l’échantillon est plus proche du maïs, si l’on tient compte des teneurs en 13C et 2H.
C’est sûrement la corrélation δ13C-δ2H (Figure 10) qui offre la meilleure
différentiation des éthanols analysés, les deux gammes étant bien étendues et distinctes pour
les deux groupes de plantes C3 et C4.
Les valeurs (D/H)1 pour les échantillons d’orge (95.6 – 96.3 ppm, Figure 12 a) sont
dans l’intervalle reporté dans la littérature [29] (95-101 ppm) pour des orges de diverses
provenances.
∗∗∗
Chapitre V
170
Figure 10 : Combinaison des résultats δ13C et δ2H des éthanols issus de sucres de céréales et
classés par origine botanique
Ethanol issu de céréales : origine botanique, 13C et 2H
-260
-240
-220
-200
-180
-27.0 -22.0 -17.0 -12.0 -7.0δ 13C [‰] vs PDB
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Blé Maïs 10%/blé 90% Maïs 70%/blé 30% Maïs 80%/blé 20% Maïs Orge Pomme de terre
Figure 11 : Combinaison des résultats δ18O et δ13C des éthanols issus de sucres de céréales et
classés par origine botanique
Ethanol issu de céréales : origine botanique, 18O et 13C
-27.0
-22.0
-17.0
-12.0
-7.0
19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0δ 18O [‰] vs V-SMOW
δ 13
C [‰
] vs
PDB
Blé Maïs 10%/blé 90% Maïs 70%/blé 30% Maïs 80%/blé 20% Maïs Orge Pomme de terre
Chapitre V
171
Figure 12 a et b : Combinaison des résultats (D/H)1 en fonction des δ18O et distribution de
(D/H)2 des éthanols issus de sucres de céréales et classés par origine botanique
Ethanol issu de céréales : origine botanique, 18O et (D/H)1
95
100
105
110
115
19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0
δ 18O [‰] vs V-SMOW
(D/H
) 1 [p
pm] v
s TM
U
Ethanol issu de céréales : origine botanique, 18O et (D/H)2
125
130
135
19.0 21.5 24.0δ 18O [‰] vs V-SMOW
(D/H
) 2 [p
pm] v
s TM
U
Chapitre V
172
4.3. Boissons alcoolisées
Les matières premières utilisées pour la plupart des boissons spiritueuses les plus
diffusées (voir Tableau 1) sont les mêmes (beaucoup de produits sont dérivés du raisin) ou
souvent d’origine botanique (plantes C3) très proche pour s’attendre à les différencier sur la
base de mesures isotopiques. Pour celles produites à partir d’autres matières premières (la
vodka ou le gin, par exemple) on pourra utiliser les techniques isotopiques pour confirmer
l’origine déclarée sur l’étiquette. D’ailleurs, les produits issus de plantes C4 (rhum) ou CAM
(tequila) se différencient très aisément.
4.3.1. Whisky/Whiskey
Les échantillons de whisky analysés étaient étiquetés avec les deux dénominations,
selon l’habitude du pays de production. Ce distillat étant produit à partir de céréales (orge, blé
et maïs), la gamme des valeurs δ18O et δ2H est large, on le constate dans les Figures 13 a, b et
c ; on voit aussi qu’elle ressemble à celle des sucres issus de céréales vue précédemment
(Figure 9-Figure 11).
On peut distinguer toujours trois groupes d’échantillons :
1. 3 dénommés whiskey, dont 2 garantis des Etats-Unis ;
2. 3 whisky écossais ;
3. 2 d’origine effectivement inconnue.
Les différences dues aux céréales de départ sont visibles : les whiskys américains
montrent des teneurs en 18O comparables aux écossais (δ18O 21-24 ‰), mais des δ2H plus
élevés (une moyenne de -230 ‰ par rapport à -250 ‰) et 13C (supérieurs à -18.0 ‰ pour les
américains, inférieurs à -21.5 ‰ pour les écossais). Cela s’explique par l’utilisation plus
fréquente de maïs (plante C4) aux États-Unis, contrairement à l’Europe, où l’orge et le blé
(plantes C3) sont plus utilisés dans la production.
La Figure 13 c (δ13C-δ2H) donne probablement une indication des rapports relatifs
entre les céréales utilisées : en bas à gauche les valeurs plus basses de 13C et 2H sont dues à la
présence d’orge et blé, en haut à droite les valeurs sont plus élevées car elles sont
probablement dues au maïs.
Chapitre V
173
Figure 13 a, b et c: Combinaison des résultats δ2H, δ13C et δ18O des whiskys analysés
Whisky, 18O et 2H
-290
-270
-250
-230
-210
14.0 17.0 20.0 23.0 26.0δ 18O [‰] vs V-SMOW
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Whisky, 18O et 13C
-28
-23
-18
-13
14.0 17.0 20.0 23.0 26.0δ 18O [‰] vs V-SMOW
δ 13
C [‰
] vs
PDB
Whisky, 13C et 2H
-290
-270
-250
-230
-210
-28.0 -25.0 -22.0 -19.0 -16.0 -13.0δ 13C [‰] vs PDB
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Whisky Whiskey
X Ecosse
* USA
Chapitre V
174
Figure 14 a et b : Combinaison des résultats δ2H, 13C et 18O pour rhums et tequilas
Rhums et Tequilas, 18O et 2H
-290
-260
-230
-200
14.0 17.0 20.0 23.0 26.0δ 18O [‰] vs V-SMOW
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Rhums et Tequilas, 18O et 13C
-14
-12
-10
14.0 17.0 20.0 23.0 26.0
δ 18O [‰] vs V-SMOW
δ 13
C [‰
] vs
PDB
Rhum Tequila
Chapitre V
175
4.3.2. Rhums et Tequilas
Les rhums et les tequilas sont des distillats produits à partir de plantes C4 (canne à
sucre) pour les rhums et CAM (agave, Agave tequilana) pour les tequilas. Beaucoup de pays
sont producteurs de rhum de plusieurs variétés. La plupart des tequilas, au contraire, sont
produites au Mexique ; il existe deux catégories principales : agave 100 % et des mélanges de
tequilas de diverses années de production.
La Figure 14 a montre une superposition complète des teneurs en 18O entre les
échantillons de tequila (δ18O 16.5 ‰) et de rhum, bien que les valeurs de ces derniers soient
plus dispersées (δ18O de 15.0 à 21.6 ‰), ce qui a été également observé pour des échantillons
commerciaux de tequilas [39].
Les teneurs en 2H sont en moyenne plus basses pour les rhums (δ2H -233.8 ‰) que
pour les tequilas (δ2H -218.7 ‰) malgré un échantillon particulier avec δ2H de -248.3 ‰.
L’analyse du rapport 13C/12C montre (Figure 14 b) la similarité entre les deux types de
boissons : l’intervalle des valeurs δ13C est plutôt étroit et va de -12.8 à -11.4 ‰, plus typiques
des plantes C4 que des CAM.
4.3.2.1. Cas de la fausse Tequila / Ethanols synthétiques
Les mesures des rapports 2H/1H et 18O/16O par pyrolyse ont confirmé un cas de tequila
d’origine suspecte qui nous avait été soumis par Madame Catherine Lamoureux des Douanes
Françaises de Paris. L’éthanol distillé de la tequila, importée du Mexique et déjà refusée par
l’acheteur pour non conformité, montrait à l’analyse 2H-RMN des valeurs (D/H)1 et (D/H)2
de, respectivement, 131.0 et 126.4 ppm. Le δ13C élevé de -13.4 ‰ était compatible avec une
origine de plantes CAM (Tableau 2).
L’analyse par comptage à scintillation du 14C montrait rapidement qu’il s’agissait d’un
éthanol de synthèse, ce qui a été confirmé par nos mesures d’oxygène-18 et de deutérium
total, en comparaison avec des éthanols commerciaux synthétiques. La Figure 15 montre la
proximité de la tequila suspectée des échantillons d’alcools synthétiques caractérisés par des
valeurs très basses en 18O, même δ18O négatifs (de -4.9 à 6.1 ‰), et des valeurs très élevées
en 2H (δ2H de -156 à -130 ‰).
Chapitre V
176
Tableau 2 : Analyses isotopiques d’un échantillon de tequila d’origine suspecte.
Cas de la fausse Tequila
(D/H)1 (D/H)2 R 14C δ13C δ2H δ18O
131.0 126.4 1.930 Carbone fossile -13.4 -158.2 11.1
Les valeurs (D/H) sont exprimées en ppm vs. TMU, δ2H en ‰ vs. V-SMOW, δ13C en ‰ vs.
PDB et δ18O en ‰ vs. V-SMOW.
Figure 15 : Combinaison des mesures de 18O et 2H confirmant l’origine suspecte d’une
tequila analysée par le laboratoire des Douanes de Paris.
Fausse Tequila, 18O et 2H
-290
-260
-230
-200
-170
-140
-5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0δ 18O [‰] vs V-SMOW
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Alcools synthétiques Alcools naturels Tequilas commerciales Tequila suspectée
Chapitre V
177
4.3.3. Sakés
Nous avons analysé l’éthanol distillé de trois échantillons de saké, de producteurs
différents et achetés au Japon. Leurs étiquettes indiquaient riz (plante C3) et malt de riz
comme ingrédients.
Les trois sakés montrent des rapports isotopiques très homogènes (Tableau 3) : (D/H)1
et (D/H)2, respectivement d’environ 100 et 126 ppm ; le deutérium total est en moyenne de
-251 ‰ ; les teneurs en 13C, entre -27.2 et -26.3 ‰, cohérentes avec celles reportées dans la
littérature (de -27.3 à -26.1 ‰) [38], sont typiques des plantes C3 ; les teneurs en 18O sont en
moyenne de 17.2 ‰.
Tableau 3 : Analyse multi-isotopique d’échantillons de saké
Sakés
Echantillon Saké 1 Saké 2 Saké 3 Moyenne ± SD
Origine Japon Japon Japon
Ingrédients Riz, malt de riz Riz, malt de riz Riz, malt de riz
(D/H)1 99.7 99.2 100.5 99.8 ± 0.7
(D/H)2 123.9 125.8 127.9 126 ± 2.0
δ2H -251.9 -251.4 -248.5 -251 ± 2
δ13C -26.3 -27.0 -27.2 -26.8 ± 0.5
δ18O 16.7 18.7 16.3 17.2 ± 1.3
Les valeurs (D/H) sont exprimées en ppm vs. TMU, δ2H en ‰ vs. V-SMOW, δ13C en ‰ vs.
PDB et δ18O en ‰ vs. V-SMOW.
Chapitre V
178
4.3.4. Vodkas, Gins, liqueurs
Les boissons alcoolisées telles que la vodka, le gin, l’ouzo, celles au goût amer
(bitters,amers) et les liqueurs doivent être préparées, réglementairement, à partir d’éthanol
d’origine agricole. Les origines botaniques peuvent donc être des plus variées, et
l’aromatisation ne peut être réalisée qu’à l’aide des substances ou plantes caractéristiques
autorisées (voir Tableau 1).
Nous avons analysé en deutérium total et oxygène-18 des échantillons de quelques
spiritueux de ce genre et les résultats sont représentés dans les Figures 16 a, b et c.
Comme il était prévisible, les rapports 18O/16O et 2H/1H sont très dispersés pour un
même type de boisson, et souvent superposables pour différents produits.
Exemple : les vodkas ont des δ18O entre 16.4 et 23.9 ‰ et des δ2H entre -277.5 et
-243.8 ‰, nos échantillons ont été produits à partir de blé, de seigle ou de matières non
spécifiées. Effectivement les trois vodkas déclarées de blé et seigle (plantes C3) ont des δ18O
de 20.9 à 23.9 ‰, compatibles avec les valeurs trouvées pour les sucres issus de blé (voir
Figure 9).
Les deux ouzos sont les produits les plus éloignés entre eux : un avec δ18O de 16.2 ‰
et δ2H de -268.6 ‰ et l’autre avec δ18O de 29.5 ‰ et δ2H de -212.4 ‰. Les gins aussi
montrent de grandes variations de δ18O et δ2H, soulignant ainsi la variété d’origine botanique
et géographiques possible.
Par contre, les valeurs δ13C sont plus homogènes, elles sont comprises entre -28 et
-22 ‰, sûrement à cause de l’origine de plantes C3. Une exception, celle d’un échantillon
d’alcool agricole avec un δ13C de -17.6 ‰, valeur qui indique plutôt une origine de plante C4,
probablement du maïs, ou un mélange.
Il parait donc difficile d’aboutir à une caractérisation botanique précise des produits à
base d’alcool agricole en n’utilisant que les teneurs en deutérium total et oxygène-18. Il est
par contre sûrement possible de déceler l’éventuelle utilisation d’alcool de synthèse, comme
dans le cas de la fausse tequila précédemment étudié.
Chapitre V
179
Figure 16 a, b et c: Combinaison des résultats δ2H, δ13C et δ18O des spiritueux analysés
Vodka, Gin, liqueurs : 18O et 2H
-290
-270
-250
-230
-210
14.0 18.0 22.0 26.0 30.0δ 18O [‰] vs V-SMOW
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Vodka, Gin, liqueurs : 18O et 13C
-30.0
-28.0
-26.0
-24.0
-22.0
-20.0
-18.0
-16.0
14.0 18.0 22.0 26.0 30.0δ 18O [‰] vs V-SMOW
δ 13
C [‰
] vs
PDB
Vodka, Gin, liqueurs : 13C et 2H
-290
-270
-250
-230
-210
-30.0 -28.0 -26.0 -24.0 -22.0 -20.0 -18.0 -16.0
δ 13C [‰] vs PDB
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Chapitre V
180
4.3.5. Spiritueux de fruit
Nous avons mesuré les rapports 2H/1H, 18O/16O et 13C/12C de l’éthanol distillé d’une
trentaine d’échantillons de boissons spiritueuses dérivées de fruits charnus, avec ou sans leur
noyau. Dans cette catégorie de produits, on trouve les distillats de vin ou de marc de raisin
(brandy, cognac, grappa, eaux-de-vie) et ceux de fruits divers (pommes, poires, framboises,
cerises, mirabelles et autres).
La relation entre les teneurs en 18O et 2H des tous les échantillons est représentée dans
la Figure 17. Les extrêmes des valeurs δ18O sont 15.2 ‰ pour un maraschino (issu de cerise)
et 30.2 ‰ pour deux brandies espagnols, mais la plupart des échantillons sont compris entre
20.4 et 26.0 ‰ avec une grande superposition.
La variabilité du contenu en deutérium est bien plus ample, δ2H étant compris entre
-260 et -212 ‰. Ces valeurs sont comparables à celles observées pour les alcools d’origine
agricole et à ceux provenant de la fermentation des miels, blé et orge.
Les deux brandies espagnols présentent des teneurs en deutérium et en oxygène-18
significativement plus élevées que celle observées pour les deux autres échantillons (l’un
d’origine italienne et l’autre d’origine inconnue).
Les δ2H et δ18O de l’ensemble de tous les échantillons montrent une assez bonne
corrélation linéaire (Rtotal=0.74, calculée dans la Figure 17). Il serait intéressant d’étudier
cette corrélation par groupe d’origine botanique de ces alcools. Dans notre étude ceci est
possible pour les alcools issus du raisin en regroupant les échantillons de brandy, cognac,
grappa, et eaux-de-vie de vin, pour lesquelles une corrélation similaire (Rraisin=0.75, dans la
Figure 17) est alors retrouvée. Pour les autres origines botaniques le nombre des échantillons
est insuffisant.
La comparaison entre 18O et 13C ou entre 2H et 13C n’apporte rien à la différentiation
des produits (voir Figures 18 a et b). D’ailleurs toutes les plantes utilisées comme matières
premières sont du même groupe botanique C3. L’intervalle de teneurs en 13C de nos
échantillons de boissons spiritueuses est très limité (δ13C entre -28 et -25 ‰).
∗∗∗
Chapitre V
181
Figure 17 : Combinaison de δ18O et δ2H de boissons alcoolisées dérivées de fruits
Chapitre V
182
Figure 18 a et b : Combinaison des mesures de 2H, de 13C et de 18O sur boissons alcoolisées
dérivées de fruits
Boissons spiritueuses de fruits : 18O et 13C
-30.0
-28.0
-26.0
-24.0
14.0 17.0 20.0 23.0 26.0 29.0 32.0
δ 18O [‰] vs V-SMOW
δ 13
C [‰
] vs
PDB
Boissons spiritueuses de fruits : 13C et 2H
-270
-250
-230
-210
-30.0 -28.0 -26.0 -24.0δ 13C [‰] vs PDB
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Chapitre V
183
4.4. Vins
Les échantillons (environ 180) de vins analysés font partie de la banque de données du
BEVABS (voir paragraphe 1.2 du Chapitre III) des récoltes 1998 et 1999 (les listes complètes
sont reportées dans l’Annexe D). Ces vins authentiques proviennent de neuf pays européens
producteurs.
4.4.1. Oxygène de l’éthanol et oxygène de l’eau
L’échelle de δ18O des éthanols de vins européens analysés est vaste, elle s’étale entre
10.4 et 35.0 ‰. Ces extrêmes coïncident, comme on le verra ultérieurement, aux diverses
origines géographiques.
La teneur en oxygène-18 de l’éthanol est bien corrélée à celle de l’eau du même vin.
Comme on peut le voir dans les Figures 19 a et b, le δ18O des deux composants augmentent
simultanément. Pour la récolte 1998 (Figure 19 a), le coefficient de corrélation linéaire est
R=0.86 (en écartant les 3 échantillons de vins anglais qui sont assez atypiques).
Pour l’année 1999 il manque des mesures de 18O de l’eau pour plusieurs échantillons,
néanmoins les δ18O d’éthanol et d’eau sont corrélés avec R=0.63.
Comme pour l’eau la provenance géographique influence la teneur en 18O des vins.
Cela est déjà évident dans la Figure 19 a : les échantillons des pays plus chauds (Espagne,
Grèce, Portugal) sont plus riches en 18O, contrairement aux pays plus froids (Angleterre,
Luxembourg, Autriche). Les vins de pays aux conditions climatiques voisines, comme ceux
du Luxembourg, de l’Allemagne et de l’Autriche se confondent. Entre les extrêmes
climatiques on trouve les vins des pays à grande surface de production comme l’Italie et la
France, qui ont des valeurs plus dispersées.
4.4.2. Influences géographiques : δ2H et δ18O
Les teneurs en deutérium total et en oxygène-18 sont bien corrélées (Figures 20 a et
b) et montrent une influence due à la provenance géographique du vin :
Chapitre V
184
Figure 19 a et b : Combinaison des δ18O de l’éthanol et de l’eau des vins analysés
Vins - récolte 1998 : 18O éthanol vs. eau
R* = 0.86
-10.0
-5.0
0.0
5.0
10.0
15.0
10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0δ18O Ethanol [‰] vs V-SMOW
δ 18
O E
au [‰
] vs
V-SM
OW
Allemagne Angleterre Autriche Espagne FranceGrèce Italie Luxembourg Portugal
Vins - récolte 1999 : 18O éthanol vs. eau
R = 0.63-5.0
0.0
5.0
10.0
15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
δ18O Ethanol [‰] vs V-SMOW
δ 18
O E
au [‰
] vs
V-SM
OW
Autriche Espagne France Grèce Italie Lux.g Portugal
* La droite et le coefficient de la Figure a ne tiennent pas compte des échantillons anglais.
Chapitre V
185
Figure 20 a et b : Combinaison des δ18O et δ2H de l’éthanol des vins analysés
Vins - récolte 1998 : 18O et 2H
R* = 0.79
-280
-260
-240
-220
-200
-180
10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0δ18O Ethanol [‰] vs V-SMOW
δ 2 H
Eth
anol
[‰] v
s V-
SMO
W
Allemagne Angleterre Autriche Espagne France Grèce Italie Lux.g Portugal
Vins - récolte 1999 : 18O et 2H
R = 0.61
-260
-240
-220
-200
-180
15.0 20.0 25.0 30.0 35.0δ18O Ethanol [‰] vs V-SMOW
δ 2 H
Eth
anol
[‰] v
s V-
SMO
W
Allemagne Angleterre Autriche Espagne France Grèce Italie Lux.g Portugal
* La droite et le coefficient de la Figure a ne tiennent pas compte des échantillons anglais.
Chapitre V
186
échantillons d’Autriche et d’Allemagne (les échantillons d’Angleterre font exception pour
l’année 1998) ont des δ18O et δ2H plus faibles (δ18O entre 20 et 25 ‰ et δ2H entre -260 et -
228 ‰ pour l’Autriche en 1998, entre 18 et 25 ‰ pour 18O et -262 et -248 ‰ pour 2H pour
l’Allemagne la même année) tandis que l’Espagne montre en 1998 des δ18O entre 24.5 et 35.0
‰ et des δ2H entre -241 et -209 ‰.
Des corrélations plus évidentes entre l’18O de l’éthanol et la géographie, sont possibles
si l’on considère les pays individuellement, mais ici on ne considère que les observations sur
l’ensemble de tous les échantillons.
4.4.3. Variations annuelles de 18O et 2H
Les facteurs climatiques, variables d’une année à l’autre, influencent fortement les
propriétés isotopiques des vins. Les études qui visent à interpréter la composition isotopique
des vins et du raisin sur la base de nombreuses données climatologiques sont plutôt
compliquées et nécessitent des outils statistiques appropriés.
Des études au niveau régional existent [27], mais des études récentes [53, 54] portant sur
un plus grand nombre d’échantillons ont été réalisées par le Prof. Cornelis Van Leeuwen et
son équipe, de l’UMR Œnologie-Ampélogie de Bordeaux. Ils prennent en considération des
paramètres tels que la pluviométrie, la température, la position géographique et d’autres
facteurs strictement agronomiques pour interpréter les contenus en deutérium et oxygène-18
du raisin et des vins.
De l’analyse de nos vins, produits en 1998 et 1999, nous avons remarqué une variation
des valeurs moyennes des δ18O et des δ2H. Les moyennes et leurs écart-types, calculés pour
année et pays, sont reportés dans le Tableau 4, une représentation graphique pour quelques
pays est présentée dans la Figure 21.
Dans la plupart des 9 pays, les teneurs en 18O et 2H sont en général plus élevées en
1999 qu’en 1998, bien que pour l’Angleterre la variation en δ2H (∆δ2H (1999-1998)) soit
fortement négative. Pour les pays les plus chauds, comme l’Espagne, le Portugal ou la Grèce,
il n’y a presque pas de variations en 18O entre 1998 et 1999. La Figure 21 montre, pour
l’Allemagne, l’Autriche et la France, que les valeurs δ18O (colonne de gauche) et δ2H des vins
de 1999 sont plus élevés : la ligne bleu (1999) est plus externe et autour de celle rouge,
représentant les données de 1998.
Chapitre V
187
4.4.4. Carbone-13
L’homogénéité des valeurs δ13C des 180 vins analysés est très évidente, même en
prenant en compte deux récoltes distinctes et des provenances géographiques diverses.
L’intervalle de δ13C de nos échantillons de vins va de -30 à -25 ‰.
Les comparaisons de δ2H et δ18O avec δ13C sont reportées dans les Figures 22 a et b
et Figures 23 a et b. En 1998 δ2H et δ18O montrent une assez bonne corrélation linéaire avec
le contenu en 13C (R=0.61 et 0.71). Les échantillons de 1999 montrent encore une corrélation
significative entre δ18O et δ13C avec R=0.60, mais la dispersion plus grande des valeurs δ2H et
δ13C en 1999 conduit à l’absence de corrélation (R=0.20).
Tableau 4 : Variation des teneurs moyennes en 18O et 2H des vins des deux récoltes.
Variation temporelle de 18O et 2H des éthanol des vins
δ2H δ18O Pays
n (1998/1999) 1998 1999 ∆δ2H
(1999-1998) 1998 1999 ∆δ18O
(1999-1998)
Allemagne 11/10 -253±4 -242±5 11.7 20.7±2.4 25.6±2.6 4.9
Angleterre 3/4 -214±24 -246±8 -31.6 14.1±4.9 19.5±1.0 5.4
Autriche 10/12 -246±9 -238±6 8.3 21.5±1.5 24.0±1.3 2.5
Espagne 10/10 -227±10 -220±5 7.9 29.5±3.6 30.2±1.9 0.7
France 15/14 -234±13 -230±5 4.6 24.6±3.0 27.5±2.0 3.0
Grèce 4/6 -222±13 -215±8 6.7 27.8±2.4 27.6±1.6 -0.2
Italie 13/14 -228±13 -221±11 6.3 27.2±3.0 25.1±3.6 -2.1
Luxembourg 3/4 -251±5 -248±2 3.3 20.4±1.9 24.1±1.0 3.6
Portugal 9/14 -222±11 -225±7 -3.9 28.1±1.5 28.1±2.5 0.0
Les valeurs δ2H et δ18O (moyenne ± SD) sont exprimées en ‰ vs. V-SMOW.
Chapitre V
188
Figure 21 : Variation de l’18O et du 2H des vins des deux récoltes
18O : Allemagne
18.0
23.0
28.0
33.0
18O : Autriche
18.0
22.0
26.0
18O : France
20.0
26.0
32.0
2H : Allemagne
-270
-260
-250
-240
-230
2H : Autriche
-270
-260
-250
-240
-230
2H : France
-270-260-250-240-230-220-210-200
Chapitre V
189
Figure 22 a et b : Combinaison des δ18O et δ13C de l’éthanol des vins analysés
Vins - récolte 1998 : 18O et 13C
R = 0.71-31,0
-29,0
-27,0
-25,0
-23,0
10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0δ18O [‰] vs V-SMOW
δ 13
C [‰
] vs
PDB
Allemagne Angleterre Autriche Espagne France Grèce Italie Lux.g Portugal
Vins - récolte 1999 : 18O et 13C
R = 0.60-31,0
-29,0
-27,0
-25,0
-23,0
10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0δ18O [‰] vs V-SMOW
δ 13
C [‰
] vs
PDB
Allemagne Angleterre Autriche Espagne France Grèce Italie Lux.g Portugal
Chapitre V
190
Figure 23 a et b : Combinaison des δ13C et δ2H de l’éthanol des vins analysés
Vins - récolte 1998 : 13C et 2H
R = 0.61
-280
-260
-240
-220
-200
-180
-31 -30 -29 -28 -27 -26 -25 -24
δ13C [‰] vs PDB
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Allemagne Angleterre Autriche Espagne France Grèce Italie Lux.g Portugal
Vins - récolte 1999 : 13C et 2H
R = 0.20
-280
-260
-240
-220
-200
-180
-31 -30 -29 -28 -27 -26 -25 -24δ13C [‰] vs PDB
δ 2 H
[‰] v
s V-
SMO
W
Allemagne Angleterre Autriche Espagne France Grèce Italie Lux.g Portugal
Chapitre V
191
Tableau 5 : Analyse multi-isotopique d’échantillons de bières
Mesures de δ2H, δ13C et δ18O sur les éthanols issus de bières
Echantillon Origine Type déclaré /
composition δ2H δ13C δ18O
Bière 1 Belgique double malt -255.4 -27.0 25.8
Bière 2 France double malt -250.4 -27.1 25.4
Bière 3 Allemagne Weißbier,
blé/orge -266.8 -26.7 23.9
Bière 4 Allemagne Weißbier,
blé/orge -268.6 -26.7 24.8
Bière 5 Allemagne Weißbier,
blé/orge -263.9 -26.0 24.6
Bière 6 Irlande orge -274.7 -27.8 23.5
Bière 7 Italie riz/orge -255.1 -25.5 26.5
Bière 8 Italie pur malt -265.2 -26.7 24.1
Bière 9 Italie n.d. -255.2 -21.8 23.4
Bière 10 Italie n.d. -244.0 -19.9 24.7
Bière 11 Mexico maïs/riz/orge -251.5 -17.5 24.1
Moyennes -260 ±9 24 ± 1
Les valeurs δ2H sont exprimées en ‰ vs. V-SMOW, δ13C en ‰ vs. PDB et δ18O en ‰ vs. V-
SMOW.
Compte tenu de l’utilisation de plantes C3 ou C4 la moyenne δ13C n’a pas été calculée, elle
n’aurait aucune signification.
Chapitre V
192
4.5. Bières
Les échantillons de bière que nous avons analysés (voir Tableau 5) sont des produits
commerciaux provenant de plusieurs pays. La teneur en oxygène-18 est très homogène, avec
δ18O compris entre 23.5 et 26.5 ‰ (moyenne 24.0 ‰), sans aucune corrélation particulière
avec la composition déclarée sur l’étiquette. Les valeurs du rapport 2H/1H sont plutôt
dispersées, les δ2H vont de -244.0 à -274.7 ‰, autour d’une moyenne de -260 ‰.
Il ne parait donc pas possible de caractériser les bières, au moins à cette étape des
études, par leurs teneurs en deutérium total et en oxygène-18.
Le contenu en carbone-13 est clairement lié à l’origine botanique des composants
fermentés, une plus grande proportion de maïs augmente la teneur en 13C. Les mêmes bières
ont été analysées et d’autres résultats ont été discutés dans le Chapitre IV.
5. CONCLUSIONS
5.1. Technique
D’un point de vue technique, la mesure de la teneur en deutérium total et en oxygène-
18 par pyrolyse utilisant un appareil TC/EA est plutôt simple et conduit à une bonne
répétabilité. Peu de laboratoires étant actuellement équipés pour ce type d’analyse, il est
difficile de comparer les expériences et d’avoir des repères communs.
C’est pour mieux évaluer cette technique que nous avons organisé le « ring-test » de
mesures 18O sur l’éthanol par TC/EA : il faut évaluer les différences, s’il y en a, entre
injection directe et introduction par capsules, comprendre l’influence due aux calibrations,
vérifier si les tamis moléculaires introduisent des fractionnements isotopiques ou pas pendant
la déshydratation des alcools.
Un résultat important de nos études est sûrement la création d’une banque de données
assez riche et variée de teneurs en 18O et 2H de plusieurs éthanols, qui va être ultérieurement
enrichie.
Chapitre V
193
5.2. Interprétation
Mis à part le problème de la déshydratation, il faut préciser que les profils de
distribution dans l’espace δ18O-δ2H de nos échantillons, notamment des sucres de céréales,
des éthanols de riz (saké) et des alcools synthétiques, sont similaires ou superposables à ceux
d’une étude japonaise [40]. Les valeurs absolues ne sont pas comparables à cause des
différences de préparation des échantillons, les chercheurs japonais ont analysé les éthanols
tels quels, sans étape de déshydratation, comme nous l’avons pratiqué.
Pour les alcools issus de plusieurs matrices, des différences dans le contenu en 18O et 2H sont visibles, elles sont dues soit à l’origine botanique (miels, sucres de céréales, boissons
spiritueuses) soit aux différentes origines géographiques (vins, brandies), et des distinctions
sont possibles en utilisant d’autres données isotopiques (13C, D/H).
Pour les vins les facteurs climatiques jouent un rôle très important et les considérations
sur la base des mesures 18O et 2H sont limitées, si l’on ne possède pas de données
climatologiques. Néanmoins, des corrélations entre les isotopes et l’origine des vins sont très
claires et elles mériteraient d’être approfondies.
194
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Chapitre V
195
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Chapitre V
198
50 F. Serra, A. Mikołajczuk, G. Calderone, F. Vanhaecke, F. Reniero, C. Guillou – A oxygen isotope ratio measurement of organic compounds: observation on the commercially available on-line systems - the TC-IRMS, 2004, en preparation 51 Projet managé par E. Anklam, « Detection of the botanical and geographical origin of honey », CCR-Ispra, 1997 52 Projet du contrat n° DG XXI/95/901, « Determination of the presence of glucose derived from other cereals or from potatoes in maize glucose », 1995-1996 53 J.-P. Gaudillère, C. van Leeuwen, N. Ollat – Carbon isotope composition of sugars in grapevine, an integrated indicator of vineyard water status, Journal of Experimental Botany, 2002, 53, 369, 757-763 54 C. van Leeuwen, P. Friant, X. Chone, O. Tregoat, S. Koundouras, D. Dubourdieu –Influence of climate, soil, and cultivar on terroir, American Journal of Enology and Viticulture, 2004, 55 (3), 207-217
Chapitre VI
Chapitre VI
201
Contribution à l’authentification de
l’arôme de pomme : 13C du butan-1-ol
mesuré par GC-C-IRMS
1. INTRODUCTION
application des techniques isotopiques aux études des arômes et des parfums
pour en vérifier l’origine naturelle, synthétique ou hémi-synthétique est
couramment pratiquée dans le domaine des industries alimentaires et des arômes. Dans ce but
la RMN-FINS [1] a beaucoup été utilisée pour l’étude de la répartition du 2H dans les
molécules cibles, et la CG-C-SMRI dans les mesures multicomposants en carbone-13.
Suite aux études pionnières de A. Mosandl [2, 3], une abondante littérature a été publiée
sur l’application de la CG-C-SMRI utilisant des colonnes capillaires chirales.
Les molécules aromatiques qui ont été étudiées sont nombreuses et pour la plupart
issues de fruits. Les essences de citron, de citronnelle, de mandarine, d’orange ont fait l’objet
de plusieurs études [4-6]. A ces travaux on peut ajouter ceux réalisés plus récemment sur les
arômes de pommes [7], de banane [8], d’ananas [9] et de poire [10], sur la vanilline [11-14], les
huiles d’amande et de cannelle [15] , sur des composés isolés rencontrés dans des herbes et des
épices : par exemple le trans-anéthol, l’estragol, la cétone de framboise, le méthyl-eugénol,
les acides phénylacétiques ou le cinnamate de méthyle [16-21].
L’
Chapitre VI
202
1.1. Réglementations pour la protection de la santé publique
Les règlements en vigueur aussi bien en Europe qu’au Japon sur l’origine des produits
et l’étiquetage sont très restrictifs, le faux étiquetage qui peut entraîner de dégâts économiques
ou affecter la santé du consommateur est lourdement sanctionné.
Dans l’Union Européenne l’harmonisation des lois sur les substances aromatisantes
remonte à 1988 [22] et à 1989 [23] pour les additifs. Le règlement le plus récent sur les arômes
et leur ajout aux aliments date de 1996 [24].
Au Japon, le règlement principal du Ministère de la Santé, du Travail et du Bien-être
qui règle tous les aspects liés aux productions agricoles, aux produits de la pêche, aux additifs
alimentaires – naturels ou synthétiques permis – etc., est la « Food Sanitation Law » [25].
1.2. Notre approche pour la caractérisation de l’arôme de pomme
En collaboration avec le Professeur C. Fuganti du « Politecnico di Milano » nous
avons entrepris un travail de recherche visant à utiliser la méthode des rapports isotopiques
pour évaluer l’authenticité de certains mélanges d’arôme de pomme produits par de nouveaux
fournisseurs de substances aromatisantes. La demande émanait d’une entreprise de confiserie,
soucieuse de vérifier s’il y avait eu des changements de « naturalité » dans les nouvelles
essences qu’elle allait utiliser dans ses produits destinés aux marchés européen et japonais.
Parmi les composants aromatiques les plus importants dans les pommes – constitués
principalement de β-damascénone, de plusieurs esters (hexanoates, butanoates et acétates) –
on trouve aussi le butan-1-ol (ou n-butanol) [26]. Ce composé n’est pas le responsable
déterminant du goût typique du fruit, mais il est présent plutôt comme « solvant », et il peut
être utilisé comme tel dans les préparations aromatisantes. C’est sur cette molécule-sonde que
nous avons réalisé des mesures de rapport isotopique 13C/12C par CG-C-SMRI.
2. MATERIEL ET METHODES L’équipe du «Politecnico» de Milan nous a fourni six échantillons d’arôme de pomme,
dont deux sûrement artificiels. A côté de ces mélanges, nous avons pris en considération trois
autres échantillons de butan-1-ols commerciaux, de pureté supérieure à 99.5%.
Chaque échantillon a été dilué dans l’acétate d’éthyle, dans un rapport 1:40, jusqu’à
obtenir un pic à m/z 44 d’intensité comprise entre 4 et 6 V. Les trois butan-1-ols
Chapitre VI
203
commerciaux ont été mesurés préalablement par AE-SMRI et l’un d’eux en GC pour
déterminer les conditions chromatographiques.
2.1. Système CG-C-SMRI
Notre chaîne CG-C-SMRI était constituée d’un chromatographe (Varian 3400), couplé
au spectromètre de masse de rapports isotopiques (ThermoFinnigan Delta Plus), par une
interface de combustion (ThermoFinnigan Mat).
La colonne capillaire utilisée pour la séparation était une Chrompack WCOT en silice
remplie de polyéthylène glycol, model CP-WAX57CB, de 25m de longueur, de 0.25mm de
diamètre intérieur et de 0.20 µm d’épaisseur du film.
L’échantillon était introduit – en mode split, avec un flux de dilution de 210 mL/min –
à l’aide d’un « auto-sampler » A200S, la quantité injectée au moyen d’une seringue Hamilton
de 1.8 µL était de 0.1 µL. La température de l’injecteur était réglée à 250 °C, en tête de
colonne la pression du gaz vecteur (hélium) était de 6 PSI.
Le programme de température était le suivant : 5 min à 35 °C , puis une augmentation
de 5 °C par minute jusqu’à 200 °C, pour un temps total de 38 minutes, sans considérer le
temps nécessaire pour le refroidissement de la colonne. La sortie du butan-1-ol commençait à
environ 900-950 secondes (15-16 min). L’élution de tout le mélange n’était complète
qu’après 35 minutes. Au moyen de la vanne de « backflush » (anti-retour), le solvant et les
composants les plus volatils étaient déviés à la sortie de la colonne, pour limiter la
dégradation des fours de combustion et de réduction.
La configuration de l’interface de combustion, pour la production de CO2 en ligne par
oxydation-réduction des produits élués pour la mesure des masses 44, 45 et 46 est la même
que celle mentionnée au Chapitre III. Le chromatogramme résultant de la séparation des
composés d’un échantillon d’arôme de pomme est montré en Figure 1.
2.2. Autres mesures
Les trois butan-1-ols purs commerciaux ont été analysés par EA-IRMS, grâce à un
analyseur élémentaire Carlo Erba couplé par l’interface ConFLO ThermoFinnigan Mat, au
spectromètre de masse ThermoFinnigan Delta Plus. Les produits ont été injectés au moyen
Chapitre VI
204
Figure 1 : Chromatogramme de l’arôme de pomme
n-bu
tano
l Pi
cs d
e C
O2 d
e ré
fére
nce
Chapitre VI
205
d’un « autosampler » pour liquides AS800. Les principes de la technique et notre
configuration ont été déjà illustrés dans le Chapitre II.
Les valeurs δ18O de ces échantillons ont aussi été mesurées, par pyrolyse au moyen du
système TC-EA, afin de mieux caractériser ces produits. On a décrit les principes de cette
méthode dans le Chapitre II et nos conditions opératoires pour certains échantillons liquides –
dont le butanol – dans l’Annexe C.
3. RESULTATS Toutes les analyses d’échantillon d’arôme par CG-C-SMRI, ont été répétées trois fois
et la valeur δ13C est la moyenne de trois mesures individuelles. Une trop faible concentration
en butan-1-ol ne permet pas d’obtenir une bonne séparation et donc une mesure de δ13C.
L’écart- type (SD) varie en fonction de la séparation atteinte.
Les échantillons d’alcool n-butylique commerciaux ont été mesurés en double pour la
détermination du rapport 13C/12C par EA-IRMS et en cinq injections pour les mesures du
rapport 18O/16O par TC-EA.
Les échantillons analysés et tous les résultats sont reportés dans le Tableau 1.
4. DISCUSSION 4.1. Technique
La réponse au problème de départ – tester la possible utilisation des méthodes
isotopiques sur un des composants d’un mélange aromatisant – est positive : la séparation par
chromatographie gazeuse du composé butan-1-ol, à condition qu’il soit présent en
concentration suffisante, et la mesure de sa teneur en 13C sont possibles.
Bien que quasi totalement automatisable, l’analyse δ13C du butan-1-ol d’un arôme de
pomme par CG-C-SMRI est plutôt longue à cause des trois répétitions de 45 minutes chacune.
De plus chaque échantillon nécessite des essais préliminaires pour vérifier la distribution des
composants et d’éventuelles superpositions.
Chapitre VI
206
Tableau 1 : Liste des échantillons et résultats des analyses isotopiques
Analyse δ13C du butan-1-ol dans des mélanges d'arôme de pomme
Echantillon δ13C
(en ‰ vs. PDB) SD
(n=3)
A. Apple Standard Aroma (12.02.2003) -13.7 0.3
B. Artificial Apple Flavor RMR-15611 (lot 01-022) -18.9 0.6
C. Flavor Apple 52.681T (old) -28.5 0.1
D. Flavor Apple 54.697T (new) -14.5 0.1
Butan-1-ols commerciaux
δ13C
(en ‰ vs. PDB)SD
δ18O (en ‰ vs. VSMOW)
SD (n=5)
Fluka mesuré par CG-C-SMRI (n=3) -27.8 0.25
Fluka -28.3 0.2 10.3 0.1
Merck -28.2 0.2 17.1 0.1
Sigma
mesurés par EA-IRMS (n=2)
-28.6 0.1 17.6 0.2
4.2. Interprétation
La valeur δ13C du nouveau mélange aromatique (échantillon D, -14.5‰) est
effectivement très éloignée de celle de l’ancien (échantillon C, garanti d’origine naturelle) et
elle est comparable aux δ13C des deux échantillons artificiels (A et B). Une teneur en 13C de
-28.5 ‰ est cohérente avec une origine de plante C3, telle que la pomme.
Par contre, si l’on considère les valeurs des échantillons commerciaux, on ne peut pas
exclure que de tels produits soient utilisés pour la production d’arôme de pomme. Les plus
récents procédés de production des alcools butyliques commercialisés (normal-, et iso-
butanol), utilisent des techniques biosynthétiques, à partir de sucres, par fermentation à l’aide
de Clostridium acetobutylicum ou bien par synthèse à partir de dérivés du pétrole (par
réduction de l’acide butyrique, issu du propylène).
Chapitre VI
207
L’augmentation du prix du pétrole est probablement en liaison avec une part croissante
de butan-1-ol produit par fermentation. D’ailleurs, des échantillons d’origine synthétique
obtenus à partir d’hydrocarbures fossiles auraient présenté des valeurs δ13C bien plus
négatives. Les valeurs δ13C élevées (~ -14‰) pourraient s’expliquer par l’utilisation de sucres
C4 dans le processus de fermentation ou par la mise en œuvre d’un procédé américain qui
conduit à l’alcool butylique à partir de fibres de maïs hydrolysées puis fermentées par une
forme sélectionnée de Clostridium beijerinckii.
La proximité des teneurs en carbone-13 observées pour les butanols commerciaux,
limite l’interprétation que l’on peut donner, à ce stade, de l’application de la seule mesure de
cet isotope. Ces études préliminaires mériteraient donc un approfondissement, par exemple
par combinaison des mesures δ13C et δ18O (voire δ2H), qui pourraient être obtenues par
chromatographie gazeuse couplée à la pyrolyse (technique GC-TC), afin de collecter des
informations indépendantes et plus nombreuses. L’équipement nécessaire à ces mesures est en
développement chez les deux principaux constructeurs.
Parallèlement l’utilisation de molécules sondes, autres que le butan-1-ol, permettrait
vraisemblablement d’accroître le pouvoir discriminant de ces méthodes.
208
Bibliographie 1 C. Fuganti, G. Zucchi – Recent studies on the biogeneration of flavours, La Chimica e l’Industria, 1997, 79, 745-50 2 A. Mosandl – Enantioselective capillary gas chromatography and stable isotope ratio mass spectrometry in the authenticity control of flavors and essential oils, Food Reviews International, 1995, 11, 597-664 et références citées 3 M. Bayer, A. Mosandl – Improved gas chromatographic stereodifferentiation of chiral main constituents from different essential oils using a mixture of chiral stationary phases, Flavour and Fragrance Journal, 2004, 19, 6, 515-517 4 W. Meier-Augenstein – Review: Applied gas chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1999, 842, 351-371 et références citées 5 A. Rossmann – Determination of stable isotope ratios in food analysis, Food Reviews International, 2001, 17, 3, 347-381 et références mentionnées dans la revue 6 A. Mosandl – Authenticity assessment: a permanent challenge in food flavor and essential oil analysis, Journal of Chromatographic Science, 2004, 42, 8, 440-449 7 V. Karl, A. Dietrich, A. Mosandl – GCC-IRMS measurements of some carboxylic esters from different apple varieties, Phytochemical Analysis, 1994, 5, 32-37 8 B. Salmon, G.J. Martin, G. Remaud, F. Fourel – Compositional and isotopic studies of fruit flavours. Part I. The banana aroma, Flavour and Fragrance Journal, 1996, 11, 353-359 9 C. Preston, E. Richling, S. Elss, M. Appel, F. Heckel, A. Hartlieb, P. Schreier – On-line gas chromatography combustion/pyrolysis isotope ratio mass spectrometry (HRGC-C/P-IRMS) of pineapple (Ananas comosus L. Merr.) volatiles, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2003, 51, 8027-8031 10 K. Kahle, C. Preston, E. Richling, F. Heckel, P. Schreier – On-line gas chromatography combustion/pyrolysis isotope ratio mass spectrometry (HRGC-C/P-IRMS) of major volatiles from pear fruit (Pyrus communis) and pear products, Food Chemistry, 2005, 91, 3, 449-455 11 G. Remaud, Y.L. Martin, G.G. Martin, G.J. Martin – Detection of sophisticated adulterations of natural vanilla flavours and extracts: application of the SNIF-NMR method to vanillin and p-hydroxybenzaldehyde, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1997, 45, 3, 859-866 12 M.J. Dennis, P. Wilson, S. Kelly, I. Parker – The use of pyrolytic techniques to estimate site specific isotope data of vanillin, Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 1998, 47, 95–103 13 G. Fronza, C. Fuganti, S. Serra, A. Burke, C. Guillou, F. Reniero – The positional δ(18O) values of extracted and synthetic vanilla, Helvetica Chimica Acta, 2001, 84, 351-359
Chapitre VI
209
14 E. J. Tenailleau, P. Lancelin, R.J. Robins, S. Akoka – Authentication of the origin of vanillin using quantitative natural abundance 13C NMR, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2004, sous presse 15 G. Remaud, A.A. Debon, Y.L. Martin, G.G. Martin, G.J. Martin – Authentication of bitter almond oil and cinnamon oil: application of the SNIF-NMR method to benzaldehyde, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1997, 45, 10, 4042-4048 16 S. Hanneguelle, J.-N. Thibault, N. Naulet, G.J. Martin – Authentication of essential oils containing linalool and linalyl acetate by isotopic methods, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1992, 40, 81-87 17 G. Fronza, C. Fuganti, C. Guillou, F. Reniero, D. Joulain – Natural abundance 2H nuclear magnetic resonance study of the origin of raspberry ketone, Journal of Agriculture and Food ChemistryJournal of Agriculture and Food Chemistry, 1997, 46, 248-254 18 J. Aleu, G. Fronza, C. Fuganti, S. Serra, C. Fauhl, C. Guillou, F. Reniero – Differentiation of natural and synthetic phenylacetic acids by 2H-NMR of the derived benzoic acids, European Food Research and Technology, 2002, 214, 63–66 19 C. Ruff, K. Hör, B. Weckerle, T. König, P. Schreier – Authenticity assessment of estragole and methyl eugenol by on-line gas chromatography-isotope ratio mass spectrometry, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2002, 50, 1028-1031 20 S. Bilke, A. Mosandl – 2H/1H and 13C/12C isotope ratios of trans-Anethole using gas chromatography isotope ratio mass spectrometry, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2002, 50, 3935-3937 21 K. Fink, E. Richling, F. Heckel, P. Schreier - Determination of 2H/1H and 13C/12C isotope ratios of (E)-methyl cinnamate from different sources using isotope ratio mass spectrometry, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2004, 52, 3065-3068 22 Directive du Conseil 88/388/CEE et amendements successifs 23 Directive du Conseil 89/107/CEE et amendements successifs 24 Règlement (CE) N° 2232/96 du Parlement Européen et du Conseil « fixant une procédure communautaire dans le domaine des substances aromatisantes utilisées ou destinées à être utilisées dans ou sur les denrées alimentaires » et amendements successifs 25 Loi No. 233, 24 décembre 1947. Dernière révision 30 mai 2003. Source JETRO, Japan External TRade Organization (http://www.jetro.go.jp/) 26 E.A. Baldwin – Fruit and vegetable flavor. In: The commercial storage of fruits, vegetables, and florist and nursery stocks, edited by Ken Gross, Agriculture Handbook N° 66, 2004, USDA, online draft
Chapitre VII
Chapitre VII
213
Conclusions et perspectives
ous avons montré qu’il est possible de séparer les divers composants de
plusieurs produits, surtout de boissons alcoolisées, et en analyser le contenu en
isotopes stables (2H total et spécifique, 13C, 18O) en utilisant les techniques de spectrométrie
de masse des rapports isotopiques.
Nous avons déterminé la teneur en 13C du glycérol du vin par CG-C-SMRI (Chapitre
III) et au moyen de la même technique nous avons mesuré sa concentration. Ces deux
mesures ne sont pas nouvelles, mais dans ce travail nous les avons réalisées simultanément et
de plus cette application évite les longues préparations d’échantillons pratiquées
précédemment.
Nous avons mis en évidence une forte corrélation linéaire entre les δ13C du glycérol et
de l’éthanol, qui se maintient dans les vins de pays différents et une corrélation logarithmique
entre la concentration en glycérol et en éthanol. Toutefois, ces corrélations ne sont pas
observées dans le cas des vins botrytisés, qui sont plus riches en glycérol ne provenant pas de
la fermentation alcoolique.
N
Chapitre VII
214
Nous envisageons d’étendre ces études sur le glycérol à des matrices telles que les vins
doux, qui présentent des problèmes lors de la chromatographie à la présence des sucres, mais
qui sont sans doute plus susceptibles d’être sujets à ce type d’adultération. Les bières qui sont
elles-mêmes des produits de fermentation, donc contenant du glycérol, seraient aussi
intéressantes à étudier.
Une évolution de ces études sur le glycérol pourrait être l’analyse par pyrolyse en
GC-TC, afin de caractériser son contenu en deutérium total et en oxygène-18.
Pour les vins pétillants (Chapitre IV) le rapport 13C/12C du dioxyde de carbone a été
mesuré. Une méthode par CG-IRMS a été mise au point et utilisée pour mesurer la teneur en 13C du CO2 de l’espace de tête de n’importe quelle boisson gazeuse, y compris les bières, les
eaux, les cidres etc.. La mesure de 13C du CO2 permet de déceler l’ajout de gaz industriel
dans, par exemple, les eaux embouteillées et de vérifier l’origine de production des vins
pétillants ou des bières. Pour ces derniers produits nous n’avons pas trouvé de corrélations
entre le rapport 13C/12C du CO2 et les autres isotopes analysés pour l’éthanol (2H,13C, 18O).
Ceci n’est pas très surprenant car ce ne sont pas les mêmes carbones du sucre qui conduisent à
l’éthanol et au CO2. Les teneurs en 13C du CO2 et de l’éthanol sont donc deux paramètres
indépendants susceptibles d’être utilisés pour la caractérisation de ces boissons.
Une étude plus approfondie des bières est prévue en mesurant par 2H-RMN les (D/H)
de l’éthanol, il serait peut-être aussi intéressant de déterminer le 13C du résidu sec et si
possible le contenu en 15N du matériel protéique. De telles analyses pourraient être étendues
aux cidres. Une extension possible des études sur le dioxyde de carbone des boissons
pétillantes pourrait être l’emploi de l’appareil TC/EA pour mesurer le rapport 18O/16O.
Le Chapitre V a été consacré à l’étude de nombreux exemples d’éthanols d’origine
botanique et de provenance géographique diverses, ils ont été analysés par TC/EA en
deutérium total et oxygène-18. Pour les vins de deux récoltes différentes nous avons obtenu
de bonnes corrélations linéaires entre les δ18O de l’eau du vin et de l’éthanol distillé, entre le
δ2H et le δ18O et entre le δ13C et le δ18O de l’éthanol. Au contraire les δ2H et les δ13C ne sont
pas aussi bien corrélés. La rapidité de l’analyse en TC/EA permettra de travailler sur un très
grand nombre d’échantillons et de comparer les données isotopiques aux données
climatologiques.
Chapitre VII
215
Les valeurs δ18O mesurées sur l’éthanol permettent aussi, dans certains cas (miels,
sucres issus de céréales), une différenciation botanique ou en fonction de l’origine (boissons
spiritueuses), ou la détection d’ajout d’éthanol synthétique (exemple de la « fausse tequila »).
Les bières que nous avons étudiés montrent une gamme de variations δ2H et δ18O assez
restreinte. En revanche, leur paramètre δ13C indique clairement la présence de maïs lorsque
celui-ci figure parmi les ingrédients.
Jusqu’à présent les mesures par pyrolyse pour obtenir les valeurs δ18O et δ2H de
matière organique n’ont pas présenté une bonne reproductibilité sans doute à cause de
techniques et méthodes différentes appliquées par les quelques laboratoires qui s’y sont
intéressés. Actuellement un nouveau test interlaboratoire, organisé par le CCR, est en cours,
basé sur la méthode présentée (Chapitre V) pour l’analyse en 18O de l’alcool éthylique. Cela
permettra d’évaluer les différentes procédures de mesures et de calibration au niveau
international.
Une amélioration possible pourrait être l’analyse de l’éthanol par le système GC/TC.
Ceci permettrait d’analyser les éthanols sans étape de déshydratation, grâce à la séparation
chromatographique de l’eau et de l’alcool. On peut même envisager l’injection directe de
l’échantillon au moins dans le cas des boissons à contenu alcoolique élevé.
Une application classique des techniques isotopiques, la caractérisation des arômes, a
été utilisée (Chapitre VI) pour l’authentification de l’arôme de pomme utilisé dans
l’aromatisation de produits alimentaires. La méthode de chromatographie gazeuse couplée à
la SMRI fonctionne pour mesurer la teneur en 13C de notre molécule cible, le n-butanol, dans
certaines limites de concentration. Une recherche minutieuse de conditions
chromatographiques conduisant à une bonne séparation des autres composants permettrait de
faire un profil isotopique plus complet du mélange. De plus si on ajoutait des mesures de δ2H
et de δ18O par GC/TC, on aurait un profil multi-isotopique des divers composants de l’arôme.
La prochaine étape pourra être l’utilisation généralisée de la mesure des δ18O de
composés préalablement séparés par chromatographie en phase gazeuse, le développement de
cette technique semble déjà assez avancé chez les deux constructeurs principaux (Thermo
Electron et GVI) mais n’est pas encore disponible en routine.
L’arrivée sur le marché des premières applications utilisant la chromatographie liquide
à haute performance permettra prochainement d’accroître encore le nombre de données
Chapitre VII
216
accessibles et ainsi d’aller plus loin dans la caractérisation isotopique de composés très
différents.
Nous avons donc montré que les techniques isotopiques modernes peuvent être
utilisées pour obtenir de nouveaux critères qui, lorsqu’ils sont associés à ceux déjà utilisés en
routine pour le contrôle de l’authenticité de produits alimentaires et de boissons variées,
permettront sûrement d’accroître le pouvoir discriminant de ces techniques.
217
Annexes
Annexe A
Les techniques isotopiques dans les règlements CE
Annexe B GC-C-IRMS : Calibration du CO2 comme gaz de référence
Annexe C
TC-EA : Nos conditions opératoires
Annexe D Tableaux des vins soumis à l’analyse du glycérol (Chapitre III)
et de l’éthanol (Chapitre V)
Annexe A
Annexe A
221
Les techniques isotopiques dans les règlements CE
1. INTRODUCTION
es pages suivantes, sont la reproduction d’un article paru dans l’Actualité
Chimique, août-septembre 2003. Dans cette publication, nous faisons un
récapitulatif des normes et réglementations officielles au sein de la Communauté Européenne,
qui ont adopté des méthodes et techniques isotopiques dans le domaine des produits agro-
alimentaires.
Des notes sur les analyses standards utilisées dans l’industrie sont aussi reportées.
L
Annexe A
222
Annexe A
223
Annexe A
224
Annexe B
Annexe B
227
GC-C-IRMS :
Calibration du CO2 comme
gaz de référence
1. STANDARDS
n des problèmes de la technique GC-C-IRMS est le manque de produits de
référence certifiés, comme il en existe pour l’EA-IRMS.
On peut résoudre ce manque en étalonnant une bouteille de CO2 par rapport aux
références habituelles dans une chaîne EA et transférer la bouteille au système GC-C ou en
utilisant des composés appropriés à l’injection en GC. Malheureusement, l’absence de tels
standards certifiés nécessite une calibration sur l’autre système et augmente les incertitudes de
mesure.
1.1. En pratique
En Europe, les constructeurs proposent un mélange d’alcanes qui permet en
chromatographie de tester les FID. Nous avons utilisé comme référence de travail le FID-mix
fourni par Varian.
U
Annexe B
228
La solution de FID-mix est composée de C14, C15 et C16 dans l’isooctanol. Les valeurs
de δ13C assignées aux alcanes nous ont été communiquées par ThermoFinnigan France :
C14: -29.614 ‰ , C15: -25.514 ‰ , C16: -33.392 ‰.
L’avantage de ce mélange est dû au fait que les alcanes ne sont élués qu’en fonction de
leur masse sans qu’il y ait d’interaction sur la phase stationnaire. Cela se traduit par une
utilisation très générale du mélange, sur n’importe quelle colonne.
La séparation obtenue est montrée dans le chromatogramme suivant:
Figure 1 : Chromatogramme des alcanes du « FID-mix »
2. ELABORATION DES DONNEES
Pour chaque injection de la solution, les 3 valeurs δ13C des alcanes permettent de
calculer 3 valeurs δ13C pour le CO2 introduit.
La valeur finale attribuée au CO2 est la moyenne d’au moins cinq injections. Le
Tableau 1 montre un exemple de calibration d’une bouteille de CO2, évidemment d’origine
fossile.
C14 C15
C16
isooctanol
Annexe B
229
Tableau 1 : Calibration de CO2 contre le « FID-mix » Varian (2 µL)
Alcanes et leurs valeurs δ13C en ‰ vs PDB
C14 : -29,614 C15 : -25,514 C16 : -33,392
Injection δ13C attribués par Isodat au CO2 Moyen SD
1 -65,97 -66,56 -66,52 -66,35 0,27
2 -66,11 -66,77 -66,78 -66,55 0,31
3 -66,58 -66,53 -66,72 -66,61 0,08
4 -66,56 -66,41 -66,53 -66,50 0,06
5 -67,03 -66,69 -66,31 -66,68 0,29
6 -66,56 -66,42 -66,46 -66,48 0,06
7 -66,86 -66,55 -66,54 -66,65 0,15
Moyenne -66,52 -66,56 -66,55 -66,55 0,02
SD 0,35 0,12 0,15 0,10 0,23
Les valeurs δ13C pour le CO2 trouvées contre le FID-mix sont très reproductibles :
Figure 2 : Répétitivité des mesures de calibration du CO2
Annexe C
Annexe C
233
TC-EA :
Nos conditions opératoires
1. L’APPAREIL
otre système de TC-EA-IRMS est composé d’un TC-EA de la société
ThermoFinnigan (Finnigan MAT – Brême, GmbH), couplé à un spectromètre
de masse de rapport isotopique Delta Plus XP, du même constructeur. Les différents flux de
gaz – le gaz vecteur, gaz de référence, produit de la pyrolyse en sortie du TC-EA et gaz de
dilution – sont réglés au moyen des vannes du ConFLO III, qui relie les deux instruments. La
chaîne complète est pilotée par le logiciel Isodat NT version 2.0, sous Windows XP.
Le réacteur de pyrolyse est constitué d’un tube en céramique, long de 47 cm et
d’environ 1.5 cm de diamètre. A l’intérieur du tube, se trouve un tube plus petit entièrement
en carbone vitreux. Les deux colonnes sont remplies de carbone vitreux en granules, à la
hauteur à laquelle la température est la plus élevée.
2. CARBONE VITREUX (GLASSY CARBON) Le remplissage des colonnes est fait avec du « glassy carbon » ou carbone vitreux. Le
type utilisé dans notre laboratoire, est le Sigradur-G, produit par la firme allemande
Hochtemperatur-Werkstoffe GmbH. Les dimensions des granules – irrégulières – sont
comprises dans la plage de 3150-4000 µm.
N
Annexe C
234
Le carbone vitreux est une forme allotropique de carbone pur, produit par
décomposition thermique à partir d’un matériel polymérique à trois dimensions. Sa résistance
aux agressions chimiques et à la haute température, sa faible porosité aux gaz en font un
matériel utilisé dans plusieurs contextes [1]. Dans notre utilisation, il fournit le carbone en
excès nécessaire à la réaction de pyrolyse, pour que l’oxygène des échantillons introduits soit
transformé quantitativement en CO.
3. CONFIGURATIONS L’analyse des échantillons solides et liquides nécessite des configurations d’appareil
un peu différentes, soit du côté du passeur automatique d’échantillons (autosampler) pour
l’introduction des échantillons soit dans la préparation même du tube de réaction.
3.1. Echantillons solides
Les échantillons solides ou très visqueux sont introduits dans le four dans des capsules
en argent, les plus petites possibles, au moyen d’un autosampler à plateaux, l’A128S. Les
plateaux sont maintenus sous flux constant d’hélium pour les purger de l’air et ainsi éviter les
interférences avec l’azote lors des mesures.
Un entonnoir en graphite, à deux centimètres de la tête de la colonne, permet aux
capsules de tomber dans la partie chaude du réacteur. Là, un petit creuset retient le métal des
capsules et les cendres des échantillons. Le schéma de cette configuration est présenté en
Figure 1.
3.2. Echantillons liquides
Les échantillons liquides étaient majoritairement des eaux et des éthanols. Les produits
telles que les huiles sont trop visqueux pour être injectés avec succès, et il faut, donc, les
introduire au moyen des capsules.
Un tube en graphite affleurant le haut du four, empêche que le liquide injecté aille au
contact des parois qui sont froides à cette hauteur. L’autosampler pour injecter les liquides
était un A200S, équipé d’une seringue Hamilton à aiguille fixe de 1 ou 2 µL. Le schéma de
cette configuration est présenté en Figure 2.
1 http://www.2spi.com/catalog/mounts/vitreous.html et http://www.dendritics.com/scales/c-allotropes.asp
Annexe C
235
Figure 1 : Configuration du système TC-EA pour échantillons solides (réélaboration d’après le
manuel original de ThermoFinnigan)
Annexe C
236
Figure 2 : Configuration du système TC-EA pour échantillons liquides (réélaboration d’après le
manuel original de ThermoFinnigan)
Annexe C
237
4. TEMPERATURE Les conditions de température conseillées par le constructeur, sont les suivantes:
Matrice Elément Température conseillée
Oxygène 1325-1350 °C Matériel organique
Hydrogène 1400 °C
Eau Oxygène/Hydrogène 1400 °C
Oxygène 1450 °C Matériel inorganique
Hydrogène 1450 °C
85 °C pendant les analyses Colonne chromatographique
150 °C pour la reconditionner
Pour notre part, nous avons toujours réglé la température du réacteur à 1450 °C, aussi
bien pour l’oxygène que pour l’hydrogène des eaux, alcools et autres matrices. Des essais sont
en cours pour les matrices contenant de l’azote, surtout pour la colonne chromatographique,
pour éliminer la superposition du pic d’N2 à celui du CO.
5. GAZ DE REFERENCE Pour la référence 2H, nous avons utilisé une bouteille de 14 L d’H2 (Air Liquide, degré
de pureté type Alphagaz 2). Pour la référence 18O, nous avons utilisé une bouteille de 20 L de
CO, Air Liquide, même degré de pureté.
La calibration des deux gaz a été faite par des injections des eaux SMOW, GISP et
SLAP fournies par l’IAEA. Pour l’18O la validité de cette calibration a été confirmée grâce à
d’autres standards IAEA solides (cellulose, sucres), analysés en capsule.
Nous avons vérifié la stabilité du système en mesurant ces produits ayant des valeurs
δ18O connues, mais non certifiées (Figure 3).
Apparemment le changement de matrice – de liquide à solide – n’influence pas
beaucoup la calibration ni les valeurs assignées au gaz de référence dans l’une ou l’autre des
configurations. Mais des études complémentaires sont encore nécessaires et déjà en cours.
Annexe C
238
Figure 3 : Test de stabilité du TC-EA pour les mesures de δ18O. Les sucres de canne et de betterave sont ceux lors du projet «18O-sugars» [2]. (En collaboration avec F. Serra – JRC)
2 Determination of 18O /16O in Fruit Juice Sugars by Isotopic Ratio Mass Spectrometry, n° SMT4-CT98-2219
Annexe C
239
6. DEBIT D’HELIUM Le débit d’hélium dans le réacteur influence la forme des pics. Pour les analyses
routinières d’éthanol, on a réglé la pression à 1.5 bar, ce qui correspond à un débit d’environ
110 mL/min (mesuré avec un débitmètre digital). Pour les échantillons solides, on a utilisé
une pression de 2 bars. Sur le Conflo III, la pression de l’hélium de dilution est fixée à 1.0
PSI.
7. REMARQUES Pour les analyses de solides, il ne faut utiliser que des capsules en argent : avec celles
en étain, nous avons parfois observé un colmatage apparemment dû à une « réaction » entre le
métal et le carbone vitreux. Un tel colmatage n’est pas facile à briser, et le risque de casser le
réacteur est grand.
D'après le Dr. Giorgio Capasso de l’Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia
(INGV) de Palerme un déficit ou une inactivation du carbone vitreux au niveau de la zone de
pyrolyse entraîne une réaction avec le réacteur interne lui-même sur tout le pourtour du tube
qui alors se brise.
Nous avons vérifié partiellement ce processus en particulier avec les échantillons
d’eau, qui sont plus grands consommateurs de carbone que les échantillons organiques tels
que l’éthanol.
Un remède, partiel, consiste à rajouter régulièrement des granules de carbone vitreux
pour compenser sa disparition par réaction. Cela permet de prolonger la durée de vie du
réacteur qui est très onéreux (1.300 € pièce).
Annexe D
Annexe D
243
Tableaux des vins soumis à l’analyse
du glycérol (Chapitre III) et
de l’éthanol (Chapitre V)
ous avons analysé le contenu en glycérol et déterminé les teneurs en 13C de ce
même composé par GC-C-IRMS et en 2H (TC/EA et SNIF-NMR) et 18O-IMRS
sur l’éthanol d’environ 180 vins authentiques produits par les pays européens. Les récoltes
prises en considération sont celles des années 1998 (Tableau 1) et 1999 (Tableau 2).
Malheureusement, les informations sont incomplètes pour l’année 1999.
N
Annexe D
244
Tableau 1 : Liste des vins de la récolte 1998
Vintage 1998 Water Ethanol Glycerol Lab.
code Region/District Wine variety Typeδ18O TQ δ13C δ18O δ2H conc. δ13C
[‰] vs SMOW % w/w [‰] vs
PDB [‰] vs SMOW
[‰] vs SMOW g/L [‰] vs
PDB
99010203 Nordburgenland Valteliner Grüner white -2,80 9,56 -28,70 20.98 -251.45 7,9 -30,2799010204 Nordburgenland Zweigeltrebe r -1.80 11.65 -27.80 22.67 -242.28 - - 99010205 Nordburgenland Welschriesling w -3,40 10,30 -27,80 20.91 -243.91 7,7 -28,6099010206 Nordburgenland Valteliner Grüner w -3.70 9.42 -28.90 19.74 -259.38 - - 99010207 Nordburgenland Blaufraenkisch r -3.30 11.43 -27.40 20.74 -253.85 - - 99010208 Suedburgenland Cabernet Sauvignon red -2,50 11,38 -27,90 21.37 -246.63 8,6 -29,4199010219 Weinviertel Valteliner Grüner w -3,00 10,45 -27,90 22.20 -240.71 7,9 -29,0599010227 Weinviertel Mueller Thurgau w -3,10 10,19 -27,70 21.19 -252.94 7,0 -28,9699010245 Nordburgenland Traminer w -3,20 14,60 -28,70 24.94 -228.19 19,8 -28,35
Aus
tria
99010248 Nordburgenland Traminer w -4,60 16,71 -28,10 20.30 -244.12 23,3 -27,45
99060006 Dordogne Sémillon w 0,50 17,19 -25,30 24.77 -224.46 22,8 -24,4599060011 Loire-Atlantique Muscadet w -1,60 10,71 -26,10 22.36 -239.75 7,3 -27,7299060012 Maine-et-Loire Chenin Blanc w -1,40 12,58 -29,40 22.05 -247.01 9,3 -31,2199060014 Nièvre Sauvignon Blanc w -0,50 9,09 -25,10 22.82 -242.22 6,5 -27,9799030008 Haut-Rhin Auxerrois Blanc w 1,20 10,77 -26,50 21.35 -203.89 6,1 -28,5299030007 Marne Chardonnay w -0,10 10,92 -28,90 25.97 -220.01 6,5 -30,2099030053 Marne Meunier w -0,30 10,24 -28,40 22.36 -238.03 5,7 -30,5099030047 Drôme Grenache (Noir) rosé 5,20 12,22 -24,80 29.43 -221.28 7,1 -25,9799030048 Yonne Chardonnay w -0,60 10,69 -27,50 24.91 -242.32 7,0 -30,3899020005 Marne Pinot Noir w -1,00 11,82 -27,60 21.14 -247.32 8,0 -30,0199020009 Gironde Cabernet Sauvignon r -0,30 11,48 -26,00 30.05 -229.59 6,6 -27,0599020004 Côte-d’Or Pinot Noir w 2,20 11,55 -25,60 24.30 -242.47 8,6 -27,8299020015 Pyrénées-orientales Grenache (Noir) w 4,90 13,91 -26,10 30.00 -225.66 9,2 -27,3199020018 Vienne Chenin Blanc w -1,40 8,99 -28,80 23.89 -237.85 5,7 -31,46
Fran
ce
99020019 Haut-Rhin Pinot Gris w -0,80 13,16 -26,60 23.32 -251.03 8,3 -28,66
99020044 Naumburg Pinot Blanc w -6,00 9,28 -30,30 18.12 -257.83 6,8 -30,9899020062 Bas Kissingen Mueller Thurgau w -6,20 9,66 -28,50 18.83 -255.23 6,4 -31,5099020063 Schweinfurt Sylvaner w -4,20 10,71 -28,90 18.63 -250.00 7,6 -32,0999040020 Rems-Murr-Kreis Kerner w -4,10 13,47 -29,50 20.69 -252.49 8,4 -30,1899040024 Bad Durkheim Mueller Thurgau w -0,90 9,65 -27,30 24.79 -247.89 6,4 -30,3299040026 Ortenaukreis Gewürztraminer w -2,10 11,64 -28,00 21.48 -251.21 9,4 -30,23
99040027 Breisgau-Hochschwarz Pinot Noir w -3,20 12,91 -28,80 19.70 -256.64 8,7 -31,39
99040028 Ahrweiler Dornfelder r -4,30 8,02 -29,30 18.12 -247.90 5,5 -32,3499020042 Bergstrasse Riesling w -3,80 10,81 -28,90 24.60 -254.75 6,9 -29,30
99040031 Rhein-Hunsruck-Kreis Riesling w -3,40 10,18 -29,70 21.43 -251.18 6,2 -33,09
Ger
man
y
99040035 Mainz-Bingen Riesling w -4,90 8,80 -27,40 21.41 -261.39 4,8 -31,53
Annexe D
245
Water Ethanol Glycerol
Lab. code Region/District Wine variety Type
δ18O TQ δ13C δ18O δ2H conc. δ13C
[‰] vs SMOW % w/w [‰] vs
PDB [‰] vs SMOW
[‰] vs SMOW g/L [‰] vs
PDB
99050036 Florina Xynomavro w -0,20 10,62 -28,10 24.45 -240.13 5,9 -31,4999050048 Irakleio Mandilaria rosé 5,40 8,26 -24,10 - - 7,4 -26,6999050051 Irakleio Liatiko rosé 8,20 12,78 -25,20 27.80 -209.33 9,8 -26,9499050057 Samos Muscat Blanc à Petit w 4,80 16,27 -26,10 29.30 -217.71 9,0 -27,89G
reec
e
99050062 Samos Muscat Blanc à Petit w 5,30 15,28 -27,90 29.67 -219.06 9,5 -29,97
98110021 Bolzano Schiava grossa w 0.30 12.83 -28.50 - - 7.9 -30.9898120002 Padova Muscat blanc à petit w 4.60 13.12 -27.10 26.98 -234.29 10.3 -28.8899010009 Catania Calabrese rosé 4,20 12,92 -26,80 33.37 -208.65 12,9 -28,3299010012 Palermo Nerello mascalese r 6,95 11,02 -26,80 30.20 -206.22 11,7 -29,4798110015 Bari Uva di Troia r 2,90 11,96 -24,20 30.86 -214.75 7,1 -24,6399030010 Perugia Sagrantino w 1,40 14,68 -28,70 28.31 -218.87 10,1 -31,1499010197 Cuneo Barbera r 0,02 13,64 -28,90 22.58 -239.39 9,7 -31,9799010195 Aosta Pinot Noir w 1,25 14,13 -28,20 24.76 -249.98 10,1 -30,7899010002 Pavia Pinot Noir w 4,46 12,52 -25,60 26.71 -234.62 8,9 -27,4499010003 Brescia Pinot Blanc w 3,44 12,30 -26,40 26.02 -233.40 8,8 -28,4199010008 Imperia Vermentino w 2,27 12,96 -26,60 25.46 -226.28 9,5 -28,7199010016 Ravenna Sangiovese w 2,86 12,42 -26,50 26.66 -229.34 7,5 -29,0399010026 Ascoli Piceno Ugni Blanc w 0,92 12,27 -26,00 23.82 -228.38 9,5 -27,3799030029 Verona Garganega w 2,00 12,94 -26,80 - - 6,4 -27,92
Italy
99030030 Piacenza Barbera r 2,50 13,66 -27,10 27.96 -236.04 7,7 -29,30
99030034 Luxembourg Mueller Thurgau w -2,10 8,40 -28,30 22.26 -247.70 5,5 -29,8999030035 Luxembourg Cot w -3,60 9,86 -29,90 18.50 -257.10 6,6 -32,3499030036 Luxembourg Riesling w -3,50 10,18 -29,10 20.56 -248.19 5,3 -32,66Lu
x.
99030037 Luxembourg Riesling w -3,40 10,70 -30,10 - - 5,0 -33,33
99070087 Douro Donzelinho Roxo w 10,30 11,86 -25,80 32.85 -215.43 5,9 -28,2999070105 Oeste Boal Branco w 3,60 8,22 -26,10 29.23 -227.33 7,9 -26,4799070118 Dão-Lafões Rufete r -25,10 29.50 -212.12 9,8 -27,7399070130 Dao Lafoes Tinta Roriz r 2,60 10,79 -27,80 25.98 -215.85 7,7 -30,60
99070139 Beira Interior Norte Trincadeira Preta r 2,80 9,63 -23,60 - - 6,7 -26,54
99070141 A.Tras-os-Montes Siria w 1,30 12,60 -28,10 26.14 -239.69 8,6 -29,85
99070143 A.Tras-os-Montes Boal w 1,70 11,47 -28,80 26.92 -230.53 6,8 -30,59
99070151 A.Tras-os-Montes Tinta Barroca r 2,90 9,35 -27,50 26.17 -217.33 6,9 -30,44
99070164 Minho-Lima Borranal r -0,90 7,99 -28,70 25.57 -230.55 7,6 -29,31
Port
ugal
99070172 Oeste Periquita r 7,00 12,25 -24,90 30.13 -205.04 6,2 -28,18
Annexe D
246
Water Ethanol Glycerol
Lab. code Region/District Wine variety Type
δ18O TQ δ13C δ18O δ2H conc. δ13C
[‰] vs SMOW % w/w [‰] vs
PDB [‰] vs SMOW
[‰] vs SMOW g/L [‰] vs
PDB
99080005 Leon Mencia r 4,80 14,53 -26,10 28.85 -226.59 10,1 -28,6799080011 Sevilla Airen w 7,20 12,64 -25,90 29.96 -208.93 8,8 -28,3199050130 Valladolid Verdejo w 5,50 12,42 -24,20 30.71 -224.74 8,8 -26,5499080014 Valladolid Tempranillo r 1,80 12,80 -29,30 24.43 -240.92 8,6 -32,1599050131 Valladolid Tempranillo r 2,50 12,95 -27,40 25.16 -240.88 9,2 -30,6099080006 Ciudad Real Airen r 9,60 12,96 -25,50 33.65 -224.80 7,1 -28,1299080007 Badajoz Tempranillo r 12,90 14,37 -24,50 35.05 -215.68 9,2 -27,4999080008 Madrid Grenache (noir) rosé 3,10 14,74 -25,30 28.96 -230.23 9,2 -28,3899050133 La Rioja Tempranillo rosé 1,00 12,53 -25,40 25.91 -236.83 6,3 -28,03
Spai
n
99050135 Barcelona Macabeo w 3,60 12,57 -25,50 31.95 -225.34 5,9 -26,90
99030022 New Hall Bacchus w -2,70 7,98 -28,40 - - 3,3 -30,8599030023 Denbies Reichensteiner w -3,40 10,52 -28,80 19.67 -241.31 5,0 -31,6399030024 Bruisyard Mueller Thurgau w -4,00 6,92 -29,80 12.12 -197.55 2,1 -32,52U
.K.
99030025 Frithsden Mueller Thurgau w -3,50 6,57 -29,80 10.46 -204.23 1,5 -32,93
Annexe D
247
Tableau 2 : Liste des vins de la récolte 1999
Vintage 1999
Water Ethanol Glycerol
Lab. code Region/District Wine variety Type
δ18O TQ δ13C δ18O δ2H conc. δ13C
[‰] vs SMOW % w/w [‰] vs
PDB [‰] vs SMOW
[‰] vs SMOW g/L [‰] vs
PDB
00030014 --- --- white - - -29,11 22.66 -239.43 9,2 -30,0800030015 --- --- w - - -28,48 24.75 -237.08 16,4 -28,9200030021 --- --- red - - -27,17 23.73 -241.29 7,6 -29,1500030022 --- --- r - - -27,03 26.37 -233.08 7,7 -31,0600030023 --- --- w - - -28,03 25.34 -244.24 12,1 -29,7100030024 --- --- r -0,76 10,90 -28,43 24.08 -250.33 11,5 -28,8100030029 --- --- r - - -27,53 23.88 -240.78 9,1 -28,2400030034 --- --- w - - -28,08 22.34 -236.35 9,0 -28,9700030048 --- --- r - - -28,41 22.72 -240.16 8,2 -29,4100030051 --- --- w - - -27,98 22.78 -233.20 7,5 -29,9400030052 --- --- w - - -29,42 23.99 -233.71 7,3 -32,18
Aus
tria
00030062 --- --- w - - -26,67 25.74 -227.31 9,2 -30,88
00030069 Chiroubles Gamay w 4,77 13,90 -25,48 27.01 -230.91 7,5 -28,0700030073 Pomerol Merlot w 3,77 12,40 -25,77 28.36 -230.26 7,8 -27,7900030079 Pocé-sur-Cisse Cabernet Franc r -0,59 10,40 -26,32 24.43 -230.61 7,4 -28,6500030084 Cournonterral Syrah r 3,08 12,70 -28,05 28.70 -223.73 8,9 -29,02
00030085 Lançon de Prou Cabernet Sauvignon rosé 5,58 12,53 -24,66 31.04 -222.44 8,2 -27,10
00030086 Rosières Syrah rosé 2,02 11,80 -28,35 27.69 -230.73 7,5 -30,6800010069 Ouveillan --- w 2,78 9,42 -26,35 26.82 -234.56 9,3 -29,4900010071 Puyméras --- rosé 3,27 13,71 -27,16 27.43 -231.38 8,0 -30,0400010074 Chablis --- rosé 1,47 10,76 -25,71 28.90 -223.58 8,6 -27,4000010075 Maligny --- rosé 1,90 11,51 -27,42 28.96 -228.80 8,2 -29,2100060026 St- Ferme Sémillon w 2,86 11,35 -27,33 26.02 -224.97 7,1 -29,9000060028 Prayssac Cot rosé 1,97 11,47 -28,49 25.21 -238.81 7,0 -30,7100060032 Le Landreau Muscadet w 4,09 11,65 -26,98 30.04 -224.57 7,8 -29,93
Fran
ce
00060033 St-Jean-des- Mauvrets Cabernet Franc r -0,01 12,52 -28,70 24.90 -239.45 6,7 -30,73
00030004 Zeilitzheim Bacchus w - 10,07 -26,66 25.44 -239.54 6,1 -28,8100030005 Randersacker Riesling w - 12,71 -28,15 25.67 -242.57 7,8 -30,1300030007 Meißen Mueller Thurgau w - 11,42 -28,49 24.48 -248.25 5,8 -31,2000030008 Freyburg Gewürztraminer w - 11,19 -23,41 32.34 -229.95 11,1 -25,9900040186 Gundelsheim Spätburgunder w - 12,03 -29,36 25.09 -243.17 6,6 -29,9600040187 Abstatt Gewürztraminer w - 12,02 -28,29 24.61 -243.75 7,7 -29,0500040190 Briedern Mueller Thurgau w - 11,10 -28,14 24.35 -240.24 8,0 -29,3600040191 Ockfen Riesling w - 11,54 -26,79 25.50 -239.45 8,2 -26,9100040193 Heppenheim Portugieser rosé - 10,15 -28,37 26.41 -244.50 7,4 -28,70
Ger
man
y
00040194 Opfingen Mueller Thurgau w - 10,11 -28,71 22.10 -244.97 9,1 -29,45
Annexe D
248
Water Ethanol Glycerol
Lab. code Region/District Wine variety Type
δ18O TQ δ13C δ18O δ2H conc. δ13C
[‰] vs SMOW % w/w [‰] vs
PDB [‰] vs SMOW
[‰] vs SMOW g/L [‰] vs
PDB
00070015 --- --- r - - -26.41 27.31 -213.76 13.2 -26.3700070016 Dafnes Liatiko r 9,08 15,17 -26,12 29.93 -201.09 12,0 -26,9900070031 --- --- r - - -26,15 26.85 -215.39 12,6 -25,8500070032 --- --- w - - -26,99 29.11 -215.78 7,8 -27,7900070049 --- --- w - - -28,20 26.77 -219.86 7,9 -29,76G
reec
e
00070050 --- --- w - - -29,51 25.51 -223.41 6,9 -31,23
99110013 Trapani Cabernet francese r 9,32 16,04 -26,17 29.65 -198.00 14,7 -27,2099110018 Pordenone Verduzzo Friuli w 2,19 9,36 -28,62 26.38 -225.23 9,1 -28,8299110026 Alto Adige Riesling w -0,04 12,20 -28,59 21.07 -232.27 7,4 -29,9399110052 Cagliari Vermentino w 4,21 11,07 -27,84 22.99 -230.38 8,1 -29,6399110054 Bologna Sauvignon bianco w 3,74 12,14 -27,03 16.11 -217.75 7,1 -28,0199110061 Roma Grechetto rosso rosé 3,37 15,08 -27,87 25.61 -217.75 15,4 -28,81
99110083 Ragusa Frappato di Vittoria rosé 4,53 14,35 -25,94 28.88 -205.57 18,0 -25,65
99110091 Lucca Sangiovese r 2,71 11,23 -25,04 27.36 -219.74 6,6 -27,12
99110092 Siena Vernaccia di San Gimignano w 5,90 9,21 -24,57 24.78 -225.92 8,4 -25,65
99110097 Genova Sangiovese r 4,18 11,53 -25,29 23.37 -210.21 6,2 -25,6899110111 Bari Trebbiano toscano w 3,44 9,33 -26,13 28.99 -221.40 6,5 -26,6699120013 R. di Calabria Greco bianco w 5,91 14,53 -27,94 - - 99120026 Napoli Perricone w 2,23 13,00 -26,03 - - 9,3 -27,0500010011 Asti Dolcetto w 3,67 11,99 -27,78 26.07 -235.83 7,2 -28,5800010020 Brescia Pinot Blanc w 1,38 11,10 -27,90 23.06 -232.73 7,4 -30,59
Italy
00040003 Perugia Trebbiano w 3,11 12,23 -27,36 27.39 -227.21 8,5 -29,55
00050001 Luxembourg --- w -0,69 8,59 -26,55 25.17 -247.57 5,1 -28,5800050002 Luxembourg --- w -0,51 11,14 -29,35 23.07 -249.99 6,4 -31,1700050003 Luxembourg --- w -1,58 11,03 -26,75 24.55 -247.57 6,3 -27,31Lu
x.
00050004 Luxembourg --- w -0,39 11,26 -28,53 23.55 -245.84 6,5 -30,03
00040079 --- --- w - - -28,55 26.75 -230.04 6,0 -30,3400040080 --- --- w - - -27,74 27.19 -222.56 7,5 -28,6000040091 --- --- r - - -25,29 29.51 -221.11 7,4 -26,1700040092 --- --- r - - -24,24 28.07 -221.99 8,5 -25,2000040097 --- --- r - - -26,30 28.18 -216.19 9,2 -27,6600040098 --- --- r 5,20 10,99 -25,59 29.52 -222.13 9,7 -26,3900040118 --- --- w 0,85 7,65 -29,06 26.14 -228.15 4,1 -31,7900040119 --- --- w - - -29,11 26.13 -241.41 4,9 -31,4000040127 --- --- r - - -27,65 27.85 -230.31 5,9 -28,3600040128 --- --- r - - -28,34 27.28 -231.02 5,6 -30,4400040143 --- --- r - - -23,15 28.29 -218.76 7,5 -26,2500040144 --- --- w - - -27,21 27.82 -225.84 10,2 -27,8700040151 --- --- w - - -25,25 31.73 -213.21 7,4 -27,04
Port
ugal
00040152 --- --- w - - -28,58 28.26 -233.03 8,0 -30,47
Annexe D
249
Water Ethanol Glycerol
Lab. code Region/District Wine variety Type
δ18O TQ δ13C δ18O δ2H conc. δ13C
[‰] vs SMOW % w/w [‰] vs
PDB [‰] vs SMOW
[‰] vs SMOW g/L [‰] vs PDB
00050023 Calzada Calatrava --- w 7,04 11.54 -25,79 30.87 -222.56 7,6 -29,62 00050027 Calzadilla Los Barro --- w 7,00 10.42 -26,56 31.01 -221.05 7,6 -30,57 00050029 Sax --- r 7,61 10.81 -26,33 30.11 -216.53 8,0 -28,86 00050030 Mahora --- r 7,64 11.70 -25,94 30.61 -215.84 10,7 -27,96 00050032 Almonte --- w 9,55 12.19 -25,04 33.04 -209.18 8,5 -28,31 00050033 Mollina --- w 8,76 12.86 -26,14 31.74 -218.78 9,4 -29,34 00070009 Requena --- r 4,39 9.19 -25,08 31.44 -219.80 9,4 -27,30
00080009 Gumiel Del Mercado --- r 3,47 15.12 -24,22 27.34 -229.01 11,5 -26,42
00080010 Camarena --- r 5,65 13.42 -26,21 28.12 -218.82 9,1 -29,45
Spai
n
00080012 Alesanco --- w 2,94 12.57 -24,87 27.42 -223.93 7,6 -27,61
00030104 --- --- w - 4,57 -28,47 20.18 -255.70 2,5 -32,98 00030105 --- --- w - 8,29 -29,21 17.95 -248.75 3,6 -32,54 00030106 --- --- w - 7,74 -28,68 19.74 -238.21 2,7 -31,98 U
.K.
00030107 --- --- w - 7,98 -29,88 19.95 -241.24 4,4 -32,97
