République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de L’enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Mentouri-Constantine

Faculté des sciences de la nature et de la vie

Département de Biochimie- Microbiologie

N° d’ordre :…………

N° de série :…………

MEMOIRE

Pour l’obtention du diplôme de MAGISTER

Microbiologie Appliquée

Option : Biotechnologies microbiennes

Présenté par :

Melle LAHLAH Fatima Zohra

Thème

Devant le jury : Soutenu le :Président Mr BOUSSEBOUA Hacene Professeur, Univ.Mentouri Constantine

Rapporteur Mme MECHAKRA Aicha Maître de Conférences, Univ.Mentouri

Constantine

Examinatrices Mme MERAIHI Zahia Professeur, Univ.Mentouri Constantine

Mme DJEGHRI Baida Maître de Conférences, Univ. Badji

Mokhtar, Annaba

Année Universitaire 2007/2008

EXTRACTION DES FLAVONOIDES PAR LE BUTANOL ET LE

CHLOROFORME A PARTIR DE SILYBUM marianum ET ETUDE DE LEUR

ACTIVITE ANTIMICROBIENNE

Remerciements Avant tout, je remercie DIEU, sans lui ce manuscrit n’aurait pu exister.

Je tiens à remercier Mme Mechakra Aicha, Maître de conférences à la faculté des

Sciences de la Nature et de la Vie, Université MENTOURI Constantine, qui a bien

voulu m'encadrer, je la remercie pour toute l'aide scientifique et technique qu'elle m'a

apportée au cours de la réalisation de ce travail.

Je remercie également Mr Bousseboua Hacene, professeur à la faculté des

Sciences de la Nature et de la Vie à l'Université Mentouri- Constantine pour m'avoir fait

l'honneur de présider le jury. Qu'il trouve ici l'expression de mon profond respect.

Je remercie de tout cœur Mesdames Meraihi Zahia, professeur à l’Université

Mentouri de Constantine et Djeghri Baida, Maître de conférence à l’Université Badji

Mokhtar Annaba qui ont bien voulu examiner ce travail.

Je remercie Mme Kaabouche Z, professeur à la faculté des Sciences exacte à

l'Université Mentourie de Constantine pour l’aide matérielle qu’elle m’a apportée.

Mes plus vifs remerciements à toutes mes amies de la promotion pour leur soutien

moral tout au long de ces années mémorables.

Je remercie également, toute personne ayant contribué de prés ou de loin à la

réalisation de ce travail.

Dédicace

Je dédie ce modeste travail à

La mémoire de mon père

A ma chère mère

A mes frères

Toutes mes soeurs

A mes oncles et mes tantes

Ainsi qu'a mes cousins et mes cousines

A mes amies et à toute ma famille.

Liste des abréviations

A.T.C C American type culture collection.

M S Matière sèche.

M.O Microorganisme

Nb Nombre

C M I Concentration minimale Inhibitrice.

CMB Concentration minimale bactéricide.

C I Chromatographie Ionique.

C C M Chromatographie sur couche mince.

d Densité.

H P L C Chromatographie Liquide a haute performance.

R F Rapport frontal.

R.M.N Résonance magnétique nucléaire.

S M Spectrométrie de masse.

Sp Espèce.

U V Ultra violet.

U F C Unité formant une colonie.

V/V Volume par volume.

- YPG Yeast Peptone Gelose

Introduction

Chapitre I : La plante : Silybum marianum

1. Historique …………………………………………………………………….......32.Description………………………………………………………………………...5

3. Systématique de la plante

3.1.Systématique……………………………………………………………..5

3.2. Caractères des feuilles et des graines………………………...…………6

3.3.Noms vernaculaires……..…………………………………….……….....6

4. Cycle vital du chardon marie………………………………………….……….....7

5. Constituants chimiques des graines...……………………………..........................7

6. Usages de la plante……………...…………….......................................................9

Chapitre II : Les agents antimicrobiens

Introduction ………………………………………………….…………………….10

1. Mode d’action des agents antimicrobiens

1.1. Action germicide………………………………………………………….10

1.2. Action germistatique (bactériostatique et fongistatique)...………...……..10

2. Facteurs influençant l’activité des antimicrobiens

2.1. Nature et état du microorganisme..…………………………………...…..11

2.2. nature de l'agent antimicrobien ………………………………………….12

2.2. Rôle de l’environnement………..……………...………………………....12

3. Détermination de l’activité antimicrobienne

3.1. Notion de germe test……………………………………………………….12

3.2. Détermination des doses actives d’un antimicrobien………………………12

3.3. Méthode des porte-germes……………………………...………………….12

3.4. Détermination des doses minimales inhibitrices et bactéricides.…………..13

4. Types d’agents antimicrobiens

4.1. Agents physiques……………..……………………………………………13

4.2. Agents chimiques………………..…………………………………………14

4.3. Agents chimiothérapeutiques…....…………………………………………15

4.4. Les substances naturelles…………………………………………………..15

Chapitre III : Les flavonoïdes

Introduction…..……………………………………………………………………....16

1. Biosynthèse des flavonoïdes……….…………………………………………..…..18

2. Propriétés botaniques………………………………………………………………18

3. Distribution et exemples de flavonoïdes…...………………………………………19

4. Propriétés thérapeutiques des flavonoïdes

4.1. Action anti-oxydante..….……………………………………………….20

4.2. Protection vasculaire..……………………………………………...........21

4.3. Flavonoides et ménopause…...……………………………………..........21

4.4. Effet contre le cancer………...……………………………………..........21

4.5. Action anti-inflammatoire….……………………………………………22

4.6.Action antidiabétique……….…………………………………………….22

4.7. Action anti-infectieuse….………………………………………………..22

4.8. Effet sur la peau………….……………………………………………….23

5. Autres utilisations des flavonoïdes

5.1. Edulcorant...………………………………………………………………23

5.2. Engrais…..……………………………………………………….………23

ChapitreIV :Méthodes d’étude des flavonoïdes

1. Méthode de séparation et de purification

1.1. Extraction par solvant…………………………………….........................24

1.2. Chromatographie sur couche mince (CCM)………..…………………….26

1.3. Chromatographie d’adsorption……………...……………………………26

2. Méthode d’analyses structurales…………………………………………………….26

2.1. Facteur de retardement...…………………………………………………27

2.2. La fluorescence…………..…………………………………....................27

2.3. L a spéctrométrie UV- visible…….……………………………………...28

2.4. La spéctrométrie de masse (SM)………………...……………………....28

2.5. La spectrométrie de résonance

magnétique nucléaire (R.M.N)…………………………….. …………...28

Chapitre V : Materiel et méthodes

1. Récolte de la plante…………………………………………………………………29

2. Extraction des flavonoïdes…..……………………………………………………..30

2.1. Macération……………………………………………………………….30

2.1. Evaporation……...……………………………………………………….30

2.3. Extraction par solvants……….………………………………………….30

2.3.1. Affrontement à l’ether de pétrole………………………………..30

2.3.2. Affrontement au chloroforme……………………………………31

3. La séparation par chromatographie sur couche mince (CCM)……………………..31

4. Etude microbiologique

4.1. Microorganismes tests…………………………………………………..32

4.2. Mise en évidence de l’activité antibactérienne

par la méthode des disques……………………………………………...32

4.3. Mise en évidence de l’activité antifongique………………………....….33

5. Détermination des concentrations minimales inhibitrices et bactéricides (CMI,

CMB)

5.1. En milieu solide………..…………………………………………….…34

5.2. En milieu liquide…..……………………………………………..……..35

6. Thermostabilité des molécules bioactives (flavonoïdes)….…..……………………35

Chapitre VI : Résultats et discussion

1. Caractéristiques des échantillons (graines de Silybum marianum)

1.1. Nombre des graines……..………………………………….…………..37

1.2. Couleur des graines …..………………………………………………..37

2. Rendement massiques des extractions………………………………………………38

3. Chromatographie des flavonoïdes par CCM………………………………………..43

4. Détermination de l'activité antimicrobienne des différents extraits

4.1. Activité antibactérienne……………………………………………..…45

4.2. Activité antifongique………………………………………….……….46

5. Détermination des CMI et des CMB

5.1. Méthode de dilution en milieu solide…….……………………………48

5.2. Méthode de dilution en milieu liquide…..………………..……………50

6. Etude de la thermostabilité des flavonoïdes de Siybum

marianum…………….……54

Conclusion et perspectives………………..……………………………………...…….56

Résumé……………………………...……………………………………………….…59

Annexe...………………………...………………………………………………….….66

Références bibliographiques……..……....…………………………………….………75

INTRODUCTION

Silybum marianum, appelé couramment chardon Marie est une plante annuelle ou

bisannuelle appartenant à la famille des Asteraceae, endémique de la région

méditerranéenne ; notamment en Algérie.

S. marianum est considéré comme une plante médicinale antique employée pour

épurer et protéger le foie, pour traiter les troubles menstruels et les congestions du foie, de

la vésicule biliaire et les reins, ainsi que pour stimuler la lactation et la protection des cellules

hépatiques lors de la chimiothérapie anticancéreuse (Venkataraman et al., 2000 ; Anderson

et al., 2002). Ce sont les Allemands qui, pour la première fois en 1968, ont isolé de la

plante un groupe de flavonoïdes ayant un puissant pouvoir hépatoprotécteur ; la Silymarine.

Cette plante est également utilisée en Portugal pour la préparation des fromages

traditionnels grâce à sa richesse en enzymes protéolytiques.

Par ailleurs, face à la l’augmentation du prix des agents antimicrobiens, plusieurs

substituts sont recherchés dans les plantes et les herbes, notamment les substances

phénoliques : tannins, alcaloïdes et flavonoïdes, (Alberto et al., 2001 ; Alberto et al., 2004).

En effet, comme tous les polyphénols, les flavonoïdes sont reconnus pour leurs propriétés

antioxydantes, anti-inflammatoires et anti-radicalaires, mais également antimicrobiennes.

Les activités biologiques multiples des flavonoïdes sur la santé humaine, a poussé les

chercheurs à étudier les activités antimicrobiennes de ces substances extraites de nombreuses

plantes; le chardon Marie est l'une de ces plantes.

L’objectif de cette étude vise à montrer la richesse de S. marianum en flavonoïdes et

à tester leurs propriétés antimicrobiennes. Pour cela, le travail réalisé comporte plusieurs

étapes:

- Une extraction des flavonoïdes qui consiste à solubiliser les substances actives par

macération des graines broyées dans une solution hydro alcoolique.

- Une séparation par fractionnement liquide-liquide comprenant des affrontements

par différents solvants organiques de polarités différentes, suivie d'une purification par

chromatographie sur couche mince (CCM).

- Une mise en évidence de l'activité antimicrobienne des flavonoïdes réalisée par la

méthode de diffusion sur gélose, détermination des concentrations minimales inhibitrices et

bactéricides (CMI, CMB).

- Une étude de la stabilité des flavonoïdes à différentes températures.

SILYBUM MARIANUM

1. HistoriqueSilybum marianum ou le chardon marie est une plante annuelle ou bisannuelle

robuste, de grande taille, apparentement à la famille des Astéracées ou composées, c’est le

seul représentant connu du genre Silybum (Vincent, 2000 ), certains auteurs mentionnent

cependant une seconde espèce, Silybum eberneum (Julve, 1998).

Le Silybum était déjà cité par Plime et Discoride dans son materia medica comme

une plante médicinale du genre chardon (Vogel encyclopédie, 2007 ), le nom dérive du

grec Silybon ou Silybos qui veut dire houppe (Vincent, 2000 ; Vogel encyclopédie, 2007).

L’adjectif marianum vient du latin et est lié à la vierge Marie : une légende du moyen age

veut que celle–ci, voulant dissimiler son enfant Jésus aux soldats d’Hérode, l’a caché sous

un grand chardon, comme elle était entrain de l’allaiter quelques gouttes de son lait

tombèrent sur les feuilles de la plante, qui se trouva ainsi maculée héréditairement (Vincent,

2000).

2. Description de la plante

Le chardon marie est facilement reconnaissable par ses grandes feuilles vertes,

brillantes marbrées de blanc (Vogel encyclopédie, 2007) aux lobes découpés, aux bords

dentés pourvus d’épines jaunes, à bord moins découpé, mais très épineux. Elles présentent

toutes de nombreuses nervures blanches, donnant l’impression que la feuille est maculée de

lait (Caremes, 1990) (voir fig. 1a).

Les tiges généralement ramifiées, atteignant environ 20 à 150 cm de haut, à leur

extrémité portent des touffes bien fournies de fleurs tubulaires, ses capitules ont des bractées

épineuses fortement recourbées en arrières ; Luper, 1998 ; Pepping,, 1999 ; Vogel

encyclopédie, 2007) (voir fig.1d).

a- Les feuilles b- La fleur

c- Les graines

d- Les tiges

Figure 1. Photographies représentant les différentes parties de la plante :

Silybum marianum (Vogel encyclopédie, 2007).

cm et se réfléchissant vers l’arrière. La corolle est dentée de couleur pourprée, cinq étamines

formant un tube autour du style (Guignard, 1998 ; Bezanger, 1990 ; Michael, 2003) (voir

fig. 1b).

Les fruits sont des Akènes luisantes, ovoïdes et obliques, de 6-7mm, de couleur

beige ou brune ; ils sont entourés d’une coquille (Guittonneaire et Huon, 1983) et portent

des aigrettes légèrement pendantes avec des poils soyeux et blancs (Vogel encyclopédie,

2007 ; Sindel, 1991). L’aigrette est denticulée en anneaux dur à leur base, chacun d’eux est

inséré sur une sorte de disque d’apparence cornée et portant au centre une sorte de cylindre,

court de 3 à 5 mamelons ( Bezanger, 2003) (voir fig. 1c).

3. Systématique et caractères généraux de la plante

3.1. Systématique

Selon Anonyme, 1984 ; Guignard, 1998 et Spichiger et al., 2000, la systématique du

chardon-Marie est comme suit :

Embranchement : Phanérogames.

Sous–embranchement : Angiospermes.

Classe : Magniolipsida.

Ordre : Asternales.

Famille : Asteraceae.

Sous- famille : Tubuliflores.

Genre : Silybum.

Espèce : Silybum marianum (ln).

3.2. Caractères des feuilles et des graines

Les feuilles possèdent les caractères suivants.

Type d’inflorescence : racème de capitules.

Répartition des sexes : Hermaphrodites.

Type de pollinisation : Entomogame.

Période de floraison : mai à juin.

Le type de fruits correspond à des akènes (graines) et leur mode de dissémination est

anémochore (Julve, 1998) ; elles permettent au chardon Marie de se reproduire. Les

bourgeons non ouverts et entièrement formés de fleur produiront des graines attachées à la

plante (Groves et Kaye, 1989).

3.3. Noms vernaculaires

Les noms vernaculaires français sont : chardon marie, artichaut sauvage, chardon

argenté, chardon de notre Dame (Passeport santé.net, 2007), Silybum marial (Brouillet,

2002; AAC, 2004), Lait de notre dame, Silybe de marie, chardon marbré, épine blanche

(Wiersema et léon, 1999 ; USDA, 2007).

Les noms étrangers sont : en allemand Mriandistel, en anglais Blessed milk thistle,

en castillon cardo lechoso, en italien cardo mariano (cardo di santa maria) et en chinois

Shui Fei Ji (Michael, 2003 ; Julve, 1998).

Ses noms vernaculaires targui ou berbère sont : Tawra, Douj-n’ilour man (Gharb et

Bertrand, 1991 ; Belkhada, 1997). Sa nomenclature en Arabe est: Chouk el Djemel,

Bou-Zerwal ou Sùk Ez-zerwal, Bùzerwal, Hacoub et Lichilik (Neger, 1961 ; Belkheda,

1997 ; Beloued, 1998).

4. Cycle vital du chardon marie

Le chardon marie est décrit comme une plante annuelle ou bisannuelle (Burnie,

1997 ; Vial, 1998). Il peut accomplir un cycle de vie annuel s’il peut germer assez tôt dans la

saison de croissance. Les jeunes plantes en retard d’hiver et de printemps se comporteront

en tant que plantes bisannuelles (Dodd, 1989).

Quelques températures froides sont exigées pour la production de fleurs. La plante

a un potentiel de production de 33 capitules en moyenne, chaque tête de fleur produit

environ 190 graines, avec une moyenne de 6350 graines par plante dont 94 % sont viables

(Sindel, 1991). Les graines peuvent entrer en état de dormance, cependant n’importe quelle

longueur de dormance est affectée par la température et l’humidité (Dodd, 1989) ; elles

restent viables pendant neuf années, ou plus (Sindel, 1991).

La croissance et l’allélopathie végétatives fortes pendant la germination pourraient

expliquer la forte densité du chardon marie (Gaby et al., 1994).

Lorsque la plante meurt, elle peut rester sèche sur place pendant une longue période

et maintient le secteur nu de l’autre végétation, permettant la croissance de la prochaine

génération de chardon marie. Ces caractéristiques biologiques favorisent la croissance de

chardon marie et sa dominance dans un champ (Sindel, 1991).

5. Constituants chimiques des graines

Les graines du chardon contiennent plusieurs composées chimiques ; des huiles

essentielles, des protéines (albumine) qui représentent 25 à 30 %, des matières grasses

avec prédominance d’acide linoléique et d’acide oléique en plus de l’acide palmitique

(Widmer, 2001) ainsi que des flavonolignanes dont la fraction principale porte le nom de

silymarine. Celle-ci représente 1 à 4 % ; c’est un mélange de trois flavonolignanes issus de

la taxifoline (une flavonone) et de l’acide coniferilique, la Silybine, la Silychristine et la

Silydianine. Il existe également d’autres flavonoides en faibles quantités tels que la

quercetine, la taxifoline, le kaepmoferol, l’apigenine, la naringine, ériodyctiol, chrysoériol

etc. Le fruit renferme également d’autres constituants tels les tocophérols, les stérols

(cholestérol, campéstérol, Stigmastérol, sitostérol) et le mucilage (Bruneton,1999

6. Usages de la plante

Les Grecs de l’antiquité connaissaient déjà les propriétés du chardon marie pour

traiter les troubles hépatiques et biliaires. Celui-ci était recommandé dans le plus important

traité de pharmacie du moyen age, le « Kreutterbuck » de Mathiolus de 1626, contre les

points de coté et la jaunisse et de Lowitzer (Lonicereus) de 1679, contre l’inflammation du

foie (Vogel encyclopédie, 2007). Au XIXe siècle, les médecins de l’école éclectique

américaine l’ont employé pour traiter les varices, les troubles menstruels et les congestions

du foie, de la vésicule biliaire et des reins (Flora, 1998 ; Susan et al ,2000).

De nos jours, le chardon marie se retrouve en Europe dans plusieurs préparations

pharmaceutiques destinées au traitement de divers troubles hépatiques pour soulager les

troubles de digestion associés au foie (Bradley, 2006 ; Blumenthal, 2003 ; Bradley, 2006 ;

UK, 2006 ; Morazzoni et Bombardelli, 1995). Le Chardon marie est également appliqué en

cas d’hépatites et hépatopathies latentes et de cirrhoses. Les meilleurs effets sont observés

lors d’administrations prophylactiques où il protège la cellule hépatique lors des

chimiothérapies anticancéreuses. Il agit également contre la dépression nerveuse et permet la

stimulation de la lactation (Compos, 1989 ; Schandalik et al., 1994 ; Venkataraman et al.,

2000).

Le chardon marie figure au nombre des compléments nutritionnels dont l’usage est

répandu en Amérique du Nord où plusieurs personnes vivant avec la VIH (PVVIH)

complètent leur traitement pharmaceutique à l’aide de plantes médicinales (Anderson et

Fletcher, 2001 ; Anderson et al., 2002).

Les ingrédients médicinaux actifs de Silybum marianum; les flavonoides, sont

concentrés dans les graines (Combest, 1998). La Silymarine a un rôle dans la protection du

foie contre les effets des toxines naturelles des champignons (Pietrangelo et al., 1995 ;

Foster, 1995 ; Ody, 2000), des morsures de serpents, de piqûres d’insectes, etc. (Anderson

et al., 2001 ; Anonyme, 2001) et des produits de synthèse (solvants, produits de nettoyage,

médicaments, etc.) (Pizzorno et al, 1999 ; Ernest, 2001). Une étude de Polyak et al en

(2007) montre l’effet anti-inflammatoire de la silymarine standardisée extraite du

chardon-Marie en particulier par inhibition des cytokines des cellules-T et probablement une

activité antivirale. Une revue bibliographique de Pradhan et Girish (2006) discute de la

sécurité, l’efficacité et les utilisations futures de la silymarine dans les maladies du foie.

Celle-ci pourrait remplacer des formules composées de plusieurs plantes, ce qui réduirait les

problèmes de standardisation et de contrôle de qualité.

Les agents antimicrobiens

Introduction

On désigne par agent antimicrobien tout agent chimique, physique ou biologique

inhibant la croissance et/ou la survie des micro-organismes (Asada et al., 1998). Ces

substances ayant une affinité pour les cellules des parasites et le pouvoir de les tuer plus

forts que les dommages qu'elles causent à l'organisme; ce qui rendra possible la destruction

des parasites sans perturbation sérieuse de l'organisme (Perry et al., 2002).

1. Mode d'action des agents antimicrobiens

Les agents antimicrobiens agissent par différents mécanismes et peuvent être utilisés

de diverses manières, selon les objectifs recherchés et leur spécificité d'action qui peut être

germicide ou germistatique.

1.1. Action germicide

Cette action caractérise les agents ayant une action létale sur les microorganismes.

En fonction de la catégorie de microorganismes ciblés, les agents antimicrobiens exercent

une action bactéricide (agent antibactérien), algicide (agent anti-algues), fongicide (agent

anti-champignons), virucide (agent anti-virus) ou antiparasitaire (agent anti- protozoaires)

(Bousseboua, 2006).

1.2. Action germistatique (bactériostatique et fongistatique)

Dans ce cas, les agents inhibent la croissance du microorganisme sans le tuer

(bactérie ou champignon) (Bousseboua, 2006). Les substances bactériostatiques inhibent

temporairement le développement microbien, les microorganismes recommenceront à se

développer dès que la concentration de la substance aura diminué ou dès que l'application du

procédé physique sera interrompue (Guiraud 1998)

2. Facteurs influençant l'activité des antimicrobiens

Plusieurs facteurs peuvent affecter l’activité d'un agent antimicrobien, modulant ainsi

leur efficacité et même plus leur structure, parmi ces facteurs on peut citer la nature et l’état

du microorganisme, la nature de l'agent antimicrobien et le rôle de l’environnement.

2.1. Nature et état du microorganisme

Les différences existants entre les espèces microbiennes entraînent une sensibilité

variable à l'égard des agents antimicrobiens caractérisé chacun par son spectre d'activité plus

ou moins large, et également par leur nature.

L'état physiologique de la cellule microbienne joue également un rôle crucial car les

microorganismes sont plus sensibles en phase exponentielle qu'en phases stationnaire à

l'égard des antimicrobiens chimiques, ce phénomène pouvant être inversés pour les agents

physiques, alors que les formes sporulées sont beaucoup plus résistantes aux agents

physiques ou chimiques que les formes végétatives correspondantes, en raison de

l’apparition d’un composé nouveau, absent dans les cellules végétatives : l’Acide

dipicolinique qui représente environ 10% du poids sec de l’endospore (Bousseboua, 2001).

Il existe une corrélation directe entre l'age de la culture et le taux de destruction

des cellules microbiennes, en fait plus la charge initiale en microorganismes est élevée, plus

le temps nécessaire pour obtenir un niveau de destruction donnée sera grand (Guiraud,

1998).

2.2. Nature de l'agent antimicrobien

Les agents antimicrobiens diffèrent par leur efficacité et leur spectre d’activité. Dans

le cas des agents physiques, l'activité microbicide augmente souvent avec la dose, alors que

pour les agents chimiques, les effets seront d'abord bactériostatiques puis bactéricides.

Cependant, l'activité de certains d'entre eux dépend de leur stabilité, pour d'autres elle est

liée à leur décomposition ; c'est le cas par exemple de l'hypochlorite de sodium et peroxyde

de l'hydrogène (Guiraud, 1998).

2.3. Rôle de l’environnement

La population à détruire ou à inhiber n'est pas isolé mais elle est soumise a des

facteur de l'environnement qui peuvent offrir une protection ou favorisé la destruction par

exemple la chaleur tue plus facilement à pH acide. La nourriture et les boissons acide tel que

les fruits et les tomates, sont plus facilement pasteurisé que les denrées alimentaires plus

neutres comme le lait el les solutions huileuses (Prescott et al., 2003).

3. Détermination de l'activité antimicrobienne L’activité antimicrobienne est déterminée par plusieurs tests : « le germe-test » ;

mesure des doses actives ; porte-germes ; doses minimales inhibitrices et bactéricides (CMI

et CMB).

3.1. Notion de germe test

On utilise des microorganismes pathogènes "modèles" comme témoins d'efficacité

d'un traitement: Mycobacterium tuberculosis, Clostridium botilium, parfois Salmonella,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli et parfois même des virus (virus de la poliomyélite)

pour le traitement de l'eau, Salmonella typhi pour les désinfectants, Staphylococcus aureus

pour les antiseptiques lors de la mesure du coefficient phénol, Clostridium sporogenes et

Bacillus stearothermophilus pour la chaleur (Guiraud 1998).

3.2 Détermination des doses actives d'un agent antimicrobien

Il s'agit de comparer l’action d'un antiseptique avec celle du phénol en présence d'un

germe test selon un protocole bien précis. Le coefficient phénol est égal au rapport entre la

dilution du désinfectant et celle du phénol (Perry, 2002).

3.3. Méthode des porte-germes

Le porte-germes est constitué d'une bandelette de papier filtre. Il est immergé dans

une culture d'un germe test, séché puis mis en contact avec le désinfectant pendant des

durées croissantes. La survie ou la destruction du germe est mise en évidence par immersion

du préalablement séché dans un bouillon nutritif et par essai de culture (Guiraud, 1998).

3.4. Détermination des doses minimales inhibitrices et bactéricides

La construction des courbes de croissance in vitro en présence de concentration

croissante en agents antimicrobiens permet de définir des concentrations limites :

c’est-à-dire la concentration pour laquelle on n'observe pas de croissance visible.

La concentration inhibitrice 50 % ou CMI correspond à une croissance égale à la

moitié de la croissance du témoin et la concentration minimale bactéricide (la CMB)

correspond à la concentration permettant de tuer tous les micro-organismes. Celle-ci est

appréciée par étalement après culture. Ces méthodes sont adaptables aussi bien aux

antibiotiques qu’à d'autres substances bactéricides (Perry, 2002).

4. Types d’agents antimicrobiens

Il existe trois types d’agents antimicrobiens : physiques, chimiques et

chimiothérapeutiques.

4.1. Agents physiques

De nombreux agents physiques exercent un effet antagoniste vis-à-vis des

microorganismes. La chaleur ou certains types de radiations ont une action létale qui permet

leur emploi dans la stérilisation de différents milieux. D’autres agents moins agressifs,

comme la dessiccation limitée sont utilisés à d’autres fins.

Les principaux agents physiques sont la chaleur (humide ou sèche), les radiations

(micro-ondes, rayons ultra-violets, rayons gamma, rayons béta, rayons alpha ; rayons X).

Chaque type de radiation a une longueur d’onde spécifique qui détermine son énergie, son

mécanisme d’action et son domaine d’application (Bousseboua 2001).

4.2. Agents chimiques

Ils correspondent aux substances utilisées comme désinfectants et antiseptiques. Les

désinfectants sont des agents antimicrobiens utilisés sur les matériaux inertes ; leur action

est létale ou inhibitrice de la croissance microbienne. Les antiseptiques ont la même nature

chimique que les désinfectants mais leur toxicité plus réduite permet leur emploi sur les

tissus vivants. Les désinfectants et antiseptiques les plus largement employés sont les

alcools, les composés phénoliques qui agissent par dénaturation des protéines et altération

des membranes cellulaire, les aldéhydes, les halogènes et les détergents (Bousseboua 2001).

Les alcools sont les désinfectants et antiseptiques les plus largement employés,

notamment comme désinfectants de la peau. Les composés phénoliques ont une utilisation

avantageuse en raison de leur efficacité, de leur persistance dans le temps et de leur

insensibilité relative à la présence de matière organique dans le milieu. L'aldéhyde de plus

commun est le formaldéhyde, souvent commercialisé en solution à 40% (formol). Les

halogènes sont des composés dérivés du chlore, du brome et de l'iode: hypochlorites et

chloramines, hypobromites, iodures, qui ont une action bactéricide par l'oxydation

dénaturante des protéines et d'autres composés cellulaires. Les détergents enfin, ont la

propriété de solubiliser les résidus normalement peu solubles. Seuls les détergents

cationiques sont des désinfectants efficaces (Guiraud, 1998).

4.3. Agents chimiothérapeutiques.

Un agent chimiothérapeutique est un composé chimique ou de synthèse qui inhibe le

développement des microorganismes. Ce composé agit à faibles doses, il exerce une action

très spécifique sur le fonctionnement cellulaire tout en ayant une toxicité sélective. Il inhibe

le développement de sa cible ou la tue tout en étant inoffensif pour l'hôte. Dans ce groupe,

on retrouve les antibiotiques, les antifongiques et les antiviraux (Guillaume, 2000).

Il existe actuellement deux grandes catégories d'agents chimiothérapeutiques

antibactériens : les sulfamides et les antibiotiques ; ils ont des modes d'action comparables et

se distinguent principalement par leur origine. Les sulfamides sont des produits de synthèse

alors que la majorité des antibiotiques sont d'origine naturelle (les plus anciens) d'autres de

synthèse ou d'hémisynthèse. Les agents chimiothérapeutiques comprennent cinq groupes

selon qu'ils affectent la synthèse de la paroi, les échanges cellulaires, la réplication et la

transcription de l'ADN, la synthèse des protéines ou certaines réactions du métabolisme

intermédiaire (Prescott et al., 1995).

Flavonoïdes

Introduction

Le terme flavonoïde provient du latin flavus signifiant jaune. La présence de

flavonoïdes a été révélée dans le zeste du citron par les travaux du Hongrois Szent -Gyogyi

en 1936 et 1937 sur le scorbut. Avant lui, la première substance flavonoïde obtenue à

l’état pur : le morin, a été isolée par Chevreul en 1814. Le terme "flavonoïde" provient du

nom flavedo correspondant à la couche externe des écorces d’orange. Ce terme désigne une

très large gamme de composés naturels appatenant à la famille des polyphénols (Gérard,

2004) qui sont considérés comme des pigments quasi universels des végétaux, presque

toujours hydrosolubles (Riberau–Gayon, 1968).

Les flavonoïdes sont répandus dans toutes les parties de la plante : racines, feuilles,

fleurs, pollens, fruits, graines et bois. Certains sont plus spécifiques de certains tissus ; les

anthocyanes sont plutôt localisées dans la partie externe des fruits, des fleurs et les cellules

épidermiques; les chalcones se trouvent plus fréquemment dans les pétales assurant ainsi la

protection des tissus contre les effets nocifs des rayonnement ultraviolet des fleurs. Les

flavonoïdes sont des pigments naturels au même titre que les chlorophylles (couleur verte)

et les caroténoïdes (nuances jaunes et orangées).

1. Biosynthèse des flavonoïdes

Les flavonoïdes sont dérivés des phényles propanoides caractérisés par l’adjonction

au noyau coumaryl en C6- C3 activé par le coenzyme A (Comaryl – CoA), 3 acétyles

(fournis par le malonyl – CoA) ; réaction suivie d’une cyclisation qui aboutit à une chalcone,

la tetrahydroxy-chalcone ; l’enzyme est la chalcone synthase (CHS), les légumineuses

possèdent en outre une chalcone réductase (CHR) qui co-agissent avec la CHS, peut

aboutir à la trihydroxy chalcone (fig) (Heller et al., 1998).

Figure 2.

Différentes

réactions

conduisant

aux

principales

familles de

flavonoïdes

(www.

Détour

Santé.com/

flavo-perso

.htm)

La

c h a l c o n e

e s t

l’intermédi

a i r e

caractéristi

que de la

biosynthèse

des divers flavonoïdes, elle est en équilibre avec les flavonoïdes, cet équilibre étant contrôlé

par une enzyme, la chalcone isomérase, conduisant à une cyclisation stéréospécifique du

cycle donnant naissance aux flavanones (Bruneton, 1933). Les chalcones gardent la

structure de tri ou tétra-stérols. Les flavonones dérivent des précédentes par une

cyclisation du noyau central, conduisant à un hétérocycle, suite à une isomérisation par la

chalcone isomérase (CHI) (Heller et al., 1998).

Les flavones, particulièrement abondantes chez les légumineuses (fabales) dérivent

des flavanones par une oxydation qui introduit une seconde double liaison dans

l’hétérocycle. Les flavonols se différencient des flavones par la présence d’un OH en C3.

Les isoflavones dérivent aussi des flavanones, mais après une oxydation centrale, il y a

transposition du cycle latéral du C2 au C4 de l’hétérocycle (Heller et al., 1998).

Les anthocyanes dérivent également des flavanones suite à une réduction par la

flavone -3 hydroxylase (F3H ) en dihydrokaempférol (un dihydroxyflavonol) ; une deuxième

réduction est opérée par une dihydroflavonol réductase (DFR) (Heller et al.,1998)

2- Propriétés botaniques

Sur le plan cellulaire, les flavonoïdes sont synthétisés dans les chloroplastes, puis ils

migrent et se dissolvent dans les vacuoles. Ils interviennent comme constituants des

chromoplastes (Bruneton, 1933). La plante fabrique des flavonoïdes pour se protéger de

l’oxydation et c’est le rayonnement solaire qui stimule cette réaction. Plus l’ensoleillement

augmente, plus les teneurs en flavonoïdes augmentent, surtout dans les parties les plus

exposées. Ils servent également à attirer l’attention des insectes pollinisateurs, ou au

contraire à dessiner des formes pour éloigner les prédateurs, certains flavonoïdes sont

mêmes toxiques pour les insectes (www. Détour Santé.com/flavo-perso.htm)

3 – Distribution et exemples de flavonoïdes

Les flavonoïdes sont généralement présents chez les végétaux supérieurs, le plus

souvent sous la forme d’hétérosides (liés à différents sucres). Ils ont pu être isolés des

fougères (la cytominétine) (Mazza, 2000), mais ils sont totalement absents des

microorganismes comme les champignons et lichens (Ribireau-Gayon., 1968). Certaines

classes de flavonoïdes sont présentes exclusivement dans certains végétaux; on retrouvera

par exemple, les isoflavones dans le soja, les flavanones dans les agrumes, les anthocyanes

dans les fruits rouges, les flavonols dans les choux, les brocolis et les oignons. Ces derniers,

ont la particularité de se polymériser en composées qu’on appelle des tannins et qui sont

présent dans le vin et le thé.

Les flavonoïdes sont largement représentés dans la classe des aurantiacées (les

agrumes), mais également dans les rutacées (tomate, sarrasin), les oléacées (cyprès, frêne),

les conifères (épicéa, sapin), les ginkgoacées (ginkgobiloba), les théacées (théiers et

camélias) et les vitacées (raisin), ainsi que dans les fines herbes. C’est par contre à des

concentrations variables, que les substances utilisées comme principes actifs sont présent

dans ces familles de végétaux (Fleuriet et al., 2005).

Les aliments les plus riches en flavonoïdes sont : le raisin, le thé, le cacao, l’oignon et

les pommes. Les principaux flavonoïdes retrouvés dans le thé sont : la rubigine, la flavine et

la catéchine, dont les propriétés antioxydantes sont 20 fois supérieures à celles de la vitamine

C. L’artichaut est le seul dépositaire d’un groupe appelé Silymarine. Le soja est riche en

isoflavones (génistéine et diazéine) (Heller, 1998). Quatre flavonols sont majoritairement

présents chez le raisin: le kaempférol, la quercétine, la myricétine et l’isorhamnétine. Les

dérivés de la quercétine sont toujours prédominants, alors que la myricétine semble être

spécifique aux variétés de raisins rouges. On retrouve également de fortes concentrations de

flavonoides dans l’hamamélis (kaempférol, quercétine), le céleri (apioside), et dans le

chocolat (catéchine) (Heller, 1998).

4- Propriétés thérapeutiques des flavonoïdes

Les flavonoïdes possèdent plusieurs propriétés thérapeutiques, certaines établies

depuis longtemps (2000 ans), par leurs propriétés nutritionnelles et thérapeutiques multiples,

dans cette partie on va citer certaines actions de flavonoïdes.

4.1. Action antioxydante

Les antioxydants sont largement utilisés dans la prévention primaire et secondaire, les

plus connus sont le β-carotène, l'acide ascorbique, le tocophérol, les tanins, les anthocyanes,

les acides phénoliques, le lycopène et les polyphénols (Bjelakoyic et al., 2007). Ils ont la

capacité de piéger les radicaux libres générés par notre organisme en réponse aux

agressions de l'environnement (cigarette, polluants, infectieux, etc.) qui favorisent le

vieillissement cellulaire. Les antioxydants renforcent nos défenses naturelles en protégent

les constituants tissulaires. Un exemple de composés antioxydants est résumé dans le

tableau n°1.

incluent les flavonoïdes.

La Silymarine, le composant majeur des flavonoïdes de S. marianum possède de

puissantes propriétés anti radicalaires, empêchant ainsi certains produits toxiques de causer

des lésions au foie (Ody, 2000). Elle est plusieurs fois plus puissante que la Vitamine E

(Hikino et al., 1984 ; Sarre, 1971).

Constituants Thé vert Thé noir

Catéchines 30 - 42 3 - 10

Théaflavines 0 2 - 6

Polyphénols simples 2 3

Flavonols 2 1

Autres polyphénols 6 23

Théanine 3 3

Caféine 3 - 6 3 - 6

Tableau 1 : Antioxydants du thé (M.S) (Bjelakoyic et al., 2007).

4.2. Protection vasculaire

Les flavonoïdes sont « veino-actif » c'est-à-dire ayant la capacité de diminuer la

perméabilité des capillaires sanguins et de renforcer leur résistance ; une étude menée

aux Pays Bas (l’étude Zutphen) à mis en évidence le fait que les personnes chez qui l’on

a donné une dose importante de flavonoides sont moins exposées aux maladies cardiaques

que les autres (Hertog et al., 1995). Grâce à l’effet synergique des flavonoïdes, de

nombreuses plantes sont maintenant classées dans la catégorie des protecteurs

vasculaires (Rice et al., 1996). C'est ainsi que l'on classe les flavonoïdes de raisins dans cette

catégorie (Fleuriet et al., 2005).

4.3. Flavonoïdes et ménopause

Les flavonoïdes ont également des effets protecteurs contre les maladies

hormono-dépendantes. En effet, les isoflavones du soja par exemple, interagissent de

manière spécifique avec les récepteurs des oestrogènes et inhibent les bouffées de

chaleur chez la femme ménopausée, pour cela, ils sont maintenant considérés comme

phyto-œstrogènes. La quercétine de l’oignon et le kaempferol de la chicorée, possèdent de

leur côté des propriétés pseudo-oestrogéniques qui inhibent la perte osseuse chez la rate

ovariectomisée. De nouvelles études restent cependant nécessaires pour valider ces effets sur

l’être humain (Fleuriet et al., 2005).

4.4. Effet contre le cancer

Les flavonoïdes ont pour effet d’inhiber l’activité d’une enzyme, la topoisomérase II,

qui joue un rôle essentiel dans l’apparition du cancer, notamment la maladie de Hodgkin. Ils

ont largement montré leurs effets protecteurs contre plusieurs cancers, dont la prostate, le

colon et le poumon (Rice et al., 1996).

Par ailleurs, la Silymarine, fraction principale des flavonoïdes de Silybum marianum,

a la capacité de bloquer la fibrose, un processus qui contribue au développement de la

cirrhose chez des personnes ayant une inflammation du foie consécutive à une maladie, a un

abus d’alcool ou à une hépatite et favorise l’écoulement de la bile (Ferenci et al.,1989;

Alarcon, 1995). Les flavonoides de raisins permettent la prévention et le traitement des

cancers; ils ont également des activités anti-tumorales et chimiopréventives (www. Détour.

Santé.flavonoides.htm)

4.5. Action anti-inflammatoire

Des recherches récentes ont démontré que les flavonoïdes, notamment les flavonols

du cacao, peuvent prévenir la douleur musculaire en accélérant la réparation des tissus au

niveau moléculaire. De manière spécifique, ils éliminent la synthèse de l’oxyde nitrique,

déclencheur chimique de l’inflammation. Il a été également démontré que d’autres

flavonoïdes inhibaient la sécrétion des mastocytes impliqués dans les phénomènes

inflammatoires (Fleuriet et al., 2005), cette activité concerne de nombreux composés

phénoliques et en premier lieu l'acide salicylique sous sa forme acétylé (acétyl salycilique)

commercialisée sous le nom d'aspirine. Ainsi que certaines anthocyanes, la cyanidine extraits

de cerises, les flavonoïdes des agrumes (Manthey, 2000).

4.6. Action antidiabétique

En raison de ses propriétés antioxydantes et de son log passé d'utilisation dans le

traitement des désordres hépatiques, la Silymarine est utilisé pour décliner la glycémie chez

des diabétiques, Une équipe de chercheurs de l’hôpital Oronfalcone à Gorizia en Italie à

traité 60 patient diabétiques quotidiennes pendant 12 mois avec 600 mg de Silymarine ou

un placebo (Anonyme, 1997).

D'autres études cliniques ont montrés également l'efficacité de la Silymarine dans la

régulation de la glycémie sanguine, qui descend d'une moyenne de 190 mg/dl à 174 mg/dl.

Bien qu'une telle diminution des niveaux sanguins de sucre puisse augmenter le risque

d'hypoglycémie. Les patients traités par la Silymarine n'ont pas eu d'augmentation du nombre

d'épisodes légers ou sévères d'hypoglycémie, suggérant que la Silymarine stabilise la

glycémie en même temps qu'elles à diminue(Nutranews, 2003).

4.7. Action anti-infectieuse

Les flavonoïdes accélèrent le processus de destruction des agents pathogènes en

améliorant la capacité des macrophages à les neutraliser. La transformation des macrophages

en antigène est donc plus rapide et les lymphocytes-T peuvent intervenir avec plus

d’efficacité (Fleuriet et al., 2005).

4.8. Effet sur la peau

Des composés extraits de myrtilles ou des épinards amélioreraient la signalisation des

messages nerveux et pourraient ralentir le processus de vieillissement (Rice et al., 1996 ;

Martini, 2006), les polyphénols participent à la lutte contre le vieillissement cutané en tant

que molécules antiradicalaires ou en tant que protecteurs de protéines de dégradation des

protéines de structure de la peau comme l'élastine et le collagène (Closs, 2002). Par ailleurs,

une étude préliminaire sur l’utilisation d’extraits de plantes comme filtres UV a démontré

que l’incorporation de flavonoïdes à une solution à 2% de filtre solaire synthétique,

augmente sensiblement l’indice de protection de celui-ci (Ramos et al.,1996).

5. Autres utilisation de flavonoïdes

5.1. Edulcorant

Un puissant édulcorant, la néohespéridine dihydrochalcone (E958) est utilisé en

alimentation pour les boissons non alcoolisées. Cet édulcorant est synthétisé à partir d’un

flavonoïde particulier : la néohéspéridoside (molécule naturelle amère).(www. Détour.

Santé.flavonoides.htm).

5.2. Engrais

Le généticien Don Smith a associé les flavonoïdes à un cocktail de bactéries fixatrices

d’azote. Le résultat a été concluant : la récolte a augmenté d’au moins 10%.) (www.

Détour. Santé.flavonoides.htm).

Méthodes d’étude des flavonoïdes

1. Méthodes de séparation et de purification

Les méthodes les plus utilisées pour la séparation et la purification des flavonoïdes

sont l’extraction par les solvants, la C.C.M. et la chromatographie de partage.

1.1. Extraction par solvant

L’extraction par solvant consiste à séparer les constituants d’un mélange à l’aide

d’un solvant volatil (éthanol , hexane ) qui ne se mélange pas avec l’eau. Le solvant se

charge des molécules à extraire grâce à sa forte affinité avec elles. On sépare ensuite le

solvant et l’eau dans une ampoule à décanter. Pour récupérer les molécules, on élimine

ensuite le solvant par évaporation (Audigié, 1995 ; Kamoun, 1975).

La solubilité des flavonoïdes dans les solvants dépend généralement de leur nature,

les hétérosides sont hydrosolubles et solubles dans les alcools, alors qu’un nombre d'entre

eux sont faiblement hydrosolubles (rutoside, hespérideside). Les génines sont pour la plupart

solubles dans les solvants organiques apolaire, lorsqu'elles ont au moins un groupe

phénolique libre se dissolvent dans les solutions d'hydroxyles alcalins les lipides et la

chlorophylle sont éliminés par l'éther de pétrole.

Les flavonoïdes lipophiles des tissus superficiels des feuilles (ou des frondes) sont

directement extraits par des solvants moyennement polaires comme le dichlorométhane

(chloroforme), (Ribereau -Gayon, 1968), les hétérosides sont extraits le plus souvent à

chaud avec de l'acétone ou d'autres alcools (Ethanol, Méthanol) additionnés d'eau (20 à 25

pour cent).

Une extraction par des solvants de polarité croissante tels le chloroforme qui permet

l’extraction des aglycones méthoxylés et peu hydroxylés, l’acétate d’éthyle pour extraire les

aglycones poly hydroxylés, le n- butanol qui accède aux hétérosides polyglycosylés et aussi

les hétérosides de type c-glycosyl (Ribereau-Gayon, 1968).

1.2. La chromatographie sur couche mince (CCM)

La chromatographie de manière générale est une méthode physique de séparation

basée sur les différences d’affinités des substances à analyser à l’égard de deux phases,

l’une stationnaire ou fixe, l’autre mobile (Audigié, 1995 ; Edith et al., 1998). Selon la

technique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte

soit de leur adsorption et de leur désorption successive sur la phase stationnaire, soit de

leur solubilité différentes dans chaque phase (Edith et al., 1998).

La C.C.M. est une chromatographie de partage ; elle est basée sur la différence de

solubilité des substances à séparer dans deux fluides parfaitement miscibles (René, 2002).

Le facteur principal qui intervient est le coefficient de partage entre chaque phase. Les

substances les plus solubles dans la phase mobile se déplacent plus facilement que celles qui

le sont moins (Audigié, 1995).

La C.C.M. est une technique d’analyse très utile et simple à mettre en œuvre, on

l’utilise en général pour suivre l’avancement d’une réaction, pour connaître la composition

d’une fraction séparée sur colonne ou pour visualiser la pureté d’un produit (Edith et al.,

1998). Les adsorbants les plus employés sont par ordre d’importance décroissante: le gel de

silice, le kieselguhr et la cellulose.

L’éluant est formé d’un solvant unique ou d’un mélange de solvants. Un éluant qui

entraîne tous les composants de l’échantillon est trop polaire, celui qui empêche leur

migration ne l’est pas suffisamment.

Le choix de l’éluant dépend des composés à séparer :

Pour les hydrocarbures : hexanes, éther de pétrole ou benzène.

Pour les groupements fonctionnels courants : hexane ou éther de pétrole mélangé en

proportions variables avec du benzène ou de l’éther diéthylique forment un éluant

de polarité moyenne.

Pour les composés polaires : ethanoate de l’éthyle, propanone ou méthanol.

1.3. Chromatographie d’adsorption

Son principe est essentiellement différent, en ce sens que ce sens que l'on

commence par former le chromatogramme par dépôt au sommet de la colonne d'un petit

volume de la solution initiale, mais que l'on développe ensuite le chromatogramme par dépôt

au sommet de la colonne d'un petit volume de la solution initiale, mais que l'on développe

ensuite le chromatogramme au moyen d'une solution d'un corps plus forement adsorbé que

ne l'est aucun des constituants du mélange. Généralement utilisée pour la séparation des

colorants, des protéines, des alcaloïdes etc. (Loiseleur, 1963 ; Audigié, 1995).

2. Méthodes d’analyses structurales

Plusieurs méthodes sont appliquées pour l'étude structurale des flavonoïdes, ce sont

le facteur de retardement (le Rf) dans les systèmes de solvants connus, la fluorescence du

produit en question permettent d’avoir une première approche structurale qui facilitera

énormément l'identification, puis par ordre d’utilisation, la spectrophotométrie UV-visible,

la spectrométrie de masse et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN)

(Fleuriet et al., 2005).

2.1. Facteur de retardement

Le rapport frontal (Rf) est défini comme étant le rapport de la distance entre la

tache du produit et l’origine d’une part et la distance entre l’origine et le front de solvant

d’autre part. Il est caractéristique d’une substance donnée pour un éluant déterminé

(organique ou aqueux) sur un support qui constitue "la phase stationnaire" (gel de silice,

polyamide, cellulose). La valeur du rapport frontal Rf varie avec le type de squelette

flavonique (aglycone ou glycoxyle) ainsi que la dispersion de ses différents substituant

(Markham, 1982 ; Mabry et al., 1970 ; Berthillier, 1972). La relation entre les Rf et la

structure flavonique est résumée dans le tableau 3.

Tableau 2 : Relation entre Rf et la structure flavonique (Yaou, 2001).

Structure flavonique Rf (Rapport frontal)

Augmentation des OH -Diminution du Rf dans un solvant

lipophile

Glycosylation - Rf augmente dans un solvant aqueux

- Rf diminue dans un solvant

alcoolique

Hydroxyles méthyles - Rf augmente dans un solvant

alcoolique

Méthylation d’un OH en C5 - Rf diminue dans un solvant

alcoolique

Hétérosides de flavones avec 3-OH - Rf nul dans l’eau

2.2. La fluorescence

Une analyse chromatographique est généralement suivie d'un dosage

absorptiométrique, la précision de ces méthodes d'analyse, dépond du but que l'on vise si on

désire doser des traces d'un élément, c'est souvent l'ordre de grandeur de la teneur en cet

élément qui à de l'importance; de la teneur en cet élément qui a de l'importance; on peut

alors se permettre sur le résultat une erreur relative de 10,20 % ou par fois même 100%.

Deux méthodes sont le plus souvent utilisées: l'absorbtionmétrie visuelle.

Par comparaison à des étalons ou par la méthode de dilution. Un appareil très simple

peut être utile est alors suffisante. La précision de cette méthode peut atteindre peut

attenidre celle des méthodes volumétriques ou gravimétriques, pour le dosage des quantités

importantes doivent être prise.

Les inconvénients de cette technique sont de trois types : des erreurs systématiques

calculables, et des erreurs mésurables, et des erreurs dues à la sensibilité de l'appareil ou de

la méthode utilisée.

2.3. La spectrométrie UV –Visible

La spectroscopie dans l’ultraviolet constitue une technique majeure de détection, de

contrôle de pureté et d’information des composés phénoliques, en particulier, les

flavonoïdes. Ces derniers sont caractérisés en milieu méthanolique par deux bandes

d’adsorption (Bande I, entre 330 et 550 nm ; Bande II entre 240 et 285 nm). Ces deux

bandes sont attribuables au fait que les flavones et flavonols présentent des formes limites

de type cinnamoyle, ou benzoyle. La position précise et les intensités relatives des

maximums d’adsorption fournissent des renseignement précieux sur la nature du

flavonoïdes et de sa substitution (Jurd et al ;1962).

2.4. La spectrométrie de masse (SM)

Cette technique permet la détermination du pic moléculaire qui donne

globalement le nombre et la nature des substituant hydroxyles ou méthoxyles (Fleuriet et

al., 2005), ainsi que la détermination du poids moléculaire des aglycones et leur nombre

(Moller et al., 1970). Il existe plusieurs analyses en spectrométrie de masse : l’ionisation par

impact électronique ; l’ionisation par impact électronique à haute résolution et the Fast

Atom Bombardement (Es-Safi et al., 2005)

2.5. La spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN)

La résonance magnétique nucléaire est un phénomène qui apparaît lorsque les

noyaux de certains atomes, immergés dans un champ magnétique uniforme B0, sont exposés

à un autre champ magnétique variable Be. La RMN est utilisée pour étudier les propriétés

physiques, chimiques et biologiques de la matière organique.

Dans le cas des flavonoïdes, c’est une technique qui permet de connaître :

Le nombre de sucres liés à l’ aglycone et la nature de leur liaison (A ou B).

La liaison et le nombre de substituant méthoxyles sur le squelette flavonique

(Auder, 1966 ; Moller et al., 1970).

Matériel et méthodes

1- Récolte de la plante

La récolte de la plante a été effectuée en mai 2006, au niveau du campus Chaab -Ersas

de l’Université Mentouri de Constantine. Les fleurs sont coupées et séchées; les graines

sont récupérées et pesées à l’aide d’une balance de précision (OHAUS). Les caractéristiques

des graines échantillon sont résumées dans le tableau 3.

Fleur Nombre degrainesviables

Nombre degraines non

viables

Totalpar

fleur

1 32 04 36

2 30 05 353 67 20 874 36 110 1465 15 05 206 13 02 157 45 01 468 84 4 889 44 04 48

10 50 03 5311 40 06 46

12 32 6 3813 54 02 5614 72 20 9215 186 9 195

Total 800 201 1001Nb

Moyen53 13 67

% 80 % 20 % 100 %Poidsmoyen

26,6 mg/graine

- -

Tableau 3. Caractéristiques des graines de Silybum marianum.

2- Extraction des flavonoïdes

La méthode d'extraction des flavonoïdes appliquée est celle utilisée dans le

laboratoire de Phytochimie de l'Université de Constantine; elle correspond à une macération

suivie d'une évaporation, puis une extraction par les solvants.

2.1. Macération

A 100 g de graines broyées en une poudre fine, on ajoute un volume du mélange du

mélange Ethanol / Eau (80:20) puis on laisse macérer pendant trois jours avec

renouvellement du solvant chaque 24 heures (350 ml x 3). Les solutions hydro-ethanoliques

obtenues sont réunies dans un même récipient pour subir une filtration afin d'obtenir une

solution limpide.

2.2. Evaporation

Elle est réalisée à l'aide d'un évaporateur rotatif (Rotavapor) R 120 à une

température comprise entre 35 à 45°C. L’extrait sec est repris par 200ml d’eau distillée

bouillante, il est ensuite laissé pendant 24 heures afin de subir une décantation, puis il est

filtré sur papier filtre Whatman n°1.

2.3. Extraction par les solvants

La phase aqueuse limpide issue des extractions successives est placée dans une

ampoule à décanter de 1 l afin de subir des affrontements successifs par différents solvants.

Pour cela, nous avons utilisé l’éther de pétrole, le trichlorométhane, l'acétate d’éthyle et le

n-butanol.

2.3.1. Affrontement à l’éther de pétrole

100 ml de phase aqueuse sont déversés dans une ampoule à décanter à laquelle on

rajoute 100 ml d’éther de pétrole. Apres une agitation énergique et un repos de quelques

minutes on observe deux phases :

-la phase éther de pétrole supérieure contenant les boues,

-la phase aqueuse inférieure contenant des flavonoïdes.

La phase éther de pétrole est récupérée dans un bécher, alors que la phase aqueuse

est remise dans l’ampoule à décanter afin de subir l'affrontement au chloroforme.

2.3..2. Affrontement au chloroforme

La phase aqueuse obtenue après affrontement à l’éther est remise dans l’ampoule à

décanter pour subir les mêmes opérations que précédemment. La phase aqueuse se retrouve

en haut de l'ampoule et la phase chloroforme en bas; celle-ci est récupérée dans un bécher,

alors que la phase aqueuse est remise dans l’ampoule à décanter pour être affrontée au

solvant suivant. Le même protocole est répété pour les deux autres solvants; l’acétate

d’éthyle et le n-butanol.

Les différentes phases (éther de pétrole, chloroforme, acétate d’éthyle, butanol, et

eau) sont évaporées à sec; chaque extrait est repris par un minimum de méthanol (5ml) pour

être utilisé dans les tests phytochimiques et antimicrobiens.

3- La séparation par chromatographie sur couche mince (CCM)

Le but de cette étape est d'avoir une idée générale sur le contenu en flavonoïdes de

l’échantillon à analyser et de choisir le système de solvants adéquat pour la séparation. Pour

cela, nous avons préparé des plaques de verre (10x20 cm) sur lesquelles nous avons étalé le

gel de silice.

L'échantillon est déposé sur la plaque à l’aide d’une micropipette de 10µl ; on laisse

sécher puis de place les plaques dans des cuves contenant l’un des systèmes de solvants

suivant :

S1 : toluène/butanol/méthanol/éther de pétrole 20/10/10/20.

S2 : chloroforme/acétone/acide formique 75/16,5 /8,5.

S3 : acétate d’éthyle/méthanol/eau. 50/ 20 /10.

La chromatographie est arrêtée lorsque le solvant a parcouru une distance à 2 à 3 cm

du bord supérieur de la plaque. Le solvant est éliminé par évaporation à température

ambiante

4. Etude microbiologique

4.1. Microorganismes tests

Les microorganismes testés proviennent des laboratoires de Microbiologie et de

Parasitologie de l'hôpital Universitaire de Constantine. Ils correspondent aux espèces

suivantes:

Catégorie Genre et espèce

Bactéries Gram- Escherichia. coli,

Serratia sp,

Pseudomonas sp.

Bactéries Gram+ Staphylococcus albus,

Staphylococcus aureus.

Moisissures Penicillum sp,

Aspergillus sp.

Levures Candida albicans,

Saccharomyces

cerevisiea.

2. Mise en évidence de l’activité antibactérienne par la méthode des disques

La méthode de diffusion à partir d’un disque a été utilisée pour mettre en évidence

l’activité antimicrobienne (Collin et al., 1970).

Des disques de papier Whatman n°1 de (6 mm) de diamètre sont stérilisés dans des

tubes à essai contenant de l’eau distillée puis séchés à l’étuve. Ces disques sont ensuite

imbibés de 20µl d’extrait à tester (butanolique ou chloroformique).

Par ailleurs, la gélose de Mueller-Hinton stérile est coulée dans des boites de Pétri de

90 mm de diamètre jusqu’à une épaisseur de 4 mm puis laissées refroidir.

Une suspension bactérienne de 18 à 24h est préparée avec le bouillon nutritif (voir

annexe2) et ajustée sur 0,5 de turbidité de Mc Farland. L’ensemencement est réalisé par

écouvillonnage à l’aide d’un coton-tige stérile en tournant la boite d’environ 60°. Deux

boites sont utilisées pour chaque souche bactérienne.

La dernière étape consiste à déposer à l’aide d’une pince stérile à la surface de la

gélose ensemencée par la souche à tester d’une boite de pétri des disques imbibés de 20 µl

d’extrait (butanol, chloroforme) .

La sensibilité des bactéries au méthanol est appréciée selon le même protocole que

précédemment, mais avec les disques contenant 20 µl de méthanol. Cinq disques sont

déposés au maximum dans chaque boite.

L’incubation dure de 18à 24h. Durant cette période, les substances diffusent dans la

gélose à partir des disques selon un gradient de concentration jusqu’à une limite où sa

concentration est la plus faible, déterminant ainsi des zones d’inhibition.

Après incubation, le diamètre d’inhibition autour des disques est mesuré et les valeurs

sont exprimées en mm.

4.3. Mise en évidence de l’activité antifongique

La méthode utilisée est la même que celle utilisée pour l'activité antibactérienne

(diffusion à partir d’un disque solide selon Collin et al., 1970).

L’incubation des boites se fait à 37°C pendant 18 à 24 h pour les levures et les

moisissures. A la fin de la culture, si l’extrait inhibe le développement microbien, un halo

clair est visible autour des disques.

5. Détermination des concentrations minimales inhibitrices etbactéricides (CMI, CMB)

Les méthodes de dilutions sont effectuées en milieu solide et en milieu liquide.

5.1. Détermination des (CMI, CMB) En milieu solide

La méthode utilisée est celle de (Collin et al., 1970). Une double série de dilutions

est préparée à partir de 200 µl de chaque extrait dans des tubes contenant 100 µl de

méthanol. 100 µl de chaque tube sont alors prélevés puis transférés dans le tube suivant

pour obtenir des concentrations réduites de moitié (C½, C¼, C1/ 8, etc).

Pour cette étude, seules deux souches sont utilisées: S. albus et C. albicans. Les

cultures pures de S. albus et de C. albicans sont inoculées dans le bouillon nutritif et

incubées pendant 18 à 24 h à 37°C. Elles sont ensuite ensemencées sur gélose de

Mueller-Hinton pour S. albus et sur Sabouraud pour C. albicans en boites de Pétri.

L’ensemencement se fait par écouvillonnage, en trempant un coton tige stérile dans la

suspension bactérienne ou levurienne en tournant la boite d’environ 60° afin d’assurer une

bonne répartition des microorganismes à la surface de la gélose.

Les disques sont chargés de 20 µl de l’extrait de butanol ou de chloroforme puis

déposés à la surface sur la gélose (Mueller-Hinton ou Sabouraud). L’incubation des souches

se fait pendant 18-24 h à 37°C pour S. albus et C. albicans. La lecture se fait en mesurant

le diamètre d’inhibition autour des disques.

Chaque essai est réalisé en double.

5.2. Détermination des (CMI, CMB) En milieu liquide (Macro dilution)

La méthode de dilution en milieu liquide a été utilisée pour déterminer les

concentrations minimales inhibitrices (CMI) et les concentrations minimales bactéricides

(CMB). La CMI est la plus faible concentration d’extrait alcoolique à laquelle le

microorganisme testé ne montre aucune croissance visible à l’œil nu.

La méthode consiste à distribuer 200 µl de méthanol dans une serie de tubes

auxquels on ajoute 100 µl de différentes dilutions (C ½, C1/4, C1/ 8, C1/ 6 etc) d'extrait

butanolique ou chloroformique dans chaque tube, à l'exception du premier qui servira de

témoin positif. Ensuite, on prélève 100 µl du mélange que l'on ajoute à 5 ml de bouillon

nutritif et 200 µl de suspension microbienne. On laisse incuber 18 à 24 h à 37°C, puis on

effectue la lecture des tubes visuellement.

La croissance bactérienne est indiquée par la turbidité ; le résultat est positif lorsque

un trouble apparaît dans les tubes. Le premier tube où il n' y a plus de culture visible indique

la concentration minimale inhibitrice (Kamagate et al., 2001). Un tube de contrôle négatif et

un tube de contrôle positif sont préparés pour chaque test.

Les CMB peut se mésurer à temps variable et consiste à déterminer le nombre de

survivants au cours du temps (Archambaud, 2000).

6. Thermostabilité des molécules bioactives (Flavonoïdes)

La thermostabilité des extraits de butanol et de chloroforme mélangés repris dans du

méthanol est mesurée selon le protocole suivant (Doughari et al., 2006).

Les extraits sont répartis dans des tubes de 18 ml, à raison de 6 ml par tube, puis

placés à différentes températures pendant 30 min : au réfrigirateur à (-5°C; 4°C) et dans un

bain-Marie ( 40°C; 60°C et 100°C). Ils sont ensuite testés vis-à-vis de S. albus et S.

cerevisiae par la technique des disques imbibés par 20 µl de chaque extrait.

Le test antimicrobien est réalisé selon le même protocole que précédemment.

Couleur Taille

Beige à marron foncé 5-8 mm *

Beige ou brune 6-7 mm (1)

Beige ou brun chiné 6-7 mm (2)

Brune ou grisâtre Environ 10 mm (3)

* Nos valeurs; (1) Guittonneaire et Huon (1983); (2) Sindel (1991); (3) Widmer (2001)

Tableau 4. Caractéristiques des graines de Silybum marianum. Comparaison avec la

bibliographie.

Figure 3. Echantillon des graines utilisées.

Résultats et discussions

1. Caractéristiques des échantillons (Graines de Silybum marianum)

1.1. Nombre et poids des graines

D’après le tableau 4 (voir matériel et méthodes), le nombre de graines produites par

chaque tête de fleur varie entre 15 à 195 avec une moyenne de 67 graines. Le nombre de

graines viables varie de 15 à 186 avec une moyenne de 53 graines par fleurs, ce qui

représente environ 80 %. Ces valeurs sont relativement différentes de celles obtenues par

Sindel (1991) qui mentionne un nombre de 192 graines par fleur dont 94 % sont viables.

Cela doit être lié à l'origine phytogénétique des échantillons ainsi qu'aux facteurs climatiques

et pédologiques. La pesée de 200 graines viables de l'échantillon a donné 5.32 g. soit 2,66

mg par graine.

1.2. Couleur des graines

D'après le tableau, les graines sont de couleur variable; elle s’étend du beige au marron

foncé, ce qui correspond aux caractéristiques des graines décrites par différents auteurs

(Guittonneaire et Huon, 1983; Sindel, 1991 et Widmer, 2001) (voir fig 3).

2. Rendement massique des extractions

La macération hydroalcoolique et l'affrontement par différents solvants de 100 g de

poudre de graines a donné les rendements massiques et les pourcentages résumés dans le

tableau 5.

L’extrait M.S (g) Rendement (%)

Extrait brut 2,56 100

Extrait chloroformique 0,41 16,01

Extrait de l’acétate d’éthyle 0,38 14 ,84

Extrait de butanol 0,28 10,94

Extrait aqueux 0,19 7,42

Tableau 5. Rendements des extractions exprimés en g. de matière sèche et en% par rapport à l'extrait brut.

D'après le tableau n°5, on constate que le rendement d'extraction en masse diminue

d'une phase à l'autre, il passe de 2,56 g dans l'extrait brut à 0,19 g pour la phase aqueuse.

Cette diminution est due à la rétention des molécules par la phase où elles possèdent la plus

forte affinité; chaque phase va récupérer des groupes de molécules de polarité croissante. La

phase chloroformique renferme des aglycones (molécules moyennement polaires :

Qeurcétine, Apiginine etc); la phase acétate d'éthyle des aglycones poly hydroxylés (plus

polaires que les aglycones :La silymarine ); la phase butanolique des hétérosides de type

C-glycosyl alors que la phase aqueuse retient les molécules insolubles dans les solvants

utilisés (Ribereau-Gayon, 1968).

1 2 3

Figure 4. Photographie représentant la plaquechromatographique des extraits alcooliques (1:chloroforme; 2: acétate d'éthyle; 3: butanol)

Rf3=0.53 cm

Rf2=0.40 cm

Rf1=0.36 cm

3. Chromatographie des flavonoïdes par CCM

La chromatographie sur couche mince des extraits des différentes phases (éther de

pétrole, chloroforme, acétate d’éthyle, butanol et eau) dans 3 systèmes (voir chapitre

matériel et méthodes) a donné une bonne séparation des molécules dans le système n°2

uniquement; les molécules extraites des graines de Silybum marianum sont solubles dans le

mélange de solvants du système (Chloroforme / acétone / acide formique:75/16,5/8,5 v/v).

On observe trois spots indiquant la séparation d'au moins trois molécules différentes dans

chaque phase. Les rapports frontaux donnent les mêmes valeurs pour les 3 phases, soit 0,36

cm pour la première tache, 0,4 cm pour la deuxième et 0,53 cm pour la troisième. Ces

résultats indiquent que les 3 extraits contiennent des molécules ayant des propriétés

similaires (polarité et masse moléculaire); l'intensité des tâches correspond à des

concentrations différentes.

Les molécules ont des polarités différentes et se solubilisent donc chacune dans un

solvant différent. Les mêmes molécules sont solubles dans des solvants variés.

D'après le profil chromatographique obtenu (fig 4 ), la dernière est la plus probable.

Selon Guernet et Hamon (1981), il peut co-exister des caractères polaires et apolaires chez

les molécules organiques, ce qui entraîne une affinité pour des solvants très divers. Par

ailleurs, la structure des flavonoïdes est généralement complexe (formés de plusieurs cycles)

(Hiller, 1998); ils ne sont pas solubles dans un solvant spécifique mais plutôt dans divers

solvants de polarités différentes.

Figure 5. Diamètres d’inhibition (mm) de la croissance de S. aureus et S. albus par les

différents extraits

Figure 6. Diamètre d’inhibition de la croissance des bactéries par les extraits butanolique et

chloroformique.

4. Détermination de l'activité antimicrobienne des différents extraits

Diamètre

d’inhibit

Bactéries-tests

4.1. Activité antibactérienne

La méthode utilisée pour la mise en évidence de l’activité antibactérienne est la

diffusion sur gélose Mueller-Hinton. Grâce à sa spécificité et à sa composition, ce milieu,

souvent rencontré dans la littérature, permet une bonne croissance aux bactéries-tests tout

en offrant des résultats clairs. L’ensemencement est réalisé par écouvillonnage afin d’assurer

une distribution uniforme de l’inoculum sur la gélose et faciliter la diffusion des molécules

actives dans une fine couche de surface (Horikawa et al., 1999 ; Woo et al., 2002).

Les résultats rassemblés dans l’annexe 5 et les figure 5 et 6 montrent que tous les

extraits possèdent une activité antimicrobienne sur au moins une des souches bactériennes

testées. Cependant, seules les zones d'inhibition supérieures à 10 mm sont considérées

comme positives (Hassan et al., 2006). Celles-ci varient d’un extrait à l’autre et d’un germe

à l’autre. Les extraits chloroformique et butanolique sont les plus actifs; les diamètres

d’inhibition varient de 8 à 19 mm, la plus grande inhibition est obtenue avec S. albus avec 18

mm pour l’extrait chloroformique et 19 mm pour l’extrait butanolique. La plus petite

inhibition est obtenue avec S. aureus avec 17 mm et 16 mm pour les extraits chloroformique

et butanolique respectivement.

L’extrait éther de pétrole est moins actif que les deux premiers; il présente un

diamètre d’inhibition de 12 mm pour S. albus et 8 mm pour S. aureus. L’extrait aqueux est

le moins actif avec un diamètre d’inhibition de 8 mm pour chacune des 2 souches sensibles.

Le méthanol n’est actif sur aucune souche-test; il sert de contrôle négatif.

L’étude de la sensibilité aux extraits de la plante montre que les souches

bactériennes Serratia sp, E. coli, Pseudomonas sp sont résistantes, les zones d'inhibition

sont toutes inférieures à 10 mm.

Figure 7. Inhibition de la croissance de Staphylococcus albus

Par les extraits de chloroforme et de butanol.

Un deuxième essai des extraits butanolique et chloroformique sur les bactéries

confirme la forte inhibition provoquée sur S. albus avec un diamètre de 19 mm et sur S.

aureus avec un diamètre de 18 mm (voir histogrammes fig. 5, 6 et 7). Les deux extraits ont

une action signifiante sur les bactéries gram positif (diamètre d'inhibition supérieur à 10) et

insignifiante sur les bactéries gram négatif.

L'activité des agents antimicrobiens sur les bactéries gram positif peut

s’expliquer par l’accessibilité directe de ces molécules aux peptidoglycanes constituant la

paroi, provoquant ainsi la dissolution complète de cette dernière. Les bactéries perdent alors

leur rigidité et se lysent sous l’effet de leur pression osmotique interne qui rompt leur

membrane cytoplasmique d’une part, d’une autre part la configuration spatiale des molécules

l’empêchent de traverser les protéines de transport (porines) de la membrane externe des

bactéries gram négatif, et ne peuvent pas donc atteindrent le peptidoglycane de la paroi

bactérienne (Bousseboua, 2001).

Figure 8 Diamètre d’inhibition de la croissance de C. albicans et S. cerevisiea

par les différents extraits.

Diamètre

d’in

Figure 9. Diamètre d’inhibition de la croissance des champignons par les extraits

butanolique et chloroformique

Diamètre

d’ih

La sensibilité des bactéries (S. albus, S. aureus) aux extraits chloroformique et butanolique

peut s’expliquer par le fait que les flavonoides de la plante exercent une inhibition de la

croissance via plusieurs mécanismes: inhibition de la biosynthèse des protéines et des

phospholipides membranaire, inhibition de leur acide nucléique (Franklin et al., 1987;

Hassan et al., 2006); les extraits flavonoidiques de S. marianum exercent probablement leur

action par l'un de ces deux mécanismes.

4.2. Activité antifongique

La méthode utilisée pour la mise en évidence de l’activité antifongique est la

diffusion sur gélose Sabouraud. Comme pour les bactéries dans le milieu Muller-Hinton ,

cette méthode est utilisée le plus souvent à cause de sa spécificité et de sa composition ; elle

assure une bonne croissance des champignons-tests et elle donne des résultats clairs

(Horikawa et al., 1999 ; Woo et al., 2002).

Les résultats rassemblés dans les figures 8 et 9, Annexe 6 montrent que tous les

extraits ont une activité sur Candida et Saccharomyces, mais celles-ci varient selon l’extrait.

Elles sont positives (diamètre d'inhibition supérieur à 10 mm) vis-à-vis des deux levures C.

albicans et S. cerevisiae pour les extraits de chloroforme et de butanol. En effet, les

diamètres d’inhibition de l'extrait chloroformique est de 16 mm sur C. albicans et de 15 mm

sur S. cerevisiae. Ceux de l’extrait butanolique sont de 15 mm sur C. albicans et de 16 mm

sur S. cerevisiae.

Les activités sont non significatives (inférieures ou égales à 10 mm) par rapport à

l’extrait éther de pétrole qui entraîne une inhibition de 10 mm sur C. albicans et de 8 mm

sur S. cerevisiae. La phase aqueuse présente la plus faible activité antifongique avec un

diamètre d’inhibition de 8 mm pour chacune des levures. Les résultats montrent une

résistance des moisissures (Aspergillus sp et Penicillium sp) (voir fig.8)

La comparaison des valeurs extrêmes des zones d’inhibition montre que les

extraits de butanol et de chloroforme sont les plus actifs. Un deuxième essai de l'action des

extraits butanolique et chloroformique sur les champignons confirme la forte inhibition

provoquée sur C. albicans et S. cerevisiae (voir histogramme de la figure 9) on constate

que les extraits butanolique et chloroformique exercent une action signifiante sur C. albicans

avec des diamètres d'inhibition de 18 et 17 mm, et sur S. cerevisiae avec des diamètres

d'inhibition de 16 et 15 mm. Ces extraits ont donc une action signifiante sur les levures et

pas d'action sur les moisissures. (fig 10)

C. albicans. S. cerevisiea.

Figure 10. Inhibition de la croissance de C. albicans et S. cerevisiea

Par les extraits de chloroforme et de butanol.

Il n'est pas possible d'expliquer la cause précise des inhibitions observées; en effet, les

différents extraits contiennent un ensemble de molécules et on ne sait pas si l'inhibition est

provoquée par une ou par plusieurs molécules. Cela peut s’expliquer cependant par

l’accessibilité directe de la paroi des levures et ce n’est pas le cas pour les moisissures

protégés par la structure mycélienne rigide, en effet, certains auteurs ont mentionnés que

leur paroi est constituée de trois polysaccharides : β- 1,3 glucane, la chitine et la mannane

associées par des liaisons chimiques (Farkas et al., 1985). Il est probable que les molécules

contenues dans les extraits inhibent la synthèse de la chitine et agissent alors comme certains

antibiotiques (Isono et Suzuki, 1979). D'autre part, le mécanisme d'action des agents

antimicrobiens sur les levures reste mal connu (Isono et Suzuki, 1979 et Hassan et al.,

2006).

5. Détermination des CMI et des CMB

La CMI et la CMB ont été déterminées pour les extraits possédants la plus forte

activité antimicrobienne (diamètre d’inhibition supérieur à 10 mm), il s’agit de l’extrait

butanolique et chloroformique sur la bactérie S. albus et sur la levure C. albicans. Les

résultats sont rassemblés dans les tableaux 6, 7, 8 et 9.

5.1. Résultats des CMI et des CMB par la méthode de dilution en

milieu solide

dilution

diamètre

C0 C½ C 1/ 4 C ⅛ C 1/

16

chloroforme 17,33 14,66 11,33 10 7

Butanol 17 14 12 9 7

Tableau 6. Diamètre d'inhibition de S. albus (exprimés en mm) par l'extrait chloroformique

par la méthode de dilution en milieu solide.

(Les résultats sont les moyennes de trois répétitions).

dilution

diamètre

C0 C 1/ 2 C1/ 4 C1/ 8 C1/

16

chloroforme 16 15 12 10 7

butanol 15 14 11 8 7

Tableau 7. Diamètres d’inhibition de C. albicans (exprimés en mm) par l'extrait

chloroformique par la méthode de dilution en milieu solide.

Il apparaît d’après les tableaux 6 et 7 que la valeur des diamètres d’inhibition

diminue au fur et à mesure de la diminution des concentration en extraits (butanol ou

chloroforme) jusqu'à la concentration de 1/8 ou on constate que le diamètre d’inhibition

atteindrent des valeurs inférieurs à 10 (activité insignifiante).

D’après (Ganiere et al., 2004) les résultats de la méthode des disques à l’échelle

pratique doit être considérée comme uniquement qualitative en raison de la variabilité

expérimentale des diamètres et de l’erreur sur les valeurs car à la limite des zones

d’inhibition, il existe dans la gélose des concentrations en agent antimicrobien égales aux

CMI. Les méthodes de diffusion sur gélose ne permettent pas de chiffrer directement ces

valeurs.

5.2. Résultats des CMI et des CMB par la méthode de dilution en

milieu liquide

dilution

phase

C0 C1/ 2 C1/ 4 C1/ 8 C1/ 16 C1/ 32

chloroforme - - - - - - - - - + + + + + + + + +

Butanol - - - - - - - - - + + + + + + + + +

(+) : présence de trouble dans le tube; (-) : absence de trouble

Tableau 8. Inhibition de la croissance de S. albus par l'extrait chloroformique par la

méthode de dilution en milieu liquide.

dilution

phase

Co C 1/2 C 1/ 4 C1/ 8 C1/16 C1/32

Chloroforme - - - - - - - - - + + + + + + + + +

Butanol - - - - - - - - - + + + + + + + + +

(+) : présence de trouble dans le tube; (-) : absence de trouble dans le tube.

Tableau 9. Inhibition de la croissance de C. albicans par l'extrait butanolique par la

méthode de dilution en milieu liquide.

D’après les résultats des tableaux 8 et 9 l’apparition du trouble dans les tubes débute

dés la concentration de 1/8 pour les deux extraits de butanol et de chloroforme étudiés sur S.

albus et C. albicans.

L’absence de trouble dans les concentrations de ½ et ¼ des deux souches s’explique

par l’inhibition de leur croissance par les deux extraits, l’apparition de trouble à partir de la

concentration de 1/8 est du au fait que les extraits a ces concentration sont trop diluée est

sont alors incapables d’inhiber la croissance des deux souches (concentration inefficace pour

l’inhibition de la croissance).

Extrait

chloroformique

Extrait

butanolique

Rapport CMB / CMI

CMI

(mg/ml)

CMB(mg/ml)

CMI(mg/ml)

CMB(mg/ml)

Extrait

chloroforme

Extrait

butanolique

S. albus 10 ,25 41 7 28 4 4

C. albicans 20,5 41 14 28 4 2

Tableau 10. Résultats des CMI et CMB; CMI/CMB des extraits actifs sur Staphylococcus

albus et Candida albicans.

Les CMI de l’extrait chloroformique varient de 10,25 mg/ml à 20,5 mg/ml pour S.

albus et C. albicans respectivement. La CMB est la même pour les deux souches, soit 41

mg/ml. Le germe ayant la plus faible CMI, donc le plus sensible est S. albus.

Les CMI de l’extrait butanolique sont comprises entre 7 mg/ml et 14 mg/ml pour S.

albus et C. albicans respectivement. Au regard des CMI, le germe le plus sensible est S.

albusLa CMB est de 28 mg/ml pour les deux germes.

La comparison des CMI obtenus avec chacune des méthodes montre qu’il existe une

corrélation positive dans les résultats. Les CMI déterminée en milieu solide correspondent

aux CMI déterminée en milieu liquide, lorsque les diamètres des zones d’inhibition sont

importantes, les CMI en milieu liquide sont faibles (Kamagate et al., 2001). Tandis, que la

CMB ne peut être déterminée qu’on milieu liquide.

D'après ces résultats, on constate que les CMI varient d’un microorganisme à l’autre,

tandis que les CMB sont les mêmes pour les deux microorganismes ceci est observé aussi

bien pour l’extrait butanolique et chloroformique. D’après la littérature la mesure du rapport

CMB/CMI permet de juger si l’action des agents antimicrobiens est bactériostatique ou

bactéricide ( tableau 10)

-Si CMB/ CMI ≤ 1 l’action est bactéricide.

-Si CMB/ CMI > 1 l’action est bactériostatique (Archambaud, 2001)

Les résultats résumés dans le tableau 11 montrent que dans le cas de S. albus et C.

albicans, le rapport CMB/ CMI est égal à 4 pour l'extrait chloroformique. Pour l’extrait

butanolique, ce rapport égal à 2 dans le cas de C. albicans et à 4 dans le cas de S. albus ;

ces valeurs permettent de dire que les deux extraits ont une action bactériostatique.

Les extraits de la plante ont donc une action bactériostatique vis-à-vis des bactéries

gram positif (S. aureus, S. albus) et mycostatique vis-à-vis des levures (C. albicans, S.

cerevisiea). Ceci confirme l’étude de Lee et al en (2003) qui a montré l’effet antibactérien

de la silymarine sur les bactéries Gram+ et complète les conclusions de (Polyak et al., 2007)

concernant une activité sur d’autre microorganisme de cette substance.

a

b

c

Figure 11. Diamètre d'inhibition de la croissance des M.O. par les extraits de chloroforme

et de butanol à différentes températures (a: S. albus, b: S. cerevisiea c: C. albicans).

---

Température (°C).

Figure 12.

Diamètre

d'inhibition de la

croissance des M.O. par les extraits butanolique et chloroformique à différentes

températures (moyenne des 3 souches).

Diamètre

d’in

6. Etude de la thermostabilité des flavonoïdes extraits de Silybum

marianum

L'étude de l'activité des fractions flavoinidiques extraites par le chloroforme et le

butanol puis traitées pendant 30 min par différentes températures a donné les diamètres

d’inhibition de la croissance de la bactérie (S. albus) les courbes suivantes (figure11,

Annexe 7).

D’après la figure n°12 il apparaît 3 intervalles de températures (voir valeurs en

annexe 7):

- de -5°C à 4°C: la valeur du diamètre d’inhibition augmente; elle passe de 12 mm à

-5°C à 15 mm à +4°C pour l’extrait de butanol, et de 11mm à 16 mm pour l’extrait de

chloroforme.

- de 4°C à 40°C: le diamètre d’inhibition reste relativement constant, il se situe entre 15 et

16 mm pour les deux extraits.

- de +40°C à 100°C: la valeur du diamètre d’inhibition diminue jusqu'à atteindre la valeur

de 8 mm pour les 2 extraits.

Ces résultats montrent que les extraits de butanol et de chloroforme conservent leur

activité antimicrobienne après congélation (à -5°C) et au froid à 4°C, les diamètres

d’inhibition supérieurs à 10 mm permet de conclure que les molécules bioactives contenues

dans les deux extraits résistent la baisse de température. Ces résultats sont identiques à ceux

obtenus par Doughari (2006) qui a travaillé sur les flavonoides de Tamarindus indica linn ;

ces molécules ont une bonne activité antimicrobienne dans des températures comprises entre

40 et 60°C. Ils confirment les travaux de Bibitha et al. (2002), Daughari (2006) et de Hassan

et al., (2006), qui ont montré que les molécules d’usine y compris les flavonoides, restent

actives à des températures élevées durant 30 min et plus.

A 100°C pendant 30 min, les diamètres d’inhibition des bactéries et levures sont de 8

mm environ, l’action est donc insignifiante. Ceci est du à la perte de l’activité des molécules,

contrairement à Daughari (2006) qui mentionne une stabilité des flavonoides à 100°c

pendant 30 min.

De ces résultats, on peut conclure que les flavonoides de S. marianum conservent

leur activité à des basses températures et restent actives à des températures comprises entre

40 et 60°C. Elles deviennent inactives à 100°C. La température optimale de ces molécules

se situe entre 40 et 60°C.

Conclusion et perspectives

L’extraction de flavonoïdes de Silybum marianum est effectuée par un

fractionnement de type liquide- liquide par divers solvants de polarité différentes (éther de

pétrole, chloroforme, acétate d’éthyle, n-butanol) a permis d'évaluer les rendements

massiques de chaque phase. Les masses des extraits passent de 2,56g dans l'extrait brut à

0,41; 0,38; 0,28; 0,19 g dans l'extrait de chloroforme, acétate d'éthyle, butanol, et l'extrait

aqueux, successivement.

La séparation des composés actifs est réalisée par CCM utilisant le gel de silice. Les

résultats ont montré l’apparition de trois taches différentes dans chaque phase migrant de la

même façon avec des rapports frontaux de 0,36; 0,41; 0,53 cm.

Le choix des phases à haut potentiel antimicrobien est réalisé par la méthode de

diffusion sur milieu solide (Gélose Mueller-Hinton pour les bactéries et Sabouraud pour les

champignons). Les résultats ont montré que l’extrait butanolique et chloroformique sont les

plus puissants vis-à-vis des germes sensibles (S. aureus, S. albus; C. albicans, S. cerevisiea).

Un deuxième criblage de l’activité antimicrobienne utilisant ces deux extraits est effectué par

la méthode des disques. Les résultats ont montré une action signifiante sur les bactéries gram

positif et les levures avec des diamètres d'inhibition atteignant 19 mm.

La détermination des CMI et CMB est réalisée par la méthode de dilution en milieu

solide et liquide. Les résultats des CMI vont de 10,25 à 7 mg/ml pour l'extrait de

chloroforme et de butanol respectivement dans le cas de S. Albus et de 20,5 à 14 mg/ml pour

la levure C. albicans, tandis que les CMB vont de 41 à 28 mg/ml pour l'extrait de

chloroforme et de butanol respectivement pour S. albus et de 41 à 28 mg/ml pour C

.albicans.

Le rapport CMB/ CMI est égal à 4 pour l'extrait chloroformique avec les deux

souches C. albicans et S. albus, tandis qu'il prend une valeur de 4 avec S. albus et de 2 avec

C. albicans dans le cas de l'extrait butanolique. Ces résultats montrent que les deux

extraits sont bactériostatiques vis-à-vis des microorganismes (S. albus et C. albicans).

L'étude de la thermostabilité de ces molécules a montré leur résistance dans la

gamme de température étudiée -5 °C à 60 °C et deviennent inactives à 100 °C.

Cette étude révèle que la plante S. marianum renferme des molécules flavonoidiques

douées d’activité antibactérienne et antifongique.

Les perspectives de la recherche consistent à la purification des molécules par des

techniques plus efficaces (HPLC, chromatographie en phase gazeuse, etc). La réalisation

d’une analyse structurale par RMN permet la détermination de la structure exacte des

substances à analyser.

- Identification des molécules responsables de l'activité antimicrobienne.

- Etude du mécanisme d'action de ces molécules sur les microorganismes inhibés.

: ةيحاتفملا تاملكلا

S. marinum،ومنلل قيعملا زيكرت ىندأ ،تابوركيملل طبثملا طاشنلا ،يفارغوتاموركلا لزعلا ةينقت ،تاديونوفالف

( (CMI، لتاق زيكرت ىندأ ( (CMB.

ANNEXES

Annexe 1 : Composition des milieux de culture utilisés pour la mise enévidence de l’activité antimicrobienne :

Mueller-hinton :

-Agar……………………………………………10g.

-Extrait de viande……………………………….02g.

-Hydrolysat acide de caséine………………… 17,5g.

-Amidon……………………………………….. 1,5g.

-Eau distillée…………………………………1000ml.

PH 7,4.

Milieu Sabouraud :

-Agar……………………………………………...15g.

-Glucose…………………………………………. 40g.

-Peptone……………………………………………10g.

-Eau distillée……………………………………1000ml.

PH 7,00.

Annexe 2 : Composition des bouillons nutritifs utilisés pour la culture desmicroorganismes-tests :

-Bouillon nutritif pour les bactéries :

-Extrait de viande…………………………………….. 5g.

-Peptone………………………………………………10g.

-Na cl…………………………………………………...5g.

-Eau distillée………………………………………1000ml.

Ph 7,35.

Stérilisation à 110°C pendant 20mn.

-Bouillon nutritif pour les champignons (YPG) :

-glucose………………………………………………..20g.

-extrait de levure………………………………………05g.

-peptone………………………………………………..10g.

-eau distillée………………………………………..1000ml.

5< ph < 5,2.

Annexe 3 : Préparation des solutions :-Solution de Mc Farland :

Solution A Solution BComposition de la solutionde Mc Farland

Ba cl2 2(H20) à 1%

(10g/l).

H2 SO4 à 1%

(10ml/l)

0,5 ml de la solution A +99,5ml de la solution B.

-la densité optique de la solution (DO) varie de 0,08 à0, 1 lue à 625 nm.

-Solution d’eau physiologique :-Na cl…………………………………………….9g.-Eau distillée…………………………………1000ml.

Stérilisation à 120 °C pendant 20mn.

-Réactif de GODIN

Solution mèreSolution A à 1 % Solution B à 3 % Réactif de Godin

-Ethanol pur 1000ml.-Vanilline 10g.

-Hcl04 à 3 % d = 1,67

50ml de la solution A + 50mlde la solution B.

Révélation

-Solution éthanolique d’acide sulfurique :-Ethanol………………………………… 100ml.-Acide sulfurique………………………… 10ml.

Annexe 4 :

Valeur des rapports frontaux correspondant aux figures (2 ).

-La première tache :

Rf = 0,36 cm calculé à partir de la phase acétate d’éthyle.

-La deuxième tache :

Rf = 0,41 cm calculé à partir de la phase éther de pétrole.

-La troisième tache :

Rf = 0,53 cm calculé à partir de la phase chloroforme.

Poids de chaque phase après évaporation :

Après chaque évaporation la masse de chaque phase est pesée par une balance de pricisionpuis repris dans 5ml de méthanol.

-l’extrait brute : 2,56g.

- la phase chloroforme : 0,41g.

-la phase acétate : 0,38g.

-la phase butanol : 0,28g.

-la phase aqueuse : 0,19g.

-Annexe 5 : Données pour la représentation de la figure ( 6 et 9 )

- Bactéries-tests :

Phases

Souches-tests Butanol Chloroforme

Staphylococcus albus 19 18

Staphylococcus aureus 18 17

Escherichia coli 0 0

Serratia sp 0 0

- Les champignons-tests :

PhaseSouches-tests Butanol Chloroforme

Saccharomyces cerevisiae 16 15

Condida albicans 18 17

Aspergillus niger 0 0

Penicillium sp 0 0

Les résultats sont des diamètres d’inhibition exprimés en (mm).

Annexe 6 : données pour la représentation de la figure (5 et 8) :

Souche

Phase

Staphylococcus albus Staphylococcus aureus

Phase éther de pétrole 12 8

Phase chloroforme 18 17

Phase butanol 19 16

Phase aqueuse 8 8

méthanol 0 0

Souche

Phase

Condida albicans Saccharomyces cerevisiae

Phase éther de pétrole 10 15

Phase chloroforme 16 16

Phase butanol 15 8

Phase aqueuse 8 8

Méthanol 0 0

Annexe 7 : Données pour la représentation de la figure (11 et 12) : Extrait butanolique (les diamètres d’inhibition sont exprimés en mm).

Souches-tests

Température

S.albus S.cerevisiae C.albicans Moyenne

-5°C 12 12 12 12

4°C 19 13 15 15,66

40°C 15 14 15 14,66

60°C 12 11 13 12

100°C 8 8 8 8

. Extrait chloroformique :

Souches-tests

Températures S.albus S.cerevisiae C.albicans Moyenne

-5°C 10 12 12 11,33

4°C 16 16 16 16

40°C 15,5 15 16 15,5

60°C 12 12 11 10

100°C 8 8 8 8

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Abstract

New antimicrobial vegetal compounds are researched from an endemic medicinal

plant, widely répandue in Mediterranean region, particularly in Algeria, Silybum marianum.

For that, flavonoids have been extracted using several adapted solvent systems then

separated by a thin layer chromatography (TLC) on silica gel.

The antimicrobiol effect of the compounds extracted was tested using disk method

against the following bacteria and fungi : Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus,

Pseudomonas sp, Escherichia coli, Serratia sp ; Aspergillus sp, Penicillum sp, Candida

albicans and Saccharomyces cereviseae. The highest inhibitory effect is corresponding to

chloroform and butanol extracts; both extracts presented strong activity against:

Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus, Candida albicans and Saccharomyces

cereviseae.

The minimum bacteriostatic and bacteriocidal inhibitory concentrations against

sensitive germs were determined by solid and liquid dilution methods.

Determination of CMB/CMI ratio revealed a bacteriostatic action of these

flavonoids. The study of thermostability revealed their resistance at cold and heat

temperatures (-5°C ; 4°C ; 40°C ; 60°C )but it will be and inactive at 100°C.

These results highlight antimicrobial activities of flavonoids extracted from Silybum

marianum, which broadens the therapeutic properties of this plant.

Key words : Silybum marianum ; Flavonoids ; splitting ; antimicrobial activity ; TLC ;

CMB ; CMI ; Thermostability.

صخلم

نم ةعومجم جارختساب انمق يتابن ردصم تاذ ةيرهجملا تانئاكلل ةطبثم ةديدج تابكرم نع ثحبلا راطإ يف

ةرسأل ةيمتنم رئازجلا ةصاخ طسوتملا ضيبألا رحبلا ضوح يف ةرشتنم ةيبط تاتابن نم تاديونوفالفلا

(Asteraceae): Silybum marinum

.ةراضلا ةيرهجملا تانئاكلا نم ةعومجم ىلع تابكرملا هذهل طبثملا طاشنلا ةبرجت مت

اهتيقنت مت نم و ،صئاصخلا ةعونتم ةيلوحكلا تابيذملا نم ةعومجم ةطساوب تاديونوفالفلا جارختساب انمق كلذل

(سيليسلا ماله) ةقيقرلا تاقبطلا ىلع يفارغوتاموركلا لصفلا ةينقت لامعتساب

: ةراضلا تايريتكبلا نم ةعومجم دض بلص طسو يف راشتنالا ةينقتب طبثملا طاشنلا ديدحت مت

Escherichia coli, Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus, Serrati sp, Pseudomonas

sp,

:تايرطفلا ضعبو

Aspergillus niger, Penicillum sp, Condida albicans, .Saccharomyces cereviseae

نم لك ىلع طيبثت ةوق ىلعأ ارهظا ناذللا يمروفورولكلا و يلوناتيبلا صلختسملل طبثملا طاشنلا بسني

:ةيلاتلا تالالسلا S. aureus, S. albus, C. albicans, S. cereviseae دض ةلتاقلا و ومنلل ةقيعملا زيكارتلا ىندأ

.بلص و لئاس طسو يف فيفختلا ةقيرطب ددح ةساسحلا تالالسلا

ةبسنلا باسح CMB/CMI يمروفورولكلا و يلوناتيبلا صلختسملا يف ةدوجوملا تاديونوفالفلا نأ رهظأ

تاديونوفالفلا ةمواقم جئاتنلا ترهظا ةفلتخم ةرارح تاجرد يف تابكرملا هذه ةساردب انمق ،ومنلل قيعم طاشن تاذ

.م° 100 دنع اهطاشن دقفت اهنأ الإ م° 60،م° 40 ،م° 4 ،م5°- ةيلاتلا ةرارحلا تاجردل

تابن نم ةجرختسملا تاديونوفالفلل تابوركيملل داضملا طاشنلا ىلع ءوضلا طلست اهيلع لصحتملا جئاتنلا

S. marinum .تابنلا اذهل ةيجالعلا صئاصخلا نم عسوي امم ،

Nom: LAHLAH Prénom : Fatima Zohra

Titre: EXTRACTION DES FLAVONOIDES A PARTIR DE SILYBUM MARIANUM PAR LE

BUTANOL ET LE CHLOROFORME ET ETUDE DE LEUR ACTIVITE SUR QUELQUES

MICROORGANISMES.

Résumé

Ce travail a pour but d’étudier et de valoriser une plante sauvage largementrépandue en Algérie, et de rechercher de nouveaux composés à activité antimicrobienne.Pour cela, les flavonoïdes de Silybum marianum sont extraits et leur effet antimicrobien aété examiné sur quelques microorganismes pathogènes humains.

Les flavonoïdes sont extraits par fractionnement par plusieurs systèmes de solvantspuis séparés et identifiés par chromatographie sur couche mince (CCM).

L’effet antimicrobien à été déterminé par la méthode de diffusion sur géloseMueller-Hinton pour les bactéries-tests Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus,Eischerichia coli, Serratia sp, Pseudomonas sp, et sur gélose Sabouraud pour leschampignons Aspergillus sp, Penicillium sp, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae.

L’effet inhibiteur le plus élevé est obtenu par l’action des extraits butanolique etchloroformique qui ont présenté une forte activité antimicrobienne sur S. albus, S. aureus,C. albicans et S. cerevisiae.

Les concentrations minimales inhibitrices bactéricides et bactériostatiques vis à visdes germes sensibles ont été déterminées par la méthode de dilution en milieu solide etliquide.

D’après le rapport CMB/CMI, les flavonoïdes contenus dans les extraits butanoliqueet chloroformique ont une action bactériostatique ; l’étude de leur thermostabilité àdifférentes températures (-5°C, 4°C, 40°C, 60°C) a montré que les molécules restent actives30 min tandis qu'elles deviennent inactives à 100 °C.

Ces résultats mettent en évidence les activités antimicrobiennes des flavonoïdes deSilybum marianum, ce qui élargit les propriétés thérapeutiques de cette plante.

Mots clés : Silybum marianum, flavonoïdes, extraction, activité antimicrobienne, CCM ;

CMB ; CMI ; thermostabilité.

Laboratoire de recherche : Laboratoire de Biologie et Environnement Faculté des Sciences

de la Nature et de la Vie. Université, Constantine.