Analyses génomiques et phénotypiques contrastant les ...

Analyses génomiques et phénotypiques contrastant les embryons bovins des races Holstein et Jersey

Thèse

Luis Manuel Baldoceda Baldeon

Doctorat en sciences animales Philosophiae doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

© Luis Manuel Baldoceda Baldeon, 2014

iii

Résumé Au cours des dernières années, la production laitière a été en croissance constante en raison

de plusieurs facteurs tels que l‟utilisation d‟individus plus performants. L‟augmentation du

nombre d‟enregistrements de vaches de la race Jersey confirme l‟intérêt économique des

producteurs pour cette race en raison de la production élevée de protéines et de gras du lait

par rapport aux autres races. Cependant, les embryons de la race Jersey ont montré des

difficultés dans le processus de cryopréservation lequel peut aider à une commercialisation

massive de matériel génétique de cette race. Il a été observé que la race Jersey présente un

faible taux de gestation lors du transfert des embryons après la cryopréservation en

comparaison aux embryons de la race Holstein. Nous proposons que cette différence entre

les deux races bovines soit due à des caractéristiques spécifiques de la race au niveau du

phénotype et du génome. Dans un premier temps, les résultats de cette étude ont mis en

évidence des différences au niveau du phénotype et du profil lipidique et génomique de

l‟embryon Jersey. Celui-ci est caractérisé par un contenu de lipides associé à une faible

fonction mitochondriale laquelle déterminera le faible succès à la cryopréservation. Par la

suite, nous avons évalué au niveau du phénotype et de la génomique, l‟utilisation de la L-

carnitine dans le milieu de culture in vitro afin de compenser cette caractéristique des

embryons de la race Jersey. Cette étude sur la supplémentation de L-carnitine a permis

d'identifier une faible réponse chez les embryons Jersey qui est expliqué par le faible effet

de la L-carnitine sur l‟activité mitochondriale. Afin de définir l‟impact de la fonction

mitochondriale sur la viabilité de l‟embryon lors de nos études, nous avons mis au point

une méthode pour compenser la dysfonction mitochondriale sur le développement

embryonnaire chez le bovin. Enfin, l‟application de la vitamine K2 dans le milieu de culture

in vitro montre un impact positif sur la fonction mitochondriale qui a mené à des

changements phénotypiques et génomiques chez les embryons bovins. En conclusion, ce

projet a permis de caractériser et d‟identifier la race comme un facteur qui limite la

cryopréservation des embryons et peut influencer sur le métabolisme embryonnaire au

niveau des mitochondries. La fonction mitochondriale est une caractéristique importante

sur le développement embryonnaire bovin qui peut ouvrir sur des perspectives

d‟amélioration de la viabilité embryonnaire.

v

Abstract

For the past decades, milk production has been increasing due to several factors such as the

use of high genetic merit individuals. In this regard, Jersey cows have been of interest for

the producers because of high protein and fat indexes in their milk compared to others

breeds. However, there are some challenges associated with Jersey particularly poor results

using embryo cryopreservation which could help to massively commercialize the genetic

material of this breed. It was observed that the Jersey breed have low pregnancy rates

following embryo transfer of cryopreserved Jersey embryos compared to the Holstein

breed. Here, we hypothesised that those differences between these two breeds in embryo

cryopreservation are due to specific phenotypic and genotypic characteristics at the embryo

level. Initially, the results of this study showed differences on the phenotype, lipid profile

and genomic differences of Jersey embryo characterized by the higher lipid droplets content

associated with low mitochondrial function which will determine the low success with

cryopreservation. Subsequently, we assessed the phenotype and genotype of embryos using

L-carnitine supplementation in the in vitro embryo culture medium in order to compensate

those characteristics in Jersey embryos. The results of this study revealed moderate

beneficial effects of L-carnitine supplementation in Jersey embryos through low effect of

L-carnitine on mitochondrial activity. To define the impact of mitochondrial function on

the embryo viability during our study, we developed a method to compensate the

mitochondrial dysfunction during early embryo development in bovine model. To do that,

Vitamin K2 supplementation in the in vitro embryo culture medium was applied which

showed a positive effect on the mitochondrial function leading to satisfactory phenotypic

and genotypic changes in the embryos. In conclusion, this study resulted in identification

and characterization of the cattle breeds effects as a critical factor on cryopreservation

performance and embryonic metabolism of the mitochondria. Our results emphasized that

mitochondrial function is an important feature of embryonic development in cattle, which

can provide opportunities to improve embryonic viability.

vii

Table des matières

Résumé .................................................................................................................................. iii

Abstract ................................................................................................................................... v

Table des matières ............................................................................................................... vii

Liste des tableaux ................................................................................................................... xi

Liste des figures .................................................................................................................. xiii

Liste des abréviations ............................................................................................................ xv

Remerciements ..................................................................................................................... xxi

Avant-Propos .................................................................................................................... xxiii

Introduction ............................................................................................................................. 1

CHAPITRE I : MISE EN CONTEXTE ................................................................................. 5

1.1 DÉVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE ................................................................. 5

1.1.1 Folliculogenèse ....................................................................................................... 5

1.1.1.1 L'ovogenèse ........................................................................................................... 7

1.1.1.2 La stéroïdogenèse .................................................................................................. 8

1.1.2 La fécondation et le développement embryonnaire précoce ................................. 12

1.2 LES LIPIDES : REVUE ............................................................................................ 18

1.2.1 Les lipides: Généralités .......................................................................................... 18

1.2.2 Structure, nomenclature et propriétés des acides gras ........................................... 21

1.2.2.1 Les acides gras saturés ........................................................................................ 25

1.2.2.2 Les acides gras insaturés ..................................................................................... 26

1.2.2.2.1 Les acides gras monoinsaturés ......................................................................... 26

1.2.2.2.2 Les acides gras polyinsaturés ........................................................................... 27

1.2.3 La synthèse des acides gras .................................................................................... 28

1.2.4 La β-oxydation ou lipolyse des acides gras ........................................................... 31

1.2.5 Synthèse des triglycérides et des phospholipides................................................... 34

1.2.6 Élongation et désaturation des acides gras à longue chaîne ................................... 35

1.2.7 Accumulation des acides gras dans la cellule ........................................................ 36

1.2.7.1 La membrane plasmique ..................................................................................... 36

1.2.7.2 Les gouttes lipidiques .......................................................................................... 38

1.2.7.3 Contrôle génomique de l‟accumulation des lipides ............................................ 40

1.3 LES MITOCHONDRIES : REVUE .......................................................................... 43

1.3.1 Les mitochondries : Généralités ............................................................................. 43

1.3.2 Structure et morphologie des mitochondries.......................................................... 44

1.3.3 Fonctions principales des mitochondries : Revue .................................................. 49

1.3.3.1 Phosphorylation oxydative .................................................................................. 49

1.3.3.2 L‟apoptose ........................................................................................................... 54

1.3.3.3 L‟homéostasie du calcium .................................................................................. 56

1.3.3.4 Production de DRO ............................................................................................. 58

1.3.4 Distribution et activité des mitochondries dans les ovocytes et les embryons ...... 60

1.3.5 Génome de la mitochondrie ................................................................................... 63

1.3.6 Les mitochondries et la reproduction ..................................................................... 68

1.4 LES LIPIDES DANS LA FONCTION DE LA REPRODUCTION ........................ 71

viii

1.4.1 Les lipides dans l‟alimentation animale ................................................................. 71

1.4.1.1 Effet des lipides dans l‟alimentation sur la fonction ovarienne et les ovocytes .. 72

1.4.1.2 Effet des lipides dans l‟alimentation sur les embryons ....................................... 74

1.4.2 Les acides gras de l‟ovocyte et de l‟embryon : Revue ........................................... 75

1.4.3 Les lipides sur la production in vitro des embryons ............................................... 77

1.4.3.1 Effet de l‟ajout du sérum ou BSA dans la culture des embryons ........................ 78

1.4.3.1.1 Effet de l‟ajout du sérum .................................................................................. 78

1.4.3.1.2 Effet de l‟ajout du BSA .................................................................................... 81

1.4.3.2 Effet de l‟ajout des AG dans la culture des embryons ........................................ 82

1.4.4 Effet des lipides sur l‟efficacité de la cryopréservation ......................................... 83

1.4.4.1 La morphologie des embryons ............................................................................ 84

1.4.4.2 L‟origine des embryons (in vivo ou in vitro) ....................................................... 87

1.4.4.3 Le stade de développement.................................................................................. 90

1.4.4.4 La race ................................................................................................................. 91

1.5 HYPOTHÈSES .......................................................................................................... 94

CHAPITRE II : Phenotypic and genomic differences between early embryos of the Jersey

and Holstein dairy cow breeds. ............................................................................................ 97

2.1 RÉSUMÉ ................................................................................................................... 99

2.2 ABSTRACT ............................................................................................................ 101

2.3 INTRODUCTION ................................................................................................... 103

2.4 MATERIALS AND METHODS ............................................................................ 105

2.6 DISCUSSION .......................................................................................................... 114

2.7 ACKNOWLEDGMENTS ....................................................................................... 119

2.8 REFERENCES ........................................................................................................ 120

2.9 TABLES AND FIGURES ....................................................................................... 124

2.10 SUPPLEMENTAL DATA .................................................................................... 131

CHAPITRE III : Genetic influences cellular responses of bovine embryos to L-carnitine

added to the in vitro production medium. .......................................................................... 133

3.1 RÉSUMÉ ................................................................................................................. 135

3.2 ABSTRACT ............................................................................................................ 137

3.3 INTRODUCTION ................................................................................................... 139


3.5 RESULTS ................................................................................................................ 149

3.6 DISCUSSION .......................................................................................................... 152

3.7 ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................................... 157

3.8 REFERENCES ........................................................................................................ 158

3.9 TABLES AND FIGURES ....................................................................................... 163


CHAPITRE IV: Improvement of bovine in vitro embryo production by vitamin K2

supplementation ................................................................................................................. 173

4.1 RÉSUMÉ ................................................................................................................. 175

4.2 ABSTRACT ............................................................................................................ 177

4.3 INTRODUCTION ................................................................................................... 179


4.5 RESULTS ................................................................................................................ 189

ix

4.6 DISCUSSION .......................................................................................................... 191

4.7 ACKNOWLEDGEMENTS ..................................................................................... 195

4.8 REFERENCES ......................................................................................................... 197

4.9 FIGURES ................................................................................................................. 201


Conclusion .......................................................................................................................... 207

Bibliographie ...................................................................................................................... 213

xi

Liste des tableaux

Tableau 1. Perte des ovocytes pendant la méiose ................................................................... 8 Tableau 2. Classification des lipides ..................................................................................... 20 Tableau 3. Nomenclature des acides gras. ............................................................................ 24 Tableau 4. Critères de classification de la qualité des embryons chez le bovin. .................. 86

Tableau 5. The most significant phosphatidylcholine (PC) and sphingomyelin (SM) ions

identified based on MALDI-MS data obtained from individual bovine oocytes and

embryos ....................................................................................................................... 124 Tableau 6. Genbank accession, primer sequences, annealing temperatures and product size

of candidates used for validation of relative gene expression levels in in vivo bovine

embryos by quantitative RT-PCR . ............................................................................. 131 Tableau 7. The most significant phosphatidylcholine (PC) and sphingomyelin (SM) ions

identified based on MALDI-MS data obtained from individual bovine oocytes and

embryos (in vitro). ...................................................................................................... 163 Tableau 8. Genbank accession, primer sequences, annealing temperatures and product size

of candidates used for validation of relative gene expression levels in in vitro bovine

embryos by quantitative RT-PCR. .............................................................................. 172 Tableau 9. Characteristics of the primers used for gene candidate transcript quantification

.................................................................................................................................... 206

xiii

Liste des figures

Figure 1. La stéroïdogenèse : Biosynthèse des hormones stéroïdes.. ..................................... 9

Figure 2. La stéroïdogenèse et le modèle « 2 cellules, 2 gonadotrophines » ........................ 11

Figure 3. Schéma de la nomenclature des acides gras .......................................................... 22

Figure 4. Fonctions de l‟ACC1 et de l‟ACC2 sur le métabolisme des lipides ..................... 30

Figure 5. Microphoto de l‟association entre la goulette lipidique et la membrane du

reticulum endosplasmique ........................................................................................... 39

Figure 6. Morphologie de la mitochondrie. .......................................................................... 45

Figure 7.Micrographie électroniques qui montre plusieurs formes des mitochondries ........ 46

Figure 8.Phosphorylation oxydative en lien avec les 4 complexes mitochondriaux. ........... 49

Figure 9.Organisation du génome mitochondrial. ................................................................ 65

Figure 10. Morphology of bovine embryos in vivo six days after insemination. ............... 125

Figure 11. Lipid droplet content of Holstein and Jersey morula-stage in vivo embryos .... 126

Figure 12. Confocal microscopic images of Holstein and Jersey in vivo. .......................... 127

Figure 13. Quantitative RT-PCR validation of microarray analysis of genes involved in

lipid metabolism.. ....................................................................................................... 128

Figure 14. MALDI-MS spectra of lipids in Holstein and Jersey in vivo embryos. ............ 129

Figure 15. 3D representation of PCA data for Holstein and Jersey in vivo embryo ........... 130

Figure 16. Phase contrast images of bovine embryos produced in vitro. ........................... 164

Figure 17. Confocal imaging of Holstein and Jersey in vitro embryos . ............................ 165

Figure 18. Lipid droplets in morula-stage bovine embryos produced in vitro ................... 166

Figure 19. Fluorescence intensity of Mitotracker Red (A) in in vitro bovine embryos ..... 167

Figure 20. Validation by quantitative RT-PCR for gene expression levels in Holstein

embryos produced in vitro. ......................................................................................... 168

Figure 21. MALDI spectra of the lipid profiles of bovine embryos produced in vitro ...... 169

Figure 22. Relative abundance of lipid species in bovine embryos produced in vitro. ...... 170

Figure 23. 3D analysis of the lipid composition of bovine embryos produced in vitro. .... 171

Figure 24. Bovine embryos produced in vitro treated with vitamin K2. ............................. 201

Figure 25. Effect of vitamin K2 on bovine embryo development in vitro. ......................... 202

Figure 26. Confocal microscopy images of embryos with vitamin K2 ............................... 203

Figure 27. Validation by quantitative RT-PCR of bovine embryo with vitamin K2. ......... 204

Figure 28. Electron micrographs of embryos in the vitamin-K2-treated group. ................. 205

xv

Liste des abréviations

3β-HSD : Δ5-3β-hydroxystéroïde-deshydrogénases Δ5→ Δ4-isomérases.

ACC : Acétyl-CoA carboxylase

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNmt : Acide désoxyribonucléique mitochondrial

ADP : Adénosine diphosphate

ADRP : Adipose differentiation-related protein

AG : Acides gras

AGE : Activation du génome embryonnaire

AGMI : Acides gras monoinsaturés

AGNE : Acides gras non estérifiés

AGPI : Acides gras polyinsaturés

ALA : Acide linolénique (18:3 n-3)

ARN : Acide ribonucléique

ARNm : Acide ribonucléique messager

ARNr : Acide ribonucléique ribosomique

ARNt : Acide ribonucléique de transfert

ATP : Adenosine triphosphate

CAT : Carnitine-acylcarnitine translocase

cDNA : Acide désoxyribonucléique complémentaire

CoA : Coenzyme A

COC : Complexe cumulus ovocyte

CPT-I : Carnitine-palmitoyl CoA transferase I

CPT-II : Carnitine-palmitoyl CoA transferase II

xvi

DAG : Diacylglycerol

DRO : Dérivés réactifs de l'oxygène

EIM : Espace intermembrenaire de la mitochondrie

FAS : L'acide gras synthase

FADH : Flavine adénine dinucleotide hydrogené

FMN : Flavine mononucleotide

FSH : Hormone folliculostimulante

HMG-CoA : Hydroxy-Méthyl-Glutaryl-CoA

IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemestry

JUT : Jonction utéro-tubaire

LA : Acide linoléique (18 :2 n-6)

LDL : Lipoprotéines de basse densité

LH : Hormone lutéinisante

LPA : Acide lysophosphatidique

GL : Gouttelettes lipidiques

GV : Vésicule germinale

hpi : Heures post-insémination

NADH : Nicotinamide adénine dinucléotide réduit

PHOSOX : Phosphorylation oxydative

P450aro : P450 aromatase

P450scc : P450 Side-Chain Cleavage

P450C17 : P450 17 α-hydroxylase, C17→ 20 lyase

PC : Phospholipids phosphatidylcholine

PE : Phosphatidyléthenolamine

xvii

PI : Phosphatidylinositol

PG : Phosphatidylglycerol

PPM : Perméabilité de la membrane mitochondriale

PRI : Potentiel rédox intracellulaire

PS : Phosphatidylserine

RA : Réaction acrosomique

RE : Réticulum endoplasmique

Smac/DIABLO : Second mitochondria-derived activator of caspace / direct inhibitor of

apoptosis- binding protein with low pI

StAR : Steroidogenic Acute Regulatory Protein

TAG : Triacylglycérol

TCA : Cycle de l'acide citrique

TIP47 : Tail-interacting protein of 47 kilodaltons

ZP : Zone pellucide

xix

A mis padres Luis y Lourdes

xxi

Remerciements

Tout d'abord, je me dois de remercier tout spécialement Claude Robert, mon directeur de

recherche qui m'a offert la chance d'effectuer mes études doctorales. Je suis très

reconnaissant de la confiance qu‟il m‟a donnée et de l‟opportunité de réaliser un projet

scientifique original. Merci pour tout ton support et ton encadrement. Je tiens aussi à

remercier Patrick Blondin pour avoir accepté la co-direction de mon doctorat ainsi que

Christian Vigneault pour leur très grande disponibilité et leurs innombrables conseils au

cours de mes études. Ils m‟ont aidé au nom de L‟Alliance Boviteq qui a supporté mon

projet de recherche via la production d‟embryons in vivo et in vitro spécialement des

embryons Jersey. Aussi, je tiens à remercier Marc-Andrée Sirard pour ses conseils. Un

grand merci à Dominic Gagné, Isabelle Laflamme et Alexandre Bastien pour leurs efforts et

leur aide en biologie moléculaire, production des embryons et microscopie, ainsi que pour

les moments partagés hors du labo. Merci à tous les membres de l‟équipe des étudiants qui

ont partagé plusieurs heures de travail de laboratoire à l‟INAF et au Comtois : Isabelle D,

Isabelle G, Julie Niemman, Angus, Habib, Sara, Éric, Gael, Rémi, Nicolas S., Nicolas G.,

Ernesto, Anne-Laure, Florence, Audrey, Annie, etc. Je tiens aussi à remercier mes amis

péruviens de toute la vie (los amigos de la agraria y los que conoci en Québec) et les amis

français et québécois qui ont été avec moi au cours de mes études.

Quiero agradecer de manera especial a mi familia: mis padres Luis y Lourdes y mi hermano

Alan. Desde siempre me han mostrado su amor y apoyo incondicional, a pesar de las

dificultades y la distancia. Los amo mucho. Finalement, je tiens à remercier Kim, qui a

changé ma vie pendant mon aventure au Québec, pour m'avoir donné de l„inspiration,

confiance, son support inconditionnel pendant ces années.

xxiii

Avant-Propos

Il est important de souligner la participation des différents auteurs dans les chapitres

présentés dans cette thèse. Tout d‟abord, les analyses des échantillons utilisés dans le

chapitre 2 et chapitre 3 ont été réalisées grâce à la collaboration, la gestion et les conseils

techniques de Patrick Blondin et Christian Vigneault. Ils ont participé via L‟Alliance

Boviteq qui nous a fourni les embryons in vivo et in vitro des vaches Holstein et Jersey.

Christina Ramires Ferreira a participé comme conseillère dans l‟interprétation des résultats

de la désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-MS) des lipides. Isabelle

Gilbert et Dominic Gagné ont participé activement à la supervision technique des

expériences en microarray et validation PCR présentées dans les chapitres 2, 3 et 4. Mon

directeur de thèse Claude Robert a conçu l‟étude et il a supervisé la direction des travaux et

la rédaction du manuscrit de tous les chapitres présentés dans cette thèse. Finalement, moi,

Luis Baldoceda, j‟ai effectué la plupart des expériences et rédigé le manuscrit. Les

chapitres 2, 3 et 4 seront soumis sous la forme d‟articlespour publication dans la revue

Reproduction, Fertility and Development.

1

Introduction

La production laitière mondiale des vaches a progressé énormément et de façon

constante au cours des dernières années. Au Canada, la production moyenne des vaches

laitières est de 9,774 kg/année. Celle-ci a augmenté de 25 % au cours des 20 dernières

années. Un facteur fondamental de cette augmentation est la sélection d‟animaux plus

performants. Ainsi, l‟utilisation des races de vaches spécialisées en production laitière est

une étape critique chez les producteurs. Il n‟est donc pas surprenant qu‟il y ait une élévation

du nombre d‟enregistrement des animaux de races chez les producteurs laitiers au Canada

(Statistique Canada 2012). Cependant, la haute sélection génétique des animaux a eu un

impact sur certaines caractéristiques reproductives. En effet, il est connu qu‟il existe une

corrélation inverse entre la haute production du lait et la reproduction (Dobson et al., 2007).

La baisse de la fertilité des vaches de haute qualité génétique a poussé la recherche à

trouver des alternatives de sélection génétique afin de résoudre cette problématique.

L‟utilisation des techniques de reproduction assistée est la plus populaire chez les

producteurs laitiers. Au cours des dernières années, les technologies comme le transfert des

embryons, la production embryonnaire in vitro et la cryopréservation embryonnaire se sont

développées pour améliorer l‟efficacité des programmes de sélection génétique (Bousquet

et al., 2003). La cryopréservation à un intérêt économique et génétique important pour

l‟industrie puisqu‟elle permet une commercialisation plus facile et rapide des embryons de

haute valeur génétique (Guignot, 2005). La recherche a permis de perfectionner les

méthodes de cryopréservation des embryons. Cependant, l‟éfficacité de la cryopréservation

embryonnaire peut être affectée par l‟état du développement, l‟espèce, l‟origine des

embryons in vitro ou in vivo, l‟état de nutrition de la mère, les conditions de culture, etc.

(Hasler, 2001; Massip, 2001; Van Soom et al., 2003; Guignot, 2005; Leroy et al., 2005).

Cependant, l‟impact de la race de vache sur la survie post-cryopréservation est peu

documenté.

2

Steele et Hasler (2004) ont observé que les embryons de la race Jersey ont un faible

taux de gestation après la cryopréservation comparativement aux embryons de la race

Holstein en utilisant le même protocole de congélation. Cette étude a suggéré que les

embryons de la race Jersey ne montrent pas une bonne performance lors de la congélation

en raison de leur haut contenu lipidique comparativement aux autres races. Au Canada, la

race Holstein représente 90 % du cheptel national de la population des vaches laitières

tandis que la race Jersey représente 3 % (Statistique Canada, 2012). En plus, la race Jersey

est économiquement importante dans l‟industrie laitière pour la commercialisation de son

matériel génétique qui lui confère une prédisposition à produire un lait riche en gras et en

protéines en comparaison aux autres races (Statistique Canada, 2012). Beaulieu et

Palmquist (1995) ont suggéré que cette caractéristique est propre à la biochimie cellulaire

ce qui pourrait différer au niveau du métabolisme lipidique.

Bien que la littérature n‟en ait pas fait mention, chez les producteurs laitiers, il est

connu que les embryons Jersey ont une couleur foncée marquée comparativement aux

embryons d‟autres races. Plusieurs études ont démontré que cette caractéristique

morphologique de certaines races bovines est probablement corrélée négativement avec sa

cryorésistance (Visintin et al. 2002; Van Soom et al. 2003; Leroy et al. 2005). En effet, la

couleur foncée des embryons est associée à une accumulation excessive de gouttes

lipidiques, lesquelles peuvent avoir une influence sur la survie post-congélation (Abe et al.,

1999). La principale difficulté lors de la cryopréservation réside dans la concentration du

contenu lipidique des embryons (Abe et al., 1999; Crosier et al., 2001; Abe et al., 2002a;

Rizos et al., 2003). Les conditions de culture (par exemple avec sérum), l‟origine des

embryons et une faible fonction mitochondriale sont des facteurs potentiels qui ont été le

sujet de plusieurs études afin de déterminer l‟origine de l‟accumulation des lipides dans les

embryons (Kruip et al., 1983; Thompson et al., 1995, Abe et al., 1999; Sata et al., 1999;

Stojkovic et al., 2001, Abe et al., 2002a).

3

Cependant, peu d‟information permet de déterminer l‟effet de la race de vache sur

l‟accumulation de lipides des embryons bovins. Ainsi, les raisons pour lesquelles les

embryons Jersey ont une suraccumulation de lipides ne sont pas connues. En répondant à

cette problématique, ce projet cherche à élucider les causes qui diminuent le succès de la

congélation des embryons Jersey avec comme but final, l‟amélioration de la survie après la

cryopréservation.

5

CHAPITRE I : MISE EN CONTEXTE

1.1 DÉVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE

1.1.1 Folliculogenèse

Les ovaires sont les gonades qui font partie de l'appareil reproducteur interne des

femelles. Elles ont plusieurs fonctions, mais la première et la plus importante est la

production des ovocytes. Les ovocytes sont des cellules hautement spécialisées qui ont des

composantes génétiques maternelles, capables de se fusionner avec un spermatozoïde en un

seul noyau et continuer le développement embryonnaire précoce. Le processus de sa

croissance et sa longue différentiation sont dépendants des cellules folliculaires qui

l‟entourent. Ainsi, les processus de folliculogenèse et d‟ovogenèse sont étroitement reliés

(Royère, 2006). La folliculogenèse peut se définir comme la succession des différentes

étapes du développement du follicule depuis le moment où il sort de la réserve, constitué

pendant la vie embryonnaire lors de l‟ovogenèse, jusqu‟à sa rupture lors de l‟ovulation ou à

son involution lors de l‟atrésie (Mermillod et al., 2008). À la fin de la folliculogenèse,

l‟ovocyte doit acquérir sa compétence afin de reprendre sa méiose, être fécondé, se

développer jusqu‟à l‟activation du génome embryonnaire afin de soutenir le développement

jusqu‟au stade de blastocyste et assurer le succès d‟une gestation viable (Sirard et al.,

2006).

Dès le vêlage de la femelle chez les mammifères, les ovaires possèdent des stocks

importants de follicules primordiaux qui sont constitués par des ovocytes primaires

entourés d‟une petite couche de cellules épithéliales et d‟une lame basale (Fair et al., 2003).

Ces ovocytes primaires restent inactifs jusqu‟à ce qu‟ils soient stimulés pour compléter leur

méiose et leur croissance (Erickson, 1966). Le mécanisme par lequel un certain nombre de

follicules primordiaux se développent en follicules primaires, c‟est-à-dire l‟étape suivante

de croissance, est peu connu. Les follicules primaires proviennent de l‟activation des

follicules primordiaux, étape caractérisée par deux phases (Braw-Tal et Yossefi, 1997). La

première phase est caractérisée par la prolifération et la transformation des cellules de la

http://fr.wikipedia.org/wiki/Gonade

http://fr.wikipedia.org/wiki/Appareil_reproducteur

6

granulosa de forme aplatie à forme cuboïde qui ont une grande activité mitotique. Dans la

deuxième phase, l‟augmentation du nombre de cellules de la granulosa est accompagnée

par une augmentation rapide de la taille de l'ovocyte (Braw-Tal et Yossefi, 1997; Fair et al.,

1997).

La progression vers le stade de follicule secondaire se caractérise par l‟apparition

d‟une deuxième couche de cellules de la granulosa (Driancourt, 1991) et par le dépôt initial

de glycoprotéines autour de l‟ovocyte qui feront partie de la zone pellucide (ZP). La

croissance des ovocytes est accompagnée par la formation d'une ZP. Chez les autres

mammifères, la ZP forme un anneau complet autour de l'ovocyte au stade de follicule

primaire. Dans l'ovaire bovin cependant, cela se produit beaucoup plus tard, lorsque le

follicule atteint le stade tardif préantral (Braw-Tal et Yossefi, 1997).

Selon Braw-Tal et Yossefi (1997), les ovocytes commencent leur croissance quand

il y a au moins 40 cellules de la granulosa dans la plus grande section transversale

(quatrième génération de cellules folliculaires). Les granules corticaux sont formés au sein

du cytoplasme de l‟ovocyte (Fair et al., 1997). Les follicules secondaires deviennent

follicules tertiaires (antraux) caractérisés par la prolifération massive et continue de cellules

de la granulosa autour de l‟ovocyte appelées cumulus. Le follicule présente aussi une

prolifération et une différentiation de certaines cellules qui deviendront les cellules de la

thèque interne et externe séparées des cellules de la granulosa par la lame basale. Ce

développement comprend aussi la formation de petites cavités ou la formation d‟une cavité

remplie de fluide (la cavité antrale) (Driancourt, 1991; Fair et al., 1997).

La croissance des follicules et des ovocytes chez les bovins se fait de façon parallèle

jusqu‟à ce que le follicule ait un diamètre de 3 mm (Fair et al., 1995). Ensuite, il a été

observé que les ovocytes pouvaient atteindre un diamètre maximal de 120 à 130 µm, alors

que les follicules pouvaient continuer leur croissance jusqu‟à un diamètre de 15 à 20 mm

avant l‟ovulation (Fair et al., 2003). Ainsi, plusieurs observations ont démontré que les

ovocytes provenant de follicules antraux qui ont un diamètre de 1mm ont un faible signe de

7

reprise de méiose (Blondin et Sirard, 1995; Fair et al., 1995). De cette façon, la littérature a

conclu que la plupart des ovocytes (110 à 130 µm) provenant des follicules >3 mm ont un

certain potentiel de développement important en termes de taux de blastocyste après la

fécondation et la culture in vitro (Blondin et Sirard, 1995, Fair et al., 1995, Fair et al.,

2003).

1.1.1.1 L'ovogenèse

Les ovaires ont un grand stock de cellules germinales primordiales, lesquelles sont les

premières cellules germinales dans l‟ovaire et augmentent en nombre par mitoses.

L‟ovogenèse commence au début du développement fœtal et se termine quelques années

plus tard chez l'adulte sexuellement mature (Picton et al., 1998). Les cellules germinales

primordiales entrent dans les gonades des embryons chez les femelles, elles deviennent

alors des cellules appelées ovogonies. Les ovogonies prolifèrent par mitose, laquelle

comprend une période de synthèse de l‟ADN (Van den Hurk et Zhao, 2005). La prophase

du premier cycle de la mitose des ovocytes chez les bovins se produit entre le 75e et le

80e jour post-conception (Erickson, 1966). La prolifération des ovogonies continue, elles

entrent en méiose puis elles se transforment en ovocytes primaires. Les ovocytes passent

par les phases de leptotène, zygotène et pachytène avant d‟arrêter au stade diplotène (stade

de la prophase méiotique I), lequel se produit au cours de la vie fœtale (Picton et al., 1998 ;

Van den Hurk et Zhao, 2005). Les ovocytes sont plus grands que les ovogonies, car ils ont

plus d‟organites cytoplasmiques (Picton et al., 1998). Le nombre d‟ovogonies atteint un

maximum avant la formation des follicules primaires qui s‟ensuit par une perte de gamètes

importante principalement due à un processus apoptotique qui mène à l‟établissement des

réserves d‟ovocytes dans le cortex ovarien (Tableau 1). Il est accepté que le nombre

d‟ovocytes est fixe dès lors et que la vie reproductive procède par l‟utilisation progressive

de ces réserves jusqu‟à leur épuisement ce qui correspond à la ménopause.

8

Tableau 1. Perte des ovocytes pendant la méiose

Espèce Nombre maximum

d‟ovocytes

Nombre d‟ovocytes

à la naissance

Perte

d‟ovocytes

(%)

Rongeurs 50 000–75 000 10 000–15 000 80

Brebis 900 000 82 000 91

Vaches 2 700 000 135 000 95

Femmes 2 700 000 700 000 90

(Adapté de Van den Hurk et Zhao, 2005)

Les ovocytes peuvent demereur dans cet état de quiescence en prophase I jusqu'à la fin de

la folliculogenèse menant soit à l‟atrésie ou à l‟ovulation suite à la décharge de LH. Le pic

de LH induit l‟ovocyte à reprendre la méiose et ensuite à se soumettre à deux divisions de

réduction pour devenir un ovule haploïde. Au stade antral de la croissance folliculaire, le

noyau des ovocytes est appelé vésicule germinale (GV) (Van den Hurk et Zhao, 2005). Le

« Germinal Vesicle Break Down » (GVBD) est le premier indicateur clair et visible de

reprise de la méiose. Celui-ci est remarqué par une condensation et un alignement des

chromosomes pour une première division méiotique afin d'éliminer la moitié du bagage

chromosomique (2N) par l'expulsion du premier globule polaire lors de la méiose I.

Ensuite, la deuxième division méiotique est initialisée et la méiose est à nouveau stoppée au

stade de métaphase II dans l'attente de la fécondation par le spermatozoïde (1N) (Mattson et

Albertini, 1990).

1.1.1.2 La stéroïdogenèse

La stéroïdogenèse est une voie de biosynthèse longue et complexe qui commence

habituellement avec le cholestérol et finit avec une série de métabolites stéroïdes (Figure 1).

Le cholestérol peut être synthétisé à partir de l‟acétyl CoA par l‟intermédiaire du HMG-

CoA, mais cette capacité est limitée.

9

Figure 1. La stéroïdogenèse : Biosynthèse des hormones stéroïdes. Abréviations cyt

P450scc : cytochrome P450scc clivage de la latéral du cholestérol, P450aro : P450 aromatase ; 3β-

HSD : Δ5-3β-hydroxystéroïde-deshydrogénases Δ5→4Δ isomérases, 17β-HOR : 17β-

hydroxystéroïde oxydo-réductases. Les flèches en bleu indiquent les réactions catalysées

par 3β-HSD et la flèche en jaune indique la réaction catalysée par 17β-HOR. Le cholestérol

peut aussi provenir du sang, transporté par les LDL où il est incorporé avec les vésicules

lipidiques et est stocké sous forme estérifiée (Robel, 2001).

10

Les hormones trophiques activent une chaîne de réactions qui conduisent à l'hydrolyse des

esters de cholestérol en cholestérol libre et le transport du cholestérol vers les

mitochondries où il est converti en prégnénolone par le cytochrome P450scc (Hanukoglu,

1992). La prégnénolone sort de la mitochondrie et pénètre le réticulum endoplasmique (RE)

où elle est ensuite convertie en progestérone par les Δ5-3β-hydroxystéroïde-

deshydrogénases Δ5→4Δ isomérases (3β-HSD). La coupure de la chaîne latérale de la

prégnénolone et de la progestérone est assurée par le cytochrome P-450C17 (17 α-

hydroxylase, C17→ 20 lyase). Le cytochrome P450aro (aromatase) assure la conversion

des androgènes en estrogènes. Enfin, les 17β-hydroxystéroïde oxydo-réductases (17β-

HOR) assurent l‟interconversion de stéroides 17-cétoniques et de leurs homologues 17 β-

hydroxylés (Robel, 2001).

Une des fonctions principales des cellules de la granulosa et de la thèque est la production

de l‟œstradiol pour la régulation du cycle œstral. Ainsi, la croissance folliculaire et la

stéroïdogenèse sont dépendantes de l‟action coordonnée de la FSH et de la LH dans les

follicules pré-ovulatoires (Figure 2). Ces hormones ne jouent pas seulement un rôle dans la

production d‟hormones stéroïdes sexuelles, elles jouent aussi un rôle essentiel dans la

régulation de la stéroïdogenèse des hormones (Soumano et al., 1996; Soumano et Price,

1997). Les récepteurs des hormones gonadotropes sont couplés à l‟adénylate cyclase

produit par l‟AMP cyclique, qui représente leur second messager et dont l‟action se

distingue en effets rapides et en effets lents sur la stimulation de la stéroïdogenèse (Hillier

et al., 1994 ). L‟effet rapide de l‟action de la LH provoque une mobilisation du cholestérol

à partir des gouttelettes lipidiques (GL) vers le cytochrome P450SCC lequel stimule la

sécrétion de la prégnénolone (Hillier et al., 1994, Robel, 2001). Les effets lents sont une

conséquence de la stimulation de la transcription des gènes des enzymes stéroïdogènes

(Robel, 2001).

11

Les cellules de la granulosa ont des récepteurs à la FSH et les cellules de la thèque ont des

récepteurs à la LH au début du développement folliculaire (Fortune, 1986; Soumano et

Price, 1997). Les cellules de la thèque sécrètent des androgènes sous la forme

d‟androstènediones qui sont stimulés par la LH et non par la FSH (Fortune, 1986). Les

cellules de la thèque du follicule dominant possèdent une grande quantité d'ARNm de

StAR, ce qui lui assure une bonne entrée de cholestérol dans les mitochondries pour le

transformer en androstènedione (Soumano et Price, 1997; Bao et Garverick).

Figure 2. La stéroïdogenèse et le modèle « 2 cellules, 2 gonadotrophines ». Abréviations AMPc :

Adénosine monophosphate cyclique, Chol : cholestérol, P : progestérone, T : testostérone, et E2 :

œstradiol.

La liaison de la LH à son récepteur sur les cellules thécales stimule l'activité du

cytochrome P450c17 nécessaire pour la conversion de la progestine en androstènedione

(Bao et Garverick, 1998). Dans une période de 12 à 24 heures après le début de la lutéolyse,

la capacité des cellules de la thèque est grandement améliorée pour répondre à la LH et à la

production de l'androstènedione (Fortune et Quirk, 1988). Cette capacité est augmentée par

le précurseur de la progestérone fourni par les cellules de la granulosa sous la forme de la

prégnénolone (Fortune et Quirk, 1988). Les cellules de la granulosa apparaissent incapables

de synthétiser des androgènes, mais elles peuvent convertir des androgènes exogènes en

estradiol, ce qui implique in vivo qu‟elles utilisent des androgènes thécales pour synthétiser

12

l‟estradiol. Les deux types de cellules (granulosa et thèque) sont présumés avoir la P450scc

nécessaire pour la conversion de cholestérol en progestagènes lesquels sont précurseurs de

la synthèse de l‟androstènedione dans les cellules de la thèque (Fortune, 1986). Cependant,

les cellules de la granulosa ne produisent pas les androgènes même en présence de

précurseurs de la progestérone (Bao et Garverick, 1998). De cette façon, l'androstènedione

est importé dans les cellules de la granulosa où il est transformé en estradiol par le

cytochrome P450aro (Bao et Garverick, 1998). La capacité des cellules de la granulosa

pour aromatiser les androgènes en estradiol augmente pendant 48 heures après le début de

la lutéolyse, mais la plus forte augmentation se situe entre 12 et 24 heures après le début de

la lutéolyse (Fortune et Quirk, 1988) (Figure 2).

1.1.2 La fécondation et le développement embryonnaire précoce

Lorsque l'ovocyte est retiré de son follicule, dans certains cas, il a la possibilité de

reprendre la méiose spontanément. La fusion d‟un spermatozoïde et d‟un ovule entraîne

l'expulsion du 2e

globule polaire, ainsi que la formation du zygote qui possède le contenu

génétique de ces deux cellules germinales et qui est capable de se développer en un

embryon viable.

Après l‟ovulation, le complexe cumulus-ovocyte (COC) mature est capté par les cils de

l‟infundibulum de l‟oviducte où il est déplacé pour la fécondation (Talbot et al., 2003).

L'adhésion entre la matrice de cellules du cumulus et les cils est essentielle pour déplacer le

COC sur la surface de l'infundibulum (Talbot et al., 2003 ; Kölle et al., 2009). Cependant,

Kölle et al. (2009) ont observé que l‟adhésion du COC à l'épithélium de l‟oviducte est

dépendante de la maturation. Ils ont démontré l‟importance des cellules du cumulus, car le

COC qui est immature ou dénudé n‟est pas attaché à l‟épithélium de l‟oviducte. Cela

démontre que l‟oviducte est un lieu de sélection pour les ovocytes capables d‟être fécondés

(Talbot et al., 2003). Une fois que le COC entre dans l‟ampoule, il est rapidement attaché à

13

l‟épithélium de l‟oviducte qui sera le lieu de la fécondation (Talbot et al., 2003; Kölle et

al., 2009).

Les gamètes mâles sont déposés dans le tractus vaginal où ils sont aussi déplacés jusqu‟au

lieu de la fécondation (Talbot et al., 2003). Des milliers de spermatozoïdes atteignent

l‟utérus après l‟éjaculation, mais seulement des milliers atteignent l'isthme de l'oviducte

pour la fécondation (Van Soom et de Kruif., 1998). La transformation des spermatozoïdes

qui permet d‟acquérir leur pouvoir fécondant est défini comme la capacitation. Ceci est un

effet combiné de plusieurs modifications moléculaires des protéines de la membrane

plasmique des spermatozoïdes (glycoprotéines) et des composants lipidiques qui modifient

les canaux ioniques dans la membrane plasmique des spermatozoïdes (Abou-Haila et

Tulsiani, 2000).

Chez les mammifères, il y a deux barrières anatomiques de l‟utérus pour la sélection des

spermatozoïdes mobiles et vigoureux. Le cervix est la première grande barrière qui sert à la

sélection du sperme, car seuls les spermatozoïdes mobiles peuvent passer dans le mucus

cervical fortement hydraté (Kölle et al., 2010). Chez la vache, le transport des

spermatozoïdes dans l'utérus est soutenu par les vagues de contractions des muscles lisses

utérins, cette activité contractile est forte pendant l'œstrus, alors que pendant la phase

lutéale, les contractions sont faibles et localisées (Talbot et al., 2003).

Le deuxième obstacle anatomique est la jonction utéro-tubaire (JUT). Chez la plupart des

mammifères, la lumière est particulièrement tortueuse et étroite et peut devenir encore plus

petite en raison d‟un fort repli muqueux et/ou vasculaire du plexus et des ligaments qui

compriment la lumière (Hawk, 1983). De plus, le passage des spermatozoïdes est empêché

par le mucus qui rempli le lumen étroit ou le JUT ce qui explique pourquoi seulement

quelques milliers de spermatozoïdes atteignent l'isthme (Kölle et al., 2010).

La fécondation comprend une série d'événements qui ont comme résultat la fusion des

gamètes mâles et femelles. Kölle et al. (2009) ont observé que les COC ont perdu une

grande part des cellules du cumulus après l‟ovulation lors de leur déplacement jusqu‟à

14

l'isthme de l'oviducte. Ainsi, le spermatozoïde peut être en contact avec les cellules du

cumulus restant et avec la surface de la ZP de l‟ovocyte (Talbot et al. 2003 ; Kölle et al.,

2009). De cette façon, les cellules du cumulus peuvent agir comme un filtre physiologique

puisque le sperme qui a déjà terminé la réaction acrosomique (RA) est piégé à son bord

externe (Florman et al., 1999). Il est suggéré que le sperme subisse la RA à la marge

extérieure du cumulus oophorus. En effet, des observations indiquent que les cellules du

cumulus sont intégrées au sein d'un acide hyaluronique riche et extracellulaire de la

matrice, présentant ainsi une barrière physique aux spermatozoïdes (Florman et al., 1999).

Le sperme a ainsi une activité hyaluronidase qui est libérée à la suite de la RA (Florman et

al., 1999; Talbot et al., 2003).

La RA implique une série d‟événements cellulaires : fusion entre la membrane plasmatique

et la membrane acrosomique externe, dispersion de la matrice acrosomale et exposition de

la membrane externe laquelle est une membrane de surface (Hyttel et al., 1989). Un certain

nombre d'inducteurs physiologiques et non physiologiques peuvent réguler la RA. Il s'agit

notamment de la progestérone, du liquide folliculaire et des sécrétions des cellules du

cumulus contenant des prostaglandines, des sulfates de stérol, des glycosaminoglycanes et

des néoglycoprotéines (Abou-Haila et Tulsiani, 2000).

Toutefois, l‟interaction avec la ZP (la couche extracellulaire de l'ovule) est aussi vitale pour

déclencher la RA (Abou-Haila et Tulsiani, 2000, Sinowatz et al., 2001). L'interaction entre

les gamètes lors de la fécondation est au moins en partie régulée par des groupements

glucidiques de la ZP et par des glycoprotéines de liaison de la surface des spermatozoïdes

(Sinowatz et al., 2001). La plupart des mammifères ont une ZP composée de trois à quatre

glycoprotéines, appelées ZP1, ZP2, ZP3 et ZP4 (Sinowatz et al., 2001). Florman et al.

(1999) et Abou-Haila et Tulsani (2000) ont suggéré que ZP3 est le composant critique pour

l‟interaction des gamètes et participe à la capacitation des spermatozoïdes. Abou-Haila et

Tulsani (2000) ont décrit que ZP3 peut fusionner la membrane plasmique des

spermatozoïdes et la membrane externe de l‟acrosome dans plusieurs sites de la région

antérieure de la tête du spermatozoïde. Florman et al. (1999) ont décrit aussi que ZP3

15

présente plusieurs caractéristiques d'adhésion avec le spermatozoïde. L‟ovocyte peut ainsi

se lier aux spermatozoïdes de façon intégrale et inhiber l'adhérence des autres gamètes

compétitifs. Un autre changement important que déclenche la RA est une augmentation du

pH intracellulaire du spermatozoïde. Cette hausse est régulée entre autres par les canaux

ioniques de Ca2+

sur la membrane plasmique des spermatozoïdes et de la membrane externe

acrosome (Abou-Haila et Tulsiani, 2000).

La recherche scientifique a bien documenté les événements de la fécondation en conditions

de culture in vitro chez les bovins. Saeki et al. (1991) ont observé que la première évidence

de pénétration des spermatozoïdes dans les ovocytes a été observée à 3 hpf mais le taux de

pénétration s‟accroît jusqu'à 5 hpf avec un taux maximum (92 %). En plus, ils ont aussi

déterminé que la formation pronucléaire a été observée à 9 hpf (Saeki et al., 1991). Dans

une autre étude, Van Soom et al. (1992) ont déterminé que la formation d'embryons au

stade pronucléaire se produit entre 18 à 20 hpf. Cette différence de temps dans la formation

pronucléaire observée dans les deux études précédentes peut être expliquée parce que les

embryons bovins produits in vitro peuvent varier considérablement leur rythme de

développement à cause des différentes conditions de culture (Van Soom et al., 1992).

Le premier cycle cellulaire inclue quatre phases, soit les phases G1, S, G2 et M. Il s‟agit du

stade de formation des pronoyaux jusqu‟à la première division de segmentation séparant le

zygote en deux blastomères (Barnes etEyestone, 1990; Van Soom et al., 1992). Le premier

clivage du zygote bovin peut se produire entre 23 à 31 hpi en conditions in vivo (Barnes

etEyestone, 1990) tandis qu‟en conditions in vitro entre 29 à 32 hpf (Holm et al., 1998;

Lequarre et al., 2005). Au cours de son séjour dans l‟oviducte (24 à 48 hpi), les embryons

précoces modifient leur vascularisation de l‟oviducte et induisent la formation de cellules

sécrétrices, assurant un microenvironnement optimal et la nutrition pendant les premiers

jours de vie (Kölle et al., 2009). Le deuxième et troisième cycle cellulaire sont

considérablement plus courts que le premier avec une durée globale de 9 heures et de 11

heures respectivement (Holm et al., 1998). Les embryons de 2 à 4 cellules ont été observés

entre 36 et 50 hpi en conditions in vivo et entre 36 et 45 hpf en conditions in vitro (Barnes

16

etEyestone, 1990; Van Soom et al., 1992 ; Holm et al., 1998). La transcription du génome

embryonnaire commence lors du troisième cycle cellulaire lorsque les premiers ARN ont

été transcrits et la formation moléculaire de nucléoles fonctionnelle est établie au cours du

quatrième cycle cellulaire (Barnes Eyestone, 1990; Viuff et al., 1998).

Le début du quatrième cycle cellulaire a été observé de 38 à 39 hpf, mais la plupart des

embryons à 8 cellules étaient présents de 58 à 86 hpf (Holm et al. 1998). La durée du

quatrième cycle cellulaire était de 38,6 à 48,6 heures, avec une moyenne de 43 heures, ce

qui est particulièrement long comparativement aux cycles précédents (Holm et al., 2002;

Lequarre et al., 2003). C‟est durant le quatrième cycle cellulaire, c‟est-à-dire lors du

passage de 8 à 16 cellules, que l‟embryon bovin acquiert la capacité de transcrire son

propre génome. Cette étape se nomme l‟«activation du génome embryonnaire» ou

Embryonic Genome Activation (EGA) et constitue l‟œuvre centrale d‟un phénomène plus

général appelé « transition maternelle embryonnaire » ou Maternal to Embryonic Transition

(MET) (Holm et al., 1998; Memili et al. 1998). Durant cette transition, les premiers

blastomères subissent des modifications substantielles dans le but de favoriser la

transcription. Cependant, plus de 60 % des embryons produits in vitro ne passent pas le

stade de la MET (Blondin et al., 1997). Cela est confirmé par Holm et al. (1998) qui ont

observé que les blastomères de l'embryon à 8 cellules ont subi un arrêt prononcé du

développement ou «lag-phase».

Les embryons complètent le cinquième cycle cellulaire à environ 102 à 106 hpi (Van

Soom et al., 1992; Holm et al. 1998). Le nombre d‟embryons augmente très lentement à

partir de ce moment en raison des cycles cellulaires longs qui se produisent lorsqu‟il y a

entre 8 et 16 cellules (Van Soom et al., 1992).

Au cours du stade de 16 à 32 cellules chez les bovins, l‟embryon est appelé morula.

L‟émergence des premières morulas est observée à 116,4 hpi (Holm et al. 1998).

Cependant, l'apparition de morulas bien compactées a été observée entre 126 et 162 hpi

avec un nombre moyen de cellules variant entre 30,9 et 45,8 cellules (Van Soom et al.,

17

1992). La formation d‟un jeune blastocyste est caractérisée par l‟apparition d‟une cavité

remplie de liquide appelée blastocèle. Il montre aussi une différenciation interne visible

entre le trophoblaste et la masse cellulaire interne (Linder et Wright, 1983 ; Holm et al.

1998). Le diamètre des blastocystes précoces est d‟environ 160 µm cerné d‟une ZP avec

une épaisseur moyenne de 12 µm, laquelle donne un diamètre extérieur total entre 160 et

180 µm. Le jeune blastocyste est constitué d‟environ 100 cellules (Betteridge et Fléchon,

1998).

Les premières cavités du blastocèle sont observées entre 120 à 122 hpi, mais l‟intervalle

correspondant entre l‟insémination et la formation du blastocèle est en moyenne de 145

heures (Holm et al. 1998). La différenciation marquée de la couche de trophoblaste externe

et la masse cellulaire plus foncée et compacte est évidente chez les blastocystes. Le

diamètre global de l'embryon augmente considérablement entre 200 à 220 µm (Holm et al.,

2002), avec un amincissement simultané de la ZP à environ 1/3 de son épaisseur initiale au

stade de blastocyste expansé (Linder et Wright, 1981). Le nombre de cellules en moyenne

est de 160 au cours de cette étape (Betteridge et Fléchon, 1998). La durée moyenne entre la

formation du blastocèle et l'expansion permanente de la ZP est de 21,6 heures (Holm et al.,

1998). Les blastocystes en éclosion présentent un contenu embryonnaire qui se déverse

complètement ou en partie à l‟extérieur de la ZP et présente une forme sphérique et un

blastocèle bien défini ou effondré (Linder et Wright, 1983). L‟éclosion du blastocyste a été

observée à partir de 174 hpi ou 7 jours post-insémination (Holm et al., 1998).

18

1.2 LES LIPIDES : REVUE

1.2.1 Les lipides: Généralités

Les lipides ont été définis par Christie (1982) comme une variété de substances qui sont de

nature biologique et qui ont une solubilité dans les solvants organiques comme par exemple

le diéthyl éther, l‟hexane, le benzène, le chloroforme ou le méthanol (Christie, 1982). La

littérature scientifique a établi des définitions plus précises des lipides lorsque ceux-ci sont

considérés avec une perspective structurelle et de biosynthèse. De cette façon, beaucoup de

schémas de classification différents ont été utilisés au fil des années. Par exemple, Fahy et

al. (2005) ont défini les lipides comme des substances hydrophobes ou des petites

molécules amphipathiques qui proviennent toutes ou en partie de la condensation de la base

carbanion des thioesters et/ou par la condensation de la base ion carbonium des unités

isoprènes.

Christie (1982) a décrit que les lipides ont été subdivisés en deux grands groupes : les

lipides «simples» qui produisent au moins deux types de produits par hydrolyse (par

exemple, les acides gras, les stérols et les acylglycérols) et les lipides «complexes» qui

produisent trois produits ou plus par hydrolyse (par exemple, les glycérophospholipides et

les glycosphingolipides). Cependant, Fahy et al. (2005) ont déterminé une classification des

lipides, incluant la plupart des noms, en 8 catégories qui sont bien acceptées dans la

littérature (Tableau 2). Les catégories sont : les acides gras, les glycérolipides (les

triglycérides), les glycérophospholipides, les sphingolipides, les stérols et les prénols.

Les acides gras (AG) représentent le bloc de lipides majeurs de la construction des

lipides complexes et est donc la catégorie fondamentale de lipides biologiques. Ils

forment un groupe diversifié de molécules se caractérisant par une série répétitive

de groupes méthylènes qui leurs confèrent un caractère hydrophobe (Fahy et al.,

2005).

19

Les triglycérides sont omniprésents dans la nature et sont des éléments constituants

de la membrane des cellules. Les triglycérides contiennent essentiellement du

glycérol combiné avec trois acides gras. Les plus connus sont les esters gras de

glycérol (acylglycérols) qui comprennent les tri-, diet mono-acylglycérols. Dans la

nutrition, les triglycérides constituent la majorité des lipides dans les huiles de

graines et de graisse de stockage dans les tissus animaux (Ratnayake et Galli, 2009).

Les glycérophospholipides sont des constituants des membranes cellulaires dans les

aliments et dans les huiles extraites. Ils sont constitués d'un glycérol en union avec

deux acides gras et un groupement phosphate relié à un alcool (Ratnayake et Galli,

2009).

Les sphingolipides sont une famille complexe de composés qui partagent une

caractéristique structurale commune : ils ont une base sphingoïde qui est convertie

en céramides, phosphosphingolipides, glycosphingolipides et autres types de

molécules. Les céramides sont une sous-classe importante de produits dérivés de la

base sphingoïde avec un alcool aminé et un acide gras lié (Ratnayake et Galli,

2009).

Les stérols sont une classe de lipides qui contiennent un noyau stéroïde commun,

une structure de fusion de quatre anneaux avec une chaîne latérale d'hydrocarbures

et un groupe alcool. Le plus important est le cholestérol car il est précurseur de

nombreux composés et aussi un constituant important des membranes plasmiques

(Fahy et al., 2005).

Le terme «saccharolipide» est utilisé pour décrire les composés dont les acides gras

sont directement liés à un glucide formant ainsi des structures qui sont compatibles

avec la double couche membranaire (Fahy et al., 2005).

20

Les prénols sont les lipides qui sont formés à partir des précurseurs de 5 carbones.

Les caroténides, vitamines E et K et les ubiquinones, sont des exemples de cette

classe de lipide (Ratnayake et Galli, 2009).

Les polycétydes sont synthétisés par la polymérisation de sous-unités acétyle et

propionyle. Ils comprennent un très grand nombre de métabolites secondaires et des

produits naturels d'origine animale et végétale, des sources bactériennes, fongiques

et marines, et une grande diversité structurale (Fahy et al., 2005).

Tableau 2. Classification des lipides (Adapté de Fahy et al, 2005)

Groupe Exemple

Acides gras et dérivés acides oléiques

Triglycérides mono-, diet tri-glycérides

Glycérophospholipides acides phosphatidylcholines

Sphingolipides céramides, phophosphingolipides

Stérols cholestérol, stéroïdes, vitamine D

Saccharolipides UDP-3-0-(3-hydroxy-tetradecanoyl)-

N-acetylglucosamine

Prénols isoprénoïdes, quinones (vitamine E)

Polycétides aflatoxines B1

21

Moran et al. (2012) ont décrit que les lipides ont plusieurs fonctions biologiques à cause de

leurs diverses structures. Par exemple :

La base structurale de toutes les membranes biologiques est la double couche

lipidique qui inclut les lipides amphipathiques (glycérophospholipides et

sphingolipides) et parfois le cholestérol.

Dans certains organismes, les triglycérides ont une fonction de stockage de

molécules pour l‟énergie métabolique.

Les gras aussi fournissent une isolation thermique chez les animaux.

Les cires dans la paroi cellulaire, les exosquelettes, et la peau peuvent protéger les

surfaces de certains organismes.

Certains lipides ont des fonctions très spécialisées. Par exemple, les hormones

stéroïdes régulent et intègrent une série d‟activités métaboliques chez les animaux.

Les eicosanoïdes participent à la régulation de la pression artérielle, de la

température du corps, de l‟inflamation et à la contraction du muscle lisse chez les

animaux.

1.2.2 Structure, nomenclature et propriétés des acides gras

Les acides gras (AG) sont constitués d‟un groupe (-COOH) et d‟une queue aliphatique

linéaire comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à quatre et généralement pair

avec une extrémité méthyle (-CH3) (Figure 3) (Ratnayake et Galli, 2009). La concentration

des AG « libres » dans les cellules est basse, car en haute concentration, elles peuvent

désorganiser la membrane en raison du caractère « acide » du groupe carboxyle (Moran et

al., 2012).

22

Nombre d'atomes de carbone 18 : 3 n-3 Position de la lre

double liaison

Nombre de doubles liaisons

Figure 3. Schéma de la nomenclature des acides gras (ex : l'acide a-linolénique).

Selon Moran et al. (2012), les AG peuvent être différents les uns des autres au niveau de :

La longueur de leur queue d‟hydrocarbures ou leur nombre d‟atomes de carbone : le

nombre d‟atomes de carbone dans la plupart des AG sont au nombre de 4 à 24 et

sont presque toujours en nombre pair dès qu‟ils sont synthétisés par addition

successive de deux unités de carbone. Les AG qui ont entre 4 à 10 carbones sont

connus comme des AG à courte chaîne, entre 12 à 14 carbones, ce sont des AG à

moyenne chaîne et finalement, les AG de 16 carbones et plus sont appelés AG à

longue chaîne.

Le nombre de doubles liaisons carbone-carbone : les AG sans aucune double liaison

sont appelé saturés, tandis que les AG qui ont au moins une double liaison sont

appelés insaturés et ceux qui ont plusieurs doubles liaisons sont appelés

polyinsaturés.

La position des doubles liaisons dans la chaîne, connue aussi comme isomérie de

position : il s‟agit des doubles liaisons localisées dans des positions différentes dans

la chaîne de carbone. La position des doubles liaisons est indiquée par le symbole

Δn dans la nomenclature IUPAC, où n indique la position de l‟insaturation

numérotée à partir du premier atome de carbone dans le groupe carboxylique (-

COOH).

23

La configuration des doubles liaisons : dans les AG insaturés, la configuration peut

être cis ou trans. La configuration des AG dans la nature est usuellement cis,

laquelle est caractérisée par la position des deux atomes d‟hydrogène du même côté

du plan de la liaison. La configuration trans est caractérisée par les deux atomes

d‟hydrogène situés dans l‟autre plan de la liaison.

Dans la nomenclature IUPAC, le carbone carboxyle est marqué comme le C-1 et les

suivants sont numérotés de façon séquentielle. Dans la nomenclature commune, les lettres

grecques sont utilisées pour identifier les atomes de carbone. Le carbone voisin du carbone

carboxyle (C-2 dans la nomenclature IUPAC) est désigné α, et les autres carbones sont

lettrés β, γ, δ, ε, et ainsi de suite. La lettre grecque ω est spécifique pour l‟atome de carbone

le plus éloigné depuis le groupe carboxyle, quelle que soit la longueur de la queue

hydrocarbonée (Moran et al., 2012).

Les AG sont solubles dans les solvants organiques en raison de leur caractère hydrophobe.

L‟hydrophobie des AG a une corrélation avec la longueur de leur chaîne carbonée.

Cependant, cette hydrophobie est considérablement influencée par le pH et s‟explique aussi

par la tendance des AG à s‟associer entre eux pour former une monocouche ou des

micelles. L‟évidence des lipides dans la formation de micelles dans une solution aqueuse

est le changement rapide de ses propriétés physiques sur une échelle de concentration (Gurr

et al., 2002).

24

Tableau 3. Nomenclature des acides gras (Adapté de Gurr et al., 2002).

Nom systématique Nom commun Abréviation Point de fusion

(°C)

Acides gras saturés

Éthanoïque Acétique 2:0 16.7

Butanoïque Butyrique 4:0 -7.9

Dodécanoïque Laurique 12:0 42.2

Hexadécanoïque Palmitique 16:0 60.7

Eicosanoïque Arachidique 20:0 75.4

Docosanoïque Béhénique 22:0 24

Acides gras monoinsaturés

9-hexadecenoïque Palmitoléique 16:1 n-7 1

9-octadecenoïque Oléique 18:1 n-9 16

9-docosénoique Érucique 22:1 n-9 24

Acides gras polyinsaturés

9-,12- octadécadiénoïque Linoléique 18:2 ω-6 -5

9,12,15-octadecatrienoïque Linolénique C18:3 ω-3 -11

5,8,11,14-eicosatétraènoïque Arachidonique C20:4 ω-6 -49.5

25

Les AG sont généralement liquides (AG insaturés) ou solides (AG saturés) à température

ambiante (22°C). Le passage d‟un stade à l‟autre se produit à une température connue

comme le point de fusion lequel peut diminuer avec le degré d‟insaturation en

configuration cis et augmenter selon la longueur de la chaîne carbonée (Moran et al., 2012).

De façon intéressante, le point de fusion des acides gras dépend du nombre de carbone dans

la chaîne carbonée, soit pair ou impair. Les acides gras saturés sont très stables, mais les

acides gras insaturés sont sensibles à l‟oxydation. Ainsi, les acides gras insaturés doivent

être traités dans une atmosphère de gaz inertes et gardés loin des agents oxydants ou des

substances provoquant des radicaux libres (Gurr et al., 2002).

1.2.2.1 Les acides gras saturés

La plupart des acides gras saturés ont une chaîne linéaire avec un nombre pair d‟atomes de

carbone (Tableau 3). Les acides gras saturés communs ont une longueur de chaîne carbonée

comprenant de 14 à 20 atomes de carbone, bien qu‟il soit possible de retrouver dans la

nature des chaînes homologues, paires ou impaires, avec 2 à 30 atomes de carbone ou plus

(Christie, 1982). La formule chimique générale des acides gras saturés est la suivante :

CH3 - (CH2)n – COOH

De façon générale, les acides gras n‟existent pas comme acides carboxyliques libres en

raison de leur affinité avec plusieurs protéines. En fait, quand les acides gras libres sont les

constituants majeurs des tissus, cela est dû à des dommages cellulaires qui permettent aux

lipases de décomposer les lipides acylés endogènes. Des exceptions à cette règle sont les

acides liés à l‟albumine du sang des mammifères. Les acides gras libres sont connus

comme AGL, mais ils sont préférablement désignés avec le terme AGNE (acides gras non

estérifies) (Gurr et al., 2002).

26

Les AG qui ont entre 4 et 12 atomes de carbone sont trouvés principalement dans le gras du

lait, mais les AG avec 10 et 12 atomes de carbone sont aussi trouvés dans certaines huiles

de graines. Les AG saturés qui sont très abondants dans la nature sont :

L‟acide myristique (C14) est un composant mineur de la plupart des acides d‟origine

animale, mais est un composant majeur dans les huiles de graines de la famille

myristicaceae.

L‟acide palmitique (C16) est probablement l‟acide saturé le plus commun et le plus

retrouvé dans les gras d‟origine animal et végétal ainsi que dans les huiles.

L‟acide stéarique (C18) est aussi relativement commun et peut occasionnellement

être plus abondant que l‟acide palmitique, spécialement dans les lipides complexes

(Christie, 1982).

1.2.2.2 Les acides gras insaturés

1.2.2.2.1 Les acides gras monoinsaturés

Les acides gras monoinsaturés (AGMI) avec une chaîne droite entre 10 et 30 atomes de

carbone qui contiennent une double liaison en configuration cis ont été retrouvés dans des

sources naturelles (Christie, 1982). La formule chimique générale des acides gras

monoinsaturés est la suivante :

CH3 - (CH2)n - CH = CH - (CH2)m – COOH

Les AGMI d'une longueur de chaîne donnée peuvent avoir la double liaison dans une

certaine position et configuration différente. De cette façon, le système de numérotation le

plus utilisé considère le groupe carboxyle comme le premier carbone. Cette description est

complète parce que n'importe où sur la chaîne, la position et la configuration de la double

liaison ne sont pas spécifiées. Par ailleurs, dans la nomenclature commune, l‟acide est

désigné 18:1 ou 18:1(9), de manière à montrer la position de la double liaison sur le

27

carbone 9. En plus, la position de la double liaison peut être indiquée de la manière

suivante (n-x) où : n est la longueur de l‟acide et x le nombre d‟atomes de carbone depuis la

dernière double liaison jusqu‟au groupe terminal méthyle (Christie, 1982).

Selon Christie (1982) les AGMI les plus abondants dans les tissus animaux et végétaux

sont:

• L‟acide oléique (C18:1 n-9) qui est probablement l‟AG le plus abondant et retrouvé

dans tous les lipides d‟origine végétale et animale.

• L‟acide palmitoléique (C16:1 n-7) qui est aussi retrouvé dans les gras d‟origine

animal et végétal. Cependant, il est aussi présent en faible quantité dans les huiles

de poisson et quelques graines.

• L'acide docosénoïque (C22 : 1 n-9).

1.2.2.2.2 Les acides gras polyinsaturés

Tous les acides gras polyinsaturés (AGPI) sont dérivés des AGMI, la position de la double

liaison étant une fonction du système biochimique. Ainsi, les mammifères ont des

désaturases qui sont capables d'éliminer les atomes d‟hydrogènes uniquement à partir des

atomes de carbone entre une liaison double existante et le groupe carboxyle (Gurr et al.,

2002). Les AGPI ont tous des doubles liaisons cis ou plus, ont la même structure terminale

et sont presque invariablement séparés les uns des autres par un groupement méthylène

(Christie, 1982 et Gurr et al., 2002). Les AGPI avec plus d‟un groupe méthylène entre les

doubles liaisons ont été trouvés chez quelques bactéries, plantes et organismes marins, mais

rarement chez les animaux, bien que les AGPI avec un nombre pair d‟atomes de carbone

aient été trouvés chez la plupart des huiles de poisson. Les AGPI ont un point de fusion très

bas et ils ont une grande sensibilité à l‟oxydation (Christie, 1982).

28

Les AGPI des familles (n-6) et (n-3) sont appelés acides gras essentiels, car ils ne peuvent

pas être biosynthétisés par les animaux. Ils sont plutôt obtenus à partir de sources végétales

dans l'alimentation. Le AGPI oméga-3 (n-3) et les oméga-6 (n-6) dérivent de l‟acide

linolénique (18:3 n-3, ALA) et de l‟acide linoléique (18:2 n-6, LA) respectivement. L‟acide

linolénique (ALA) est un des composants majeurs des lipides des plantes, spécialement

dans les tissus participant à la photosynthèse, mais se retrouvent peu souvent dans les gras

provenant d‟animaux. L‟ALA est extrêmement important comme précurseur primaire d'une

autre famille importante des AGPI. Les AGPI des groupes (n-3) sont essentiellement les

AG dans les poissons, mais leur rôle chez les mammifères est encore matière à discussion.

L‟acide linoléique (LA) est l‟AG le plus commun et le plus simple retrouvé dans la plupart

des plantes et des tissus d‟origine animale. L‟acide arachidonique (20:4 n-6, AA) est un

autre membre important de la famille des n-6, qui est principalement trouvé dans le gras

animal et rarement dans les tissus des plantes. Il est aussi important parce qu‟il est le

précurseur des prostaglandines et présent en grande quantité dans les phospholipides

(Christie, 1982).

1.2.3 La synthèse des acides gras

Les AG proviennent de deux sources : la synthèse de novo et de l'alimentation. La plupart

des tissus ont comme étape préliminaire l‟absorption des AG. Chez les animaux, ils sont

transportés entre les organes soit comme un complexe des AGNE avec l‟albumine ou soit

sous la forme de lipides complexes associés avec les lipoprotéines. Le mécanisme par

lequel les AGNE peuvent pénétrer dans les cellules n'est pas défini, mais les processus de

diffusion et de médiation des protéines sont impliqués (Gurr et al., 2002).

Les AG synthétisés à partir de la synthèse de novo ont comme principal intermédiaire

l‟acétyl-CoA qui est obtenu à travers un ensemble de réactions complexes comprenant la

glycolyse et le cycle de Krebs. Ces réactions conduisent à la formation d‟atomes de carbone

du squelette des AG et des glycérols de la synthèse des lipides. L‟acétyl-CoA est aussi un

produit de la β-oxydation des AG. Par conséquent, l‟acétyl-CoA apparaît comme la clé

29

intermédiaire du métabolisme des glucides, des acides aminés et des lipides (Wakil et Abu-

Elheiga, 2009).

La lipogénèse a lieu dans le cytosol et elle est régulée par deux enzymes clés : l‟acétyl-CoA

carboxylase (ACC) et l‟acide gras synthase ou fatty acid synthase (FAS) (Figure 4) (Wakil

et al., 1983).

La première étape de la biosynthèse des AG est la conversion de l‟acétyl-CoA en malonyl-

CoA catalysée par l‟ACC. La malonyl-CoA est le donneur de carbones (C2) pour la

synthèse de novo des AG pour la réaction de l‟ACC. Elle joue un rôle important dans le

système transporteur mitochondrial carnitine-palmitoyl-CoA transférase I (CPT-I) pour

l‟oxydation des AG à longue chaîne (Kim, 1997; Wakil et Abu-Elheiga, 2009). Pour bien

comprendre les deux fonctions de l‟ACC, Wakil et Abu-Elheiga (2009) ont identifié deux

enzymes :

Acetyl-CoA carboxylase 1 (ACC1) : est utilisée par le FAS pour la synthèse des

AG. L‟activité de l'ACC 1 et le taux de synthèse des AG fluctuent rapidement en

réponse à divers facteurs internes et externes qui influent sur la lipogenèse. Kim

(1997) a relaté sur la base d‟études in vitro que la capacité catalytique relative de

l‟ACC1 est très faible comparée à celle du FAS, ce qui suggère que l'activité de

l‟ACC1 est le facteur limitant dans la détermination du taux de synthèse des acides

gras.

Acetyl-CoA carboxylase 2 (ACC2) : produit le malonyl-CoA comme inhibiteur de

CPT-I. L‟oxydation mitochondriale des AG implique l'activation d'un acide gras en

acyl-CoA qui est ensuite introduit dans la mitochondrie via le système de CPT-I. Le

CPT-I de la membrane mitochondriale est extrêmement sensible à l'inhibition par le

malonyl-CoA. Ainsi, le malonyl-CoA et l'ACC2 peuvent être les régulateurs

physiologiques de l‟oxydation mitochondriale des AG (Kim, 1997).

30

La deuxième étape de la synthèse des AG requiert la conversion de l‟acétyl-CoA et de la

malonyl-CoA en palmitate (C16:0) en présence de NADPH, laquelle est une réaction

catalysée par l'acide gras synthase (FAS) (Wakil et Abu-Elheiga, 2009). Chez les

mammifères, le FAS est un homodimère qui peut réguler une série de réactions pour

plusieurs sous-unités peptidiques. Chaque sous-unité contient huit domaines fonctionnels

dont six représentent les activités enzymatiques requises pour l'initiation de la synthèse et

l'allongement de la chaîne des AG par deux paires d‟atomes de carbone (Semenkovich,

1997).

Figure 4. Fonctions de l‟ACC1 et de l‟ACC2 sur le métabolisme des lipides dans le tissu animal.Les gras

provenant de la diète sont digérés en acides gras (AG), en glucose et en protéine. Dans le foie, les AG sont

convertis en acyl-CoA, qui est oxydé dans les mitochondries en acétyl-CoA. Ce dernier est également produit

par le métabolisme des acides aminés. L'acyl-CoA est transporté vers les mitochondries par le CPT1 pour la

β-oxydation et la production de l'acétyl-CoA. Ensuite, l'acétyl-CoA est oxydé par l'intermédiaire du cycle de

l'acide citrique pour produire de l'énergie où il est converti en citrate, sort vers le cytosol et génère de l'acétyl-

CoA par le biais de l'ATP citrate lyase (ACLY) ou à des corps cétoniques par l‟HMG-CoA. Dans le cytosol,

l‟acétyl-CoA est carboxylé en malonyl-CoA par l‟ACC1 et utilisé par la FAS pour générer le palmitate lequel

est utilisé dans la synthèse de TAG et de VLDL (lipoprotéines de très basse densité). Adaptée de Wakil et

Abu-Elheiga, 2009.

31

Le FAS est régulé principalement au niveau pré-traductionnel contrairement à l‟ACC qui

est régulé par la modification covalente (phosphorylation) et par des mécanismes

allostériques (citrate, acétyl-CoA). Le FAS est un régulateur de vitesse de la synthèse des

AG sur le long terme (heures à quelques jours). Le NADPH nécessaire à son activité est

produit par l'action de l'enzyme malique et des enzymes des pentoses phosphates. Le

produit de la réaction est la plupart du temps le palmitate (16:0). Cependant, le stéarate

(18:0), le myristique (14:0) et même de plus courts AG peuvent être produits

(Semenkovich, 1997).

1.2.4 La β-oxydation ou lipolyse des acides gras

La β-oxydation est une voie métabolique essentielle pour fournir l‟énergie dans

l‟organisme, principalement aux muscles cardiaque et squelettiques. Cependant, le foie et

autres tissus (tissu rénal, intestin grêle et tissu adipeux) peuvent utiliser les produits de la β-

oxydation pour la formation des corps cétoniques, lesquels peuvent en retour être utilisés

pour produire de l'énergie par d‟autres tissus (Bartlett et Eaton, 2004).

Les AG doivent être activés en acétyl-CoA qui peut être utilisée par plusieurs voies

métaboliques (allongement, désaturation, estérification et/ou oxydation). Cette réaction est

catalysée par l‟acyl-CoA synthétase.

Acide Gras + CoA +ATP → acyl-CoA + AMP + PPi

L‟acyl-CoA synthétase est subdivisée en au moins trois types selon la longueur de leur

chaîne. L‟acyl-CoA synthétase à longue chaîne est localisée dans le cytosol et est associée

avec la membrane extérieure de la mitochondrie et la membrane du réticulum

endoplasmique (RE). Les acyl-CoA synthétase à moyenne et à courte chaîne sont placées

dans la matrice mitochondriale (Morio et al., 2003).

32

L‟acyl-CoA ne peut pas traverser directement la membrane intérieure de la mitochondrie,

laquelle est imperméable à l‟ester de l‟acyl-CoA. Cette étape est ainsi un point majeur pour

le contrôle et la régulation de la β-oxydation (Bartlett et Eaton, 2004). Le système de

transport vers l‟intérieur de la mitochondrie consiste en un Carnitine-palmitoyl CoA

transferase I (CPT-I) localisé dans la membrane extérieure mitochondriale, la carnitine-

acylcarnitine translocase (CAT), une protéine intérieure de la membrane et la Carnitine-

palmitoyl CoA transferase II (CPT-II) localisée sur le côté matriciel de la membrane

intérieure mitochondriale (Kerner et Hopel, 2000; Morio et al., 2003).

Les CPT-I préfèrent les acyl-CoA à longue chaîne comme substrats, mais ils peuvent aussi

utiliser les acyl-CoA à moyenne et à courte chaîne. Ils sont localisés à l‟extérieur de la

membrane des mitochondries et peuvent catalyser la réaction suivante :

Acyl-CoA + Carnitine → Acylcarnitine + CoA

La réaction du CPT-I est inhibée par la malonyl-CoA qui représente un site régulateur de la

β-oxydation (Morio et al., 2003). Bartlett et Eaton (2004) ont observé deux types de CPT-I:

CPT-I (L) (foie) et CPT-I (M) (muscle), qui sont deux gènes ayant des propriétés cinétiques

et régulatrices significativement différentes dans les tissus (par exemple : CPT-I (M) est

plus sensible à la malonyl-CoA que CPT-I (L)). De cette façon, le CPT-I (L) est présent

dans le foie, le cœur, le pancréas, les ovaires, la rate et le cerveau, alors que le CPT-I (M)

est retrouvé dans les muscles, le cœur et les tissus adipeux (Kerner et Hopel, 2000; Morio

et al., 2003).

Le deuxième groupe d'enzymes qui joue un rôle dans la β-oxydation comprend la carnitine-

acylcarnitine translocase (CAT). Les acylcarnitines sont transportées à travers la membrane

interne des mitochondries et ils sont convertis en acyl-CoA. De cette façon, ils rétablissent

les groupements acyl-CoA dans la matrice pour le métabolisme (Morio et al., 2003).

33

Acylcarnitine + CoA → Acyl-CoA + Carnitine

Suite à la translocation des acylcarnitines par le CAT vers la matrice mitochondriale, les

esters de carnitine sont reconvertis à leurs acyl-CoA respectifs par le CPT-II (Kerner et

Hopel, 2000). Les CPT-I et CPT-II sont étroitement liés parce qu‟ils sont situés sur les sites

de contact où les membranes mitochondriales externes et internes sont séparées de 4 nm.

Cependant, l‟activité du CPT-II est moins contrôlée que celle du CPT-I. En effet, le CPT-II

n‟est pas régulé par la malonyl-CoA ou la disponibilité des AG. L‟activité du CPT-II peut

être inhibée par le stockage insuffisant d‟acyl-CoA dans la mitochondrie et par la fluidité

membranaire et la composition en phospholipides (Morio et al., 2003).

Une fois que les AG sont placés dans le matrice des mitochondries, la β-oxydation se

déroule en quatre étapes qui sont répétées en n cycle : l‟oxydation, l'hydratation, une

seconde oxydation et enfin, la thiolyse. Ces étapes permettent de fournir l‟acétyl-CoA

(composé de deux atomes de carbone) et une amorce de l‟acyl-CoA pour le prochain cycle

de la réaction séquentielle (Gurr et al., 2002). Quatre enzymes sont impliquées

séquentiellement dans ce processus.

Lors de la première réaction, un acyl-CoA est déshydrogéné pour donner un trans-Δ2-

énoyl-CoA. Cette réaction est suivie par l‟hydratation de la double liaison. La troisième

réaction utilise le résultat de la précédente, soit le L-3-hydroxy-acyl-CoA qui est

déshydrogéné en 3-céto-acyl-CoA. Finalement, la thiolyse produit une chaîne de deux

carbones (acyl-CoA) en plus de l'acétyl-CoA (Houten et Wanders, 2010).

Le bilan net de chaque tour de la β-oxydation est un NADH, un FADH2 et un acétyl-CoA.

L'oxydation de l'acétyl-CoA via le cycle de Krebs génère plus de FADH2 et de NADH.

Tous les équivalents réducteurs sont réoxydés par la phosphorylation oxydative afin de

former l'ATP. L'oxydation complète d'une molécule d'acide gras produit donc de

nombreuses molécules d'ATP (par exemple, un acide palmitique produit 129 ATP tandis

qu‟un glucose produit seulement 38 ATP) (Morio et al., 2003).

34

1.2.5 Synthèse des triglycérides et des phospholipides

Chez les eucaryotes, le triacylglycerol (TAG) est un stock d'énergie et une réserve de

précurseurs des AG essentiels et non essentiels pour la biosynthèse des phospholipides. En

plus, la formation de TAG agit pour protéger les cellules contre le flux des AG et d'acyl-

CoA. Ces molécules sont généralement nocives pour la membrane, ainsi leur incorporation

dans les TAG permet d'être converti en un composé non toxique qui peut être stocké en

toute sécurité. Les dépôts des TAG peuvent être partiellement hydrolysés pour former des

diacylglycérols (DAG), lesquels réagissent avec l‟acyl-CoA pour donner les TAG

(Coleman et Lee, 2004).

En plus, le DAG est un précurseur majeur de phospholipides phosphatidylcholine (PC),

phosphatidyléthanolamine (PE) et phosphatidylserine (PS). Finalement, les DAG

hydrolysés des TAG peuvent être phosphorylés pour former l'acide lysophosphatidique

(LPA) précurseur des phosphatidylinositol (PI), phosphatidylglycerol (PG) et cardiolipin

(Coleman et Lee, 2004).

La première étape dans la biosynthèse des TAG est la phosphorylation du glycérol en

glycérol-3-phosphate par la glycérol kinase et l‟activation d‟un ou de plusieurs AG à

longue ou à très longue chaîne en acyl-CoA par l‟acyl-CoA synthétase. Le glycérol-3-

phosphate est transformé en acyl-n-glycérol-3-phosphate ou LPA. Cette réaction est

catalysée par l'acyl-CoA: glycérol-n-3-phosphate acyltransférase (GPAT). Le GPAT

mitochondrial est situé sur la membrane extérieure, ce qui signifie que son produit doit être

transporté au RE où les enzymes terminales de synthèse des TAG et la plupart des enzymes

terminales de la synthèse des phospholipides sont localisées (Vance et Vance, 2004;

Coleman et Lee, 2004).

35

Selon Vance et Vance (2004), le LPA peut avoir deux destinations :

Pour la formation de PC, PE et PS; où le LPA est phosphorylé en DAG par l‟acide

phosphatique phosphatase (PAP).

Pour la formation de PI, PG, et CL; où la CPD-diacylglycerol synthétase (CDS)

peut catalyser la réaction de LPA en CDP- diacylglycerol (CDP-DG).

1.2.6 Élongation et désaturation des acides gras à longue chaîne

L‟acide palmitique (16:0); le stéarate (18:0), le myristique (14:0) et les AG à courtes

chaînes peuvent être produits par la synthèse de novo tel qu‟il a été décrit plus haut

(Semenkovich, 1997). De cette façon, les deux sources d‟AG (la synthèse de novo et la

diète) qui sont incorporés dans les TAG, les phospholipides et les esters du cholestérol pour

obtenir les lipides tissulaires, sont obtenus grâce à l‟action d‟élongases et de désaturases

dans le RE et les mitochondries. Le RE est le système retrouvé en plus grande quantité dans

les cellules et le plus fortement actif par rapport aux mitochondries (Cook et Mc Master,

2002).

Chez les animaux, une gamme de désaturases différentes a été identifiée à ce jour. Celles-ci

sont capables de créer des liens doubles dans des emplacements divers sur la chaîne

carbonée : Δ9-, Δ6-, Δ5- et Δ4-désaturase (Pereira et al., 2003).

Nakamura et Nara (2004) ont établi que l‟activité des désaturases peut varier selon leur site

de désaturation :

Δ9-désaturase, d‟habitude appelé stearoyl-CoA désaturase (SCD), peut introduire un

premier lien double dans la position 9, 10 à partir du groupe carboxyle des AG. La

Δ9-désaturase peut catalyser la désaturation de l‟acide palmitique (16 :0) et l‟acide

stéarique (18 :0) pour produire l‟acide palmitoléique (16:1 n-7) et l‟acide oléique

(18:1 n-9).

36

Δ6-désaturase est une désaturase qui est attachée à la membrane et qui peut

catalyser la synthèse d'acides gras polyinsaturés (PUFA). La Δ6-désaturase est

capable d‟ajouter une liaison double entre la liaison double préexistante et la fin du

groupe carboxyle de l‟AG.

Δ5-désaturase est une autre désaturase capable d‟introduire une liaison chez les

animaux. Elle peut catalyser la synthèse des AGPI. Après la désaturation et

l'allongement par la Δ6-désaturase et les élongases respectivement, la Δ5-désaturase

peut catalyser une autre liaison double à la position 5 des AG à 20 carbones 20:3 n-

6 et 20:4 n-3. Récemment, la recherche a démontré l'existence d‟une Δ5 et d‟une Δ6

désaturases bifonctionnelles qui sont développées à partir d'ancêtres communs.

Malgré des processus comme la désaturation et l‟élongation des AG, les exigences pour les

AGPI ne peuvent pas être rencontrées par la synthèse de novo et par d‟autres processus

métaboliques chez les mammifères. De cette façon, les animaux sont absolument

dépendants des plantes ou des insectes pour fournir des liaisons doubles dans la position

Δ12 et Δ15 des deux précurseurs majeurs des AG (n-6) et (n-3), les acides linoléique et

linolénique (Cook et Mc Master, 2002).

1.2.7 Accumulation des acides gras dans la cellule

Les organismes vivants peuvent accumuler les lipides face à un surplus énergétique. Cet

excès d‟énergie est emballé et stocké pour ensuite être utilisé quand les besoins en énergie

ont dépassé la disponibilité des nutriments supplémentés

1.2.7.1 La membrane plasmique

Chez les mammifères, la membrane plasmique est composée d‟une double couche de

lipides, principalement de phospholipides et de cholestérol, ainsi que de protéines qui ont

des fonctions cellulaires importantes, comme récepteurs, transporteurs de voies de

signalisation cellulaire et comme enzymes qui sont incorporées dans la double couche

lipidique.

37

La structure de la double couche de lipide est déterminée en grande partie par l'effet

hydrophobe, lequel contrôle aussi la structure des protéines. En effet, la structure

amphipathique des lipides polaires de la membrane fournit un environnement hydrophobe

défini par la longueur de la chaîne carbonée d‟acyle qui s‟assemble au milieu de la double

couche et par le groupe polaire des lipides qui se retrouve en phase aqueuse. C'est la

répulsion de la structure de l‟eau par les chaînes carbonées de lipides qui conduit à un

environnement hydrophobe (Yeagle, 1989; Lee, 2004).

Les lipides sont réorganisés après des processus comme la digestion, l‟absorption

intestinale et la synthèse de novo. Ils ne sont pas seulement transformés en TAG pour le

transport et le stockage, mais peuvent devenir aussi des constituants essentiels des

membranes biologiques par estérification des lipides complexes. Puisque les chaînes

carbonées des AG représentent plus de la moitié de la masse des phospholipides majeurs et

qu‟elles sont principalement responsables de la nature apolaire de la double couche de

membrane, elles sont cruciales quantitativement et qualitativement (Cook, 1996).

Les effets des modifications des lipides sur la fonction cellulaire sont très variables et

complexes en raison du type de tissu. Cependant, il a été suggéré que les lipides pourraient

influencer les fonctions de la membrane plasmique par des changements structuraux qui

affecteraient ses propriétés physiques telle que la fluidité (Spector et Yorek, 1985; Cook,

1996; Gurr et al., 2002). Cette fluidité de la membrane est régulée par le radeau lipidique

appelé « lipid-rafts » via modification de l‟association entre les sphingolipides, cholestérol,

et des protéines qui peuvent stabiliser ou dissocier la membrane en fonction de la

signalisation et le trafic membranaire (Lingwood et Simons, 2010).

Le ratio approprié d‟acides gras saturé et d‟AGMI peut contrôler la fluidité de la

membrane plasmique. Les stéaryl-CoA desaturases (SCD) sont les enzymes clés qui

peuvent limiter la synthèse cellulaire d'acides gras saturés et d'AGMI (Cook, 1996). La

recherche a aussi démontré que l‟augmentation de la concentration de cholestérol peut

38

limiter le mouvement moléculaire dans la partie hydrophobe de la double couche de lipides

dans la membrane plasmique et ainsi, modifier sa fluidité (Spector et Yorek, 1985). De

plus, le cholestérol peut aussi réguler la fonction des pompes à ions (Na, K-ATPase et Ca+2

-

ATPase), lesquelles dans certains cas ont montré une dépendance absolue de leur activité.

Ces études ont suggéré un rôle essentiel du cholestérol dans la biologie cellulaire des

mammifères, lequel doit permettre aux enzymes importantes de la membrane de fournir la

fonction nécessaire pour la survie cellulaire (Yeagle, 1989; Lee, 2004).

Les phospholipides aussi bien que le cholestérol sont capables de moduler régler l'activité

des protéines de la membrane. La littérature scientifique a conclu que les PE peuvent

réguler la fonction de la pompe à calcium protéique (Yeagle, 1989; Lee, 2004). Il a été

suggéré que la présence de PE peut diminuer l‟activité de la pompe à calcium protéique par

changements significatifs dans la région de surface de la double couche (Lee, 2004).

1.2.7.2 Les gouttes lipidiques

Chez les mammifères, les tissus adipeux sont spécialisés pour fournir une réponse

endocrine et aussi pour l‟accumulation et la récupération d‟énergie. Cependant, toutes les

cellules eucaryotes et même procaryotes peuvent accumuler des quantités limitées de

lipides intracellulaires dans leurs structures plus généralement connues comme des

gouttelettes lipidiques (GL) (Ducharme et Bickel, 2008).

Les GL sont des structures intracellulaires dans le cytoplasme, qui sont composées

principalement de lipides neutres, qui peuvent avoir un diamètre variant entre 0,1 à 50 µm.

La littérature scientifique a établi que les GL sont des lieux de stockage principalement de

TAG, d‟esters de stérol, de cholestérol libre, d'ester de rétinol, de DAG et d‟autres lipides

neutres (Murphy et Vance, 1999; Thiele et Spandl, 2008). Ils sont entourés par une couche

de lipides polaires (phospholipides) avec quelques protéines qui peuvent avoir une fonction

39

importante (exemple : adipose differentiation-related protein (ADRP) ou adipophilin)

(Murphy et Vance, 1999; Coleman et Lee, 2004).

Les GL ne sont pas formées par croissance ou fission des gouttelettes déjà existantes, mais

elles sont apparemment formées par synthèse de novo. La littérature scientifique n‟a pas

encore élucidé le site d'origine et le mécanisme impliqué dans la formation des GL (Thiele

et Spandl, 2008). Cependant, Robenek et al. (2006) et Ducharme et Bickel (2008) ont

proposé que les GL sont formées par synthèse de novo à partir de la monocouche de

phospholipides du RE. Les GL ne sont pas placées dans la membrane du RE. Les

membranes externes du RE suivent le contour des GL, lesquelles semblent avoir une forme

apparentée à un œuf (Figure 5) (Robenek et al., 2006).

Figure 5. Microphoto de cryofracture de l‟association entre la goulette lipidique (LD) et la

membrane du reticulum endosplasmique (ER) dans les macrophages.Tirée de Robenek et al., 2006.

40

Cependant, la littérature scientifique a bien documenté la relation des GL avec d‟autres

organelles particulièrement avec la mitochondrie dans les embryons ou ovocytes de

plusieurs espèces équines, bovines et porcines (Kruip et al., 1983; Hyttel et al., 1997;

Sturmey et al., 2006; Ambrousi et al., 2009; Jeong et al., 2009). Les mitochondries utilisent

les AG provenant des TAG hydrolysés pour produire de l‟ATP par β-oxydation. Sturmey

et al. (2006) ont démontré chez les ovocytes de porcs que les GL et les mitochondries ont

un contact direct entre les membranes à une échelle moléculaire (6 à 10 nm), ce qui peut

impliquer un transport facile et rapide des AG libres au site de métabolisme et un rôle

métabolique de stockage des TAG dans les GL pendant le développement in vitro. De la

même façon, Kruip et al. (1983) et Hyttel et al. (1997) ont démontré que les mitochondries

sont en contact permanent avec les GL qui occupent une position centrale dans le

cytoplasme des ovocytes chez les bovins en métaphase II.

1.2.7.3 Contrôle génomique de l’accumulation des lipides

Le transport des lipides des GL aux destinations métaboliques cellulaires spécifiques est

probablement contrôlé par des protéines. Celles-ci font partie de la famille PAT nommée

d‟après les noms périlipine, adipophiline et TIP47 (tail-interacting protein of 47

kilodaltons) qui ont toutes été localisées par immunofluorescence exclusivement à la

surface des GL (Robenek et al., 2005; 2006). Cependant, Robenek et al. (2005) ont

déterminé que les protéines de la famille PAT ont aussi une distribution partout dans leGL

et ils sont des composants de la membrane cellulaire. Dernièrement, Sastre et al. (2014) ont

confirmé que les protéines de la famille PAT (plus précisément Perilipin-2 et Perilipin-3)

sont impliquées dans la formation et la régulation des GL dans les ovocytes et blastocystes

bovins.

La périlipine a été identifiée comme une phosphoprotéine qui couvre les GL des cellules

adipeuses. Elle est un gène chez le rat, qui donne origine à trois protéines isoformes par

l‟épissage alternatif de l‟ARNm. La périlipine a été retrouvée en quantité significative dans

les GL riches en TAG, dans les adipocytes et dans les GL riches en cholestérol des cellules

41

stéréogéniques (Londos et al., 1999). La recherche a démontré que la périlipine et

l‟adipophiline contiennent deux régions avec des séquences homologues, les régions

restantes de ces protéines n'exposent aucune ressemblance similaire. Ainsi, Tansey et al.

(2001) ont observé que la concentration de l‟ADRP a augmenté dans le couvert des GL des

adipocytes en absence de périlipine dans le tissu de souris knock-out.

Gao et al. (2000) ont découvert que l‟adipophiline est une protéine de 50 kDa qui peut

faciliter le transport et l‟accumulation des AG à longue chaîne et dont l‟activité est stimulée

par le type et la dose des AG. Ils ont aussi déterminé que les AG à longue chaîne ont été

actives dans la stimulation de l‟ADRP, tandis que les AG à courte chaîne et le degré de

saturation des AG n‟ont aucune capacité de stimuler l‟expression de l‟adipophiline.

Aardema et al. (2011) ont confirmé, par l‟intermédiaire de la méthode de

l‟immunofluorescence, la présence de l‟adipophiline dans les membranes des GL,

lesquelles sont un lieu de stockage des lipides neutres. Ils ont utilisé le fluorochrome

BODIPY dans les ovocytes bovins.

La protéine TIP47, a une fonction spécifique de passage du récepteur de la mannose-6

phosphate (Londos et al., 2005). La littérature scientifique a rapporté que TIP47 possède

environ 40 % de son ADNc identique à l‟adipophiline et qu‟il est aussi localisé dans les

GL. Il est donc fortement semblable à l‟adipophiline, mais diffère de la périlipine (Londos

et al., 1999; Wolins et al., 2001). Il a été démontré que TIP47 se trouve sur la surface des

GL et que sa distribution cellulaire est dépendante du stockage des lipides neutres (Wolins

et al., 2001; Bulankina et al., 2009). TIP47 peut affecter la quantité et la taille des GL par

régulation de TAG, ce qui confirme l‟action de TIP47 sur la synthèse des lipides neutres

(Bulankina et al., 2009).

D‟autres gènes peuvent aussi être impliqués dans la synthèse des lipides qui seront des

composants de la structure des GL dans le cytoplasme. De cette façon, l‟ACC et la FAS

sont deux enzymes requises pour la synthèse d‟AG à longue chaîne. Tel qu‟il a été décrit

dans la section précédente, l‟ACC catalyse la carboxylation d'acetyl-CoA pour produire la

42

malonyl-CoA. Elle est alors utilisée pour la synthèse d‟AG à longue chaîne par l'enzyme

multifonctionnelle FAS qui implique sept réactions enzymatiques pour la synthèse d'acide

palmitique (Kim, 1997; Wakil et Abu-Elheiga, 2009). L‟activité et le taux de synthèse des

AG de ces deux enzymes fluctuent rapidement en réponse à plusieurs facteurs qui affectent

la lipogenèse, tels que des facteurs hormonaux, alimentaires et génétiques (Kim, 1997). Un

des effets les plus étudiés par la science est la modification du métabolisme du glucose qui

peut changer le profil d‟expression de l‟ACC et de la FAS par accumulation de leur ARNm

(Girard et al., 1994).

43

1.3 LES MITOCHONDRIES : REVUE

1.3.1 Les mitochondries : Généralités

Le nom mitochondrie vient de deux mots grecs mito (filaments) et chondria (grain) qui

peuvent décrire la morphologie des organelles lorsqu‟elles ont été observées pour la

première fois grâce à la microscopie (Scheffler, 2008). La mitochondrie est une organelle

composée de deux membranes (extérieure et intérieure) à l‟intérieur desquelles se trouve

une matrice dense qui inclut les enzymes du métabolisme et les copies d'un génome qui

code pour quelques protéines intermembranaires (Frey et Mannella, 2000). Cette propriété

des mitochondries d‟avoir un génome différent par rapport au génome du noyau cellulaire a

été une caractéristique très bien étudiée (May-Panloup et al., 2007). Le nombre de copies

du génome peut varier selon le type cellulaire, le moment du développment embryonnaire

et l‟espèce. L‟ovocyte de la souris aurait environ 90 000 mitochondries, mais l‟ovocyte au

moment de l‟ovulation chez l‟humain montre une variation considérable entre les

moyennes rapportées. Il est accepté que les cellules germinales ont un nombre de 10

mitochondries, mais augmente à 200 au stade ovogonie. Les ovocytes primaires

contiennent environ 6000 mitochondries et ce nombre peut augmenter pendant la

croissance (Cummins, 2004).

Au cours des dernières années, la recherche a montré un intérêt pour les mitochondries, car

ce sont des organelles intracellulaires fondamentales qui ont plusieurs fonctions telles que

la maintenance de réserves énergétiques cellulaires. Elles jouent aussi un rôle essentiel de

régulateurs dans divers voies de signalisation et processus intracellulaires (par exemple la

mort cellulaire, l‟homéostasie de calcium, etc.). La recherche a aussi montré un intérêt

spécial pour la capacité de produire de l‟énergie (ATP) dans la cellule. De cette façon, la

phosphorylation oxydative, processus qui couple l'oxydation de substrat à la synthèse

d‟ATP, est la voie métabolique la plus connue et la plus étudiée (Thompson et al. 1996;

Dumollard et al., 2009).

44

Les ovocytes et embryons mammifères ont un métabolisme d'énergie finement régulé. Les

cellules du follicule fournissent des substrats énergétiques à l'ovocyte pendant l‟ovogenèse

et sont perdues après l'ovulation. Les embryons, quant à eux, prennent les substances

nutritives dans leur environnement (l'oviducte et l'utérus, ou le milieu de culture) pendant le

développement précoce. Cependant, il semble que l‟ATP mitochondrial peut supporter tous

les besoins énergétiques de l‟embryon pendant la période de développement précoce

(Dumollard et al., 2009).

1.3.2 Structure et morphologie des mitochondries

Les mitochondries n‟ont pas de taille fixe, mais chez l‟humain, elles ont une longueur de 3

à 4 µm et un diamètre d‟environ 1 µm dans les fibroblastes et les hépatocytes (Scheffler,

2008; Van Blerkom, 2009) alors que dans les ovocytes bovins, elles ont un diamètre moyen

de 1,8 µm (Kruip et al., 1983).

La morphologie des mitochondries a été l‟objet de plusieurs études utilisant la microscopie

électronique. Ces études ont révélé un modèle qui est utilisé dans plusieurs manuels et

selon lequel la membrane mitochondriale intérieure est une surface fermée continue avec

une morphologie complexe et la « crête» est formé de plis semblables au soufflet d'un

accordéon (Frey et Mannella, 2000). La recherche a constaté que les mitochondries sont

définies par deux systèmes distincts de membranes qui sont divisés en quatre parties

distinctes : une membrane externe qui est restrictive et entoure complètement la

mitochondrie et une membrane interne qui se replie en divers points à l'intérieur même de

la mitochondrie. Ces replis constituent des cloisons appelées "crêtes mitochondriales". Les

deux membranes sont séparées par un espace inter-membranaire et un compartiment

délimité par la membrane interne appelée matrice composée de protéines (Perkins et Frey,

2000; Mannella, 2006) (Figure 6).

45

Figure 6. Morphologie de la mitochondrie. A) mitochondrie dans les embryons bovins qui montre

la membrane externe (me), la membrane interne (mi), la matrice (M) et les crêtes mitochondriales

(c) B) Modèle dérivé de la tomographie électronique des membranes dans une mitochondrie intacte

d‟un diamètre de 700 nm. Adaptée de Mannella, 2006.

La membrane extérieure des mitochondries est simple, mais elle peut varier de forme selon

que la mitochondrie soit dans une cellule (d'habitude tubulaire lorsqu‟attachée au

cytosquelette) ou isolée en suspension (ellipsoïde ou sphérique) (Mannella, 2006). De cette

façon, les mitochondries subissent des changements de forme et de structure, mais elles

présentent de façon générale une forme de saucisse dans les tissus non-germinaux comme

les hépatocytes chez les humains (Scheffler, 2008). Cependant, les mitochondries dans les

ovocytes et les embryons sont petites et structurellement peu développées. Elles ont une

forme typiquement ronde et la matrice dense est entourée par la « crête » qui traverse

rarement cette dernière (Van Blerkom, 2009).

Les méthodes de microscopie qui ont été utilisées pour observer les mitochondries dans les

ovules et embryons de plusieurs espèces peuvent montrer différentes formes dont les plus

communes sont : la forme de tige chez les xenopus, plus oblongue ou sphérique chez la

souris, le porc et l‟humain (Dumollard et al., 2006; Dumollard et al., 2007; Van Blerkom,

2009; Romek et al., 2010) et à capuche chez les bovins (Senger et Saacke, 1970; Mohr et

Trounson, 1981; Crocco et al., 2011) (Figure 7).

46

Figure 7.Micrographie électronique qui montre plusieurs formes de mitochondrie (M) dans les

embryons bovins A) forme allongée (Tirée de Abe et al., 2002); B) forme allongée (Tirée de Fair et

al., 2001); C) gonflée (Crocco et al., 2011); D) à capuche (Crocco et al., 2011) et en fusion (Crocco

et al., 2011).

47

Des études de microscopie électronique ont démontré que la morphologie mitochondriale

change au cours du développement des ovocytes et des embryons bovins. Ces études ont

établi que les ovocytes ont de petites mitochondries qui sont denses en électrons avec une

forme ovoïde, gonflée et/ou à capuche (Senger et Saacke, 1970; Mohr et Trounson, 1981;

Plante et King, 1994; Crocco et al., 2011). Pendant les premiers clivages (stade de 2, 4 et 8

cellules) et le stade de morula, les mitochondries changent leur forme sphérique à elliptique

avec une « crête » transversal et translucide et une grande surface évidente de membrane

interne est observée jusqu‟au stade de blastocyste (7 jours) chez les bovins (Mohr et

Trounson, 1981; Plante et King, 1994; Crocco et al., 2011), chez le porc (Romek et al.,

2010) et chez d‟autres espèces (Van Blerkom, 2009).

Les mitochondries peuvent changer leur forme en raison de plusieurs facteurs. Par exemple,

Rivera et al. (2003) ont observé l‟ultrastructure d‟embryons (2 cellules) qui ont un

mouvement d‟organelles vers le centre des blastomères et aussi l‟augmentation du nombre

de mitochondries avec une morphologie gonflée due à l‟exposition à de hautes températures

(41 à 43°C).

La littérature a démontré que les mitochondries peuvent changer leur morphologie sous

l‟influence des conditions de culture embryonnaires in vitro en comparaison avec les

embryons provenant de conditions in vivo chez les ovins (Dorland et al., 1994) et chez les

bovins (Plante et King, 1994; Crosier et al., 2001). Crosier et al. (2001) ont observé que les

embryons in vitro ont moins de surface mitochondriale en comparaison avec les embryons

produits in vivo. En plus, Dorland et al. (1994) et Abe et al. (1999) ont démontré que les

mitochondries peuvent changer leur forme en raison de la présence de sérum dans le milieu

de culture. Cependant, de façon opposée, Crocco et al. (2011) et Romek et al. (2010) ont

conclu que les différences sur la forme des mitochondries sont influencées par d‟autres

facteurs que les conditions de culture. Crocco et al. (2011) ont conclu que la présence des

différentes formes des mitochondries de 1 à 4 jours après la fécondation est davantage

reliée au développement embryonnaire. Ils ont observé une quantité accrue de

48

mitochondries à capuche dans le jour 4 du développement. Cela peut indiquer une

production accrue d'énergie comparée avec les jours précédents.

Selon, Mannella, 2006; Detmer et Chan, (2007), la taille et la forme des mitochondries sont

hautement variables et ces deux éléments sont contrôlées par fusion et fission des

mitochondries. De cette façon, un stade stable, dans lequel la relation de fusion et fission

est égale, peut permettre de maintenir la morphologie et le nombre de mitochondries. Cet

équilibre peut être perturbé et avoir des changements dramatiques sur la forme des

mitochondries. Par exemple, des études en génétique ont démontré que les cellules qui

présentent de hauts niveaux de fusion et de fission peuvent avoir quelques mitochondries

qui sont longes et hautement interconnectées. Par contre, les cellules avec une faible

relation de fusion et fission ont un grand nombre de mitochondries qui sont petites,

sphériques ou à courtes tiges (mitochondries fragmentées) (Detmer et Chan, 2007).

Des études en microscopie ont décrit la corrélation entre la forme des mitochondries et leur

activité. Abe et al. (2002) ont déterminé que les morulas dont les mitochondries ont une

forme allongée et des crêtes transversales chez les bovins sont classifiées comme ayant une

morphologie excellente et de bonne qualité. Par contre, les morulas qui ont été qualifiées de

piètre qualité ont des mitochondries avec une forme plus ronde ou à capuche et ont été

classées comme mitochondries immatures. Crosier et al. (2001) et Crocco et al. (2011) ont

classifié comme mitochondries fonctionnelles celles qui ont une crête régulièrement

développée. Par contre, ils ont aussi classifié comme mitochondries non fonctionnelles

celles qui ont une crête périphérique peu développée, gonflée, une apparence de capuchon

et celles qui ont des membranes contenant des vésicules (mitochondries vacuolisées)

(Figure 7).

49

1.3.3 Fonctions principales des mitochondries : Revue

1.3.3.1 Phosphorylation oxydative

Il est bien connu que plusieurs facteurs affectent le développement des embryons in vitro

chez les bovins. Des nombreuses études ont été réalisées pour développer un

environnement favorable à une croissance embryonnaire rapide. Ainsi, ces études ont

conclu que l‟embryon a besoin d‟énergie sous la forme d‟ATP produit par la chaîne

respiratoire de la mitochondrie (Thompson et al., 2000). Ainsi, les mitochondries sont les

organelles responsables de la production de la majorité de l‟énergie cellulaire sous forme

d‟ATP à travers la PHOSOX (Cummins, 2004). La PHOSOX est définie comme un

mécanisme qui couple l'oxydation de substances nutritives réduites et des molécules

organiques avec la phosphorylation de l‟ADP (Wallace, 2005). La PHOSOX est supportée

par la chaîne respiratoire de la mitochondrie, laquelle consiste en quatre complexes

localisés sur la membrane mitochondriale interne (Figure 8).

Figure 8. Phosphorylation oxydative en lien avec les 4 complexes mitochondriaux. (Tirée de

http://www.genome.jp/kegg/tool/color_a_pathway.html).

http://www.genome.jp/kegg/tool/color_a_pathway.html

50

Complexe I

Le complexe I est décrit dans la littérature comme NADH-ubiquinone réductase, lequel

catalyse la réaction suivante :

NADH + Q + 5H+ → NAD+ + QH2 + 4H+

Où: Q et QH2 sont les formes oxydées et réduites de l‟ubiquinone, respectivement.

Le complexe I a une structure similaire dans presque tous les organismes eucaryotes. En

effet, ce qui est commun, c‟est la présence d‟un certain nombre de peptides (45) en

comparaison aux procaryotes où par exemple chez E. coli, le nombre de peptides est de 14.

Les études en microscopie électronique ont démontré que le complexe I a une forme de L

ou d‟une botte, avec une grande portion de sa structure à caractère hydrophobe intégrée

dans la membrane intérieure et une petite portion à caractère hydrophile sur la matrice de la

mitochondrie (Rich et Maréchal, 2010). La petite portion de la forme L est l‟endroit de la

liaison avec le NADH qui a une fonction de NADH déshydrogénase et qui est aussi

constitué du cofacteur flavine mononucléotide (FMN) et de 7 à 9 unités de protéine fer-

soufre (Fe-S) (Scheffler, 2008; Rich et Maréchal, 2010). La réaction d'oxydoréduction

interne implique le transfert d'électrons de NADH, par l'intermédiaire de FMN, et la

participation de la série linéaire des protéines Fe-S qui les transferè immédiatement à

l‟ubiquinone (Rich et Maréchal, 2010). Les études n‟ont pas encore élucidé comment le

transport des électrons et le mécanisme de pompage des protons sont liés entre eux, mais il

est suggéré que les deux protons sont pompés par mécanisme de redox et les deux autres,

transportés par les protéines Fe-S (Scheffler, 2008).

Complexe II

Le complexe II est le plus simple des composants de la chaîne respiratoire, mais un des plus

importants car il est encodé dans l‟ADN nucléaire comparativement aux autres complexes

de la chaîne respiratoire de la mitochondrie (Rich et Maréchal, 2010). Il est composé de 4

peptides : deux grands peptides qui constituent la portion périphérique du complexe et qui

51

ont une fonction d‟enzyme succinate déshydrogénase du cycle de Krebs. Les électrons de

l‟oxydation du succinate en fumarate sont transportés dans ce canal du complexe vers

l‟ubiquinone (Scheffler, 2008; Rich et Maréchal, 2010).

La réaction qui catalyse le complexe II est :

Succinate + Q → Fumarate + QH2

Dans la plupart des eucaryotes, cette réaction procède de la gauche vers la droite en raison

de la concentration des substrats et des produits, mais aussi car l‟enzyme agit dans un seul

sens qui peut empêcher le flux des électrons dans la direction inverse (Scheffler, 2008).

Complexe III

Le complexe III est l‟enzyme ubiquinone-cytochrome c oxydoréductase, lequel est aussi

appelé complexe bc1. Cependant dans la littérature, il est identifié avec le nom plus simple

de cytochrome c réductase.

La réaction catalysée par ce complexe est la suivante :

QH2 + 2 cyt c3+ + 2H+i matrix → Q + 2 cyt c 2+ + 4 Ho+ EIM

Le complexe III montre une réaction similaire à celle du complexe I, dans laquelle

l‟oxydation d‟un des substrats (QH2) et le transfert des électrons vers un transporteur

mobile (cytochrome c) sont liés au transfert des protons à travers la membrane intérieure de

la mitochondrie. Le QH2 produit par les complexes I et II est capable de se diffuser et de

traverser l‟EIM jusqu‟au site d'oxydation de QH2 dans le complexe III, où il est oxydé de

nouveau pour former le Q. Les deux protons sont libérés dans l‟EIM et sont ensuite

transférés au cytochrome c dans l‟EIM (Rich et Maréchal, 2010). La littérature a déterminé

que les sous-unités les plus importantes du complexe III sont les cytochromes b et c1 et la

52

protéine de Rieske qui est une protéine Fe-S. Elles ont une participation dans le transfert

d'électrons et l‟accompagnement de la translocation des protons (Scheffler, 2008).

Complexe IV

Le complexe IV est généralement appelé cytochrome c oxydase, lequel s‟occupe de la

réaction suivante:

4cyt c2+ + 4 H+ (s)entrer + 4 H+(p) entrer + O2 → 4 cyt c3+ + 4 H+(p)sortir + 2 H2O

Les évènements les plus importants de cette réaction sont en premier lieu, le cytochrome c

oxydase qui catalyse le transfert des électrons du cytochrome c réduit et produit dans le

complexe III, vers l‟oxygène (O2). Ces électrons sont libérés dans l‟EIM et donne comme

résultat un transfert de quatre charges positives à travers la membrane. En deuxième lieu, la

réduction de deux molécules d'eau requiert quatre transferts d‟électrons du cytochrome c,

lequel est re-oxydé et associé à quatre protons qui sont captés de la matrice mitochondriale

(Rich et Maréchal, 2010).

L'efficacité de la PHOSOX est déterminée par l‟efficacité du couplage des systèmes pour la

production d‟ATP. Si la chaîne respiratoire de la mitochondrie pompe les protons hors de la

membrane intérieure et que la synthèse d‟ATP est très efficace avec la conversion en ATP

par le flux de proton, alors la mitochondrie produira le maximum d‟ATP pour un minimum

d‟énergie consommée. Par contre, si l‟efficacité du pompage de proton est réduite, plus de

protons seront nécessaires pour produire l‟ATP, alors chaque calorie consommée rapportera

moins d‟ATP (Wallace, 2005).

Les mitochondries sont très actives pour la PHOSOX malgré leur état apparemment

primitif ou sous-développé. Elles sont très importantes dans la compétence des ovocytes et

les premiers stades du développement embryonnaire, car elles sont la source primaire de la

production d'ATP (Dumollard et al., 2004; Van Blerkom, 2011). De plus, leur inactivité

53

peut limiter le potentiel de générer des dérivés réactifs de l'oxygène (DRO) au niveau où les

stress oxydatifs pourraient compromettre la fonction mitochondriale ou peut-être même

initier l'apoptose (Dumollard et al., 2004; Van Blerkom, 2011). Pendant la méiosedes

ovocytes et le clivage des embryons, le nombre de mitochondries doit être suffisant pour

produire de l‟ATP afin d‟éviter de perdre la compétence des ovocytes. De cette façon, il est

démontré que l‟association spécifique entre les mitochondries et les microtubules en

relation avec la PHOSOX semble être corrélée avec le potentiel individuel des blastomères

(Cummins, 2004).

La fonction mitochondriale est aussi associée avec le contenu en ATP et les changements

dans le métabolisme pendant les premiers clivages des embryons chez les bovins

(Thompson et al., 1996; Stojkovic et al., 2001). La littérature scientifique a démontré que

l‟activité mitochondriale est intimement liée aux changements du métabolisme des glucides

chez les embryons de mammifères dans les premières étapes de développement. Pendant

cette période, le cycle des acides tricarboxyliques, appelé aussi cycle de l'acide citrique

(TCA), demeure la plus grande source des équivalents réducteurs en raison de la

suppression de la glycolyse et de la voie des pentoses (Thompson et al., 1996; Cummins,

2004; Dumollard et al., 2009).

La glutamine, qui peut être transformée en glutamate et ensuite en α-cétoglutarate

intermédiaire du cycle TCA, a été confirmée comme le substrat d‟énergie majeur pour la

PHOSOX mitochondriale chez les embryons bovins jusqu‟au stade de morula (Rieger et

al., 1992; Thompson et al. 1996; Dumollard et al., 2009). Cela suggère que dans cette

période de changement du métabolisme oxydatif embryonnaire, la réduction de la glycolyse

et la possible incapacité de métaboliser le pyruvate peuvent laisser des altérations dans le

métabolisme mitochondrial et mener à l‟apoptose (Cummins, 2004). D‟autres substrats

métaboliques tels que le lactate a aussi été confirmés comme substrat pour la production

d‟ATP jusqu‟à l‟étape de morula. Après la compaction des morulas, la glycolyse et la

phosphorylation oxydative mitochondriale sont les deux voies énergetiques principales et

54

cela aboutit à une forte hausse de la consommation d'oxygène à l'étape de blastocyste

(Dumollard et al., 2009).

L‟association entre la PHOSOX et l'activité mitochondriale confère aussi un rôle important

aux mitochondries dans la régulation du potentiel rédox intracellulaire qui donnent l‟état de

redox dans la cellule et le niveau oxydatif chez l'embryon (Dumollard et al., 2007). Cette

association peut réguler la morphologie des mitochondries. Il est rapporté que la PHOSOX

est associée à la présence de cristaux dans les mitochondries. Plusieurs études ont indiqué

que la présence de crêtes sur les mitochondries était directement corrélée à une importante

fonction mitochondriale, tandis que la faible présence de crêtes sur les mitochondries était

corrélée à une baisse ou une altération de la fonction mitochondriale (Van Blerkom, 2009;

Crocco et al, 2011).

1.3.3.2 L’apoptose

Les mitochondries ont une double fonction qui est de supporter le développement

embryonnaire et de déclencher l‟apoptose. Ce double rôle peut représenter un système de

contrôle de la qualité dans les premiers stades des embryons qui déterminera si les

embryons seront développés ou rapidement éliminés. Les mitochondries ont une influence

sur l‟apoptose pendant les premiers stades de développement dans la plupart des espèces

(Dumollard et al., 2007). Chez les bovins, il est démontré que l‟apoptose est active

seulement après l‟activation du génome embryonaire (Matwee et al., 2000).

Plusieurs études ont démontré que l‟altération de l'activité mitochondriale due au stress

oxydatif amène une extrême sensibilité des embryons aux conditions de culture variables

ou conditions pathologiques. Chi et al. (2002) ont observé que les pathologies, telles que le

diabète maternel, peuvent entraîner une exposition à des niveaux élevés de glucose qui

induisent l'apoptose de blastocyste en modifiant la fonction mitochondriale. Les conditions

sub-optimales peuvent déclencher l‟apoptose chez les embryons bovins, mais seulement

55

après l‟activation du génome. Il a été démontré qu‟au stade 8-cellules, l‟apoptose semble

être régulée par le développement embryonnaire, mais sans signe morphologique chez les

embryons (Matwee et al., 2000; Antunes et al., 2010).

En fait, il est bien connu que le déséquilibre entre le stress oxydatif exogène et endogène

est responsable de l'arrêt du développement ou de l'apoptose dans les embryons (Takahashi,

2012). Il est probable que les ovocytes et les embryons des mammifères ont une lente mais

constante accumulation de charge oxydante au cours du développement et que ce n'est que

lorsque le système antioxydant de l'embryon est surchargé que cela entraîne la génération

de DRO pendant le stress oxydatif (Dumollard et al., 2009; Takahashi, 2012).

Kroemer et Reed (2000) ont déterminé que la perméabilisation de la membrane

mitochondriale (PPM) est le principal évènement dans le processus de l‟apoptose. Le

découplage de la chaîne respiratoire et/ou son inhibition peuvent causer la génération

accrue de l'anion superoxyde, l'épuisement des équivalents redox (NAD(P)H, le glutathion,

etc.) et des DRO induits par les dommages. De cette façon, la vitesse de la PMM et la

dépendance des cellules sur la production d'ATP mitochondriale ou glycolytique,

détermineront si l'activation de l‟apoptose ou la catastrophe bioénergétique/redox mènent

de la PMM à la mort cellulaire.

Une fois que la PMM se produit, elle peut libérer quelques protéines de l‟EIM vers le

cytosol dont le cytochrome c et le Smac/DIABLO qui stimulent la mort cellulaire par

l‟activation de caspases, lesquelles sont responsables de propager des signaux en cascade

de l‟apoptose (McStay et Green, 2012). Ces deux protéines ont deux mécanismes

d‟activation des caspases dans le cytosol. Le cytochrome c est nécessaire pour la formation

d‟un complexe appelé apoptosome qui peut activer la caspase 9. Le Smac/DIABLO, quant

à lui, neutralise l‟action des IAP (protéines inhibitrices de l‟apoptose) lesquels empêchent

les activités de la caspase 9 (Parson et Green, 2010). La caspase 9 active les caspases 3 et 7.

Ces protéases sont responsables du clivage de plusieurs protéines qui se traduisent par des

caractéristiques phénotypiques de l'apoptose (McStay et Green, 2012).

56

L‟intégrité de la PMM est contrôlée par les protéines de la famille Bcl-2 (ex : Bcl-2, Bcl-

xL, Bcl-w, A1 et Mcl-1). Ce groupe de protéines a un puissant caractère anti-apoptose qui

peut bloquer la PMM et inhiber la libération de cytochrome c (Parson et Green, 2010).

Cependant, une caractéristique fréquente du réseau mitochondrial au cours de l'apoptose,

c'est qu'il subit un changement dans sa structure cellulaire. De cette façon, un stimulus peut

activer en premier Bak et Bax qui sont deux molécules d‟un groupe de protéines pro-

apoptose et qui sont responsables de la formation d‟un pore dans la membrane

mitochondriale et permet la libération de protéines de l‟EIM avec comme conséquence, la

PMM et le début de l‟apoptose (McStay et Green, 2012). L'activité de Bak et Bax est

étroitement régulée par d‟autres membres de la famille Bcl-2 (BH3). Les protéines anti-

apoptoses se lient et inhibent les membres pro-apoptoses de la famille Bcl-2 (BH3 et Bax,

Bak). Cependant, BH3 est capable d‟inhiber les protéines anti-apoptoses et potentiellement

d‟activer Bax et Bak (Parson et Green, 2010).

La littérature scientifique récente a découvert que le RE participe à la fusion et à la division

mitochondriale. Ainsi, Hoppins et Nunnari (2012) ont spéculé que la division des

mitochondries peut avoir un lien avec l‟apoptose, laquelle est régulée par les dynamin-

related guanosine triphosphatases (DRP). Les DRP ont été trouvés en grande quantité dans

la membrane extérieure des mitochondries lors de l‟union avec le RE, au même endroit que

Bax qui est l‟élément déclencheur de l‟apoptose.

1.3.3.3 L’homéostasie du calcium

La recherche a démontré que le Ca+2

est régulateur de certains signaux dans plusieurs voies

métaboliques cellulaires. Cependant, la relation entre la fonction physiologique de Ca+2

et

les mitochondries n‟a pas bien été clarifiée. Duchen, (2000) ont déterminé que le Ca+2

régule les mitochondries, car il peut provoquer une dépolarisation transitoire en agissant

comme un tampon physique. De la même façon, la mitochondrie régule aussi l‟homéostasie

57

du Ca+2

cytoplasmique, lequel joue un rôle important dans les signaux des voies

métaboliques (Duchen, 2000).

De récentes études ont démontré aussi l‟influence du Ca+2

sur l‟activité mitochondriale car

il est un activateur de la PHOSOX. Il stimule plusieurs déshydrogénases du cycle de Krebs

et la chaîne de transport d'électrons. Ces deux facteurs ont un impact direct sur l‟ATP

synthétase (Dumollard et al., 2006). Dumollard et al. (2004) ont prouvé que le Ca+2

du

cytoplasme entre dans la matrice mitochondriale pour activer le cycle de Krebs.

L'activation du cycle de Krebs fournirait l‟augmentation de la concentration des équivalents

réducteurs (NADH et FADH2), lesquels stimuleraient la respiration mitochondriale et la

génération d‟ATP et causeraient une re-oxydation progressive par la chaîne de transport

d‟électrons jusqu'à ce qu‟un nouveau Ca+2

stimule la réduction et reprenne le cycle.

Cette influence de Ca+2

sur les mitochondries a été mise en évidence dans les ovocytes

lorsque les spermatozoïdes déclenchent les oscillations de Ca+2

vers les mitochondries où

ils stimulent directement l'activité mitochondriale (Duchen, 2000; Dumollard et al., 2004).

En effet, Dumollard et al. (2004) ont démontré qu‟après la fécondation, le Ca+2

est libéré

vers le cytosol et doit être éliminé par transport actif dans le RE et la membrane cellulaire.

Cette libération de Ca+2

stimule aussi l‟exocytose des granules corticaux ATP-dépendants

et l'extrusion du deuxième corps polaire qui exige aussi de l‟ATP. Ceci démontre donc que

la synthèse d‟ATP est requise pour maintenir le niveau d‟ATP après la fécondation et

pouvoir maintenir la compétence de l‟ovocyte.

Comme il a été décrit auparavant, il y a une relation étroite entre la mitochondrie et le RE.

Dans certaines études sur l‟ultrastructure cellulaire, ces deux organelles ont été vues

ensemble dans des ovocytes et des embryons (Motta et al., 2000). Cette proximité donne un

microenvironnement qui subit des variations beaucoup plus importantes de métabolites

solubles comparativement au reste du cytoplasme. De cette façon, cette juxtaposition des

mitochondries et du RE soutient l'idée qu‟il existe des interactions privilégiées entre les

deux organelles qui permettent, entre autres, une transmission efficace des signaux Ca+2

58

cytoplasmique vers les mitochondries et l‟approvisionnement d‟ATP pour le pompage de

Ca+2

par le RE et la membrane cellulaire (Dumollard et al. 2006).

1.3.3.4 Production de DRO

La recherche a démontré que les mitochondries produisent des DRO comme résultat d‟un

débalancement du métabolisme énergétique des ovocytes et des embryons (Guérin et al.,

2001; Nohl et al., 2005; Dumollard et al., 2009). Bien que les DRO sont souvent considérés

comme des produits biologiques indésirables de l‟oxydation, leur production en petites

quantités ou des changements mineurs de leur concentration peuvent agir comme signaux

des voies physiologiques dans l'embryon. (Dumollard et al., 2009).

Les DRO sont les sous-produits de plusieurs voies métaboliques et d‟enzymes, mais ils sont

produits principalement par la PHOSOX, la xanthine oxydase et le NADPH oxydase dans

les ovocytes et les embryons de mammifères (Thompson et al., 2000; Trimarchi et al.,

2000; Guérin et al., 2001; Dumollard et al. 2009). En effet, il a été démontré par Thompson

et al. (2000) que le transport des électrons peut se faire sans synthèse d‟ATP qui provoque

généralement une augmentation de la consommation d‟O2, tout cela en raison de

l‟inhibition de la PHOSOX. Trimarchi et al. (2000) ont aussi déterminé que la PHOSOX

représente entre 60 et 70 % de l‟O2 consommé à l‟état de blastocyste, tandis que la

PHOSOX n‟est pas constante au cours du développement des embryons, car seulement

30 % de l‟O2 total est consommé par des embryons de 2 à 4 cellules chez la souris.

Un facteur exogène important qui induit la génération de DRO des embryons est la

concentration de l‟O2 environnemental. Ainsi, à 37°C, la concentration en O2 dans un

milieu équilibré avec l'O2 atmosphérique est de 224 µmol/L, ce qui est nettement supérieur

à la concentration physiologique de l‟O2 des cellules (~10 µmol/L). Par conséquent, les

conditions hyperoxydes résultent en une augmentation de la teneur en O2 dans les cellules

(Guérin et al., 2001). Dumollard et al. (2009) ont rapporté aussi qu‟une hausse de 2 % de

59

l'O2 consommé par les mitochondries peut provoquer la production de DRO. Ainsi, il a été

confirmé que les mitochondries sont une source importante de DRO.

Les trois principaux DRO produits par des embryons de mammifères sont : le superoxyde

O2-, le peroxyde d‟hydrogène H2O2 et le radical hydroxyle OH• (Guérin et al., 2001).

L‟anion O2-, produit par la réduction d‟un électron de l‟O2, est le précurseur de la plupart

des DRO et un médiateur dans des réactions en chaîne oxydatives. La dismutation d‟O2-

produit du H2O2, qui peut à son tour être entièrement réduit en eau ou partiellement réduit

en radical hydroxyle (OH •), un des oxydants les plus forts dans la nature (Turrens, 2003).

La formation de DRO dans les mitochondries peut varier d‟origine selon le complexe de la

chaîne respiratoire. Il est connu qu‟en certaines conditions particulières, le complexe III

semble être responsable de la production de la plupart de l‟O2-. Cependant, le complexe I

est aussi une source primaire d‟O2- en conditions pathologiques (Turrens, 2003). Le

complexe I a aussi été découvert comme l‟origine de la formation de H2O2 de façon

indépendante du potentiel de la membrane. Si le flux d'électrons de Q au complexe II est

obstrué en raison de changements dans la fluidité des lipides, des électrons seuls peuvent

produire du H2O2. Le complexe IV (cytochrome c oxydase) a été identifié comme l‟élément

déclencheur de la production de superoxyde mitochondrial, lorsqu„il est déphosphorylé.

Cette déphosphorylation du complexe IV est associée à l‟inhibition de l‟énergie liée à la

respiration. Ainsi, cela peut augmenter de façon dramatique le potentiel de la membrane

mitochondriale (Nohl et al., 2005).

Les embryons de mammifère sont très sensibles au stress oxydatif, lequel peut induire un

arrêt total du développement au moment de l‟activation génomique du zygote et déclencher

l'apoptose dans l'embryon (Tarazona et al., 2006; Dumollard et al. 2009; Takahashi, 2012).

Plusieurs études ont montré l‟effet négatif du stress oxydatif sur le développement des

embryons bovins en culture in vitro à de haute concentration atmosphérique d‟O2 (20 %)

comparativement à de faible concentration d‟O2 (5-7 %), laquelle condition est similaire à

celle retrouvée in vivo (Voelkel et Hu, 1992; Takahashi et al., 1999; Yuan et al, 2003).

60

Le stress oxydatif est mesuré par la production de DRO, qui se traduit par un déséquilibre

du PRI vers un potentiel oxydé et peut ainsi compromettre le potentiel de développement

des embryons (Dumollard et al. 2007, Takahashi, 2012).

1.3.4 Distribution et activité des mitochondries dans les ovocytes et les embryons

Des changements dans l‟activité, l'organisation ou la structure des mitochondries peuvent

se produire pour soutenir des événements clés du développement. Ainsi, la distribution des

mitochondries actives peut être importante pour la compréhension des besoins nutritionnels

et métaboliques des embryons chez les mammifères (Barnett et al., 1996; Krisher et

Bavister, 1998). Dumollard et al. (2007) ont démontré qu‟une conséquence de la

distribution des mitochondries dans l‟ovule mature pendant le clivage peut occasionner des

blastomères avec une différente charge mitochondriale lors du développement des

embryons, conférant ainsi un potentiel de développement distinct.

Les mitochondries suivent un modèle de distribution précis pendant la maturation des

ovocytes ou la fécondation. Celui-ci est strictement régulé et semble être en corrélation

avec la compétence de l‟ovocyte de différentes espèces (Bavister et Squirrell, 2000;

Dumollard et al., 2006). Dumollard et al. (2006) ont observé que dans les ovocytes de

plusieurs espèces, les mitochondries entourent la zone périnucléaire et migrent du centre à

la périphérie en GV. Mais en métaphase II (MII), les mitochondries sont présentes

principalement près du fuseau méiotique et au centre de l'ovocyte (Dumollard et al., 2004,

2006).

La distribution des mitochondries dans les ovocytes bovins a été le sujet de recherche de

plusieurs études avec différentes conclusions. Kątska-Książkiewicz et al. (2011) ont

observé que les ovocytes des follicules pré-antraux ont une distribution hétérogène et

agrégée des mitochondries, laquelle pourrait être le résultat d'un lien étroit entre les

mitochondries, les vésicules et les agrégats du noyau. Cependant, Plante et King (1994);

61

Hyttell et al. (1986); Stojkovic et al. (2001) et Tarazona et al. (2006) ont observé et conclu

que les mitochondries sont distribuées dans tout le cytoplasme, bien qu‟elles puissent être

absentes de la région corticale après 12 à 18 heures de culture des ovocytes bovins. Kruip et

al. (1983) ont aussi observé cet événement en conditions in vivo, c‟est-à-dire une

distribution périphérique des mitochondries avant la montée de l'hormone LH suivie d‟une

formation corticale dans les étapes finales de maturation nucléaire et une distribution

dispersée après l'extrusion du corps polaire (environ 19 heure après le pic de LH) (Kruip et

al., 1983; Hyttel et al., 1997). Cette controverse sur la distribution des mitochondries chez

les ovocytes bovins est probablement due à plusieurs facteurs tels que les différences et

limitations dans les méthodes utilisées, l‟origine des ovocytes in vivo ou in vitro, etc. Ceci

empêche d‟énoncer une conclusion générale sur la distribution des mitochondries.

Malgré cette controverse sur la distribution des mitochondries, Bavister et Squirrell (2000)

ont suggéré que pendant la maturation, les mitochondries présentent deux modèles distincts

de distribution dans le cytoplasme. Les ovocytes qui ont été cultivés dans un milieu de

culture contenant du glucose et des acides aminés montrent une distribution des

mitochondries principalement situées dans le centre de l‟ovocyte. Ce modèle est associé

aux ovocytes qui sont compétents pour former des blastocystes dans un cycle standard de

production embryonnaire in vitro chez les embryons bovins. Au contraire, les ovocytes qui

ont été en culture avec du glucose et du lactate ont un mauvais développement de l'embryon

après la fécondation in vitro. Les mitochondries restent dans le cortex de l‟ovocyte (Krisher

et Bavister, 1998).

La littérature a révélé un schéma de migration périnucléaire des mitochondries actives,

lequel persiste pendant les trois premiers clivages des embryons de hamster (Barnett et al.

1996,1997), de porc (Romek et al., 2010) et de bovin (Bavister et Squirrell, 2000). Au stade

de blastocyste chez les embryons de rongeurs et de porcs, la distribution des mitochondries

a été étudiée en utilisant des colorants. Elles ont été observées de façon homogène dans les

cellules du trophectoderme tandis que dans les cellules de la masse cellulaire, il reste une

incertitude à cause du faible signal des colorants (Barnett et al. 1996; Romek et al., 2010).

62

Les mitochondries sont généralement associées avec les structures qui consomment de

l‟énergie dont le noyau, les flagelles, le RE et la membrane plasmique. De cette façon,

Barnett et al. (19997) ont conclu que le regroupement périnucléaire des mitochondries dans

l'embryon chez les mammifères est un processus «normal», lequel peut être nécessaire pour

assurer que l'ATP produit par les mitochondries est fournie de manière efficace dans le

noyau (Barnett et al., 1996;1997).

Un élément important qui déterminera la compétence des ovocytes et des embryons est

l‟activité mitochondriale. La recherche a démontré que les embryons dans les premiers

stades de développement ont une consommation d'oxygène relativement basse (Thompson

et al., 1996; Trimarchi et al., 2000). Les observations en microscopie électronique ont aussi

supporté l‟idée que les mitochondries ne sont pas matures et fonctionnelles durant cette

période et qu‟elles ont une limitation pour l‟activité respiratoire (Plante et King, 1994;

Crocco et al., 2011). Cependant, la consommation de substrats énergiques, tel que le

pyruvate, suggère que l'activité mitochondriale est cruciale pour l'activation et la survie du

développement embryonnaire (Dumollard et al., 2007; 2009).

Kątska-Książkiewicz et al. (2011) ont étudié l‟activité mitochondriale des ovocytes in vitro

bovins provenant de follicules qui ont entre 0,4 à 0,8 mm de diamètre. Ils ont observé que

l‟activité mitochondriale des ovocytes augmente en corrélation avec le temps de culture

dans un milieu de croissance. Cependant, celle-ci est très élevée en période GVBD. Cette

augmentation de l‟activité mitochondriale est soutenue aussi par Stojkovic et al. (2001) et

Tarazona et al. (2006) qui ont conclu que celle-ci augmente après la maturation des

ovocytes, en raison de l‟augmentation de la production d‟ATP nécessaire pour les futurs

évènements de la maturation. Ils ont aussi remarqué une forte corrélation entre l‟activité

mitochondriale et la morphologie des ovocytes qui peut déterminer leur compétence.

De la même façon, Tarazona et al. (2006) ont noté que les premiers états du développement

des embryons révèlent une activité mitochondriale intermédiaire ou basse. La littérature

scientifique a bien démontré que celle-ci est intimement liée aux changements du

63

métabolisme de glucides des embryons mammifères qui ont comme grande source

d‟équivalents réducteurs le TCA. Cela est dû à la suppression de la glycolyse et à la voie de

la pentose (Cummins, 2004; Dumollard et al., 2009). Cependant, Tarazona et al. (2006) et

Thompson et al. (1996) ont observé que les mitochondries des embryons ont une légère

augmentation de leur activité entre 72 et 168 hpf par la consommation d‟oxygène et la

production d‟ATP au stade de morula. Tel qu‟il a été décrit avant, des études ont confirmé

que les mitochondries changent leur morphologie car elles deviennent plus actives ou

matures dans les embryons de 8 à 16 cellules chez la souris, le lapin et l'homme (Plante et

King, 1994; Van Blerkom, 2009). Cela confirme donc l‟idée que les mitochondries

présentent une activation du génome mitochondrial entre 8 et 16 cellules et au stade de

morula chez le bovin et que leur activité est maintenue au niveau intermédiaire (May-

Panloup et al. 2005; Tarazona et al., 2006; Romek et al. 2010). Ainsi, la coordination entre

l‟AGE et la transcription de l'ADN mitochondrial (ADNmt) peut expliquer l'augmentation

de l'activité mitochondriale observée vers le jour 3 du développement (Crocco et al., 2011).

Après le stade de blastocyste, l‟activité mitochondriale diminue en comparaison des stades

précédents (Tarazona et al., 2006; Romek et al., 2010). Cela est dû à l‟augmentation du

métabolisme du glucose et du pyruvate mesurée par la production d‟ATP et la

consommation d‟O2 (Thompson et al., 1996; Trimarchi et al., 2000; Dumollard et al.,

2006).

1.3.5 Génome de la mitochondrie

L‟ADN mitochondrial (ADNmt) représente le génome extra-nucléaire. L‟ADN a été

observé dans les mitochondries (ADNmt) et chloroplastes de cellules de plantes depuis

longtemps (Wagner et al. 1972). Les mitochondries sont les seules organelles retrouvées

dans les cellules eucaryotes qui possèdent de l‟ADN. Ceci probablement en raison de leur

origine procaryote lié à α-probacteria phyla (Cummins, 1998; May-Panloup et al., 2007).

Ce type bactérien ancien est capable de métaboliser l‟oxygène ce qui supporte le principe

voulant que la mitochondrie origine d‟une coopération cellulaire unique entre une bactérie

64

et une cellule eucaryote qui ont co-évolué en endosymbiose de façon à devenir dépendants

et intégrés l‟un à l‟autre. Cette capacité à métaboliser l‟oxygène permet de survivre à des

conditions qui offrent des concentrations croissantes de cet élément hautement réactif et

potentiellement toxique dans l‟environnement (Cummins, 1998).

Le génome mitochondrial des humains, support de l‟hérédité cytoplasmique, est une

molécule d‟ADN circulaire double brin de 16 569 paires de bases et est similaire à celle des

bovins. L‟ADNmt encode 37 gènes : 13 gènes reliés aux protéines de la membrane

intérieure mitochondriale, 22 gènes pour l‟ARN de transfert (ARNt) et 2 gènes pour

l‟ARNr (sous-unités 12S et 16S). Les 13 polypeptides incluent : 7 protéines de la sous-unité

du complexe I; 1 protéine de la sous-unité du complexe III; 3 protéines du complexe IV et 2

protéines de l‟ATP synthétase ou complexe V (Anderson et al., 1981) (Figure 9).

65

Figure 9.Organisation du génome mitochondrial. Les gènes qui le composent sont 2 gènes d‟ARN

ribosomiques (12S et 16S), 22 gènes d‟ARN de transfert nécessaires à l‟expression de l‟ADNmt

(représentés par les points) et 13 gènes codant pour des protéines de la chaîne respiratoire. ND:

NADH-déshydrogénase; Cytb: cytochrome b (ubiquinone-cytochrome c-réductase); CO:

cytochrome c-oxydase; ATPase: ATP-synthase. La boucle D est une région de contrôle de la

réplication et de la transcription qui comporte deux promoteurs de transcription (HSP et LSP) et une

origine de réplication (OH). (Tirée de May-Panloup et al., 2004).

66

La plupart des cellules somatiques ont entre 103 et 104 copies d‟ADNmt qui sont

organisées en 2 à 10 copies par organelle (Shoubridge, 2000). May-Panloup et al. (2005)

ont rapporté que les ovocytes en métaphase II chez les bovins contiennent 373 000 copies

d‟ADNmt. Ils ont observé la cinétique du contenu d‟ADNmt qui est constante pendant la

maturation, mais il y a une déplétion d‟environ 60 % d‟ADNmt dans l‟embryogenèse

pendant le période de 2 à 4-8 cellules (May-Panloup et al., 2005; St John et al., 2010).

Malgré cette perte en copies d‟ADNmt, les ovocytes compétents ont une capacité

intrinsèque pour augmenter le nombre d‟ADNmt pendant l‟étape de blastocyste par rapport

aux ovocytes non-compétents (Chiarrati et al., 2010). St John et al. (2010) ont observé que

l‟augmentation de la réplication de l‟ADNmt au stade de blastocyste est plus active dans les

cellules du trophectoderme comparativement aux cellules de masse cellulaire interne, ce qui

suggère que la compétence des embryons est corrélée avec le nombre de cellules du

trophectoderme.

Il a été établi comme un dogme essentiel que l‟ADNmt provient uniquement du génome

maternel. Ainsi, la recombinaison des génomes mitochondriaux paternels et maternels est

strictement impossible (Cummins, 1998; May-Panloup et al., 2004; Shoubridge , 2000).

Malgré que le spermatozoïde transfère ses mitochondries au cytoplasme de l‟ovocyte au

moment de la fécondation, ces mitochondries paternelles sont éliminés au cours des

premières divisions cellulaires du jeune embryon (Cummins, 2000; May-Panloup et al.,

2005). Ainsi, la mitochondrie paternelle est normalement éliminée par une destruction

protéolytique suite à un marquage spécifique par ubiquitination (Stuvosky et al., 2000).

Cependant, malgré toutes ces évidences, Stuvosky et al. (2000) ont conclu que dans

certaines conditions, une mitochondrie d‟un spermatozoïde peut échapper à la mort

protéolytique et peut ainsi se combiner avec la mitochondrie d‟un ovule. Un mécanisme

possible qui permettrait à la mitochondrie paternelle d‟échapper à la destruction serait

d‟échapper à l‟ubiquitination lors d‟une vague de fusions et de redistribution

mitochondriales dans le cytoplasme de l'ovocyte (Cummins, 2000). Par contre, ce mélange

de génomes mitochondriaux pourrait engendrer des embryons ayant un développement

anormal (Cummins, 2000). De plus, il y a des évidences qui supportent que l‟hétéroplasmie

67

(présence de plusieurs types d‟ADNmt dans une cellule par intégration de différents types

de mitochondries ou encore issue de mutations à l‟ADNmt) peut se produire lors de

l‟application de nouvelles technologies de reproduction assistée. Par exemple, l‟injection

intra-cytoplasmique de spermatozoïde (ICSI) a forcé la réévaluation de la contribution

potentielle de l‟ADNmt masculin au zygote (Shoubridge et al., 2000).

Cependant, la recherche a démontré que la ségrégation de l‟ADNmt qui porte des mutations

pathogéniques se produit lors des premières divisions mitotiques des cellules germinales et

elles sont transmises rapidement aux générations futures. Le seul facteur qui peut faire

varier la présence de l‟ADN mutant est la distribution anormale de l'organite au début de

l'embryogenèse. De cette façon, non seulement les mitochondries sont importantes pour le

métabolisme des ovocytes, mais leur nombre est aussi un facteur prédictif de la

compétence fonctionnelle (Shoubridge, 2000).

Des études suggèrent fortement qu‟il existe un lien entre la richesse en ADNmt d‟un

ovocyte et sa fécondabilité. Ainsi, le contenu d‟ADNmt reflète la masse mitochondriale qui

pourrait être un outil de la qualité des ovocytes (May-Panloup et al., 2007). May-Panloup et

al. (2005) et Jeong et al. (2009) ont justifié l‟hypothèse que la réduction du nombre de

copies et la qualité de l‟ADNmt diminuent l‟activité mitochondriale pouvant ainsi affecter

leur capacité à produire de l‟ATP et la compétence des ovocytes chez les bovins.

Cependant, tel qu‟il a été décrit avant, le nombre de copies d‟ADNmt montrent une très

grande variabilité entre les ovocytes. De cette façon, Wai et al. (2010) ont résolu que le

nombre de copies d‟ADNmt peut diminuer mais doit rester à une quantité minimum (entre

40 000 et 50 000 copies) pour maintenir un développement normal. Dans la même veine,

le nombre de copies d‟ADNmt a aussi été utilisé comme paramètre de compétence

développementale pour comparer des ovocytes de différentes sources. Kameyama et al.

(2007) et Zeng et al. (2009) ont aussi observé que les ovocytes en culture in vitro chez le

rat ont un potentiel réduit pour le développement comparé aux ovocytes de follicules pré-

ovulatoires in vivo. Ce résultat est dû à la réduction significative du nombre de copies

d'ADNmt, laquelle affecte la quantité d'ATP.

68

1.3.6 Les mitochondries et la reproduction

La littérature scientifique a conclu que les spermatozoïdes de bovins qui ont une activité

mitochondriale élevée ont une motilité élevée, laquelle entraînerait un grand potentiel de

fécondation (Graham et al., 1990). En revanche, une étude récente a mis en évidence que le

taux de fertilité élevé des taureaux ne serait pas relié à une plus haute activité

mitochondriale. Ainsi, Al Naib et al. (2011) ont observé que les taureaux avec une haute

fertilité en conditions in vitro ont présenté une haute motilité des spermatozoïdes post-

congélation et un haut taux de clivage, mais le taux de blastocyste n‟était pas différent par

rapport aux taureaux avec une basse fertilité. Ils ont démontré que le pouvoir de

fécondation des spermatozoïdes n‟a pas de lien avec l‟activité mitochondriale.

Par ailleurs, des études ont confirmé que les spermatozoïdes avec un contenu bas ou

presque exempt de copies d‟ADNmt semblent avoir la meilleure capacité de fécondation,

tandis que ceux avec un plus haut contenu en ADNmt auraient de moins bonnes capacités

pour la fécondation (May-Panloup et al., 2007). Le taux d‟ADNmt pourrait donc être un

marqueur de la maturation spermatique, mais des études complémentaires doivent être

développées afin de confirmer si l‟ADNmt peut être un outil de sélection de la qualité

spermatique.

En revanche, considérant que le spermatozoïde possède un contenu d‟ADNmt d‟environ 10

copies et que celui de l‟ovocyte s‟élève à environ environ 150 000 copies qui pourrait être

lié à leur pouvoir de fécondation et utilisé comme un outil de sélection (May-Panloup et

al., 2007; Wai et al., 2010). Comme décrit précédemment, la recherche supporte l‟idée

qu‟un nombre réduit de copies d‟ADNmt est associé à un faible niveau de compétence

développementale des ovocytes chez les bovins (May-Panloup et al., 2005; Jeong et al.,

2009; Wai et al., 2010). Cependant, les ovocytes montrent une déplétion normal du nombre

de copies au cours de l‟embryogenèse (May-Panloup et al., 2005), mais il a été mis en

évidence que les ovocytes compétents ont la capacité de récupérer leur nombre de copies à

69

travers la réplication de l‟ADNmt au stade de blastocyste chez les embryons bovins (May-

Panloup et al., 2005; St John et al., 2010).

Après la fécondation, les mitochondries sont redistribuées dans le zygote probablement

pour fournir l‟ATP nécessaire pour les évènements de l‟embryogenèse (Barnett et al., 1996;

Krisher et Bavister, 1998; Stojkovic et al., 2001). Les embryons, dans les premières

divisions cellulaire, ont le contingent mitochondrial maternel ovocytaire dont le nombre

demeure constant et serait suffisant pour assurer l‟apport énergétique nécessaire au

développement embryonnaire (May-Panloup et al., 2005; Dumollard et al., 2009). Bien que

les mitochondries aient un métabolisme limité à cause de la suppression de la glycolyse

pendant les premiers stades du développement, cela n‟empêche pas d‟avoir une

embryogenèse normale (Thompson et al. 1996, Dumollard et al., 2007).

Dumollard et al. (2009) ont suggéré que les embryons sont probablement sensibles au

stress oxydatif, lequel peut arrêter leur développement de façon permanente et commencer

l‟apoptose au moment de l‟activation du génome. En effet, au stade de morula, les

mitochondries montrent des changements de leur morphologie (Plante et King, 1994;

Crocco et al., 2011), de l‟activité mitochondriale (Thompson et al. 1996; Tarazona et al.,

2006) et de leur nombre de copie d‟ADNmt (May-Panloup et al. 2005), ce qui supporte

l‟hypothèse de l‟activation des mitochondries des embryons. La synchronisation entre

l‟AGE et l‟augmentation des ADNmt confirme la croissance de l'activité mitochondriale

(Crocco et al., 2011), laquelle augmente de façon progressive jusqu‟au stade de blastocyste

(Tarazona et al., 2006; Romek et al., 2010).

La littérature scientifique a déterminé que l‟apport le plus important des mitochondries est

la production d‟ATP pour soutenir l‟embryogenèse. Thompson et al. (2000) ont conclu que

la régulation de la production d‟ATP par les mitochondries pendant les périodes de

compaction et de blastulation des embryons in vitro améliore la production de ces derniers.

Malgré toutes ces études, le lien entre la qualité de l‟ADNmt, le contenu, l‟activité et la

70

production d‟ATP des mitochondries demeure encore matière à recherche. Ainsi, la

spécificité de son implication sur la reproduction reste à démontrer.

71

1.4 LES LIPIDES DANS LA FONCTION DE LA REPRODUCTION

1.4.1 Les lipides dans l’alimentation animale

Les lipides sont ajoutés dans la ration des vaches laitières pour améliorer la production et

ce, en raison des propriétés caloriques et des fonctions sur le métabolisme qui leur sont

associées (Jenkins, 1994). En effet, certains lipides peuvent accomplir un rôle essentiel

dans le métabolisme car ils régulent et intègrent la plupart des voies métaboliques (Moran

et al., 2012).

La première période post-partum est la phase la plus critique du niveau d‟énergie des

vaches laitières. Ainsi, la recherche a mis en évidence que la supplémentation en lipides

dans la ration peut avoir un effet concret indépendant du statut d'énergie de la vache

(Staples et al., 1998). En tentant d'améliorer le bilan énergétique, la supplémentation en

matières grasses augmente la teneur en énergie alimentaire laquelle stimule la production

de lait et donc la perte d'énergie, entraînant finalement des AGNE encore plus élevés, la

production dacide bêta-hydroxibutirique et une plus petite concentration en glucose et en

insuline (Leroy et al., 2008).

En effet, les lipides peuvent influencer positivement le statut reproducteur de la vache

laitière sur : la croissance de la taille du follicule ovulatoire, le nombre de follicules

ovariens, l‟augmentation de la durée de vie du corpus luteum (corps jaune) et l‟amélioration

de la fertilité (Staples et al., 1998; Mattos et al., 2000; Leroy et al., 2008; Santos et al.,

2008). Cependant, plusieurs études ont aussi permis d‟observer des réponses antagonistes

des vaches sur la production des embryons et ovocytes en raison de la supplémentation en

lipides (Leroy et al., 2008). Les lipides peuvent aussi avoir des effets directs sur la

transcription des gènes qui codent des protéines essentielles pour la reproduction (Mattos et

al., 2000).

72

Les mécanismes par lesquels la supplémentation de certains lipides dans la diète améliore

la performance de la reproduction n'ont pas été élucidés. Cependant, Staples et al. (1998)

ont proposé plusieurs hypothèses :

1) L‟amélioration du statut d‟énergie négatif peut mener à un retour rapide à l‟œstrus

post-partum et donc, à une fertilité améliorée.

2) L‟augmentation de stéroïdogenèse favorise l‟amélioration de la fertilité.

3) La manipulation d'insuline peut stimuler le développement de follicule ovarien.

4) Une stimulation ou une inhibition de la production et la libération de PGF2α, peut

influencer la persistance du corps jaune.

1.4.1.1 Effet des lipides dans l’alimentation sur la fonction ovarienne et les ovocytes

Les lipides supplémentés dans la diète des vaches peuvent influencer la fonction ovarienne

par l‟intermédiaire de l‟activité des prostaglandines. Les prostaglandines sont un type de

composé bioactif qui peut avoir une action sur la fonction de la reproduction. Par exemple,

la PGF2α est un médiateur important du processus de la parturition chez certaines espèces et

cause la régression du corps jaune qui mène à l'initiation d'un nouveau cycle œstral (Staples

et al., 1998; Mattos et al., 2000). Santos et al. (2008) et Staples et al. (1998) ont déterminé

que peu importe la source d‟AGPI dans la diète des vaches, ils peuvent influencer la

libération de PGF2α. Ainsi, certains lipides réduisent la production de PGF2α dans

l‟endomètre de l‟utérus de la vache, ce qui peut retarder l'achèvement de la lutéolyse et

pourrait améliorer la fertilité en stabilisant la grossesse et en réduisant les pertes

embryonnaires (Mattos et al., 2000; Leroy et al., 2008).

Mattos et al. (2000) ont vu dans plusieurs études que l'alimentation supplémentée en lipides

change aussi la dynamique de croissance du follicule ovarien et cet effet est indépendant du

statut énergétique. Lucy et al. (1991) ont démontré que la supplémentation en AG à longue

chaîne peut provoquer l‟augmentation du nombre et la taille des follicules pré-ovulatoires,

73

probablement par l'induction de la concentration de cholestérol dans le plasma et le liquide

folliculaire (Leroy et al., 2008). Ils ont observé un accroissement de la taille folliculaire

passant de petits follicules (3 à 5 mm de diamètre) vers des follicules de taille moyenne (6 à

9 mm).

De façon similaire, d‟autres études ont démontré l‟effet des AGPI (soit oméga-3 ou oméga-

6) sur la fonction des ovaires avec des résultats variables. Thomas et al. (1997) et Robinson

et al. (2002) ont aussi démontré que le nombre et le diamètre du follicule changent

conséquemment à une alimentation riche en ALA (oméga-3) ou LA (oméga-6). Ils ont

observé que le nombre de follicules de taille moyenne (5 à 10 mm) s‟accroît avec des diètes

riches avec LA en comparaison avec des diètes contrôles. Néanmoins, Ponter et al. (2006)

ont étudié que la supplémentation de diètes riches en LA augmente aussi le nombre de

petits follicules en comparaison avec ALA, mais n‟ont pas observé de différences sur le

nombre de follicules de taille moyenne. De récentes études, Fouladi-Nashta et al. (2007) et

Zachut et al. (2010), ont démontré que des diètes avec une basse concentration de lipides

augmentent le nombre de follicules de petite et moyenne taille, alors que Zachut et al.

(2010) ont observé au contraire, qu„une diète riche en LA augmente le nombre de gros

follicules. Zachut et al. (2010) ont conclu que l‟effet des AGPI sur la dynamique

folliculaire est dépendant de la concentration des AGPI dans la diète des vaches, de la durée

de la supplémentation ou de ces deux facteurs combinés.

La supplémentation en AGPI dans les diètes peut aussi affecter la compétence des

ovocytes, mais les résultats sont divergents selon les espèces. Zeron et al. (2002) ont

observé une plus grande proportion d‟ovocytes avec une meilleure qualité morphologique

(grade 1) chez les brebis qui ont été nourries avec une diète riche en huile de poisson

(oméga 3). Néanmoins, Wakefield et al. (2008) ont observé que la supplémentation en

ALA réduit la qualité morphologique et la compétence des ovocytes chez les souris. Chez

les vaches laitières, Bilby et al. (2006) n‟ont pas trouvé de différences sur la qualité des

ovocytes entre les vaches qui ont reçu des diètes riches en LA (71 grammes/jour/vache) et

celles qui ont reçu des diètes riches en ALA (140 grammes/jour/vache). Cependant,

74

Fouladi-Nashta et al. (2007) et Zachut et al. (2010) ont observé une plus faible proportion

d‟ovocytes de grade 2 et 1 respectivement avec une diète riche en gras (LA : 260

gr/jour/vache) en comparaison à la diète faible en gras.

Comme conséquence de la variation de la qualité des ovocytes par la supplémentation en

AGPI, le taux de clivage est aussi affecté. Fouladi-Nashta et al. (2007) ont déterminé un

faible taux de clivage bien qu‟ils aient trouvé des ovocytes de meilleure morphologie chez

les vaches nourries avec une basse concentration de gras. Cependant, Zachut et al. (2010)

ont étudié que le taux de clivage augmente avec des diètes riches en ALA, mais ces

résultats n‟ont pas été obtenus par Bilby et al. (2006). Ces derniers n‟ont pas observé

d‟effets sur le taux de clivage, car les AG n‟ont pas été prélevés dans le liquide folliculaire,

mais plutôt dans le lait produit.

1.4.1.2 Effet des lipides dans l’alimentation sur les embryons

Bien que l‟effet divergent du contenu de gras dans l‟alimentation sur la qualité des

ovocytes ait été démontré, peu d‟indices sont actuellement disponibles dans la littérature

scientifique sur la qualité et le développement des embryons chez la vache laitière.

Thangavelu et al. (2007) n‟ont pas observé d‟effets de l‟ajout des AGMI ou des AGPI dans

les diètes des vaches sur le taux de fécondation et sur le nombre d‟embryons. Cependant,

Fouladi-Natasha et al. (2007) et Thangavelu et al. (2007) ont déterminé que l‟augmentation

du nombre de cellules des blastocystes en expansion et un meilleur taux de qualité des

blastocystes ont été observés grâce à l‟ajout des AGPI dans la diète des vaches.

Par contre, une étude subséquente a démontré l‟effet négatif des AGPI sur la fécondation et

la qualité des embryons. Petit et al. (2008) ont démontré que l‟ajout d‟ALA dans la diète

des vaches diminue le taux de fécondation et la qualité des embryons en augmentant le taux

de fragmentation cellulaire. Ils ont corrélé ce résultat avec la quantité d‟AG à longue chaîne

ainsi que le nombre de doubles liaisons dans les AG. En revanche, une étude récente a

75

démontré l‟effet positif des AGPI à l‟instar de ces autres études. En effet, Cerri et al. (2009)

ont démontré des effets positifs sur la proportion d‟embryons avec une qualité supérieure et

aussi sur le nombre de blastomères par embryon de vaches qui ont reçu une diète riche en

AGPI.

Santos et al. (2008) et Cerri et al. (2009) ont conclu que les variations entre les résultats

obtenus dans la littérature seraient dues à la difficulté d‟estimer la doses exacte d‟AGPI, car

il y a digestion dans le rumen et aussi, parce que la réponse du traitement n‟est pas bien

évaluée. En effet, certaines études indiquent que les embryons se sont développés dans

d‟autres conditions, in vitro en l‟occurrence, donc ne représentent pas les vraies conditions

in vivo. Cependant, ils ont aussi conclu que l‟ajout des AGPI a donné plusieurs évidences

qui démontrent l‟effet positif sur la qualité des embryons, mais cela devrait être confirmé

dans l‟avenir.

1.4.2 Les acides gras de l’ovocyte et de l’embryon : Revue

Les chercheurs en reproduction sont intéressés à connaître le contenu lipidique des

ovocytes et des embryons depuis qu‟il est admis que la qualité des membranes cellulaires et

par conséquent leur contenu en phospholipides joue un rôle important dans leur

compétence. Plusieurs méthodes ont été développées pour mesurer le contenu lipidique

chez plusieurs espèces. Un grand facteur limitant est la quantité de matériel biologique,

mais la recherche a permis de corriger ceci par l‟application de plusieurs méthodes

d‟analyses des lipides et l‟obtention des ovocytes à partir des ovaires de mammifères

domestiques dans les abattoirs (Ferguson et Leese, 1999 ; Sata et al., 1999; McEvoy et al.,

2000).

De cette façon, Ferguson et Lesse (1999) ont essayé de calculer le contenu en TAG des

ovocytes et des embryons chez les bovins. Ils ont trouvé que les ovocytes ont une

concentration de 59 ng en TAG avant la maturation et elle diminue à 46 ng après celle-ci.

Cette diminution est continue après la fécondation. Ils ont observé que le contenu en TAG

76

est de 34 ng dans les embryons à 2 cellules et le contenu est stable jusqu‟au stade de

blastocyste (36 ng). De cette façon, ils ont démontré que la quantité de TAG dans l‟ovocyte

immature constitue une réserve énergétique fondamentale pour le développement ultérieur

de l‟embryon.

Sata et al. (1999) ont déterminé le contenu des ovocytes des bovins en utilisant la technique

standard de chromatographie en phase gazeuse. Ils ont déterminé que l‟acide myristique

(59,6 %) et docosahexaénoïque (12,3 %) sont les AG les plus abondants dans les ovocytes

immatures. Cependant, d‟autres études comme celles de McEvoy et al. (2000) et Kim et al.

(2001) ont aussi étudié le contenu des AG dans les ovocytes immatures. Ils ont démontré

contrairement à Sata et al. (1999) que l‟acide palmitique (32 %); l‟acide oléique (25 %) et

l‟acide stéarique sont les AG les plus abondants dans le profil des ovocytes immatures des

bovins. Kim et al. (2001) ont trouvé d‟autres résultats par rapport à ceux qui ont été obtenu

par Sata et al. (1999) et qui pourraient être attribués aux différences d‟âges ou races de

vache différentes utilisées dans leur expérience. En plus, Sata et al. (1999) et Kim et al.

(2001) ont aussi observé la réduction de la concentration du contenu lipidique des ovocytes

immatures après la maturation, ce qui confirme l‟utilisation des lipides comme source

d‟énergie comme il a été décrit précédemment (Ferguson et Leese, 1999).

Par ailleurs, Sata et al. (1999) ont relevé des différences entre les profils des AG des

embryons in vitro selon le milieu de culture. Ils ont en effet démontré que les embryons de

2 cellules cultivés dans un milieu avec sérum ont montré un niveau élevé d‟acides

palmitique (27,6 %) et stéarique (27,2 %) et un niveau bas d‟acide mystirique (21,9 %)

tandis que les embryons de 2 cellules cultivés dans un milieu sans sérum ont le même profil

lipidique que les ovocytes immature. Au stade de blastocyste, Sata et al. (1999) ont aussi

déterminé que les AG les plus abondants dans les deux systèmes de culture sont les acides

palmitique et stéarique, mais qu‟il y avait une certaine concentration d‟acide oléique dans

les blastocystes qui ont été en culture avec du sérum. De la même façon, Charpigny et al.

(2003) ont déterminé par chromatographie en phase gazeuse que les acides palmitique,

77

stéarique et oléique étaient les acides les plus abondants des embryons collectés in vivo

dans le 7e, 13

e et 16

e jours de développement.

Dernièrement, Ferreira et al. (2010) ont utilisé la désorption-ionisation laser assistée par

matrice (MALDI-MS) comme méthode facile et rapide pour obtenir les profils lipidiques

ainsi que l‟identification des AG principaux des ovocytes et des embryons avec un nombre

limité d‟échantillons. Ils ont aussi observé une grande abondance d‟ions à 760,6 m/z [PC

(34:1) + H] + qui est l‟acide palmitique et à 782,6 m/z [PC (36:4) + H]

+ ou [PC (34:1) +

Na]+ qui est l‟acide oléique, tous les deux présents dans les ovocytes et les embryons in

vivo de bovins. En accord avec de précédentes études, Ferreira et al. (2010) ont aussi

montré la variation du profil lipidique des embryons par rapport aux ovocytes. Ils ont

observé une grande présence d‟ions 786,6 m/z [PC (36:2) + H] +

; 788,6 m/z [PC (36:1) +

H] +, 808,6 m/z [PC (36:2) + Na]

+ ou [PC (38:5) + H]

+ et 810,6 m/z [PC (38:4) + H]

+ ou

[PC (36:1) + Na] + comparativement aux ovocytes de bovins.

1.4.3 Les lipides sur la production in vitro des embryons

La section précédente démontre bien l‟effet divergent de la supplémentation des lipides

dans la diète sur la qualité des ovocytes et des embryons produits in vivo chez la vache

laitière. Ceci amène à observer différentes manières de mesurer l‟influence des lipides en

conditions environnementales plus contrôlées. De cette façon, la production des embryons

in vitro est une méthode standardisée utilisée depuis longtemps malgré qu‟elle ait été

décrite comme un processus inefficace. Lonergan et al. (2001) et Camargo et al. (2006) ont

conclu que tandis que la maturation (90 %) et le clivage (80 %) ont une haute performance,

la proportion d‟embryons qui atteint le stade de blastocyste est rarement plus de 40 %.

Plusieurs revues de littérature ont déterminé qu‟un des facteurs qui détermineraient la

qualité des embryons est le milieu de culture (Abe et al., 1999; Crosier et al., 2001;

Lonergan et al., 2001; Abe et al., 2002a; Rizos et al., 2003; Camargo et al., 2006). Les

78

techniques de culture in vitro des embryons se sont considérablement améliorées au cours

des dernières années. Ainsi, différents systèmes de culture ont été testés avec l‟objectif

d‟améliorer la disponibilité des nutriments en modifiant la concentration des composants du

milieu pour d‟une part, remplir les exigences nutritionnelles et d‟autre part, obtenir de

meilleurs taux de blastocystes (Thompson, 2000a; Camargo et al., 2006). Par exemple, la

recherche a étudié le métabolisme énergétique, ce qui a permis d‟améliorer notre

compréhension des exigences de substrats énergétiques permettant le développement

embryonnaire et ainsi déterminer que la concentration de glucose peut être réduite et

complémentée avec de l‟EDTA (Thompson, 2000a).

De cette façon, plusieurs évidences démontrent aussi l‟importance du rôle que jouent les

lipides dans le développement précoce. Ce sujet de recherche a été la matière de revues de

littérature récentes expliquant l‟implication très importante des lipides endogènes et

exogènes au cours du développement (Sturmey et al., 2009; McKeegan et Sturmey, 2011).

McKeegan et Sturmey (2011) ont conclu que les lipides peuvent affecter le métabolisme, le

stress oxydatif, la composition des membranes, les évènements de la signalisation cellulaire

et l‟expression des gènes. En conséquence, l‟effet des lipides dans la culture des embryons

produits in vitro a été un sujet d‟intérêt, car plusieurs études ont mis en évidence le fait que

la concentration des lipides dans l‟ovocyte et l‟embryon peut être changée selon les

modifications dans le milieu de culture (Sturmey et al., 2009). Ce dernier point sera abordé

dans les prochaines sections de ce chapitre.

1.4.3.1 Effet de l’ajout du sérum ou BSA dans la culture des embryons

1.4.3.1.1 Effet de l’ajout du sérum

La supplémentation en sérum, comme principal composant du milieu de culture, a été

utilisée pour améliorer l‟efficacité de la culture des embryons chez le bovin. Le sérum a été

ajouté dans le milieu de culture comme une composante qui apporte de l‟énergie, des

vitamines, des acides gras, des aminoacides, des facteurs de croissance, etc, lesquels

79

peuvent devenir essentiels pour soutenir le développement embryonnaire (Pinyopummintr

et Bavister, 1994).

La littérature scientifique a démontré les effets favorables de la culture des embryons chez

le bovin avec le sérum, particulièrement avec le sérum de veau fœtal (SVF), malgré la

nature non définie et variable de sa composition. Plusieurs études ont confirmé que la

supplémentation de SVF dans le milieu synthétique SOF (modified synthetic oviductal

fluid) accélère le clivage ce qui nous permet d‟obtenir un accroissement du taux de

blastocyste au jour 6 post-insemination en comparaison avec d‟autres sources de protéines

(Pinyopummintr et Bavister, 1994; Van Langendonckt et al., 1997; Thompson et al., 1998;

Gutiérrez-Adán et al., 2000; Holm et al., 2002; Rizos et al., 2003). Cependant en 1991,

Pinyopummintr et Bavister ont suggéré que la supplémentation en SVF dans le milieu de

culture a un effet biphasique pendant le développement des embryons chez le bovin.

Comme il est décrit ci-dessus, la supplémentation en SVF peut accélérer la formation des

blastocystes, mais elle peut aussi limiter le développement pendant les premiers clivages (2

à 8 cellules). Van Langendonckt et al. (1997) et Holm et al. (2002) ont observé que

l‟absence de SVF dans le milieu pendant la maturation et la fécondation augmente

significativement la durée du premier et du quatrième cycle cellulaire de 4 à 5 heures. Ils

ont observé que le quatrième cycle cellulaire (durant lequel arrive l‟AGE) a été plus court

en culture avec le sérum, car ils ont observé de jeunes blastocystes environ 16 à 18 heures

plus tôt. De plus, il a aussi été remarqué que le sérum peut augmenter la durée de la

gestation et le poids à la naissance (un phénomène appelé « large offspring syndrome ») des

embryons qui ont été cultivés en présence de sérum (Thompson et al., 1995).

Bien qu'en production embryonnaire in vitro la supplémentation en SVF ait donné de bons

résultats sur le taux de blastocystes, il est aussi reconnu qu‟il existe une influence du sérum

sur la morphologie et la variation dans la composition des AG des embryons. La recherche

a bien démontré que la supplémentation en sérum dans le milieu de culture peut influencer

l‟accumulation des lipides sous la forme de gouttelettes lipidiques (GL) dans les

blastomères des embryons. En effet, celles-ci donnent une apparence plus noire au

80

cytoplasme et une couleur foncée aux embryons (Thompson et al., 1995; Abe et al., 1999;

Sata et al., 1999; Crosier et al., 2001; Abe et al., 2002; Abe et al., 2002a).

En plus, plusieurs études ont démontré qu‟il est probable que l‟accumulation de lipides

dans les embryons soit due à l‟exposition au sérum pendant la culture. Sata et al. (1999) ont

rapporté que le changement du profil des AG des embryons est très semblable au sérum, ce

qui indique que les embryons peuvent prendre facilement les AG, les phospholipides et les

TAG du milieu contenant du sérum. Ferguson et Leese (1999) et Kim et al. (2001) ont

observé aussi une augmentation significative de la quantité de TAG dans les embryons

après la culture avec SVF, mais les mécanismes d‟accumulation ne sont pas connus. Ils ont

proposé que le sérum stimule l'embryon à synthétiser ses propres TAG ou, plus

probablement, certains lipides du sérum sont repris par pinocytose et les TAG déposés dans

le cytoplasme intracellulaire. Comme décrit précédemment, la présence du sérum peut

influencer la composition des GL dans le cytoplasme des embryons. La littérature a

fortement suggéré que c‟est parce que le sérum peut avoir un effet nuisible sur la structure

des mitochondries et l‟accumulation des GL était causée par une détérioration de la

fonction mitochondriale car les lipides intracellulaires sont normalement métabolisés par

les mitochondries (Dorland et al., 1994; Abe et al., 1999; Crosier et al., 2001; Abe et al.,

2002a; Rizos et al., 2003).

Plusieurs études soulèvent l'importance du sérum sur l‟expression de certains gènes dans

les embryons. Holm et al. (2002) ont observé un clivage plus rapide dans les embryons en

culture avec sérum, car ce dernier exerce une influence importante sur l‟expression des

ARNm des embryons et aussi sur les gènes impliqués dans la compaction et la formation

des blastocèles (Wrenzycki et al., 1999). De même façon, Rizos et al. (2003) ont aussi

démontré que la présence du sérum augmente significativement les niveaux d‟expression

des gènes liés à l‟apoptose (Bax), au stress oxydatif (MnSOD, SOX) et à la différentiation

et à l‟implantation (LIF et LR-β) au cours des premiers jours du développement dans le

période de culture in vitro.

81

1.4.3.1.2 Effet de l’ajout du BSA

Les effets du sérum sur la limitation du développement des embryons pendant les premiers

clivages (Pinyopummintr et Bavister, 1994), sur la morphologie présentant un plus grand

contenu lipidique (Thompson et al., 1995; Abe et al., 1999; Sata et al., 1999; Crosier et al.,

2001; Abe et al., 2002a) et sur l‟expression des certains gènes (Wrenzycki et al., 1999;

Rizos et al., 2003) ont conduit à changer le sérum pour d‟autres molécules. Ces dernières

années, le sérum a été remplacé par le BSA (albumine de sérum bovin) comme source de

protéines dans les milieux de cultures des embryons bovins (Thompson et al., 1995; Abe et

al., 1999; Abe et al., 2002a; Rizos et al., 2003).

Thompson et al. (2000a) ont démontré que le BSA a eu un effet bénéfique sur le

développement embryonnaire, car il joue un rôle substantiel dans le métabolisme pendant le

développement des blastocystes, spécialement pendant la période post-compaction.

L'albumine sérique est un réservoir de stéroïdes, de vitamines et de cholestérol. Il est

particulièrement bien adapté comme transporteur des acides gras dont les AGNE qui ont

une importance métabolique. L‟inclusion de BSA pourrait représenter l‟inclusion de 15 µg

d‟AG par mg de BSA utilisé dans la préparation de milieu de culture (Bavister, 1995).

Cependant, il est difficile d'élucider les fonctions spécifiques de facteurs de croissance ou

d'autres composantes de BSA, car il est un mélange indéfini de composés (Bavister, 1995,

Thompson et al., 2000a).

La recherche a démontré que les conditions de culture avec le BSA peuvent avoir un effet

sur la qualité de la morphologie des blastocystes supérieur à celui obtenu par la culture avec

sérum. Plusieurs études ont permis d‟observer une influence sur le nombre de GL dans le

cytoplasme. En effet, ces études rapportent une réduction significative des GL, ce qui

permettrait idéalement d‟avoir une meilleur survie à la cryopréservation (Thompson et al.,

1995; Abe et al., 1999; Sata et al; 1999;Abe et al., 2002a; Rizos et al., 2003).

82

1.4.3.2 Effet de l’ajout des AG dans la culture des embryons

Initialement, il fut établi que les lipides endogènes et exogènes jouent un rôle important

dans le développement des embryons (McKeegan et Sturmey, 2011). Cependant, pour une

raison ou une autre, il n‟a pas été possible d‟élucider le mécanisme réel par lequel les

lipides peuvent affecter la fonction de reproduction. Par exemple, les lipides ont un rôle

multiforme et les effets peuvent être modulés par les mécanismes endocriniens ainsi que

par l‟apport d‟éléments nutritifs dans l‟alimentation. Cependant, chez les bovins et les

ovins, les graisses alimentaires dégradables dans le rumen peuvent perturber le

fonctionnement du rumen et ainsi affecter négativement le bilan énergétique (Sturmey et

al., 2009). Cela a suscité l‟intérêt de plusieurs études afin de connaître les effets de l‟ajout

d‟acides gras dans le milieu de culture dans la production in vitro des embryons

(McKeegan et Sturmey, 2012).

Imai et al. (1997); Hochi et al. (1999) et Tominaga et al. (2000) ont observé un effet positif

de l‟incorporation de LA dans le milieu de culture sur la performance des blastocystes, des

morulas et des embryons qui ont 16 cellules lors de la cryopréservation. Ils ont conclu que

malgré qu‟ils n‟aient pas observé une augmentation du taux de blastocystes lors de la

culture des embryons avec LA, ces embryons ont obtenu après la cryopréservation un taux

élevé de blastocystes, probablement en raison de l‟augmentation de la fluidité membranaire

influencée directement par le niveau d'insaturation de la bicouche lipidique (Hochi et al.,

1999).

Quelques études subséquentes ont aussi démontré l‟effet de LA sous la forme d‟acide

linoléique conjugué (ALC) dans la culture des embryons. Malgré que Pereira et al. (2007)

n‟ont observé aucun effet sur le taux de blastocystes lors de la culture avec ALC, ces

embryons ont montré de bonnes performances à la cryopréservation, car l‟ALC a un effet

réducteur sur le nombre des GL des embryons. Par ailleurs, Marei et al. (2010) ont observé

des résultats opposés à ceux mentionnés précédemment. Ils ont remarqué des effets négatifs

de la supplémentation de LA dans le milieu sur la maturation des ovocytes et l‟inhibition du

83

développement de l‟embryon. Cependant, cet effet observé est réversible, car il est

dépendant de la concentration de LA dans le milieu de culture.

Lors d‟une étude précédente, le même groupe de chercheurs a aussi étudié l‟impact de ALA

sur le milieu de maturation des ovocytes. Marei et al. (2009) ont aussi observé que de

hautes concentrations en ALA ont un effet néfaste sur les ovocytes. Cependant, en

concentrations modérées, les ALA ont un effet positif sur la maturation des ovocytes et le

développement des blastocystes.

Quelques études subséquentes ont remis en question l‟effet combiné de deux AG dans la

culture des embryons. Aarderma et al. (2011) ont démontré que l‟acide oléique a un effet

positif sur l‟accumulation des lipides dans les ovocytes bovins malgré des effets

défavorables des autres acides gras saturés majeurs comme l‟acide palmitique et l‟acide

stéarique. Cette étude suggère que le ratio des acides gras saturés : polyinsaturés est critique

pour la maturation des ovocytes et le développement des embryons.

De cette façon, McKeegan et Sturmey (2011) ont conclu dans leur revue de la littérature

que les recherches en cours devraient se concentrer sur les ratios physiologiquement

pertinents et les combinaisons d'acides gras plutôt que sur chacun des acides gras isolés, car

leurs rôles combinés sont à la fois subtils et complexes. La modification du rapport d'acides

gras spécifiques dans l'alimentation des modèles animaux et en milieu de culture in vitro

peut entraîner une dérégulation importante du processus cellulaire et du développement; un

problème qui s'étend à la fertilité humaine.

1.4.4 Effet des lipides sur l’efficacité de la cryopréservation

La cryopréservation des embryons est une technique qui a fait d‟énormes progrès depuis

quelques années au cours desquelles ont été rapportés les premiers succès de congélation

d‟embryons de mammifères. Cependant, même si ces avancements offrent tous les

84

avantages, la multiplicité des protocoles n‟a pas permis son application massive sur le

terrain et ce, en raison de plusieurs limitations.

Il est bien démontré que le succès de la cryopréservation est affecté par la concentration de

GL cytoplasmique, ce qui affecte la sensibilité des embryons chez les bovins lors du

processus de congélation (Abe et al., 1999; Abe et al., 2002a; Pereira et al., 2007).

Cependant, il y a aussi d‟autres facteurs qui auront une influence sur la performance des

embryons à la cryopréservation comme l‟origine de l‟embryon (in vivo ou in vitro),

l‟espèce, le stade de développement, la race, etc.

1.4.4.1 La morphologie des embryons

L‟évaluation de la morphologie des embryons est l‟outil le plus utilisé dans la classification

des embryons dans le programme de reproduction assistée chez les bovins (Van Soom et

al., 2003). L‟objectif de cette méthode est la sélection des embryons viables. Linder et

Wight (1983) ont déterminé que la qualité de la morphologie des embryons est une

caractéristique plus précise pour sélectionner les embryons qui auront du succès lors de leur

transfert, malgré l‟énorme variabilité entre l‟état de développement et la qualité des

embryons. Ils ont classifié la qualité des embryons en catégorie : les embryons d‟excellente

qualité ont obtenu les taux de grossesse les plus élevés en comparaison des embryons de

piètre qualité. Cette méthode de classification est basée sur des paramètres morphologiques

comme le couleur, la forme, la taille de l‟espace périvitellin, le nombre de cellules

extrudées et dégénérées et le nombre et la taille des vésicules (Tableau 4).

De cette façon, les dernières études ont montré une haute corrélation entre l‟ultrastructure

embryonnaire, l‟expression génique et sa conséquente cryorésistance, fournissant ainsi une

évidence beaucoup plus exacte qu‟une simple sélection des embryons (Van Soom et al.,

2003). Cependant, la morphologie embryonnaire est aussi influencée par plusieurs facteurs

qui peuvent réduire sa puissance prédictive et modifier sa variabilité limitant ainsi sa valeur

comme méthode. Aguilar et al. (2002) ont déterminé que l‟utilisation de la microscopie et

85

l‟expérience des évaluateurs peuvent induire des différences entre les résultats. Ceci peut

être expliqué par la résolution du microscope ou de la résolution stéréoscopique, lesquelles

ne permettent pas de distinguer les structures qui fournissent des informations plus précises

(Aguilar et al., 2002).

Malgré toutes les limitations, l‟évaluation de la morphologie des embryons est l‟instrument

de sélection le plus répandu et le plus important pour l‟industrie depuis que les embryons

sont utilisés au niveau commercial. De cette façon, Hasler (2001) a conclu que la qualité de

la morphologie des embryons était le facteur le plus important dans le succès du taux de

grossesse des embryons frais ou congelés-décongelés. Ce facteur pourrait ainsi donner une

sélection d‟embryons viables pour obtenir un haut taux de succès dans le transfert des

embryons et lors de la cryopréservation.

86

Tableau 4. Critères de classification de la qualité des embryons chez le bovin (Adapté de

Linder et Wirght, 1983).

Qualité d‟embryon Description Photo

Excellente

Embryon idéal qui a une forme

sphérique, symétrique avec des

cellules de taille, de couleur et

de texture uniformes.

Bonne

Embryon qui a quelques

imperfections insignifiantes

comme quelques blastomères

avec points extrudés, une

forme irrégulière et quelques

vésicules.

Acceptable

Embryon qui a des problèmes

précis, mais non graves :

présence de blastomères

extrudés, vésiculation,

quelques cellules dégénérées.

Pauvre

Embryon qui a de graves

problèmes comme de

nombreux blastomères

extrudés,

cellules dégénérées et de

différentes tailles, grandes et

nombreuses vésicules.

87

1.4.4.2 L’origine des embryons (in vivo ou in vitro)

Plusieurs études ont demontré que les conditions de culture au cours de la production

d'embryons in vitro peuvent avoir un impact sur le potentiel de développement de

l'embryon précoce et un impact lors de la cryopréservation en comparaison des embryons

d‟origine in vivo (Fair et al., 2001; Abe et al., 1999a; Abe et al., 2002a; Rizos et al., 2003).

Lonergan et al. (2001) et Sirard et al. (2006) ont identifié comme facteur principal la

qualité des ovules qui va déterminer leur compétence à se developper jusqu‟au stade de

blastocyste et aussi leur capacité à survivre aux processus de congélation. Plusieurs

chercheurs ont rapporté des différences au niveau morphologique entre les embryons in

vitro et les embryons in vivo (Plante et King., 1994; Crosier et al., 2000; Crosier et al.,

2001; Lonergan et al., 2001; Rizos et al., 2002).

La compaction des embryons peut être utilisée comme un paramètre pour déterminer l‟âge

et la cryorésistence des embryons devenant ainsi un outil important dans l'évaluation

globale de la morphologie (Van Soom et al., 2003). Crosier et al. (2000) et Holm et al.

(2002) ont observé que la condition de culture in vitro donne aux embryons une moins

bonne compaction à l‟état de morula, c'est-à-dire que les embryons in vitro ont 10 % de

plus de masse cellulaire par rapport aux embryons in vivo. Ce manque de compaction des

embryons in vitro est caracterisé par un court intervalle de temps depuis la morula jeune à

la morula compacte (Van Langendonckt et al., 1997 ; Holm et al., 2002). Ainsi, les

embryons in vivo restent au stade de morula compacte et subsissent la transition vers le

blastocyste plus lentement que celle des embryons in vitro, ainsi les morulas peuvent être

récupérées des vaches donneuses entre le 6e et le 8

e jour post-oestrus (Crosier et al., 2000).

Van Soom et al. (2003) ont conclu dans leur revue de littérature qu‟une courte période ou le

manque de compaction des embryons in vitro est rélié à une diminution de la survie lors de

la cryopéservation des blastocystes formés ultérieurement.

En comparaison des embryons in vivo, les embryons in vitro ont tendance à avoir un

cytoplasme foncé, comme conséquence de leur teneur élevée en lipides, ce qui peut

déterminer le faible succès lors de la congélation des embryons (Plante et King, 1994;

88

Crosier et al., 2000; Van Soom et al., 2003). Il est bien documenté que les embryons in

vitro ont une accumulation de GL dans leur cytoplasme, ce qui donne ce phénotype noir

des embryons (Thompson et al., 1995; Abe et al., 1999; Sata et al., 1999; Crosier et al.,

2001; Abe et 2002a). La littérature a établi plusieurs raisons pour lesquelles les embryons

in vitro ont cette caractéristique, mais les plus importantes sont :

La supplémentation en sérum dans le milieu, comme observé auparavant,

augmente la concentration des GL par stimulation de l'embryon à synthétiser leur

propre TAG ou mécanisme de pinocytose ( Ferguson et Leese, 1999; Kim et al.,

2001).

La structure et la fonction mitochondriales sont affectées par la culture avec

sérum, ce qui stimule la présence des GL (Dorland et al., 1994; Abe et al., 1999;

Crosier et al., 2001; Abe et al., 2002a; Rizos et al., 2003).

Crosier et al. (2000) suggèrent que cette densité de volume des lipides dans les

embryons in vitro peut résulter de la décomposition de la membrane en réponse à un

environnement de culture non physiologique plutôt que de l'absorption à partir du

milieu de culture.

Cependant, d‟autres études ont démontré que la concentration des lipides dans le

cytoplasme n‟est pas dependante seulement des conditions de culture. Ainsi, Plante et King

(1994) ; Crosier et al. (2001) ont observé que les lipides sont plus concentrés dans les

premiers stades de développement par rapport aux blastocystes.

Van Soom et al. (2003) ont déterminé que la ZP est un autre paramètre important pour

l‟évalution morphologique. Holm et al. (2002) ont observé que la ZP des embryons in vivo

ont une épaisseur moyenne significativement plus petite (diamètre moyen des blastocyste :

201 µm) par rapport aux embryons in vitro (diamètre moyen des blastocyste : 217-221 µm).

À l‟opposé, Abe et al. (1999a) décrivent une ZP plus mince des embryons in vitro par

89

rapport à ceux in vivo. En conséquence, ils ont conclu dans une étude ultérieure que le

diamètre des morulas compactées ne peut pas être utilisée comme critère pour évaluer la

qualité des embryons, car elle est de taille comparable (égale) dans les morulas de qualité

différente (Abe et al., 2002).

Cependant, Fair et al. (2001) ; Holm et al. (2002) ; Eppig et al. (1992) ont suggéré que la

ZP des embryons in vivo pourrait avoir une composition différente en conséquence de

l‟exposition au liquide de l‟oviducte lequel peut causer des variations dans la rigidité de la

ZP. Auparavant, Fair et al. (2001) ont observé que la ZP des embryons in vitro a semblé

plus fragile que la ZP des embryons in vivo, car ces derniers ont perdu leur forme ronde

lors de l‟exposition à des cryoprotecteurs lors de la congélation. Fair et al. (2001) ont

spéculé que les conditions de culture in vivo sont plus propices au développement de

l'embryon, car certaines glycoprotéines spécifiques sont entrées dans la ZP pour se

maintenir fixées à la surface des blastomères. Il est probable que ces glycoprotéines sont au

moins en partie responsables de l'amélioration de la viabilité des embryons. Une étude

ultérieure chez une autre espèce a aussi confirmé l‟impact des spéculations discutées avant.

Ainsi, Eppig et al., (1992) ont observé chez les souris que la ZP des ovocytes in vitro

cultivés avec sérum étaient quatre fois plus rigide que celle des ovocytes in vivo ou en

culture sans sérum.

Un autre impact négatif de la culture in vitro a été démontré alors que Rizos et al. (2002)

ont déterminé que la plus grande sensibilité des embryons in vitro aux dommages

cellulaires causés par la cryopréservation pouvait accroitre l‟incidence d‟anomalies

chromosomiques. Cette observation supporte le constat général que que la culture in vitro

des embryons à elle seule peut induire la présence d‟anomalies chromosomiques. Viuff et

al. (1999) ont déterminé une incidence significativement plus élevée de mixoploïdie dans

les embryons produits in vitro (78 %) comparativement aux embryons in vivo (25 %)

provenent des vaches donneuses superovulées. En plus, ils ont déterminé que 17 % des

embryons en culture in vitro ont une incidence de plus de 10 % de polyploïdie et ce type

d‟anomalie n‟a pas été détectée chez les embryons produits in vivo (Viuff et al., 2000;

90

Viuff et al., 2001). La maturation des ovocytes semble jouer un rôle déterminant sur la

présence d‟aberrations chromosomiques dans les embryons. Dieleman et al. (2002) ont

observé que le taux de mixoploïdie (21%) dans les blastocystes provenant d‟ovocytes

maturés in vivo était similaire à celui rapporté pour les blastocystes entièrement développés

in vivo. Par contre, lorsque les embryons étaient issus d‟une maturation in vitro, le taux de

mixoploïdie grimpait à 50 %.

L'expression génique dans l'embryon en développement peut être influencée par

l'environnement de culture in vitro, lequel peut expliquer les différences de qualité des

embryons (Wrenzycki et al., 1999 ; Wrenzycki et al., 2001) et ainsi, leur capacité à survivre

après la cryopréservation (Rizos et al., 2003). De plus, les dernières études ont aussi montré

que la qualité embryonaire peut varier grâce à differentes conditions de culture in vitro.

Plourde et al. (2012) ont déterminé que les conditions de culture in vitro ont une influence

sur la cinétique et aussi sur la compétence du développement embryonnaire. Ils ont aussi

démontré qu‟il existe une grande variation de l‟expression génique entre les embryons

produits in vitro en comparaison des embryons in vivo. Côté et al. (2011) et Plourde et al.

(2012) ont ainsi observé des différences au niveau de l‟expression des gènes sur le génome

mitochondrial et aussi sur l‟expression des gènes reliés à la dysfonction mitochondriale à

cause des conditions de culture in vitro.

1.4.4.3 Le stade de développement

Il est bien connu que les embryons des stades avancés de développement tolèrent

généralement mieux la cryopréservation. Chez les mammifères, Massip, (2001) ont conclu

qu‟il y a plus de succès après la cryopréservation à partir de blastocystes produits in vivo et

congelés en comparaison aux morulas. Mahmoudzadeh et al. (1995) se sont penchés sur

deux facteurs qui vont influencer les différences entre le stade de blastocyste et de morula

lors de la cryopréservation :

91

Les cellules de la morula sont légèrement plus grandes que les cellules du

blastocyste, ce qui pourrait les rendre plus sensibles au stress osmotique, induit par

l'élimination du cryoprotecteur.

Les blastomères au stade de morula ont une grande teneur en eau comparativement

à ceux de blastocyste qui, malgré qu‟ils aient un blastocèle avec une grande quantité

d‟eau, sont de plus petite taille.

Cependant, Abe et al. (2002a) ont aussi observé un meilleur taux de survie des blastocystes

après la cryopréservation en comparaison des morulas dans différentes conditions de

culture. Ils ont observé que les morulas ont une grande présence de GL dont le nombre va

être réduit au cours des états ultérieurs du développement embryonnaire. De cette façon, ils

ont conclu que l‟accumulation des GL cytoplasmiques des embryons est le facteur qui va

affecter la sensibilité des embryons à la cryoconservation.

1.4.4.4 La race

La race a une influence sur la morphologie des embryons principalement sur la couleur du

cytoplasme des blastomères. Van Soon et al. (2003) suggèrent que chez les embryons in

vivo de bovins, il existe une relation entre la couleur et la race. Ainsi, cette caractéristique

est utilisée pour déterminer la viabilité de la réponse à la cryopréservation. De même façon,

Linder et Wright, (1983); Abe et al. (1999); Abe et al., (2002a) ont observé que les

embryons avec une couleur foncée dans le cytoplasme montrent une accumulation de

gouttes lipidiques (GL) qui peuvent affecter la survie après la congélation, cependant ces

études ont été fait avec embryons de la même race.

Plusieurs recherches ont étudié le paramètre de la morphologie des embryons bovins en

utilisant les embryons de plusieurs races. Visintin et al. (2002) ont observé que les

embryons de la race Holstein (HO) ont un grand nombre de GL dans le cytoplasme et que

celles-ci sont de plus grande taille par rapport à la race Nellore. Cependant, l‟influence de

92

la race sur la morphologie se situe au niveau de la morphologie ultra-structurale comme la

distribution des organelles cellulaires dans les blastomères des embryons. Visintin et al.

(2002) ont observé des mitochondries arrondies avec des cristaux transversaux qui étaient

plus abondants dans les cellules d'embryons Nellore (Bos taurus indicus) par rapport aux

embryons Holstein (HO) (Bos taurus taurus). Les études sur la physiologie des

mitochondries ont suggéré qu‟une déficience dans la fonction des mitochondries peut

déterminer la concentration des GL dans le cytoplasme des blastomères lequel montre une

couleur plus foncée des embryons (Thompson et al., 1995; Abe et al., 1999; Sata et al.,

1999; Crosier et al., 2001; Abe et al., 2002; Abe et 2002a).

Leroy et al. (2005) ont conclu que les embryons HO étaient de qualité inférieure et de

couleur plus foncée par rapport aux embryons de race Bleu Belge (BB). Ils ont mis en

évidence la faible proportion d'embryons qui survivent à la congélation (61 % de HO

comparativement à 75 % de BB). Cependant dans cette étude, l‟influence de la race et

d‟autres facteurs liés à la production élevée de lait comme l‟état physiologie, peuvent être

responsables de la qualité réduite des embryons des vaches HO (Leroy et al., 2005).

Une dernière étude a démontré aussi des différences entre la race Nellore et Simmental

(Bos taurus taurus) au niveau de la morphologie et du profil lipidique des embryons.

Sudano et al. (2012) ont observé davantage de contenu de GL dans les embryons

Simmental par rapport aux embryons Nellore. Ils ont aussi déterminé par MALDI-MS, la

présence de LA [PC (34:2)] dans les embryons Simmental, tandis que les embryons Nellore

favorisent la présence de l'acide palmitique (16:0) et stéarique (18:0) [PC (32:1) et PC

(34:1), respectivement]. Ces résultats démontrent que les différences de profil lipidique et

du contenu lipidique qui vont déterminer le succès de la cryopréservation sont influencées

par les races.

Steele et Hasler (2004) ont aussi observé des différences dans la couleur du cytoplasme des

embryons entre la race Jersey et HO. Ils ont spéculé que cette différence est due à la

concentration des GL qui peut indiquer une fonction faible des mitochondries. Comme

93

d‟autres études l‟ont expliqué auparavant, Steele et Hasler (2004) ont aussi confirmé que la

couleur du cytoplasme est une caractéristique morphologique embryonnaire qui varie entre

les races et qui peut permettre d‟estimer le succès de la survie à la cryopréservation. Malgré

toutes les études mentionnées avant, celles-ci ne sont pas suffisantes pour bien déterminer

l‟influence de la race sur la morphologie des embryons.

94

1.5 HYPOTHÈSES

Notre hypothèse est que les embryons de la race Jersey n‟ont pas un bon taux de succès de

survie après la cryopréservation par rapport aux embryons de la race Holstein en raison des

caractéristiques spécifiques de ces races dont des différences au niveau du phénotype et du

génome. Une meilleure compréhension des différences phénotypiques et génomiques entre

ces races pourra mener à considérer la race des vaches comme un facteur critique qui limite

la performance des embryons lors de la cryopréservation et à chercher de nouvelles

méthodes pour l'amélioration de la cryopréservation.

La première étude de cette thèse, présentée au chapitre II, avait comme objectif d‟identifier

l‟origine des différences phénotypiques et génomiques. La caractérisation des embryons

entre les races Holstein et Jersey au niveau du phénotype et du génome devait identifier les

raisons pour lesquelles les embryons Jersey n‟ont pas une bonne performance lors de la

cryopréservation. La mesure du contenu lipidique, le profil lipidique, l‟activité

mitochondriale et l‟expression des gènes étaient les outils utilisés pour atteindre notre

premier objectif de recherche.

En deuxième lieu, l‟amélioration de l‟activité mitochondriale liée aux lipides à travers

l‟utilisation de la L-carnitine, une molécule impliquée dans le transport des acides gras vers

les mitochondries lors du catabolisme des lipides, a été étudiée dans les embryons des deux

races. Dans cette étude, l‟impact de la L-carnitine dans le milieu de culture in vitro a été

évalué afin d‟augmenter le métabolisme des lipides, ce qui peut réduire le contenu lipidique

des embryons. Par ailleurs, la présence de L-carnitine peut changer le profil lipidique et

modifier l‟expression génique des embryons, tout cela pour améliorer le taux de survie lors

de la cryopréservation. Cependant, les effets de la L-carnitine ont été évalués chez les

embryons Holstein et Jersey car ils peuvent varier selon la race. Les résultats de cette étude

sont recensés au chapitre III.

95

Notre 3e objectif était d‟améliorer les conditions de culture pour compenser les effets de la

dysfonction mitochondriale observés dans les embryons bovins en conditions in vivo et in

vitro. L‟utilisation de la vitamine K2 dans le milieu de culture pour corriger la dysfonction

mitochondriale a été signalée dans les embryons de drosophiles. Cependant, nous avons

étudié pour la première fois les effets de la supplémentation de la vitamine K2 dans la

culture des embryons bovins. Les données de cette étude sont présentées au chapitre IV.

97

CHAPITRE II : Phenotypic and genomic differences between early embryos of the Jersey and Holstein dairy cow breeds.

Cet article a été soumis pour publication dans le journal Reproduction, Fertility and

Development.

Keywords: embryo, Holstein, Jersey, mitochondria, lipid droplets, breed, lipid profile.

Authors: Luis Baldoceda 1, Isabelle Gilbert

1, Dominic Gagné

1, Christian Vigneault

2,

Patrick Blondin 2, Christina Ramires Ferreira

3, and Claude Robert

1

Affiliations:

1 : Laboratory of Functional Genomics of Early Embryonic Development, Centre de

Recherche en Biologie de la Reproduction, Institut des Nutraceutiques et des Aliments

Fonctionnels, Faculté des sciences de l‟agriculture et de l‟alimentation, Pavillon des

services, Université Laval (Québec), Canada, G1V 0A6

2 : L‟Alliance Boviteq Inc., 19320 Grand rang St-François, Saint-Hyacinthe, (Québec),

Canada, J2T 5H1

3 : ThoMSon Mass Spectrometry Laboratory, Institute of Chemistry, University of

Campinas, (São Paulo), Brazil, Campinas 13083-970

Grant support: NSERC Strategic Network EmbryoGENE NETPG 340825-06.

99

2.1 RÉSUMÉ

Certains embryons présentent un meilleur potentiel de survie à la congélation que d'autres.

La cause de ce phénotype n'est pas encore claire et pourrait être due à des dommages

cellulaires pendant la cryoconservation, comme résultat d‟une suraccumulation des lipides

ainsi que de leur composition. Chez les embryons bovins, il a été démontré que les

conditions de culture in vitro peuvent influer sur le nombre de gouttelettes lipidiques dans

les blastomères. Actuellement, l'impact de la race sur la teneur en lipides des embryons n'a

pas encore été étudié. Dans cette étude, nous avons comparé la couleur, l‟abondance des

gouttelettes lipidiques, la composition lipidique, l'activité mitochondriale et l'expression des

gènes des embryons de la race Jersey, qui sont connus pour montrer de pauvre performance

post-congélation par rapport aux embryons Holstein qui eux, ont une bonne cryorésistance.

Les embryons Jersey sont plus foncés par leur contenu élevé de gouttelettes lipidiques par

rapport aux embryons Holstein, et ceci a été corrélé avec une activité mitochondriale

inférieure. L'expression différentielle des gènes associés au métabolisme des lipides et des

différences de composition en lipides ont été trouvés. Ces résultats montrent que la

génétique peut avoir un impact sur le métabolisme des lipides dans les embryons et le

stockage.

101

2.2 ABSTRACT

Some embryos display better survival potential to cryopreservation than others. The

cause of such phenotype is still unclear and might be due to cell damage during

cryopreservation, resulting from over-accumulation and composition of lipids. In cattle

embryos, in vitro culture conditions have been shown to impact the number of lipid

droplets within blastomeres. So far, the impact of breed on embryonic lipid content has not

yet been studied. In this study were compared the colour, lipid droplet abundance, lipid

composition, mitochondrial activity, and gene expression of Jersey breed embryos which

are known to display poor performance post-freezing and Holstein embryos which have

good cryotolerance. Jersey embryos were found to be darker and to contain more lipid

droplets than did Holstein embryos, and this was correlated with lower mitochondrial

activity. Differential expression of genes associated with lipid metabolism and differences

in lipid composition were found. These results show genetic background can impact

embryonic lipid metabolism and storage.

103

2.3 INTRODUCTION

Over the years, dairy milk production has increased steadily due to several factors,

including improved management, nutrition and breeding program (Lucy, 2001). Combined

with advances in assisted reproduction technology, such as artificial insemination,

superovulation, embryo freezing and transfer, conventional breeding has contributed the

most to accelerating genetic gain (Bousquet et al., 1998). In the field of embryo transfer, a

constant increase in the demand for frozen rather than fresh embryos is currently observed

(Stroud, 2011). Freezing allows storage and transportation of embryos and better

management of donors and recipients, and is commercially advantageous since genetics can

be exchanged easily without exporting livestock. However, this technology is still

challenging and damage to the embryo occurs frequently. Several factors contribute to the

success rate of embryo transfer, including production (in vivo or in vitro) (Fair et al., 2001;

Hasler, 2001; Crosier et al., 2001; Rizos et al., 2003), culture media composition (Abe et

al., 2002; Yamashita et al., 1999; Hasler, 2001; Rizos et al., 2003; Abe and Hoshi, 2003),

species (Massip, 2001; Van Soom et al., 2003; Guignot, 2005), embryo quality (Linder and

Wright, 1983; Hasler, 2001; Van Soom et al., 2003; Guignot, 2005) and lipid content (Abe

et al., 2002; Yamashita et al., 1999; Abe and Hoshi, 2003).

In the dairy industry, cattle breeds differ considerably. The Holstein is recognized

for providing milk in the greatest volume, while the Jersey is popular because of the high

fat index of the milk. The high fat content of Jersey milk suggests that the biochemical or

physiological makeup of this breed may involve differences in lipid metabolism (Beaulieu

and Palmquist, 1995). It has also been observed that Jersey embryos do not tolerate

freezing very well. Steel and Hasler showed that Jersey embryos frozen in either ethylene

glycol or glycerol produced significantly fewer pregnancies than did Holstein embryos

(Steel and Hasler, 2004). It has been suggested that the lower tolerance of Jersey embryos

might be associated with a high intracellular lipid content, causing increased damage to

cells during cryopreservation.

An inverse correlation between cytoplasmic lipid content and tolerance of freezing

or cooling has been observed among embryos cultured in media containing serum (Abe et

104

al., 1999; Yamashita et al., 1999; Hasler, 2001; Abe et al., 2002; Reis et al., 2003).

Changes in mitochondrial structure and function in association with accumulation of

intracellular lipid have been detected in embryos cultured in such media (Kruip et al., 1983;

Dorland et al., 1994; Thompson et al., 1995; Sata et al., 1999; Crosier et al., 2001; Abe et

al., 2002a; Abe and Hoshi, 2003; Rizos et al., 2003; Plourde et al., 2012). Since

mitochondria are not static organelles but vital determinants of normal early embryonic

development (Dumollard et al., 2007) and located where ATP must be supplied at high

levels (Tarazona et al., 2006), these changes should be expected to reduce embryo quality.

So far, breed effects on embryonic lipid metabolism have not been documented.

We hypothesized that embryonic lipid content are different between Jersey and Holstein

due to their intrinsic differences in lipid management. This project was conducted with

animals housed and fed under the same conditions to isolate the genetic component

associated with embryonic lipid composition. Stage specific embryos were compared on

the basis of their lipid content, composition, metabolism potential and gene expression.

This work provides a different perspective to embryonic lipid composition by addressing

the need to account for breed specific differences.

105

2.4 MATERIALS AND METHODS

All chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) unless

specified otherwise.

Production and recovery of embryos in vivo

Non-lactating healthy Holstein (n = 4) and Jersey (n = 4) cows were housed and fed

under the same conditions. Animals were kept for a year and were repetitively submitted to

in vivo embryo collection. All animals were collected at least seven times. Embryos were

staged and graded according to the IETS scores. Only morulae and early blastocysts graded

1 and 2 were used in this study. All breed comparisons were done on samples matched for

developmental stage and grade quality.

Embryos were obtained from L‟Alliance Boviteq Inc. (Saint Hyacinthe, Québec,

Canada). All animals used in this study were handled following the guidelines provided by

the Canadian Council on Animal Care. These guidelines are strictly followed by L‟Alliance

Boviteq who provided all the tissues and samples. The study did not require handling

animals on university premises.

The cows received a super-ovulating treatment: Follicles of diameter larger than 8

mm were aspirated on day 8–12 post-oestrus. Administration of FSH (Folltropin-V,

Bioniche Animal Health) was begun 36 hours later (twice daily in doses decreasing from

60 mg to 20 mg for a total of 400 mg over four days). Prostaglandin F2α analogue

(Estrumate, Intervet, Kirkland, QC, Canada) was administrated in doses of 500 µg with

each of the two final FSH injections to initiate luteolysis. Cows appearing oestrus at 36 h

after the final FSH/Estrumate injection were inseminated twice with pooled semen (12 and

24 h later). On day 6 after insemination, embryos were recovered by uterine flushing and

categorized according to the IETS system. Fresh embryos were needed for some assays

while other analyses allowed freezing of the embryos which were then washed three times

in PBS, placed into 0.5-ml microtubes in a minimum volume, snap-frozen and conserved at

-80°C.

106

Characterization of lipid droplets and active staining of mitochondria

Mitochondria in fresh embryos (n = 15 per breed) were stained with 300 nM of the

active dye CMX-rosamine (Mitotracker Red, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) in

synthetic oviduct fluid (SOF) for 40 minutes at 38 °C in 5 % CO2. The dye showed strong

sensitivity to the mitochondrial membrane potential, mitochondrial protein (thiol groups)

and exhibited better retention and much more even distribution compared to other dyes, due

to high co-localization with cytochrome C oxidase (Poot et al., 1996). The fluorescence

excitation wavelength was 594 nm and emission was read at 608 nm. Carbonyl cyanide m-

chlorophenylhydrazone (CCCP), which uncouples mitochondrial membrane potential, was

employed as a negative control to set the background which was used as a mean of

calibration between runs. In parallel experiments, embryos selected randomly were treated

with 100 nM CCCP and incubated for 15 min at 38 °C in a humidified 5 % CO2

atmosphere before adding CMX-rosamine.

Following staining with CMX-rosamine, the embryos were immersed in 3 μg/mL of

the lipid-specific dye 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene

(Bodipy 493/503, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) in SOF for 10 minutes. To label

nuclei, embryos were incubated with 1 μg/mL of Hoechst blue dye 33342 in SOF for 10

min at room temperature, washed three times in SOF and mounted on microscope slide

coverslips.

Confocal microscopy

Confocal microscopy was performed using a Nikon TE2000 confocal microscope

(Nikon, Mississauga, ON, Canada) with a water-immersion objective at an optical

magnification of 60×. Embryo morphological phenotype was recorded in photos in grey

scale taken with the same settings to estimate colour (dark or pale) based on the IETS

system. Mitochondrial activity was the recorded as an epifluorescence image of CMX-

rosamine dye in grey scale. The whole lipid volume of each embryo was estimated based

on the z-stack, which consisted of the set of adjacent optical sections taken at intervals of

0.5 µm, from a first section at the bottom of embryo next to the coverslip. This total

107

thickness of optical sections (20 µm) was sufficient to obtain homogeneity of the Bodipy

493/503 fluorescence, as established in preliminary experiments. The optical sections were

recorded with 512 x 512 pixel resolution. The settings were similar for all samples.

Digital images of embryos stained with CMX-rosamine, Bodipy 493/503 and

Hoechst dye 33342 were obtained using a LSM 700 confocal system with a Zeiss Axiovert

200M inverted microscope (Carl Zeiss GmbH, Jena, Germany). The embryos were viewed

with the Plan-Apochromat 40x lens (NA = 1.2) at 10 % utilizable laser intensity (maximum

power: 1.2 W, output: 25% of the maximum tube current) and a HFT dichroic beam splitter

(458/514 nm). The 3D images of orthogonal projections composed of first 21 slices (1 µm

each) obtained from section close to objective were acquired as “lambda stacks” using the

Lambda Mode scanning procedure at a resolution of 1024 x 1024 pixels. Lambda stacks

were recorded at a specific wavelength for each dye. The microscope settings and the

lambda mode scanning procedure were the same for all collected lambda stacks.

Image Analysis

The intensity of CMX-rosamine fluorescence was measured using the mean grey

scale in IMAGE J software (Abramoff et al., 2004). Results are expressed in arbitrary units

(AU) as the mean fluorescence intensity of all samples within a group. Measurements of

the number and the volume of lipid droplets in embryos of each section were obtained

using the plugin LIPID DROPLET COUNTER of IMAGE J software (Abramoff et al.,

2004). The minimal droplet size threshold was set at 5 pixels (which represents 0.5 μm2) to

overcome false-positive counts due to background pixels. The mean volume of lipid

droplets in this size range was calculated in femtolitres (1 fL = 10-15

litres).

Isolation of total DNA and RNA

Additional blastocysts (n = 5 embryos per breed) were used for total genomic DNA

and RNA, extracted simultaneously using the AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen,

Mississauga, ON, Canada) according the manufacturer‟s instructions. Genomic DNA was

108

used for mitochondrial DNA quantification and total RNA was reverse-transcribed and

analysed using quantitative RT-PCR (qRT-PCR).

Quantification of mitochondrial DNA

Individual embryos (n = 10 per breeds) were used to quantify mitochondrial DNA

(mtDNA) using a quantitative PCR (qPCR) method with genomic DNA. The 12S rRNA

gene (GenBank accession number J01394) was selected as a mitochondrial target and Mx1

gene (GenBank accession number AY340484) as a nuclear target (Table 6). The mtDNA

and nuclear DNA (nDNA) were used to calculate the relative concentration of mtDNA in

each embryo, which was expressed as the mtDNA/nDNA ratio. The LightCycler 2.0

(Roche Diagnostics) was used for qPCR reactions. The reaction mixture (20 µL) contained

0.5 µL of each primer solution (0.25 µM), 1.2 µL of 1.5 µM MgCl2, 2 µL of LightCycler

FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada) and 5 µL of

DNA sample. The average DNA concentration of each sample was 0.00335 ng/µL. The

following cycling conditions were applied for amplification: initial denaturation at 95 °C

for 10 min followed by 50 cycles of 95 °C for 5 sec, 5 sec (12S rRNA) at 58 °C or 60 °C

(Mx1), followed by 72 °C for 20 sec and 76 °C (12S rRNA) or 85 °C (Mx1) for 5 sec. The

presence of amplicons was verified using melting curve analysis: Following the last

amplification cycle, the internal temperature of the LightCycler was rapidly increased to 94

°C then decreased to 72 °C for 30 s, followed by a slow increase to 94 °C at a rate of 0.1 °C

per s, with continuous fluorescence reading. Quantification of mtDNA and nDNA copy

numbers was performed based on a standard curve, which was based on the linear

relationship between the crossing point cycle values and the logarithm of the starting copy

number.

Differential gene expression in Holstein and Jersey embryos

RNA of individual blastocysts (n = 4 per breed) was extracted using PicoPure RNA

kit (Molecular Devices, Downingtown, PA, USA) according the manufacturer‟s

instructions and DNase I digestion (Qiagen). The quality and concentration of the extracted

RNA was measured using a model 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto,

109

CA, USA) with the RNA PicoLab Chip (Agilent Technologies). Only RNA of very good

quality (RIN over 8) was used for amplification.

Purified RNA was amplified in two rounds using T7 RNA polymerase and a

RiboAmp HSPlus Amplification Kit (Life Sciences, Foster City, CA, USA). RNA

concentration was measured using a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop,

Wilmington, DE, USA). Antisense-RNA (aRNA) samples were labelled with Cy3 or Cy5

using the Universal Linkage System (ULS) kit (Kreatech Diagnostic, Amsterdam,

Netherlands) and 825 ng of labelled aRNA were hybridized on Agilent EmbryoGENE

slides (Robert et al., 2011) in a two-colour dye-swap design in a hybridization oven for 17

h at 65 °C. A total of four biological replicates were used for each cow breed with a

technical dye swap replicate for a total of eight hybridizations. Microarray slides were then

washed and scanned using a PowerScanner (Tecan, Männedorf, Switzerland) and analysed

with Array-Pro Analyzer software (MediaCybernetics, Bethesda, MD, USA).

Microarray data were pre-processed as described in previous studies (Ploudre et al., 2012),

using Lowess intra-array and quantile inter-array normalizations. Statistically significant

variations were detected using Limma (Bioconductor). Differences in gene expression were

considered significant when a cut-off adjusted p-value < 0.01 and change of at least 1.2-

fold were obtained. Pathway analyses and downstream exploitation of gene lists were

carried out using Ingenuity Pathway Analysis Software Version 8.6 (Ingenuity Systems

Inc., Redwood City, CA, USA). For lipid metabolism functions, significance and threshold

values were calculated using Fisher‟s Exact Test (P < 0.05).

Quantitative RT-PCR Validation

Validation of microarray results was performed using qRT-PCR on additional

embryos (n=5 per breed). RNA was reverse-transcribed using the qScript cDNA SuperMix

(Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) with an oligo-dT to prime the reaction as

per the manufacturer‟s recommendations. Primers were designed for candidates

(ADIPOR2: Adiponectin receptor 2, LPIN1: Lipin-1, LPIN2: Lipin-2, and ELVOL5:

110

ELOVL fatty acid elongase 5) using the Primer3 Web interface

(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi) and synthesized at IDT

(Coralville, IA, USA). The reaction mixture was composed of the LightCycler FastStart

DNA Master SYBR Green I kit components (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada) and

real-time measurements were performed in a LightCycler 2.0 apparatus (Roche

Diagnostics). Our real-time PCR amplification procedure has been described previously in

detail (Gilbert et al., 2010). Genebank accession number, primer sequences, annealing

temperatures, and product size are shown in Supplemental Table 6.

For quantification, real-time PCR was performed as described previously (Bermejo-

Alvarez et al., 2010). Each pair of primers was tested for reaction efficiency, and the

comparative cycle threshold (ΔCT) method was then used to quantify differences in

transcript levels as described by Schmittgen and Livak (2008). Quantification was

normalized (ΔΔCT) to the endogenous control (beta-actin to account for cell number).

Change in the relative level of gene expression of the target was calculated as 2 - ΔΔCT

.

Analysis of lipid profile by MALDI-MS

A new method of analysing lipid profiles of intact cattle embryos was used as

described in the literature (Ferreira et al., 2010) with some modifications. Briefly, embryos

(n = 7 for each breed) collected at the morula stage were washed three times in PBS

solution and stored at -80 °C in 0.5 mL micro-tubes containing 2-4 µL of PBS until

analysis. Samples were thawed in 100 µL of 50 % (v/v) methanol (HPLC grade, Fisher

Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) in ultrapure water (Millipore, Billerica, MA, U.S.A.) and

washed three times in this solution. Each embryo was placed on a single spot on the

Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) target plate. Samples were allowed to

dry at room temperature, and their locations were recorded. Prior to analysis, 1 µL of 1.0 M

2,5-dihydroxybenzoic acid diluted in methanol was placed on each target spot to cover the

embryo, and the spots were allowed to dry at room temperature.

111

Mass spectra were recorded in reflector mode using an AB SCIEX 4800 MALDI

TOF/TOF TM instrument (AB Sciex, Concord, Ontario, Canada) equipped with a Nd:YAG

laser operating at 355 nm and 200 Hz. Laser intensity remained fixed for all the analyses.

External calibration was performed and mass accuracy was better than 50 ppm. MS spectra

were acquired between 700-1000 Da. The sample plates received 10 V and 60–90 s of laser

shots on the sample spot region, until signals in that region disappeared due to ablation of

the sample. MALDI-MS data were acquired by impact energy until extensive break-up of

the precursor ion. Argon was used as the collision gas. Spectra were centred and aligned

using MassLynx 4.0 software (Waters, Manchester, UK). From each spectrum, after

exclusion of isotopic peaks, the most intense ions were considered as the starting point for

searching m/z values corresponding to lipids. After attribution, only the m/z values that

were clearly above background levels were included in the principal component analysis,

which was performed using Pirouette v.3.11 (Infometrix Inc., Woodinville, WA, USA).

The laser-induced fragmentation technique (LIFT) polar lipid database obtained from

previous studies (Ferreira et al., 2010; Sudano et al., 2012) was used to identify lipids in

this study.

Statistical Analyses

The number and mean volume of lipid droplets in embryos were tested using Prism

Version 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Student‟s t-test was applied for

comparisons between breeds. Differences were declared significant when P < 0.05. Lipid

MS profiles, multivariate and univariate statistical models were used as described

previously (Ferreira et al., 2010; Sudano et al., 2012). A first principal component analysis

(PCA) was performed using Pirouette v.3.11 (Infometrix, Inc.). Based on the MALDI-MS

results the ions with significant signals intensities over background value were selected for

analysis using Student‟s t-test in order to verify them for both breeds.

112

2.5 RESULTS

Abundance of lipid droplets makes embryos appear darker

The overall appearance of Holstein and Jersey embryos at the morula stage is shown

in Figure 10. The blastomere cytoplasm was darker in Jersey embryos than in Holstein

embryos, which can be classified as “pale” based on the IETS system.

Lipid droplets, considered as a fatty acid storage reservoir in cells, were identified and

quantified in embryos of both breeds, using the neutral lipid stain (BODIPY) according to

the Aardema protocol (Aardema et al., 2011). As demonstrated in Figure 11(A and B),

differences in lipid droplet abundance are observed between the breeds. Jersey embryos

have a higher number of droplets and these are of lower average volume compared to

Holstein (p < 0.05, C and D).

Lipid droplet numbers in Jersey embryos are related to lower mitochondrial activity

The red dye CMX-rosamine is commonly used to assess mitochondrial survival or

functional mitochondria (Poot et al., 1996). As shown in Figure 12, Holstein and Jersey

embryos (A and B) seem to have a similar mitochondrial distribution and no difference in

the mtDNA/nDNA ratio (Figure 12D) was detected. However, the fluorescence intensity

was greater in Holstein than in Jersey morulae (7,893 ± 23 AU; p < 0.05), indicating higher

mitochondrial activity (Figure 12C).

Gene expression differentials between the Holstein and Jersey breeds

To evaluate the differences between the embryos of these breeds, a large-scale

transcriptomic analysis was performed using a microarray. Among the 37,238 transcripts

represented on the microarray slide, only 83 protein-coding genes were expressed with

differentials greater than 1.2 (p < 0.05), suggesting that the embryos of both breeds are

highly similar. The differentially expressed genes were analysed by Ingenuity Pathways

Analysis (IPA, www.ingenuity.com). Among the different biological functions thus

identified, we focused on lipid metabolism genes that might explain the observed

113

differences in lipid content and mitochondrial activity. The analysis revealed that fatty acid

release, oleic acid oxidation, palmitic acid uptake and acylglycerol synthesis were the most

significant categories of differential lipid metabolism function (data not shown). Validation

of the microarray results was performed using qRT-PCR on four (ADIPOR2, LPIN1,

LPIN2, ELVOL5) selected genes related to lipid metabolism (Table 6). As observed in the

microarray analysis, the expressions of these selected genes have a positive trend in

Holstein than in Jersey embryos (Figure 13).

Differences in Jersey and Holstein lipid profiles detected by MALDI-MS

In combination with the microarray, a lipid composition analysis was also

performed. Mass spectrometry provides fast and simple means of determining lipid

profiles. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) can

provide a lipid fingerprint of a single intact cattle embryo directly, in particular of

phospholipids such as phosphatidylcholines and sphingomyelins (Ferreira et al., 2010;

Sudano et al., 2012). The most significant lipids thus identified, based on MALDI-MS, are

specified in Table 5. The lipid profiles of embryos of each breed are shown in Figure 14(A

and B). Measurement of lipid ion abundance revealed that protonated sphingomyelin

(16:0), phosphatidylcholine (32:0, 34:2) and sodiated sphingomyelin (16:0) were

significantly higher (P < 0.05) in Jersey than in Holstein embryos (Figure 14C). Principal

component analysis of the MALDI-MS data revealed a spatial arrangement in two distinct

clusters corresponding to the cattle breeds, with no overlap (Figure 15).

114

2.6 DISCUSSION

The capacity for tolerating cryopreservation is an important criterion for embryo quality

in the commercial setting. Species such as pigs and humans and some breeds of cattle (such

as Jersey) do not tolerate this procedure very well. In the dairy industry, the Jersey breed is

recognized for production of high-fat milk. Breeders regard the Jersey cow as versatile and

well suited to any production system. However, the success rate of embryo

cryopreservation is low for this breed (around 43.0 %) compared to the Holstein breed

(approaching 55.8 %) (Steel and Hasler, 2004), thus limiting the utilization of the Jersey

cow. This problem is believed to be associated with the high lipid content of the Jersey

embryo.

The colour of the blastomere cytoplasm is considered an accurate indicator of embryo

quality (Linder and Wright, 1983; Van Soom et al., 2003; Guignot, 2005; Thompson et al.,

1995; Sata et al., 1999; Abe et al., 2002a) and also appears to be a predictor of embryo

tolerance of cryopreservation (Yamashita et al., 1999; Fair et al., 2001; Massip, 2001; Abe

et al., 2002a; Van Soom et al., 2003; Guignot, 2005). However, evaluation of this criterion

is subjective, and many factors, including breed, can influence coloration. Previous studies

comparing dairy breeds to beef breeds have shown that Holstein embryos obtained in vivo

were darker than Belgian blue (Van Soom et al., 2003; Leroy et al., 2005). It was suggested

that differences in embryo colouring likely involve factors other than genetics, such as

physiological status associated with high milk production. Comparing embryos of different

subspecies, Visintin et al. (2002) found that Nellore (Bos indicus) embryos were “pale”

compared to Holstein embryos. Embryo quality was found associated with the number of

lipid droplets, which was higher in Holstein blastomeres.

Lipid concentration is a parameter used to estimate post-fertilization competence in

bovine oocytes (Aardema et al., 2011) and survival of cryopreservation by bovine embryos

(Linder and Wright, 1983; Yamashita et al., 1999; Fair et al., 2001; Abe et al., 2002; Van

Soom et al., 2003; Guignot, 2005). However, this criterion of selection has not been studied

115

in any thorough comparison of breeds. Sudano et al. (2012) reported that the lipid content

is higher in Simmental (Bos taurus) embryos than in Nellore embryos.

Our results confirmed that blastomeres of Jersey embryos are darker in colour, due

mainly to the abundance of lipid droplets, as suggested by Steel and Hasler (2004).

However, average lipid droplet volume was higher in Holstein than in Jersey embryos. The

superior performance of cryopreserved Holstein embryos in terms of pregnancy rate

suggests that the number of lipid droplets in the embryo has a greater impact than has lipid

droplet volume on the success of embryo cryopreservation.

Several reports have concluded that there is a close relationship between lipid droplets

in cells and mitochondrial activity. In mammalian oocytes, a close spatial association and

hence metabolic relationship between mitochondria and lipid droplets has been reported

(Kruip et al., 1983; Hyttel et al., 1986; Dorland et al., 1994; Sturmey et al., 2006). It is

interesting that the darker cytoplasm observed in bovine embryos produced in vitro in

several studies appears related to lipid uptake from the serum added to the culture medium

and to be a consequence of impaired mitochondrial function (Abe et al., 1999, 2002;

Dorland et al., 1994; Thompson et al., 1995; Sata et al., 1999; Reis et al., 2003; Plourde et

al., 2012). In the present study, Jersey embryos produced in vivo had more numerous lipid

droplets, due apparently to lower mitochondrial activity. This is in agreement with Visintin

et al. (2002), who reported a stronger inverse relationship between the number of lipid

droplets and the number of mitochondria in Holstein embryos compared to Nellore, and

with the findings of Abe et al. (2002; 2002a), who observed fewer mature mitochondria in

association with higher lipid droplet number in blastomeres with darker cytoplasm in

morulae obtained in vivo and subsequently classified as embryos of lower quality. These

latter authors suggested that impaired mitochondrial function, expressed as the number of

mature (elongated) mitochondria, implied differences in the metabolism of cytoplasmic

lipids by mitochondria, possibly affecting the numbers of lipid droplets present.

Analysis of gene expression using a microarray did not reveal many differences overall

between the two dairy cow breeds. However, expression of genes associated with lipid

116

metabolism appears to be influenced by the breed component. ADIPOR2 has been

described as a major physiological receptor for adiponectin (ADIPOQ) (Yamauchi et al.,

2003; Fischer et al., 2010), which is an adipocyte-derived hormone that plays an important

role in the stimulation of fatty acid oxidation and decreases the triglyceride content of cells

(Yamauchi et al., 2002; Liu et al., 2012; Chen et al., 2013). Consistent with our data, Zhou

et al. (2008) reported that absence of the ADIPOQ gene in mouse hepatocytes caused a

mitochondrial dysfunction that appeared to contribute to increased lipid droplet

accumulation as a result of lower mitochondrial activity. Genes LPIN1 and LPIN2 are

members of the lipin protein family, which are key effectors of triglyceride and

phospholipid biosynthesis (Reue and Zhang, 2008). Recent studies have shown that LPIN1

and LPIN2 modulate lipid droplet size, amount, and fatty acid composition in mammalian

cells (Valdearcos et al., 2012; Sembongi et al., 2013). However, individual effects of lipin

genes suggested that LPIN2 deficiency results in an increase in lipid droplet biogenesis

(Sembongi et al., 2013), which could explain the greater abundance observed in Jersey

embryos. The gene ELOVL5 appears to play an important role in the synthesis of long-

chain mono-unsaturated and polyunsaturated fatty acids (Leonard et al., 2002; Inagaki et

al., 2002; Gregory et al., 2011). It has been shown that ELOVL5 is involved in the

elongation of palmitic acid (16:0) into stearic acid (18:0), therefore in modifying the

palmitic acid (16:0) content of cell membranes and storage lipids (Inagaki et al., 2002). In

line with these findings, ELOVL5 appears to play an important role in modifying

membrane fluidity by changing lipid content and fatty acid composition (Kim et al., 2001;

Ferreira et al., 2010). This could explain the different embryonic sensitivity to

cryopreservation observed between Jersey and Holstein (Steel and Hasler, 2004).

It has been reported previously that lipid content plays an important role in determining

the characteristics of cell membranes and that modifying their physical properties is crucial

for successful cryopreservation of bovine embryos (Sata et al., 1999; Kim et al., 2001).

Several methods have been developed to evaluate the lipid profile of embryos. However, a

major limiting factor is the amount of biological material available for study. Ferreira et al.

(2010) and Sudano et al. (2012) nevertheless obtained lipid profiles of embryos with

117

limited quantities of sample, using MALDI-MS. As expected, we observed an abundance

of positive ions well represented in lipid profiles obtained previously in MALDI-MS

studies of in vivo bovine embryos (Ferreira et al., 2012; Sudano et al., 2012). It has been

suggested that cow breed influences the lipid profile observed in the embryos (Sata et al.,

1999; Sudano et al., 2012). This is consistent with our finding that the lipid profiles of

Holstein and Jersey embryos do not overlap.

Elevated numbers of lipid droplets have been associated previously with variable

abundance of lipid ions known to vary in association with cow breed (Sudano et al., 2012).

Although Jersey embryos contained sphingomyelins (16:0 +H+ and 16:0 +Na

+) in

abundance, these have been found not to have much impact on embryo cryopreservation

(Kalo et al., 2011; Ferreira et al. 2010; Sudano et al. 2012). We also noted that Jersey

embryo was richer in phosphatidylcholine (32:0 +H+ and 34:2+H

+) identified as palmitic

(16:0) and linoleic (18:2) fatty acids, as described for Bos taurus in a previous report

(Sudano et al., 2012). It remains unclear how linoleic acid content affects embryo tolerance

of cryopreservation. A positive effect of conjugated linoleic acid on cryopreservation of

embryos produced in vitro has been attributed to reducing the number of lipid droplets in

cells (Pereira et al., 2007). In contrast, Marei et al. (2010) reported a negative effect of

linoleic acid on cryopreservation of oocytes matured in culture medium, but this effect is

dependent on concentration and is reversible. Some studies have shown adverse effects on

lipid accumulation and lower tolerance of embryos to cryopreservation following

maturation of bovine oocytes in the presence of palmitic (16:0) and stearic (18:0) acids

(Aardema et al., 2011; Shehab-El-Deen et al., 2009; Van Hoeck et al., 2011). Based on

these studies, we believe that the ratio of saturated to unsaturated fatty acid is critical for

the cryopreservation of Holstein and Jersey embryos.

We have shown that the darker cytoplasm observed in embryos of the Jersey cow breed

compared to the Holstein cow breed is indeed due to the accumulation of greater numbers

of lipid droplets. We documented for the first time that this accumulation was associated

with lower mitochondrial activity that is breed specific. Lipid composition showed

118

significant differences between the two breeds, supporting intrinsic deviations in lipid

metabolism between both genetic backgrounds. These results provide clear evidences that

under identical management breed differences exist at least at the embryonic lipid

composition.

119

2.7 ACKNOWLEDGMENTS

The authors thank Isabelle Kelly for technical assistance with the MALDI-MS

measurements and Alexandre Bastien (Université Laval, Canada) for technical assistance

with confocal microscopy and image analysis.

120

2.8 REFERENCES

Aardema, H., Vos, P. L., Lolicato, F., Roelen, B. A., Knijn, H. M, Vaandrager, A. B.,

Helms, J. B., and Gadella, B. M. (2011). Oleic acid prevents detrimental effects of

saturated fatty acids on bovine oocyte developmental competence. Biol. Reprod. 85,

62–69.

Abe, H., Yamashita, S., Itoh, T., Satoh, T., and Hoshi, H. (1999). Ultrastructure of bovine

embryos developed from in vitro-matured and -fertilized oocytes: comparative

morphological evaluation of embryos cultured either in serum-free medium or in

serum-supplemented medium. Mol. Reprod. Dev. 53, 325–335.

Abe, H., Yamashita, S., Satoh, T., and Hoshi, H. (2002). Accumulation of cytoplasmic lipid

droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different

culture systems using serum-free or serum-containing media. Mol. Reprod. Dev. 61,

57–66.

Abe, H., Matsuzaki, S., and Hoshi, H. (2002a). Ultrastructural differences in bovine

morulae classified as high and low qualities by morphological evaluation.

Theriogenology 57, 273–283.

Abe, H., and Hoshi, H. (2003). Evaluation of bovine embryos produced in high

performance serum-free media. J. Reprod. Dev. 49, 193–202.

Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., and Ram, S. J. (2004). Image processing with ImageJ.

Biophoton. Int. 11, 36–42.

Beaulieu, A., and Palmquist, D. (1995). Differential effects of high fat diets on fatty acid

composition in milk of Jersey and Holstein cows. J. Dairy Sci. 78, 1336–1344.

Bermejo-Alvarez, P., Rizos, D., Rath, D., Lonergan, P., and Gutierrez-Adan, A. (2010).

Sex determines the expression level of one third of the actively expressed genes in

bovine blastocysts. PNAS 107, 3394–3399.

Bousquet, D., Burnside, E., and Van Doormaal, B. (1998). Biotechnologies of

reproduction applied to dairy cattle production: Embryo transfer and IVF. Can. J.

Anim. Sci. 83, 403–407.

Chen, H., Zhang, L., Li, X., Li, X., Sun, G., Yuan, X., Lei, L., Liu, J., Yin, L., Deng, Q.,

Wang, J., Liu, Z., Yang, W., Wang, Z., Zhang, H., and Liu, G. (2013). Adiponectin

activates the AMPK signaling pathway to regulate lipid metabolism in bovine

hepatocytes. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 138, 445–454.

Crosier, A., Farin, P., Dykstra, M., Alexander, J., and Farin, C. (2001). Ultrastructural

morphometry of bovine blastocysts produced in vivo or in vitro. Biol. Reprod. 64,

1375–1385.

Dorland, M., Gardner, D. K, and Trounson, A.O. (1994). Serum in synthetic oviduct fluid

causes mitochondrial degeneration in ovine embryos. J. Reprod. Fertil. 13, 70.

[Abstract].

Dumollard, R., Duchen, M., and Carroll, J. (2007). The role of mitochondrial function in

the oocyte and embryo. Curr. Top. Dev. Biol. 77, 21–49.

Fair, T., Lonergan, P., Dinnyes, A., Cottell, D., Hyttel, P., Ward, F., and Boland, M.

(2001). Ultrastructure of bovine blastocysts following cryopreservation: effect of

method of blastocyst production. Mol. Reprod. Dev. 58, 186–195.

121

Ferreira, C. R., Saraiva, S. A., Catharino, R. R., Garcia, J. S., Gozzo, F. C., Sanvido, G. B.,

Santos, L. F., Lo Turco, E. G., Pontes, J. H., Basso, A. C., and Bertolla, R. P., Sartori,

R., Guardieiro, M. M., Perecin, F., Meirelles, F. V., Sangalli, J. R., and Eberlin, M. N.

(2010). Single embryo and oocyte lipid fingerprinting by mass spectrometry. J. Lipid

Res. 51, 1218–1227.

Fischer, S., Santos, A. N., Thieme, R., Ramin, N., and Fischer, B. (2010). Adiponectin

stimulates glucose uptake in rabbit blastocysts. Biol. Reprod. 83, 859–865.

Gilbert, I., Scantland, S., Sylvestre, E., Dufort, I., Sirard, M., and Robert, C. (2010).

Providing a stable methodological basis for comparing transcript abundance of

developing embryos using microarrays. Mol. Hum. Reprod. 16, 601–616.

Gregory, M. K., Gibson, R. A., Cook-Johnson, R. J., Cleland, L. G., and James, M. J.

(2011). Elongase reactions as control points in long-chain polyunsaturated fatty acid

synthesis. PLoS One 6, e29662.

Guignot, F. (2005). Cryoconservation des embryons des espèces domestiques. INRA Prod.

Anim. 18, 27–35.

Hasler, J. (2001). Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in

cattle. Theriogenology. 56, 1401–1415.

Hyttel, P., Callesen, H., and Greve, T. (1986). Ultrastructural features of preovulatory

oocyte maturation in superovulated cattle. J. Repro. Fert. 76, 645–656.

Inagaki, K., Aki, T., Fukuda, Y., Kawamoto, S., Shigeta, S., Ono, K., Suzuki, O. (2002).

Identification and expression of a rat fatty acid elongase involved in the biosynthesis of

C18 fatty acids. Biosc. Biotech. Biochim. 66, 613–621.

Kalo, D, and Roth, Z. (2011). Involvement of the sphingolipid ceramide in heat-shock-

induced apoptosis of bovine oocytes. Reprod. Fertil. Dev. 23, 876–888.

Kim, J. Y., Kinoshita, M., Ohnishi, M., and Fukui, Y. (2001). Lipid and fatty acid analysis

of fresh and frozen-thawed immature and in vitro matured bovine oocytes.

Reproduction 122, 131–138.

Kruip, T. A., Cran, D. G, van Beneden, T. H., and Dieleman, S. J. (1983). Structural

changes in bovine oocytes during final maturation in vivo. Gamete Res. 8, 29–47.

Leonard, A., Kelder, B., Bobik, E., Chuang, L., Lewis, C., Kopchick, J., Mukerji, P.,

Huang, Y. (2002). Identification and expression of mammalian long-chain PUFA

elongation enzymes. Lipids 37, 733–740.

Leroy, J. L., Opsomer, G., De Vliegher, S., Vanholder, T., Goossens, L., Geldhof, A., Bols,

P. E., de Kruif, A., and Van Soom, A. (2005). Comparison of embryo quality in high-

yielding dairy cows, in dairy heifers and in beef cows. Theriogenology 64, 2022–2036.

Linder, G., and Wright, R. (1983). Bovine embryo morphology and evaluation.


Liu, Q., Yuan, B., Lo, K. A., Patterson, H. C., Sun, Y., Lodish, H. F. (2012). Adiponectin

regulates expression of hepatic genes critical for glucose and lipid metabolism. Proc.

Natl. Acad. Sci. U S A 109, 14568–14573.

Lucy, M. C. (2001). Reproductive loss in high-producing dairy cattle: where will it end?. J.

Dairy. Sci. 84, 277–1293.

Marei, W. F., Wathes, D. C., Fouladi-Nashta, A. A. (2010). Impact of linoleic acid on

bovine oocyte maturation and embryo development. Reproduction 139, 979–988.

122

Massip, A. (2001). Cryopreservation of embryos of farm animals. Reprod. Domest. Anim.

36, 49–55.

Pereira, R. M., Baptista, M.C., Vasques, M.I., Horta, A.E., Portugal, P.V., Bessa, R. J.,

Silva, J. C., Pereira, M. S., and Marques, C.C. (2007) Cryosurvival of bovine

blastocysts is enhanced by culture with trans-10 cis-12 conjugated linoleic acid

(10t,12c CLA). Anim. Reprod. Sci. 98, 293–301.

Plourde, D., Vigneault, C., Lemay, A., Breton. L., Gagné, D., Laflamme, I., Blondin, P.,

and Robert C. (2012). Contribution of oocyte source and culture conditions to

phenotypic and transcriptomic variation in commercially produced bovine blastocysts.


Poot, M., Zhang, Y. Z., Krämer, J. A., Wells, K. S., Jones, L. J., Hanzel, D. K., Lugade, A.

G., Singer, V. L., and Haugland, R. P. (1996). Analysis of mitochondrial morphology

and function with novel fixable fluorescent stains. J. Hist. Cyt. 44, 1363–1372.

Reis, A., Rooke, J., McCallum, G., Staines, M., Ewen, M., Lomax, M., and McEvoy, T.

(2003). Consequences of exposure to serum, with or without vitamin E

supplementation, in terms of the fatty acid content and viability of bovine blastocysts

produced in vitro. Reprod. Fertil. Dev. 15, 275–284.

Reue, K., and Zhang, P. (2008). The lipin protein family: dual roles in lipid biosynthesis

and gene expression. FEBS Lett. 582, 90–96.

Rizos D., Gutiérrez-Adán, A., Pérez-Garnelo, S., de la Fuente, J., Boland, M., and

Lonergan, P. (2003). Bovine embryo culture in the presence or absence of serum:

implications for blastocyst development, cryotolerance, and messenger RNA

expression. Biol. Reprod. 68, 236–243.

Robert, C., Nieminen, J., Dufort, I., Gagne, D., Grant, J. R., Cagnone, G., Plourde, D.,

Nivet, A.L., Fournier, E., Paquet, E., Blazejczyk, M., Rigault, P., Juge, N., and Sirard,

M. A. (2011). Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine

embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev.

78, 51–64.

Sata, R., Tsuji, H., Abe, H., Yamashita, S., and Hoshi, H. (1999). Fatty acid composition of

bovine embryos cultured in serum-free and serum-containing medium during early

embryonic development. J. Repro. Dev. 45, 97–103.

Schmittgen, T., and Livak, K. (2008). Analysing real-time PCR data by the comparative CT

method. Nature Protocols 3, 1101–1108.

Sembongi, H., Miranda, M., Han, G., Fakas, S., Grimsey, N., Vendrell, J., Carman, G., and

Siniossoglou, S. (2013). Distinct roles of the phosphatidate phosphatases lipin 1 and 2

during adipogenesis and lipid droplet biogenesis in 3T3-L1 cells. J. Biol. Chem. 288,

34502–34513.

Shehab-El-Deen, M. A., Leroy, J. L., Maes, D., and Van Soom, A. (2009). Cryotolerance

of bovine blastocysts is affected by oocyte maturation in media containing palmitic or

stearic acid. Reprod. Domest. Anim. 44, 140–142.

Steel, R., and Hasler, J. (2004). Pregnancy rates resulting from transfer of fresh and frozen

Holstein and Jersey embryos. Reprod. Fert. 16, 182. [Abstract].

Stroud, B. (2011). IETS 2011 statistics and data retrieval committee report: the year 2010

worldwide statistics of embryo transfer in domestic farm animals. Embryo Trans.

Newslett 29, 1–23.

123

Sturmey, R. G., O'Toole, P. J., and Leese, H. J. (2006). Fluorescence resonance energy

transfer analysis of mitochondrial:lipid association in the porcine oocyte. Reproduction

132, 829–837.

Sudano, M. J., Santos, V. G., Tata, A., Ferreira, C. R., Paschoal, D. M., Machado, R.,

Buratini, J., Eberlin, M. N., and Landim-Alvarenga, F. D. (2012). Phosphatidylcholine

and sphingomyelin profiles vary in Bos taurus indicus and Bos taurus taurus in vitro-

and in vivo-produced blastocysts. Biol. Reprod. 87, 130.

Tarazona, A. M., Rodríguez, J.I., Restrepo, L. F., and Olivera-Angel, M. (2006).

Mitochondrial activity, distribution and segregation in bovine oocytes and in embryos

produced in vitro. Reprod. Domest. Anim. 41, 5–11.

Thompson, J. G., Gardner, D. K., Pugh, P. A., McMillan, W. H., and Tervit, H. R. (1995).

Lamb birth weight is affected by culture system utilized during in vitro pre-elongation

development of ovine embryos. Biol. Reprod. 53, 1385–1391.

Valdearcos, M., Esquinas, E., Meana, C., Peña, L., Gil-de-Gómez, L., Balsinde, J., and

Balboa, M. (2012). Lipin-2 reduces proinflammatory signaling induced by saturated

fatty acids in macrophages. J. Biol. Chem. 287, 10894–10904.

Van Hoeck, V., Sturmey, R. G., Bermejo-Alvarez, P., Rizos, D., Gutierrez-Adan, A.,

Leese, H. J., Bols, P. E., Leroy, J. L. (2011). The effect of elevated NEFA during

bovine oocyte maturation on early embryo physiology. PLoS ONE 6, e23183.

Van Soom, A., Mateusen, B., Leroy, J., and de Kruif, A. (2003). Assessment of mammalian

embryo quality: what can we learn from embryo morphology?. Rep. Biomed. Online 7,

664–670.

Visintin, J. A., Martins, J. F., Bevilacqua, E. M., Mello, M. R., Nicácio, A. C., and

Assumpção, M. E. (2002). Cryopreservation of Bos taurus vs Bos indicus embryos: are

they really different? Theriogenology 57, 345–359.

Yamashita, S., Abe, H., Itoh, T., Satoh, T., and Hoshi, H. (1999). A serum-free culture

system for efficient in vitro production of bovine blastocysts with improved viability

after freezing and thawing. Cytotechnology. 31, 123–131.

Yamauchi, T., Kamon, J., Ito, Y., Tsuchida, A., Yokomizo, T., Kita, S., Sugiyama, T.,

Miyagishi, M., Hara, K., Tsunoda, M., Murakami, K., Ohteki, T., Uchida, S.,

Takekawa, S., Waki, H., Tsuno, N. H., Shibata, Y., Terauchi, Y., Froguel, P., Tobe, K.,

Koyasu, S., Taira, K., Kitamura, T., Shimizu, T., Nagai, R., and Kadowaki, T. (2003).

Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects. Nature

23, 762–769.

Yamauchi, T., Kamon, J., Minokoshi, Y., Ito, Y., Waki, H., Uchida, S., Yamashita, S.,

Noda, M., Kita, S., Ueki, K., Eto, K., Akanuma, Y., Froguel, P., Foufelle, F., Ferre, P.,

Carling, D., Kimura, S., Nagai, R., Kahn, B., and Kadowaki, T. (2002). Adiponectin

stimulates glucose utilization and fatty-acid oxidation by activating AMP-activated

protein kinase. Nat. Med. 8, 1288–1295.

Zhou, M., Xu, A., Tam, P. K., Lam, K. S., Chan, L., Hoo, R. L., Liu, J., Chow, K. H., and

Wang, Y. (2008). Mitochondrial dysfunction contributes to the increased

vulnerabilities of adiponectin knockout mice to liver injury. Hepatology 48, 1087–

1096.

124

2.9 TABLES AND FIGURES

Tableau 5. The most significant phosphatidylcholine (PC) and sphingomyelin (SM)

ions identified based on MALDI-MS data obtained from individual bovine oocytes

and embryos

m/z Lipid ion (C atoms: unsaturation)

703.5 [SM (16:0) + H] +

725.5 [SM (16:0) + Na] +

732.5 [PC (32:1) + H] +

734.5 [PC (32:0) + H] +

758.6 [PC (34:2) + H] +

760.5 [PC (34:1) + H] +

782.6 [PC (34:6) + H] +, [PC (34:1) + Na]

+

784.6 [PC (34:0) + Na] +

786.6 [PC (36:2) + H] +

788.6 [PC (36:1) + H] +

802.6 [PC (36:5) + Na] +

810.6 [PC (38:4) + H] +, [PC (36:1) + Na]

+

Identification is based on the collision induction dissociation database and on earlier

studies (Ferreira et al., 2010; Sudano et al., 2012).

125

Figure 10. Morphology of bovine embryos (morula stage) collected in vivo six days after

insemination. A) Holstein, categorized as pale, B) Jersey, categorized as dark. Observed under

bright-field microscopy at a magnification of 600x.

126

Figure 11. Lipid droplet content of Holstein (A) and Jersey morula-stage in vivo embryos (B) as

revealed by staining with Bodipy 493/503 green dye. DNA is stained with Hoechst blue dye. C)

Number of lipid droplets (LD), D) Lipid droplet mean volume. Values are expressed as mean ±

SEM. *Significant difference (P < 0.05).

127

Figure 12. Confocal microscopic images of Holstein (A) and Jersey (B) embryos (morula stage)

obtained in vivo and stained with CMX-rosamine (Mitotracker Red), Bodipy 493/503 (green), and

Hoechst blue dye 33342 to show respectively active mitochondria, lipid droplets and nuclear DNA.

C) CMX-rosamine fluorescence intensity (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) was

used as a negative control) and D) Ratio of mitochondrial to nuclear DNA in single blastocysts.

Values are mean ± SEM. *Significant difference (P < 0.05). AU = arbitrary unit.

128

ADIPOR2 LPIN1 LPIN2 ELVOL5

0

1

2

3

4

5

Holstein

Jersey

mR

NA

ab

un

dan

ce

Figure 13. Quantitative RT-PCR validation of microarray analysis of transcript levels of genes

involved in lipid metabolism. Values are mean ± SEM, normalized relative to endogenous β-actin

transcripts. *Significant difference (P < 0.05).

129

Figure 14. MALDI-MS spectra (positive ion mode) of lipids in Holstein (A) and Jersey (B) in vivo

embryos. C) Relative abundance of lipid ions (SM = sphingomyelin, PC = phosphatidylcholine).

Values are mean ± SEM. *Significant difference (P < 0.05).

130

Figure 15. 3D representation of principal component analysis of the MALDI-MS data for Holstein

and Jersey in vivo embryo lipid content (n=7).

131

2.10 SUPPLEMENTAL DATA

Tableau 6. Genbank accession, primer sequences, annealing temperatures and

product size of candidates used for validation of relative gene expression levels in in

vivo bovine embryos by quantitative RT-PCR .

Symbol Accession

Primer sequences Annealing

( T°)

Acquisition

( T°)

Product

size

(bp) Fw (5‟-3‟) Rv (5‟-3‟)

ADIPOR2 NM_001040499 CGCAACTGGGAAGAGAAAAC CCACCCCTCAGAGGACATAA 57 87 236

LPIN1 NM_001206156 GAGGGGAAGAAACACCACAA GTCGTCCCAGTTCCACAAGT 57 87 346

LPIN2 XM_592307 AGATCCGAGTCCCACATGGA CCCGGAAGTGGGTGTTTTCT 57 84 130

ELOVL5 NM_001046597 CACGGTCCTGCATGTGTATC AAGGTACACGGCCAGATGAC 57 85 264

Mx1 AY_340484 ATGCGTGCTATTGGCTCTTCCTCA CAAACAGAGCAAGGGAGTTTGGCA 60 85 181

12s J0_1394 TCGATAAACCCCGATAAACC TTCGTGCTTGATTCTCTTGG 58 76 186

133

CHAPITRE III : Genetic influences cellular responses of bovine embryos to L-carnitine added to the in vitro production medium.


Development.

Keywords: L-carnitine, in vitro embryo, mitochondria, lipid droplets, dairy breed, lipid

profile.

Authors: Luis Baldoceda1, Dominic Gagné


2, Patrick Blondin

2,

Christina Ramires Ferreira3, and Claude Robert

1

Affiliations:






Canada, J2T 5H1

3 : ThoMSon Mass Spectrometry Laboratory, Institute of Chemistry, University of

Campinas, (São Paulo), Brazil, Campinas 13083-970


135

3.1 RÉSUMÉ

La diminution du taux de gestation obtenue à partir d'embryons congelés in vitro chez les

bovins par rapport aux embryons in vivo a été associée à une accumulation excessive de

lipides intracellulaires, ce qui provoque des dommages aux cellules pendant la

cryoconservation. La teneur plus élevée en lipides des blastomères d'embryons bovins

produits in vitro semble être la conséquence d'une altération de la fonction mitochondriale,

ce qui se traduit par une couleur foncée du cytoplasme. La L-carnitine a été utilisée pour

augmenter le métabolisme des lipides et réduire la teneur en lipides dans le cytoplasme des

embryons bovins en culture. Nous avions observé précédemment que les embryons de

différentes races laitières différaient par leur teneur en lipides et par leur métabolisme. Dans

cette étude, le phénotype, la composition lipidique, l'activité mitochondriale et l'expression

génique ont été observés chez les embryons Holstein et Jersey. L‟ajout de L-carnitine dans

le milieu de culture d'embryons a réduit la teneur en lipides chez les deux races en raison de

l'activité accrue des mitochondries. La réponse à la L-carnitine a été plus faible chez les

embryons Jersey que chez les embryons Holstein. Nos résultats montrent donc que la race

influence la réponse d'embryons bovins à la stimulation du métabolisme mitochondrial.

Cela a été confirmé à la fois visuellement et en termes d'expression génique.

137

3.2 ABSTRACT

The decreased rate of pregnancy obtained in cattle using frozen in vitro embryos compared

to in vivo embryos has been associated with over-accumulation of intracellular lipid, which

causes cell damage during cryopreservation. The higher lipid content of blastomeres of

bovine embryos produced in vitro appears to be a consequence of impaired mitochondrial

function, which results in darker-coloured cytoplasm. L-carnitine was used to increase lipid

metabolism and reduce cytoplasmic lipid content in cultured bovine embryos. We had

observed previously that embryos of different dairy breeds differed in lipid content and

metabolism. In this study, appearance, lipid composition, mitochondrial activity and gene

expression were observed in Holstein and Jersey embryos. Adding L-carnitine to the

embryo culture medium reduced the lipid content in both breeds due to increased

mitochondrial activity. The response to L-carnitine was weaker in Jersey than in Holstein

embryos. Our results thus show that genetics influence the response of bovine embryos to

stimulation of mitochondrial metabolism. This was confirmed both visually and in terms of

gene expression.

139

3.3 INTRODUCTION

Transfer of embryos produced in vitro and preserved by freezing has become routine in

dairy production to increase the number of offspring from genetically superior cows

(Bousquet et al., 1999; Hasler, 2006). Despite advances in assisted reproductive

technology, these embryos do not tolerate cryopreservation as well as embryos obtained in

vivo (Hasler, 2001, Seidel, 2006, Guignot, 2006). The resulting lower frequency of

pregnancy has been found to be associated mainly with higher cellular lipid levels (Seidel,

2006; Yamashita et al., 1999; Abe et al., 2002). Several groups have reported that

producing embryos in serum-containing culture media yields blastomeres with high lipid

droplet contents (Thompson et al., 1995; Abe et al., 1999; Fair et al., 2001). This modifies

the embryo lipid profile, which affects tolerance of freezing (Sata et al., 1999). Excessive

formation of lipid droplets has also been associated with variations in mitochondrial

function, which likely affects lipid metabolism (Thompson et al., 1995; Abe et al., 2002;

Fair et al., 2001; Kruip et al., 1983; Dorland et al., 1994; Plourde et al., 2012).

This problem has been examined extensively and many possible solutions have been

tested in attempts to improve the performance of frozen IVP bovine embryos, such as

serum-free culture media (Abe et al., 2002; Rizos et al., 2003), lipid removal (Murakami et

al., 1998; Diez et al., 2001) and supplementation with different fatty acids (Pereira et al.,

2007; Shehab-El-Deen et al., 2009; Aardema et al., 2011; Van Hoeck et al., 2011). Some

positive experimental results have been obtained, but none of these approaches has met

with notable success in commercial practice.

Reported in recent studies, another means of reducing intracellular lipid content might

be to add L-carnitine (a co-factor of fatty acid transport into the mitochondrial matrix) to

the embryo culture medium (Takahashi et al., 2012; Phongnimitr et al., 2013). This

metabolic regulator could have the dual effects of regulating both lipid levels and

accumulation of reactive oxygen species (ROS), thus improving blastocyst development

and cryotolerance.

In North America, most studies of bovine embryo transfer have been conducted using

the Holstein breed, which is the most common dairy cow (Hasler, 2006). However,

important differences between commercial breeds have been observed, of which the

140

consequences for embryo cryotolerance have not yet been studied in any depth. The Jersey

breed, valued for its milk fat content, does not provide in vitro embryos that respond well to

freezing in comparison with the Holstein breed (Steel and Hasler, 2004).

The mechanisms underlying the lower frequency of pregnancy in Jersey cows following

transfer of cryopreserved IVP embryos are not well understood. We have observed recently

that Holstein and Jersey embryos differ somewhat in terms of morphology, lipid profile and

molecular characteristics, suggesting that lipid metabolism might be a factor. The goal of

the present study was therefore to determine whether or not L-carnitine added to the IVP

medium accelerates lipid metabolism and thereby reduces blastomere lipid content. We

focused on the response of phenotype and gene expression levels in Jersey and Holstein

embryos.

141



otherwise specified.

Animals and embryo production conditions

Non-lactating Holstein (n = 4) and Jersey (n = 4) cows were fed the same diet and kept

under the same conditions at L‟Alliance Boviteq Inc., a research farm in Saint-Hyacinthe,

Québec, Canada. Embryos were produced at this same location. All animals used in this

study were handled following the guidelines provided by the Canadian Council on Animal

Care. L‟Alliance Boviteq thus provided all samples, which were processed and analyzed at

Université Laval.

Superovulation and oocyte recovery

To initiate a new follicular wave, all follicles larger than 5 mm in diameter were

punctured on days 8–11 post-oestrus. Administration of follicle-stimulating hormone

(Folltropin-V, Bioniche Animal Health, Belleville, ON, Canada) was begun 36 h after

follicular removal. Follicle-stimulating hormone was injected twice a day in doses of 40 mg

for a total of 240 mg (six injections). Forty-eight hours after the final injection, the

ultrasound-based pick-up procedure was performed using an 18G needle and COOK

aspiration device (COOK Medical, Bloomington, IN, USA). Cumulus-oocyte complexes

(COC) thus recovered were taken immediately to the in vitro maturation laboratory.

In vitro maturation of oocytes

Cumulus-oocyte complexes were twice washed thoroughly in HEPES-buffered

Tyrode's medium containing 10 % bovine serum, 200 µM pyruvate and 50 µg/mL

gentamycin to ensure total removal of follicular liquid. Healthy COCs were then placed in

maturation medium (groups of 10 per 50 µL droplet) under filtered mineral oil (9 mL) for

24 h at 38.5 °C in a humidified 5 % CO2, 20 % O2 atmosphere. The maturation medium

contained TCM199 (Gibco 11150-059, Invitrogen, Burlington, ON, Canada), 10 % foetal

calf serum (Sterile Foetal Bovine Serum for Cell Culture, Medicorp, Montreal, QC,

142

Canada), 200 µM pyruvate, 50 µg/mL gentamycin and 0.1 µg/mL follicle-stimulating

hormone (Gonal-f, Serono Canada Inc., Mississauga, ON, Canada).

In vitro fertilization

Washed and matured COCs were placed in groups of five per droplet (50 µL) of

modified Tyrode‟s lactate medium (containing 0.6 % bovine serum albumin Sigma fraction

V and 200 µM gentamycin) under filtered mineral oil. Two µL of a solution containing 1

mM hypotaurine, 2 mM penicillamine and 250 mM epinephrine were then added to each

droplet. In vitro fertilization with frozen semen (pooled ejaculate) of the Jersey or Holstein

breed (provided by L‟Alliance Boviteq) was performed without delay. The semen was

thawed at 37 °C in a water bath, laid on a discontinuous Percoll gradient (2 mL of 45 %

Percoll over 2 mL of 90 % Percoll) and centrifuged at 700 xg for 30 min at room

temperature. The supernatant was discarded and the pellet was re-suspended in modified

Tyrode‟s lactate medium such that 50,000 spermatozoa (based on count using a

haemocytometer) were used to fertilize each group of five COC.

In vitro culture of embryos

Presumptive zygotes were stripped of cumulus cells and spermatozoa by gentle

pipetting in pre-incubated synthetic oviduct fluid then allocated randomly to two groups for

culture in synthetic oviduct fluid (SOF) either with 0.5 mM L-carnitine (the “treated” or “ +

LC ” group) or without (the “control” or “ – LC” group). The SOF media was a standard

culture medium containing amino acids and 0.4 % fatty-acid-free bovine serum albumin

(ICP-Bio, Auckland, New Zealand). Ten zygotes were placed in a single droplet (10 µL)

under filtered mineral oil (#8410, Sigma). The culture dishes were incubated at 38.5 °C in a

humidified atmosphere containing 6.5 % CO2, 5 % O2 and 88.5 % N2. Ten embryos were

transferred to each fresh droplets (10 µL) at 72 h and 120 h (20 µL) after fertilization to

prevent ammonia intoxication (from amino acid metabolism) and nutrient depletion.

Embryos remained under these conditions until day 6, when morulas and early blastocysts

were categorized according to IETS system for comparison purposes. Embryo collections

were conducted over 8 months. Animals were collected at least seven times to recover all

143

samples. Sixteen biological replicates per breed were used for lipid analysis. For gene

expression analyses, 20 biological replicates were used.

Mitochondrial and lipid droplet staining

Mitochondria in embryos were stained with the active dye CMX-rosamine

(Mitotracker® Red, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) at a final concentration of 300

nM in SOF for 40 minutes at 38 °C in 5 % CO2. This dye shows strong sensitivity to the

mitochondrial membrane potential and affinity for mitochondrial protein (thiol groups) and

exhibits better retention in the organelle compared to other dyes, due to high co-localization

with cytochrome C oxidase (Poot et al., 1996). Embryos selected randomly were incubated

for 15 min with 100 nM carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP, which

uncouples mitochondrial membrane potential) before adding the dye, in order to provide a

negative control. The fluorescence excitation wavelength was 594 nm and emission was

read at 608 nm. Following staining with CMX-rosamine, the embryos were immersed for

10 minutes in SOF containing 3 μg/mL of the lipid-specific dye 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-

pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (Bodipy 493/503, Molecular Probes, Eugene,

OR, USA) in order to stain cytoplasmic lipid droplets. To label nuclei, embryos were

incubated for 10 min at room temperature in SOF containing 1 μg/mL of Hoechst blue dye

33342, mounted on microscope slide coverslips and washed three times in SOF.

Confocal microscopy



magnification of 60x. Embryo morphological phenotype was recorded in photos in grey


system. Mitochondrial activity was the recorded as an epifluorescent image of CMX-

rosamine dye in grey scale. The whole lipid volume of each embryo was estimated based

on the z-stack, which consisted of the set of adjacent optical sections taken at intervals of

0.5 µm, starting from a first section at the bottom of embryo next to the coverslip. The total

thickness of optical sections (20 µm) was sufficient to obtain homogeneity of the Bodipy

144

493/503 fluorescence, as established in preliminary experiments. The optical sections were

recorded at a resolution of 512 x 512 pixels. The settings were the same for all samples.

Digital images of stained embryos were obtained using a LSM 700 confocal system

with a Zeiss Axiovert 200M inverted microscope (Carl Zeiss GmbH, Jena, Germany). The

embryos were viewed with the Plan-Apochromat 40x lens (NA = 1.2) at 10 % utilizable

laser intensity (maximum power: 1.2 W, output: 25 % of the maximum tube current) and a

HFT dichroic beam splitter (458/514 nm). Images of orthogonal projections consisting of

21 slices (1 µm each) were acquired as “lambda stacks” using the Lambda Mode scanning

procedure at a resolution of 1024 x 1024 pixels. Lambda stacks were recorded at a specific

wavelength for each dye. The microscope settings and the lambda mode scanning

procedure were the same for all collected lambda stacks.

Image Analysis

CMX-rosamine fluorescence intensity was measured using the mean grey scale in

IMAGE J software (Abramoff et al., 2004). Results are expressed in arbitrary units (AU) as

the mean fluorescence intensity of all samples within a group. Measurements of the lipid

droplet number and volume in each optical section were obtained using the ImageJ

software Lipid Droplet Counter plugin (Abramoff et al., 2004). The minimal droplet size

threshold was set at 5 pixels (which represents 0.5 μm2) to overcome false-positive counts

due to background pixels. The mean volume of lipid droplets in this size range was

calculated in femtolitres (1 fL = 10-15

litres).

Total DNA and RNA isolation

Additional blastocysts (nine) in each group were used to determine total genomic DNA

and RNA, which were extracted simultaneously using the AllPrep DNA/RNA Micro Kit

(Qiagen, Mississauga, ON, Canada) following the manufacture‟s instructions. Genomic

DNA was used for mitochondrial DNA quantification and total RNA was reverse

transcribed and used for quantitative RT-PCR (qRT-PCR).

145


Embryo mitochondrial DNA (mtDNA) was quantified using a quantitative PCR (qPCR)

method with genomic DNA. The 12S rRNA gene (GenBank accession number J01394)

was selected as a mitochondrial target and the Mx1 gene (GenBank accession number

AY340484) as a nuclear target (Table 8). The ratio of mitochondrial to nuclear DNA

(mtDNA/nDNA) was used to calculate the relative concentration of mitochondrial DNA in

each individual embryo. The LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) was used for qPCR

reactions. The reaction mixture (20 µL) contained 0.5 µL of each primer solution (0.25

µM), 1.2 µL of 1.5 µM MgCl2, 2 µL of LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I

(Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada) and 5 µL of DNA sample. The average DNA

concentration of each sample was 0.00335 ng/µL. The following cycling conditions were

applied for amplification: initial denaturation at 95 °C for 10 min followed by 50 cycles of

95 °C for 5 sec, 5 sec (12S rRNA) at 58 °C or 60 °C (Mx1), followed by 72 °C for 20 sec

and 76 °C (12S rRNA) or 85 °C (Mx1) for 5 sec. The presence of amplicons was verified

using melting curve analysis. Quantification of mitochondrial and nuclear DNA copy

numbers was based on a standard curve and hence on the assumption of a linear

relationship between the crossing point cycle values and the logarithm of the initial copy

number.

Differential gene expression in Holstein and Jersey embryos

Total RNA from control (-LC) and treated (+LC) embryos (n = 4 for each breed) was

extracted and purified using a PicoPure RNA kit (Molecular Devices, Downingtown, PA,

USA) according the manufacturer‟s instructions. DNA was digested using DNase I from

Qiagen. The quality and concentration of extracted RNA was measured using a 2100

Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) with the RNA PicoLab Chip

(Agilent Technologies). Only RNA of very good quality (RIN over 8) was used for the

amplification.

Purified RNA was then amplified in two rounds using the RiboAmp HSPlus RNA

Amplification Kit (Life Science, Foster City, CA, USA) with T7 RNA. The amplicon

146

concentration was measured using NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop,

Wilmington, DE, USA). Antisense RNA labelled with Cy3 or Cy5 using the Universal

Linkage System (ULS) kit (Kreatech Diagnostic, Amsterdam, Netherlands) was hybridized

for 17 h at 65 °C on Agilent-manufactured EmbryoGENE slides in aliquots of 825 ng

(Robert et al., 2011) in a two-colour dye-swap design. A simple direct comparison between

control (-LC) and treated (+LC) embryos from each breed was performed with four

independent biological replicates (each composed of a single blastocyst) per treatment.

Microarrays slides were then washed and scanned with the PowerScanner (Tecan,

Männedorf, Switzerland) and analyzed with Array-Pro Analyzer software

(MediaCybernetics, Bethesda, MD, USA).

Microarray data were pre-processed as described in previous studies (Plourde et al.,

2012). Briefly, data intensity files were analyzed by FlexArray 1.6.1

(http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray), where raw data corrected by background

subtraction were preprocessed using Lowess intra-array normalization and Quantile inter-

array normalization. Statistically significant variations were detected using Limma

(Bioconductor). Differences in gene expression were considered significant when at least

1.5 and the cut-off adjusted p-value was < 0.01. Pathway analyses and downstream

exploitation of gene lists were performed using Ingenuity Pathway Analysis Software

Version 8.6 (Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA, USA).

Validation of microarray results by quantitative RT-PCR

RNA was reverse-transcribed using the qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences,

Gaithersburg, MD, USA) with an oligo-dT to prime the reaction as per the manufacturer‟s

recommendations. Primers of candidates (ADIPOR2: adiponectin receptor 2, ATP5D: ATP

synthase H+ transporting mitochondrial F1 complex delta subunit, CPT2: carnitine

palmitoyltransferase 2, ACOT4: acyl-CoA thioesterase 4 and FADS2: fatty acid desaturase

2) were designed using the Primer3 Web interface (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-

bin/primer3/primer3_www.cgi) and synthetized at IDT (Coralville, IA, USA). The reaction

mixture was composed of the LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit

147

components (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada) and real-time measurements were

performed in a LightCycler 2.0 apparatus (Roche Diagnostics). GeneBank accession

number, primer sequences, annealing temperatures and product size are shown in

Supplemental Table 8.

The reaction conditions have been described previously (Bermejo-Alvarez et al., 2010).

Each pair of primers was tested to achieve efficiencies close to 1, and the comparative cycle

threshold (CT) method was then used to quantify expression levels as described by

Schmittgen and Livak (2008). Quantification was normalized relative to the level of beta-

actin expression (endogenous control). The CT of beta-actin was subtracted from the CT of

the gene to obtain ΔCT. For the calculation of ΔΔCT, the highest sample ΔCT value (i.e.

from the sample with the lowest target expression) was subtracted from all other ΔCT

values. The change in the relative level of gene expression of the target was calculated as 2–

ΔΔCT.

Lipid profile analyses by MALDI-MS

The lipid profile of intact embryos was analysed using a mass spectroscopy (matrix-

assisted laser desorption/ionization or MALDI) procedure described previously (Ferreira et

al., 2010; Ferreira et al., 2012; Tata et al., 2013) with some modifications. Briefly, pooled

(n = 3) control (-LC) or treated (+LC) Holstein or Jersey morula-stage embryos were first

washed three times in PBS solution and then stored in 0.5 mL microtubes containing 2-4

µL of PBS at –80 °C. Samples were thawed in 100 µL of 50 % (v/v) methanol (HPLC

grade, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) in ultrapure water (Millipore, Billerica, MA,

USA) and washed three times in the same solution. Each pool of embryos was then spotted

on a single sample location on the spectrometer probe surface and allowed to dry at room

temperature. The matrix, 1 µL of 1.0 M 2,5-dihydroxybenzoic acid diluted in methanol,

was then spotted on each sample location, and the spots were allowed to dry at room

temperature.

148

Mass spectra were recorded in reflector mode (positive ions) using an AB SCIEX 4800

MALDI TOF/TOF TM instrument (AB Sciex, Concord, Ontario, Canada) equipped with a

Nd:YAG laser operating at 355 nm and 200 Hz. Laser intensity remained constant for all

analyses. External calibration was performed and mass accuracy was better than 50 ppm.

MS spectra were acquired between 700-1000 Da. The spots received 10 V and 60-90s laser

shots, until the signal from that location disappeared due to ablation of the sample.

MALDI-MS data based on collision induction dissociation (CID) were acquired until

extensive break-up of the precursor ion. Argon was used as the collision gas. Spectra were

centred and aligned using MassLynx 4.0 software (Waters, Manchester, UK). From each

spectrum, after exclusion of isotopic peaks, the most intense ions were considered as the

starting point for searching m/z values corresponding to lipids. After attribution, only the

m/z values that were clearly above background levels were included in the principal

component analysis, which was performed using Pirouette v.3.11 (Infometrix Inc.,

Woodinville, WA, USA). Ion fragmentation patterns obtained in previous studies (Ferreira

et al., 2010; Ferreira et al., 2012; Sudano et al., 2012) were used to identify the lipids.

Statistical analyses

For the lipid droplet mean volume and number in embryos, data were analysed using

the ANOVA procedure in Prism version 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Differences between groups were declared significant when P < 0.05. As described

previously for lipid mass spectra (Ferreira et al., 2010; Sudano et al., 2012), multivariate

and univariate statistical models were used. A first principal component analysis (PCA)

was performed using Pirouette v.3.11 (Infometrix, Inc.) and the MetaboAnalyst website

(Xia et al., 2009). The relevant ions for group differentiation indicated by the PCA score

plot were selected for further univariate analysis using Student‟s t-test in order to confirm

their significance as indicated by p-value.

149

3.5 RESULTS

Impact of L-carnitine on embryo phenotype and lipid content

The overall appearance of the Holstein and Jersey control and L-carnitine-treated

morula-stage embryos obtained in vitro is showed in Figure 16. The cytoplasm of

blastomeres in the treated group (+LC) appears pale compared the control (-LC) group

regardless of the breed.

Considered as the storage reservoir of triacylglycerol and cholesterol esters, lipid droplets

in embryos were revealed and quantified using a neutral lipid stain (BODIPY) according to

Aardema et al., (2011). As shown in Figure 17, differences in lipid droplet content are

apparent between the control (-LC) and treated (+LC) groups for both breeds. The number

of droplets was lower in association with the treatment even when the breeds were

considered together (p < 0.05, Figure 18A), while the average volume tended to be lower

(Figure 18B) for the comparisons within breed.

Effects of L-carnitine on mitochondrial activity

Based on Mitotracker dye intensity (Poot et al., 1996), changes in the distribution of

active mitochondria (in red) can be observed in bovine embryos. As expected, the

fluorescence intensity was greater in the treated (+LC) group than in the control (-LC)

group in both breeds (Holstein: 9491 ± 24 AU; Jersey: 7102 ± 29 AU; p < 0.05, Figure

19A). This result indicates that the mitochondria were more active, since the difference

between the experimental treatment (+LC) and the control (-LC) group did not affect the

ratio of mitochondrial to nuclear DNA in either breed (Figure 19B).

Gene expression profile

A large-scale transcriptomic comparison of the control (-LC) and treated (+LC) groups

of Holstein and Jersey embryos at the blastocyst stage was obtained using a microarray.

Based on statistical analysis, 646 genes were more strongly expressed in the Holstein breed,

while 177 targets were more strongly expressed in Jersey embryos. The corresponding

molecular and cellular functions were cell cycle, cellular movement, carbohydrate, lipid

and small molecule metabolism in the Holstein breed, and cell-to-cell signaling and

150

interaction, cellular compromise, cellular function and maintenance, cellular development

and cellular growth and proliferation in the Jersey breed. In this study, we used the known

effect of L-carnitine to attempt to explain in terms of carbohydrate and lipid metabolism the

differences in lipid levels and mitochondrial activity observed between the two treatments

in Holstein embryos. Five genes (ADIPOR2, ATP5D, CPT2, ACOT4, FADS2) related to

carbohydrate and lipid metabolism (Table 8) were selected for validation of the microarray

results by qRT-PCR. This analysis tended to confirm the stronger expression of these genes

in Holstein embryos subjected to the L-carnitine treatment (Figure 20).

Effect of L-carnitine on the lipid profiles of Holstein and Jersey embryos obtained in

vitro

Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) can

provide directly a lipid fingerprint of a single intact cattle embryo, in particular the profile

of phospholipids such as phosphatidylcholines and sphingomyelins (Ferreira et al., 2010;

Sudano et al., 2012; Tata et al., 2013; Ferreira et al., 2012; Apparicio et al., 2012). Based

on principal component analysis (PCA), the most significant lipids were identified (Table

7). The representative lipid profile of each group is shown in Figure 21. The interactions

between cattle breed and L-carnitine supplementation affected the lipid profiles of the four

experimental groups in different ways. Phosphatidylcholine 34:6 protonated or 34:1 +

sodiated ion structure (m/z 782.6) were significantly less abundant (P < 0.05) in treated

(+LC) than the control (-LC) embryos of the Holstein breed (Figure 22). This

phosphatidylcholine was also significantly less abundant in Holstein than in Jersey embryos

subjected to the L-carnitine treatment. The treatment also tended to decrease the relative

abundance of 16:0 sphingomyelin (protonated ion m/z 703.5 and sodiated ion m/z 725.5) in

the case of Holstein embryos, while doing the opposite in the case of Jersey embryos.

Untreated embryos tended (P > 0.05) to contain less 32:1 phosphatidylcholine (protonated

ion m/z 732.5) in both breeds. Phosphatidylcholines of 34:2 and 32:0 structures (protonated

ions m/z 758.6 and 734.5 respectively) were found at similar relative abundance (P > 0.05)

among the four groups. Principal component analysis revealed two distinct clusters

corresponding to the control (-LC) and treated (+LC) Holstein embryos (Figure 23), while

151

the control (-LC) and treated (+LC) Jersey embryos overlapped respectively with the

Holstein control group and with all treatments (Figure 23).

152

3.6 DISCUSSION

The lower tolerance of cryopreservation noted in embryos obtained in vitro appears

to be associated with the higher lipid content of blastomeres, which appears to be due to

modified mitochondrial activity (Thompson et al., 1995; Abe et al., 2002; Fair et al., 2001;

Plourde et al., 2012). Several modifications of standard IVP protocols have been tested in

attempts to regulate lipid content in embryos and thereby improve cryopreservation

efficiency. L-carnitine has been used to reduce lipid over-accumulation in Holstein

embryos obtained in vitro (Takahashi et al., 2012; Phongnimitr et al., 2013). However, its

impact has not been investigated in cattle breeds such Jersey, which is known be more

sensitive to cryopreservation.

In this study, L-carnitine had the effect of changing the colour of blastomeres,

making both Holstein and Jersey embryos appear paler than embryos produced in a

standard in vitro medium. L-carnitine thus could be used to select embryos with a higher

tolerance to cryopreservation, since it has been reported in several studies that the pale

colour of the blastomere cytoplasm is reliable indicator of embryos with superior tolerance

to cryopreservation (Hasler, 2001; Yamashita et al., 1999; Sata et al., 1999; Van Soom et

al., 2003). However, the effect of L-carnitine on colour was lesser in Jersey than in Holstein

embryos. It has been reported that the coloration of the blastomere cytoplasm is due to the

number of lipid droplets and varies among cattle breeds (Van Soom et al., 2003; Leroy et

al., 2005; Sudano et al., 2012). In our study, adding L-carnitine to the culture medium

reduced the number of lipid droplets in both Holstein and Jersey embryos. This observation

is in agreement with the findings of previous studies (Takahashi et al., 2012; Phongnimitr

et al., 2013). This reduction could be due to increased expression of the ADIPOR2 gene, at

least in the Holstein breed. The ADIPOR2 gene has been described as a major

physiological receptor for adiponectin (ADIPOQ) (Yamauchi et al., 2003; Fischer et al.,

2010). ADIPOQ is an adipocyte-derived hormone that plays an important role in the

stimulation of fatty acid oxidation and decreases lipid droplet accumulation as a result of

lower mitochondrial activity (Yamauchi et al., 2003; Liu et al., 2012; Zhou et al., 2008;

Chen et al., 2013). However, L-carnitine was less effective at lowering the lipid droplet

153

content in Jersey embryos, which was echoed by its impact on embryo colour. We suggest

that differences in breed explain this observation. Breed has been shown previously to

influence the lipid content of embryos, which was found higher in Simmental (Bos taurus)

and lower in Nellore (Bos indicus), in vivo as well as in vitro (Sudano et al., 2012). Our

results suggest that abundance of lipid droplets could explain the lower tolerance of Jersey

embryos to cryopreservation compared to Holstein embryos (Steel and Hasler, 2004).

A close relationship between mitochondrial activity and lipid droplet content has

been reported previously (Kruip et al., 1983; Dorland et al., 1994; Hyttel et al., 1986;

Sturmey et al., 2006). The darker cytoplasm observed in bovine embryos obtained in vitro

thus appears related to impaired mitochondrial function (Fair et al., 2001; Thompson et al.,

1995; Abe, et al., 2002). Based on our observations of Mitotracker dye intensity, we

confirmed that L-carnitine enhanced mitochondrial lipid metabolism, as demonstrated by

the reduction in lipid droplet content and the pale cytoplasm of blastomeres of embryos of

either breed. In animal cells, L-carnitine plays an essential role in β-oxidation of long-chain

fatty acids by catalysing their transport into the mitochondrial matrix (Kerner and Hoppel,

2000). The improvement obtained in embryo mitochondrial activity by adding L-carnitine

to the culture medium may thus result from increased beta-oxidation. Beta-oxidation

generates much of the ATP necessary for embryo development (Ferguson and Leese,

1999). Furthermore, expression of the genes ATP5D and CPT2 tended to be stronger in L-

carnitine-treated (+LC) Holstein embryos, which confirm that mitochondrial activity was

improved. Several studies have related ATP5D (Hong and Pendersen, 2003) and CPT2

(Hong and Pendersen, 2003; Yao et al., 2008) to mitochondrial ATP production during

oxidative phosphorylation in eukaryotic cells. However, we observed that L-carnitine

supplementation also has a marked effect on mitochondrial activity, more so in Holstein

than in Jersey embryos. The embryo colour and reduced lipid levels observed in this study

therefore can be explained in terms of the smaller enhancing effect of L-carnitine on

mitochondrial lipid metabolism in the Jersey breed.

Consistent with our present findings, gene expression did not reveal many

differences between L-carnitine-treated (+LC) and control (-LC) embryos of the Jersey

154

breed. However, L-carnitine did influence the expression of genes associated with

carbohydrate and lipid metabolism in Holstein embryos. Based on these results, L-carnitine

appears to have a major impact on metabolism in Holstein embryos and only a minor

impact in Jersey embryos. Furthermore, expression of the genes ACOT4 and FADS2

tended to be higher in treated (+LC) embryos. Gene ACOT4 is member of the acyl-

coenzyme A (CoA) thioesterase protein family, which are key effectors of modulation of

cellular concentrations of acyl-CoA and free fatty acids, which have a major impact on

imbalances in mitochondrial long-chain fatty acid metabolism (Svensson et al., 1998; Hunt

et al., 1999, 2006). On the other hand, it has been demonstrated that FADS2 catalyses the

first and rate-limiting step of the biosynthesis and conversion of polyunsaturated fatty

acids, which are essential bioactive components of membrane phospholipids (Stoffel et al.,

2008; Park et al., 2009; Stroud et al., 2009). These findings are consistent with other studies

that have shown that ACOT4 and FADS2 appear to play an important role in the

modulation of metabolism of saturated as well as unsaturated long-chain CoA acyl esters

(Hunt et al. 2006; Stoffel et al., 2008). ACOT4 and FADS2 thus appear to play an

important role in modifying membrane fluidity by changing both lipid content and fatty

acid composition. This could explain the different sensitivities to cryopreservation observed

in embryos cultured in the presence of L-carnitine (Takahashi et al., 2012; Phongnimitr et

al., 2013).

Lipids play an important role in determining the composition and hence physical

properties of cell membranes, which in turn appear to affect the success of cryopreservation

(Sata et al., 1999; Ferreira et al., 2010; Sudano et al., 2012; Kim et al., 2001). It also known

that environmental conditions influence the lipid profiles of cultured bovine embryos

(Ferreira et al., 2010; Sata et al., 1999; Kim et al., 2001). These observations support our

findings that the lipid profiles of L-carnitine-treated (+LC) and control (-LC) groups of

Holstein embryos did not overlap. However, those of Jersey embryos did overlap,

suggesting significant biochemical differences between these two breeds. These genetic

differences between Holstein and Jersey breeds have been described in previous studies in

relation to milk fat composition (Beaulieu et al., 1995).

155

The greater abundance of sphingomyelins (lipid ions 16:0 + H+ and 16:0 + Na+) in

Holstein embryos obtained in standard culture medium (-LC) and in Jersey embryos

obtained in the modified medium confirmed the differential effects of L-carnitine. Sudano

et al. (2012) also reported greater abundance of sphingomyelins in association with high

lipid content in Simmental embryos obtained in vitro. The relevance of these compounds to

cattle embryo tolerance of cryopreservation is not known. Phosphatidylcholines containing

palmitic (16:0), oleic (18:1) and linoleic (18:2) fatty acids (respectively 32:0 + H+, 32:1 +

H+ and 34:2 + H+) have been noted previously among the lipids found in bovine embryos

(Sudano et al., 2012). It has been suggested that the proportions of these fatty acids play an

important role in determining membrane fluidity, which could have a major impact on the

success of the cryopreservation process (Pereira et al., 2007; Shehab-El-Deen et al., 2009;

Aardema et al., 2011; Van Hoeck et al., 2011; Marei et al., 2010). We found no notable

between-treatment differences in the relative abundances of these phosphatidylcholines in

either breed, suggesting that L-carnitine supplementation might not have had much impact

on their final levels. However, we noted that treated Holstein embryos contained limited

amounts of protonated (34:6) or sodiated (34:1) phosphatidylcholine. Although their lower

abundance was associated with lower lipid content, their role in embryo cryopreservation

has not yet been elucidated. However, variations in 34:1 phosphatidylcholine have been

noted in conjunction with variations in cryopreservation efficiency in the oocytes of

different mammalian species (Sudano et al., 2012; Apparicio et al., 2012; Ferreira et al.,

2010). In terms of lipid profile, the responses of Jersey and Holstein embryos produced in

culture media enriched with L-carnitine differed considerably, and the reasons for this

might be related to breed, based on results presented in this study and others.

In conclusion, the results of the present study show that adding L-carnitine to the

bovine embryo culture medium may affect phenotype by modulating lipid content. This

finding can be explained in terms of enhancement of mitochondrial functions relating to

lipid metabolism, which could directly improve the survival of cryopreserved embryos.

However, conspicuous differences in phenotype, gene expression and lipid profile were

noted between the two dairy breeds, and the effect of L-carnitine on embryos of the Jersey

156

breed was overall weaker and more variable. The influence of genetic background on

embryonic metabolism and embryo phenotype was thus apparent. Further studies are still

needed to improve culture media in order to compensate for the influence of breed on

embryonic metabolism.

157

3.7 ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank Jean-Marc Pellerin of Jersey Québec for his contribution in

providing the Jersey cows for the project, Isabelle Kelly for technical assistance with the

MALDI-MS measurements and Alexandre Bastien (Université Laval, Canada) for technical

assistance with confocal microscopy and image analysis.

158

3.8 REFERENCES

Aardema, H., Vos, P. L., Lolicato, F., Roelen, B. A., Knijn, H. M., Vaandrager, A. B.,

Helms, J. B., and Gadella, B. M. (2011). Oleic acid prevents detrimental effects of

saturated fatty acids on bovine oocyte developmental competence. Biol. Reprod. 85, 62–

69.

Abe, H., Otoi, T., Tachikawa, S., Yamashita, S., Satoh, T., and Hoshi, H. (1999). Fine

structure of bovine morulae and blastocysts in vivo and in vitro. Anat. Embryol. 199,

519–527.

Abe, H., Yamashita, S., Satoh, T., and Hoshi, H. (2002). Accumulation of cytoplasmic lipid

droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different culture

systems using serum-free or serum-containing media. Mol. Reprod. Dev. 61, 57–66.

Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., and Ram, S. J. (2004). Image processing with ImageJ.

Biophoton. Int. 11, 36–42.

Apparicio, M., Ferreira, C. R., Tata, A., Santos, V. G., Alves, A. E., Mostachio, G. Q.,

Pires-Butler, E. A., Motheo, T. F., Padilha, L. C., Pilau, E. J., Gozzo, F. C., Eberlin, M.

N., Lo Turco, E. G., Luvoni, G. C., Vicente, W. R. (2012). Chemical composition of

lipids present in cat and dog oocyte by matrix-assisted desorption ionization mass

spectrometry (MALDI- MS). Reprod. Domest. Anim. 47, 113–117.

Beaulieu, A., and Palmquist, D. (1995). Differential effects of high fat diets on fatty acid

composition in milk of Jersey and Holstein cows. J. Dairy Sci. 78, 1336–1344.

Bermejo-Alvarez, P., Rizos, D., Rath, D., Lonergan, P., and Gutierrez-Adan, A. (2010).

Sex determines the expression level of one third of the actively expressed genes in

bovine blastocysts. PNAS 107, 3394–3399..

Bousquet, D., Twagiramungu, H., Morin, N., Brisson, C., Carboneau, G., and Durocher, J.

(1999). In vitro embryo production in the cow: an effective alternative to the

conventional embryo production approach. Theriogenology 51, 59–70.

Chen, H., Zhang, L., Li, X., Li, X., Sun, G., Yuan, X., Lei, L., Liu, J., Yin, L., Deng, Q.,

Wang, J., Liu, Z., Yang, W., Wang, Z., Zhang, H., and Liu, G. (2013). Adiponectin

activates the AMPK signaling pathway to regulate lipid metabolism in bovine

hepatocytes. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 138, 445–454.

Diez, C., Heyman, Y., Le Bourhis, D., Guyader-Joly, C., Degrouard, J., and Renard, J. P.

(2001). Delipidating in vitro-produced bovine zygotes: effect on further development

and consequences for freezability. Theriogenology 55, 923–936.

Dorland, M., Gardner, D. K., and Trounson, A.O. (1994). Serum in synthetic oviduct fluid

causes mitochondrial degeneration in ovine embryos. J. Reprod. Fertil. 13, 70. (Abstr).

Fair, T., Lonergan, P., Dinnyes, A., Cottell, D. C., Hyttel, P., Ward, F. A., and Boland, M.

P. (2001). Ultrastructure of bovine blastocysts following cryopreservation: effect of

method of blastocyst production. Mol. Reprod. Dev. 58, 186–195.

Ferguson, E. M., and Leese, H. J. (1999). Triglyceride content of bovine oocytes and early

embryos. J. Reprod. Fertil. 116, 373–378.

159

Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. (2012). Single oocyte and single

embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass.

Spectrom. 47(1), 29–33.

Ferreira, C. R., Saraiva, S. A., Catharino, R. R., Garcia, J. S., Gozzo, F. C., Sanvido, G. B.,

Santos, L. F., Lo Turco, E. G., Pontes, J. H., Basso, A. C., and Bertolla, R. P., Sartori,

R., Guardieiro, M. M., Perecin, F., Meirelles, F. V., Sangalli, J. R., and Eberlin, M. N.

(2010). Single embryo and oocyte lipid fingerprinting by mass spectrometry. J. Lipid

Res. 51, 1218–1227.

Fischer, S., Santos, A. N., Thieme, R., Ramin, N., and Fischer, B. (2010). Adiponectin

stimulates glucose uptake in rabbit blastocysts. Biol. Reprod. 83, 859–865.

Guignot, F. (2005) Cryoconservation des embryons des espèces domestiques. INRA Prod.

Anim. 18, 27–35.

Hasler, J. F. (2001). Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in

cattle. Theriogenology 56, 1401–1415.

Hasler, J. F. (2006). The Holstein cow in embryo transfer today as compared to 20 years

ago. Theriogenology 65, 4–16.

Hong, S., and Pedersen, P. L. (2003). ATP synthases: insights into their motor functions

from sequence and structural analyses. J Bioenerg. Biomembr. 35, 95–120.

Hunt, M. C., Nousiainen, S. E., Huttunen, M. K., Orii, K. E., Svensson, L. T., and Alexson,

S. E. (1999). Peroxisome proliferator-induced long chain acyl-CoA thioesterases

comprise a highly conserved novel multi-gene family involved in lipid metabolism. J.

Biol. Chem. 274, 34317–34326.

Hunt, M. C., Rautanen, A., Westin, M. A., Svensson, L. T., Alexson, S. E. (2006). Analysis

of the mouse and human acyl-CoA thioesterase (ACOT) gene clusters shows that

convergent, functional evolution results in a reduced number of human peroxisomal

ACOTs. FASEB J. 20, 1855–1864.

Hyttel, P., Callesen, H., and Greve, T. (1986). Ultrastructural features of preovulatory

oocyte maturation in superovulated cattle. J. Repro. Fert. 76, 645–656.

Kerner, J., and Hoppel, C. (2000). Fatty acid import into mitochondria. Biochim. Biophys.

Acta 1486, 1–17.

Kim, J. Y., Kinoshita, M., Ohnishi, M., and Fukui, Y. (2001). Lipid and fatty acid analysis

of fresh and frozen-thawed immature and in vitro matured bovine oocytes. Reproduction

122, 131–138.

Kruip, T. A. M., Cran, D. G., van Beneden, T. H., and Dieleman, S. J. (1983). Structural

changes in bovine oocytes during final maturation in vivo. Gamete Res. 8, 29–47.

Leroy, J. L., Opsomer, G., De Vliegher, S., Vanholder, T., Goossens, L., Geldhof, A., Bols,

P. E., de Kruif, A., and Van Soom, A. (2005). Comparison of embryo quality in high-

yielding dairy cows, in dairy heifers and in beef cows. Theriogenology 64, 2022–2036.

Liu, Q., Yuan, B., Lo, K. A., Patterson, H. C., Sun, Y., Lodish, H. F. (2012). Adiponectin

regulates expression of hepatic genes critical for glucose and lipid metabolism. Proc.

Natl. Acad. Sci. U S A 109, 14568–14573.

Marei, W. F., Wathes, D. C., Fouladi-Nashta, A. A. (2010). Impact of linoleic acid on

bovine oocyte maturation and embryo development. Reproduction 139, 979–988.

160

Murakami, M., Otoi, T., Sumantri, C., and Suzuki, T. (1998). Effects of centrifugation and

lipid removal on the cryopreservation of in vitro produced bovine embryos at the eight-

cell stage. Cryobiology 36, 206–212.

Park, W. J., Kothapalli, K. S., Lawrence, P., Tyburczy, C., Brenna, J. T. (2009). An

alternate pathway to long-chain polyunsaturates: the FADS2 gene product Delta8-

desaturates 20:2n-6 and 20:3n-3. J. Lipid. Res. 50, 1195–1202.

Pereira, R. M., Baptista, M. C., Vasques, M. I., Horta, A. E., Portugal, P. V., Bessa, R. J.,

Silva, J. C., Pereira, M. S., Marques, C. C. (2007). Cryosurvival of bovine blastocysts is

enhanced by culture with trans-10 cis-12 conjugated linoleic acid (10t,12c CLA). Anim.

Reprod. Sci. 98, 293–301.

Phongnimitr, T., Liang, Y., Srirattana, K., Panyawai, K., Sripunya, N., Treetampinich, C.,

and Parnpai, R. (2013). Effect of L-carnitine on maturation, cryo-tolerance and embryo

developmental competence of bovine oocytes. Anim. Sci. J. 84, 719–725.

Plourde, D., Vigneault, C., Lemay, A., Breton, L., Gagné, D., Laflamme, I., Blondin, P.,

and Robert, C. (2012). Contribution of oocyte source and culture conditions to

phenotypic and transcriptomic variation in commercially produced bovine blastocysts.


Poot, M., Zhang, Y. Z., Krämer, J. A., Wells, K. S., Jones, L. J., Hanzel, D. K., Lugade, A.

G., Singer, V. L., and Haugland, R. P. (1996). Analysis of mitochondrial morphology

and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem. 44, 1363–

1372.

Rizos, D., Gutiérrez-Adán, A., Pérez-Garnelo, S., de la Fuente, J., Boland, M. P., and

Lonergan, P. (2003). Bovine embryo culture in the presence or absence of serum:

implications for blastocyst development, cryotolerance, and messenger RNA expression.

Biol. Reprod. 68, 236–243.

Robert, C., Nieminen, J., Dufort, I., Gagne, D., Grant, J. R., Cagnone, G., Plourde, D.,

Nivet, A.L., Fournier, E., Paquet, E., Blazejczyk, M., Rigault, P., Juge, N., and Sirard,

M. A. (2011). Combining resources to obtain a comprehensive survey of the bovine

embryo transcriptome through deep sequencing and microarrays. Mol. Reprod. Dev. 78,

51–64.

Sata, R., Tsuji, H., Abe, H., Yamashita, S., and Hoshi, H. (1999) Fatty acid composition of


embryonic development. J. Reprod. Dev. 45, 97–103.

Schmittgen, T., and Livak, K. (2008). Analysing real-time PCR data by the comparative CT

method. Nature Protocols 3, 1101–1108.

Seidel, G. E. Jr. (2006). Modifying oocytes and embryos to improve their cryopreservation.


Shehab-El-Deen, M. A., Leroy, J. L., Maes, D., and Van Soom, A. (2009). Cryotolerance

of bovine blastocysts is affected by oocyte maturation in media containing palmitic or

stearic acid. Reprod. Domest. Anim. 44, 140–142.

Steel, R., and Hasler, J. F. (2004). Pregnancy rates resulting from transfer of fresh and

frozen Holstein and Jersey embryos. Reprod. Fert. 16, 182. (Abstr).

Stoffel, W., Holz, B., Jenke, B., Binczek, E., Günter, R. H., Kiss, C., Karakesisoglou, I.,

Thevis, M., Weber, A. A., Arnhold, S., and Addicks, K. (2008). Delta6-desaturase

161

(FADS2) deficiency unveils the role of omega3- and omega6-polyunsaturated fatty

acids. EMBO J. 27, 2281–2292.

Stroud, C. K., Nara, T. Y., Roqueta-Rivera, M., Radlowski, E. C., Lawrence, P., Zhang, Y.,

Cho, B. H., Segre, M., Hess, R. A., Brenna, J. T., Haschek, W. M., Nakamura, M. T.

(2009). Disruption of FADS2 gene in mice impairs male reproduction and causes dermal

and intestinal ulceration. J. Lipid Res. 50, 1870–1880.

Sturmey, R. G., O'Toole, P. J., and Leese, H. J. (2006). Fluorescence resonance energy

transfer analysis of mitochondrial:lipid association in the porcine oocyte. Reproduction

132, 829–837.

Sudano, M. J., Santos, V. G., Tata, A., Ferreira, C. R., Paschoal, D. M., Machado, R.,

Buratini, J., Eberlin, M. N., and Landim-Alvarenga, F. D. (2012). Phosphatidylcholine

and sphingomyelin profiles vary in Bos taurus indicus and Bos taurus taurus in vitro-

and in vivo-produced blastocysts. Biol. Reprod. 87, 130.

Svensson, L. T., Engberg, S. T., Aoyama, T., Usuda, N., Alexson, S. E., and Hashimoto, T.

(1998). Molecular cloning and characterization of a mitochondrial peroxisome

proliferator-induced acyl-CoA thioesterase from rat liver. Biochem. J. 329, 601–608.

Takahashi, T., Inaba, Y., Somfai, T., Kaneda, M., Geshi, M., Nagai, T., and Manabe, N.

(2012). Supplementation of culture medium with L-carnitine improves development and

cryotolerance of bovine embryos produced in vitro. Reprod. Fertil. Dev. 25, 589–599.

Tata, A., Sudano, M. J., Santos, V. G., Landim-Alvarenga, F. D., Ferreira, C. R., Eberlin,

M. N. (2013). Optimal single-embryo mass spectrometry fingerprinting. J Mass

Spectrom. 48, 844–849.

Thompson, J. G., Gardner, D. K., Pugh, P. A., McMillan, W. H., and Tervit, H. R. (1995).

Lamb birth weight is affected by culture system utilized during in vitro pre-elongation

development of ovine embryos. Biol. Reprod. 53, 1385–1391.

Van Hoeck, V., Sturmey, R. G., Bermejo-Alvarez, P., Rizos, D., Gutierrez-Adan, A.,

Leese, H. J., Bols, P. E. J., and Leroy, J. L. (2011). The effect of elevated NEFA during

bovine oocyte maturation on early embryo physiology. PLoS ONE 6, e23183.

Van Soom, A., Mateusen, B., Leroy, J., and de Kruif, A. (2003). Assessment of mammalian

embryo quality: what can we learn from embryo morphology?. Rep. Biomed. Online 7,

664–670.

Xia, J., Psychogios, N., Young, N., and Wishart, D. S. (2009). MetaboAnalyst: a web

server for metabolomic data analysis and interpretation. Nucleic. Acids Res. 37, 652–

660.

Yamashita, S., Abe, H., Itoh, T., Satoh, T., and Hoshi, H. (1999). A serum-free culture

system for efficient in vitro production of bovine blastocysts with improved viability

after freezing and thawing. Cytotechnology 31, 123–131.

Yamauchi, T., Kamon, J., Ito, Y., Tsuchida, A., Yokomizo, T., Kita, S., Sugiyama, T.,

Miyagishi, M., Hara, K., Tsunoda, M., Murakami, K., Ohteki, T., Uchida, S., Takekawa,

S., Waki, H., Tsuno, N. H., Shibata, Y., Terauchi, Y., Froguel, P., Tobe, K., Koyasu, S.,

Taira, K., Kitamura, T., Shimizu, T., Nagai, R., and Kadowaki, T. (2003). Cloning of

adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects. Nature 23, 762–769.

Yao, D., Mizuguchi, H., Yamaguchi, M., Yamada, H., Chida, J., Shikata, K., and Kido, H.

(2008). Thermal instability of compound variants of carnitine palmitoyltransferase II and

162

impaired mitochondrial fuel utilization in influenza-associated encephalopathy. Hum.

Mutat. 29, 718–727.

Zhou, M., Xu, A., Tam, P. K., Lam, K. S., Chan, L., Hoo, R. L., Liu, J., Chow, K. H., and

Wang, Y. (2008). Mitochondrial dysfunction contributes to the increased vulnerabilities

of adiponectin knockout mice to liver injury. Hepatology 48, 1087–1096.

163

3.9 TABLES AND FIGURES

Tableau 7. The most significant phosphatidylcholine (PC) and sphingomyelin (SM)

ions identified based on MALDI-MS data obtained from individual bovine oocytes

and embryos (in vitro).

m/z Lipid ion (C atoms: unsaturation)

703.5 [SM (16:0) + H] +

725.5 [SM (16:0) + Na] +

732.5 [PC (32:1) + H] +

734.5 [PC (32:0) + H] +

758.6 [PC (34:2) + H] +

760.5 [PC (34:1) + H] +

782.6 [PC (34:6) + H] +, [PC (34:1) + Na]

+

784.6 [PC (34:0) + Na] +

786.6 [PC (36:2) + H] +

788.6 [PC (36:1) + H] +

802.6 [PC (36:5) + Na] +

810.6 [PC (38:4) + H] +, [PC (36:1) + Na]

+

Identification is based on the collision induction dissociation database and on earlier

studies (Ferreira et al., 2010; Sudano et al., 2012).

164

Figure 16. Phase contrast images of morula-stage bovine embryos produced in vitro, A) Holstein,

culture medium enriched with L-carnitine (+LC), B) Holstein, no L-carnitine added (-LC), C)

Jersey, culture medium enriched with L-carnitine (+LC), D) Jersey, no L-carnitine (-LC) added.

a)

165

Figure 17. Confocal imaging of active mitochondria labeled with Mitotracker Red (red), lipid

droplets labeled with Bodipy 493/503 (green) and DNA labeled with Hoechst dye (blue) in morula-

stage bovine embryos produced in vitro, A) Holstein, culture medium enriched with L-carnitine

(+LC), B) Holstein, no L-carnitine added (-LC), C) Jersey, culture medium enriched with L-

carnitine (+LC), D) Jersey, no L-carnitine (-LC) added.

166

+LC +LC -LC +LC

0

50

100

150

200

*

*

A

Holstein Jersey

+LC-LC

Nu

mb

er

of

LD

/em

bry

o

-LC +LC Je Je car 0

10

20

30

40

50

Me

an

vo

lum

e o

f L

D/e

mb

ryo

(fL

)

B

Holstein Jersey

-LC

+LC

Figure 18. Lipid droplets (LD) in morula-stage bovine embryos produced in vitro A) Number, B)

Mean volume in femtolitres, -LC = L-carnitine not added to culture medium, +LC = L-carnitine

added to culture medium. Bars represent mean ± SEM. *Significantly different (P < 0.05).

167

-LC +LC Je Je car 0

2000

4000

6000

B

Holstein Jersey

-LC

+LC

mtD

NA

/ n

DN

A

-LC +LC Je Je+ CCCP0

10000

20000

30000

40000

*

*

A

Holstein Jersey

-LC

+LC

CCCP

Mit

otr

ac

ke

r R

ed

In

ten

sit

y (

AU

)

Figure 19. Fluorescence intensity (in arbitrary units, AU) of Mitotracker Red (A) and ratio of

mitochondrial (mt) to nuclear (n) DNA (B) in bovine embryos produced in culture media containing

no added L-carnitine (-LC) and containing added L-carnitine (+LC). Medium containing carbonyl

cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) was used as a negative control. Bars represent mean ±

SEM. *Significantly different (P < 0.05).

168

ADIPOR2 ATP5D CPT2 ACOT4 FADS2

0

5

10

15

20

+LC

-LC

mR

NA

ab

un

dan

ce

Figure 20. Validation by quantitative RT-PCR of microarray results for gene expression levels in

Holstein blastocyst embryos produced in vitro, using five genes involved in carbohydrate and lipid

metabolism. -LC = L-carnitine not added to the culture medium, +LC = L-carnitine added to the

culture medium. Bars represent mean ± SEM. Quantities are normalized relative to endogenous

beta-actine transcripts.

169

Figure 21. MALDI mass spectra (positive ion mode) representative of the lipid profiles of morula-

stage bovine embryos produced in vitro, A) Holstein, in culture medium not containing added L-

carnitine, B) Holstein, in culture medium containing added L-carnitine, C) Jersey, in culture

medium not containing added L-carnitine, D) Jersey, in culture medium containing added L-

carnitine. *Significant quantitative difference (P < 0.05) compared to the Jersey breed.

170

Ho +LC -LC Je car0

20

40

60

80 -LC

+LC

Holstein Jersey

SM(16:0) + H+

Re

lati

ve

ab

un

dan

ce

(%

)

Ho +LC -LC Je car0

20

40

60

80 -LC

+LC

Holstein Jersey

SM(16:0) + Na+

Re

lati

ve

ab

un

dan

ce

(%

)

Ho +LC -LC Je car0

20

40

60

80 -LC

+LC

Holstein Jersey

PC(32:1) + H+

Re

lati

ve

ab

un

dan

ce

(%

)

Ho +LC -LC Je car0

20

40

60

80 -LC

+LC

Holstein Jersey

PC(32:0) + H+

Re

lati

ve

ab

un

dan

ce

(%

)

Ho +LC -LC Je car0

20

40

60

80

*

-LC

+LC

Holstein Jersey

PC(34:6) + H+ and/or PC(34:1) + Na +

*

Re

lati

ve

ab

un

dan

ce

(%

)

Ho +LC -LC Je car0

20

40

60

80-LC

+LC

Holstein Jersey

PC(34:2) + H+

Re

lati

ve

ab

un

dan

ce

(%

)

Figure 22. Relative abundance of lipid species present in morula-stage bovine embryos produced in

vitro, based on selected ions detected by MALDI mass spectroscopy, PC = phosphatidylcholine,

SM = sphingomyelin, -LC = L-carnitine not added to the culture medium, +LC = L-carnitine added

to the culture medium. Bars represent mean ± SEM. *Significantly different (P < 0.05, n = 12

embryos per group).

171

Figure 23. Three-dimensional representation of principal component (PC) analysis of the lipid

composition of morula-stage bovine embryos produced in vitro, based on MALDI-MS data, -LC =

L-carnitine not added to the culture medium, +LC = L-carnitine added to the culture medium (n =

12 embryos per group).

172


Tableau 8. Genbank accession, primer sequences, annealing temperatures and

product size of candidates used for validation of relative gene expression levels in in

vitro bovine embryos by quantitative RT-PCR.

Symbol Accession


( T°)

Acquisition

( T°)

Product

size

(bp) Fw (5‟-3‟) Rv (5‟-3‟)

ADIPOR2 NM_001040499 CGCAACTGGGAAGAGAAAAC CCACCCCTCAGAGGACATAA 57 87 236

ATP5D NM_176670 CTAGTTGTGGTCCACGCTGA ACTCCAGAGCCTTCACCAAG 57 85 256

CPT2 NM_001045889 TCCTGGATCAAGATGGGAAC GTGGGACAGGTGGACAAAGT 57 84 254

ACOT4 NM_001098941 GGCCTCCTAGACATTGTGGA ACATCACGGGTTTGTCCAAT 57 81 289

FADS2 NM_001083444 ACCTGCCTTACAACCACCAG TGTGACCCACACAAACCAGT 57 86 248



173

CHAPITRE IV: Improvement of bovine in vitro embryo production by vitamin K2 supplementation


Development.

Keywords: vitamin K2, mitochondria, in vitro culture, bovine embryo development.

Authors: Luis Baldoceda1, Dominic Gagné


2, Patrick Blondin

2, and

Claude Robert1

Affiliations:






Canada, J2T 5H1


175

4.1 RÉSUMÉ

Les mitochondries jouent un rôle important pendant le développement précoce des

embryons mammifères. Il a été démontré que la préparation folliculaire correctement

contrôlée augmente la probabilité des embryons in vitro chez les bovins d‟atteindre le stade

de blastocyste et de présenter une expression accrue de gènes associés à une fonction

mitochondriale. Notre hypothèse est que les embryons apparemment incompétents

pourraient être sauvés par la restauration de la fonction mitochondriale. Il a était démontré

que la vitamine K2 (une molécule transporteur d‟électrons liée à la membrane et semblable

à l‟ubiquinone) peut restaurer la dysfonction mitochondriale dans les cellules eucaryotes.

L‟objectif de la présente étude était donc d'étudier les effets de la vitamine K2 sur le

développement embryonnaire bovin in vitro. La vitamine a été trouvée plus efficace

lorsqu'ajoutée 72 h après la fécondation. Elle a produit une augmentation significative (P

<0,05) du pourcentage de blastocystes (+ 8,6%), des blastocystes en expansion (+ 7,8 %),

et des embryons de meilleure qualité morphologique. Elle a amélioré de manière

significative l'activité mitochondriale et a eu un impact mesurable sur l'expression des

gènes. Il s'agit de la première démonstration que les conditions standards actuelles de

production in vitro d'embryons bovins peuvent être insuffisantes en raison du manque de

soutien pour la fonction mitochondriale et peuvent être considérablement améliorées en

supplementant le milieu de culture avec la vitamine K2.

177

4.2 ABSTRACT

Mitochondria play an important role during early development in mammalian embryos. It

has been shown that properly controlled follicular preparation increases the likelihood of

in-vitro-produced bovine embryos reaching the blastocyst stage and that competent

embryos exhibit heightened expression of genes associated with mitochondrial function.

We hypothesized that apparently incompetent embryos could be rescued by restoring

mitochondrial function. It has been shown that vitamin K2 (a membrane-bound electron

carrier similar to ubiquinone) can restore mitochondrial dysfunction in eukaryotic cells.

The aim of the present study was therefore to investigate the effects of vitamin K2 on

bovine embryonic development in vitro. The vitamin was found most effective when added

72 h after fertilization. It produced a significant (P < 0.05) increase in the percentage of

blastocysts (+ 8.6 %), more expanded blastocysts (+ 7.8 %), and embryos of better

morphological quality. It improved mitochondrial activity significantly and had a

measurable impact on gene expression. This is the first demonstration that current standard

conditions of in vitro production of bovine embryos may be inadequate due to lack of

support for mitochondrial function and may be improved significantly by supplementing

the culture medium with vitamin K2.

179

4.3 INTRODUCTION

Mitochondria are intracellular organelles that ensure a multitude of key cellular

functions such as energy production, control of apoptosis, lipid metabolism, steroid

synthesis and production of metabolites having important regulatory roles in various

signalling pathways (Dumollard et al., 2009; Van Blerkom, 2009). Although mitochondria

are involved in several vital functions, it is their roles in balancing oxidative stress and in

producing adenosine triphosphate (ATP) that have been most investigated (Thompson et

al., 2000; Trimarchi et al., 2000; Van Blerkom, 2009; Dumollard et al., 2009). An atypical

mitochondrial contingent composed of immature organelles having limited cristae and

hence a limited potential for ATP production via oxidative phosphorylation and glycolysis

has been observed in oocytes (Trimarchi et al., 2000; Fair et al., 2001; Crocco et al., 2011).

This lower level of energy production lasts apparently until these organelles undergo a

transition to mitochondria of mature form, which coincides with activation of the

embryonic genome (Dumollard et al., 2009; Thompson et al., 1996; Tarazona et al., 2006).

Culture media produce adverse effects on the structure and function of mitochondria, with

consequences for the quality of embryos produced in vitro (Crosier et al., 2001; Abe et al.,

2002a). The expression of genes associated with embryo viability may be modified (Rizos

et al., 2003; Plourde et al., 2012). However, variations in mitochondrial function in

association with immature structure have also been observed in embryos produced in vivo

(Crosier et al., 2001; Abe et al., 2002a; Fair et al., 2001; Abe et al., 2002). Meanwhile,

oxidative stress, known to cause some of the most critical declines observed in the

competence of early embryos obtained in vitro, has been shown to perturb mitochondrial

function (Trimarchi et al., 2000; Van Blerkom, 2009; Bavister, 1995). This problem has

been studied extensively, and several modifications to culture media (primarily the addition

of antioxidants) have been proposed (Olson and Seidel, 2000; Sudano et al., 2010).

However, this approach has brought so far only marginal improvements in embryo

competence.

Vitamin K2 has been used recently to counteract the deleterious effects that affects

mitochondrial function in a modified strain of Drosophila and is known to be involved in

Parkinson‟s disease (Vos et al., 2012). It was thus found that vitamin K2 played an electron

180

carrier role in the mitochondrial electron transport chain complex, resulting in more

efficient oxygen use and production of ATP.

Based on our previous study, we hypothesized that vitamin K2 could rescue dysfunctional

mitochondria, which would translate into a higher percentage of embryos reaching the

blastocyst stage. The objectives of the present study were to characterize, for first time, the

effects of vitamin K2 on bovine embryo development and mitochondrial function.

181



specified otherwise.

Recovery of oocytes for embryo production in vitro

Ovaries removed without delay from cows slaughtered in a commercial abattoir were

transported in saline (0.9 % NaCl) containing 1 % antifungal agent. Oocytes were collected

and matured, followed by fertilization and culture according to standard in vitro techniques

in our laboratory (Plourde et al., 2012). Cumulus-oocyte complex (COC) was retrieved

from follicles 2–6 mm in diameter using a 38 mm 18 G needle attached to a 10-mL syringe.

Homogeneous COCs with at least five layers of cumulus surrounding the oocyte

completely were selected, while COCs exhibiting fragmented cytoplasm, pyknotic

cumulus, pale nuclei or abnormal morphology were automatically rejected.

Maturation of oocytes

COCs were placed in HEPES-buffered Tyrode's lactate medium (TLH) supplemented

with 10 % bovine serum, 200 µM pyruvate and 50 µg/mL gentamycin and washed twice

thoroughly to ensure total removal of follicular liquid. Groups of 10 healthy COCs were

placed in 50-µL droplets of medium under 9 mL of filtered mineral oil (#8410, Sigma). The

maturation medium was composed of TCM199 (Gibco product 11150-059, Invitrogen,

Burlington, ON, Canada) plus 10 % foetal calf serum (Sterile Foetal Bovine Serum for Cell

Culture, Medicorp, Montreal, QC, Canada), 200 µM pyruvate, 50 µg/mL gentamycin and

0.1 µg/mL follicle-stimulating hormone (Gonal-f, Serono Canada Inc., Mississauga, ON,

Canada). Droplets containing COCs were incubated for 24 h at 38.5 °C in a humidified

(100 %) atmosphere containing 5 % CO2 and 20 % O2.

Fertilization of oocytes

Matured COCs were washed twice in TLH. Groups of five matured COCs were added

to 50-µL droplets of TLH supplemented with 0.6 % bovine serum albumin (BSA, (Sigma

fraction V) and 200 µM gentamycin (IVF medium) and covered with filtered mineral oil.

182

Two µL of solution containing 1 mM hypotaurine, 2 mM penicillamine and 250 mM

epinephrine were then added to the COC-containing droplets. Oocytes were fertilized with

frozen semen after 15–18 h of incubation at 38.5 °C in a humidified atmosphere containing

5 % CO2 and 20 % O2. Cryo-preserved pooled bull ejaculate was thawed at 37 °C in a

water bath, laid on a discontinuous Percoll gradient (2 mL of 45 % Percoll over 2 mL of 90

% Percoll) and centrifuged at 700 xg for 30 min at room temperature. The supernatant was

discarded and the pellet was re-suspended in the in vitro fertilization medium to obtain a

concentration of 10,000 spermatozoa per COC (five COCs per droplet) based on counts

using a haemocytometer.

Culture of embryos

Presumptive zygotes were denuded of cumulus cells and spermatozoa by gentle

pipetting, washed three times in TLH supplemented with fatty-acid-free BSA and then

cultured in three steps in synthetic oviduct fluid (SOF) containing essential and non-

essential amino acids, 0.5 mM of glycyl-glutamine and 0.4 % fatty-acid-free BSA (ICP-

Bio, Auckland, New Zealand) under filtered mineral oil at 38.5 °C in a humidified

atmosphere containing 6.5 % CO2, 5 % O2 and 88.5 % N2. Embryos were placed in groups

of 10 in droplets of SOF (10 μL). For the first step, the SOF contained non-essential amino

acids at the standard concentration plus 3 μM EDTA. For the second step, the SOF also

contained essential amino acids at half this concentration (SOF2). For the third step, both

the non-essential and essential amino acids were present at the standard concentration

(SOF3).

Vitamin K2 was added in accordance with Vos et al. (2012) with some modifications.

Briefly, vitamin K2 dissolved in 95 % ethanol solution (HPLC grade, Fisher Scientific, Fair

Lawn, NJ, USA) and stored in the dark at -20 °C as a 400X stock solution was diluted in

SOF to obtain final concentrations of 0.5 mM vitamin K2 and 0.25 % ethanol.

At 72 h post-fertilization, embryos were transferred randomly to droplets (10 μL) of

SOF2 containing added vitamin K2 or not. The vitamin-supplemented and control groups

183

were thus both supplemented with 0.25 % ethanol. (Previous tests indicated that 0.25 %

ethanol had no effect on bovine embryo development in vitro.) Embryos were transferred at

120 h post-fertilization to 20 μL droplets of SOF3 again containing added vitamin K2 or not

(with 0.25 % ethanol in either case). This medium was replaced three times to prevent

toxicity due to ammonium accumulation and nutrient (amino acid) depletion due to

assimilation. Embryos remained under these conditions until day 7, when blastocyst

percentages were recorded and early, expanded and hatched blastocyst were categorized

according to the IETS system and used in the various tests in this study. Embryos were

either processed fresh or collected, snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80 °C until

use.

Characterization of embryo mitochondrial activity

Under an atmosphere containing 5 % CO2 at 38 °C, live embryos in SOF were

stained for 40 minutes with the active mitochondrial dye CMX-rosamine (Mitotracker Red,

Molecular Probes, Eugene, OR, USA) at a concentration of 300 nM (same atmosphere and

temperature). This dye has been found more sensitive to the mitochondrial membrane

potential and mitochondrial protein (thiol group abundance) than other dyes and to exhibit

better retention in the organelle and more homogenous dispersion throughout all embryonic

cells [Poot et al., 1996]. The fluorescence excitation wavelength was 594 nm and emission

was read at 608 nm. Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), which

uncouples mitochondrial membrane potential, was used at a concentration of 100 nM in

order to provide a negative control. The CCCP treatment provided background values

against which the different measurement runs were calibrated. Embryos were selected

randomly for treatment with CMX-rosamine or with CCCP + CMX-rosamine.

Confocal microscopy



magnification of 60. Embryo morphological phenotype was recorded in photos in grey

184


system. Mitochondrial activity was recorded as an epifluorescent image of CMX-rosamine

dye in grey scale.

Digital images of embryos stained with CMX-rosamine and with Hoechst blue dye

33342 (nuclear stain) were obtained using a LSM 700 confocal system with a Zeiss

Axiovert 200M inverted microscope (Carl Zeiss GmbH, Jena, Germany). The embryos

were viewed with the Plan-Apochromat 40X lens (NA = 1.2) at 10 % of the utilizable laser

intensity (maximum power: 1.2 W, output: 25 % of the maximum tube current) and a HFT

dichroic beam splitter (458/514 nm). Images of orthogonal projections consisting of 21

slices (1 µm each) were acquired as “lambda stacks” using the Lambda Mode scanning

procedure at a resolution of 1024 x 1024 pixels. Lambda stacks were recorded at a specific

wavelength for each dye. The microscope settings and the lambda mode scanning

procedure were the same for all collected lambda stacks. The intensity of CMX-rosamine

fluorescence was measured using the mean grey scale in IMAGE J software (Abramoff et

al., 2004). Results are expressed in mean fluorescence intensity arbitrary units (AU) based

on all samples within a group.

Extraction of total DNA and RNA

Additional blastocysts from each group were used to obtain values for total genomic

DNA and RNA. The nucleic acids were extracted simultaneously using the AllPrep

DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, Mississauga, ON, Canada) according the manufacturer‟s

instructions. Genomic DNA was used in the mitochondrial DNA quantification procedure

described below and total RNA was reverse-transcribed for quantification by RT-PCR.


Mitochondrial DNA (mtDNA) in individual embryos (n = 10 biological replicates

per treatment) was quantified using a PCR (qPCR) method. The 12S rRNA gene (GenBank

accession number J01394) was selected as a mitochondrial target and the Mx1 gene

185

(GenBank accession number AY340484) as a nuclear target (Table 9). The mtDNA and

nuclear DNA (nDNA) were used to calculate the relative concentration of mtDNA in each

embryo, which was expressed as the mtDNA/nDNA ratio. The LightCycler 2.0 (Roche

Diagnostics) was used to monitor qPCR reactions. The reaction mixture (20 µL) contained

0.5 µL of each primer solution (0.25 µM), 1.2 µL of 1.5 µM MgCl2, 2 µL of LightCycler

FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada), and 5 µL

of DNA sample. The average DNA concentration of each sample was 0.00335 ng/µL. The

following cycling conditions were applied for amplification: initial denaturation at 95 °C

for 10 min followed by 50 cycles of 95 °C for 5 sec, 5 sec (12S rRNA) at 58 °C or 60 °C

(Mx1), followed by 72 °C for 20 sec and 76 °C (12S rRNA) or 85 °C (Mx1) for 5 sec. The

presence of amplicons was verified using melting curve analysis: Following the last

amplification cycle, the internal temperature of the LightCycler was increased rapidly to 94

°C then decreased to 72 °C for 30 s, followed by an increase to 94 °C at a rate of 0.1 °C per

s, with continuous fluorescence reading. Copy numbers of mtDNA and nDNA were

obtained from a standard curve, which was based on the linear relationship between the

crossing point cycle values and the logarithm of the starting copy number.

Determination of differential gene expression in blastocysts

Total RNA extracted from embryos (n = four biological replicates for each group) was

purified using the PicoPure RNA kit (Molecular Devices, Downingtown, PA, USA)

according the manufacturer‟s instructions. DNA was digested with DNase I (Qiagen). RNA

concentration and quality were measured using the 2100-Bioanalyzer (Agilent

Technologies, Palo Alto, CA, USA) with the RNA PicoLab Chip (Agilent Technologies).

Only RNA of very good quality (RIN over 8) was used for amplification.

The concentration of purified RNA amplified for two rounds (with T7 RNA

polymerase) using the RiboAmp HSPlus RNA amplification kit (Life Science, Foster City,

CA, USA) was measured using a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop,

Wilmington, DE, USA). Antisense RNA labelled with Cy3 or Cy5 using the Universal

Linkage System kit (Kreatech Diagnostic, Amsterdam, Netherlands) was hybridized (825

186

ng) on Agilent-manufactured EmbryoGENE slides [Robert et al., 2001] in a two-color dye-

swap design in a hybridization oven for 17 h at 65 °C. A simple direct comparison of the

treatments was made using four independent biological replicates (each consisting of one

blastocyst) per treatment. Microarray slides were then washed and scanned with the

PowerScanner (Tecan, Männedorf, Switzerland) and analyzed with Array-Pro Analyzer

software (MediaCybernetics, Bethesda, MD, USA).

Microarray data were pre-processed as described in previous studies (Plourde et al.,

2012). Briefly, data intensity files were analyzed using FlexArray 1.6.1

(http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray), in which raw data corrected by background

subtraction were pre-processed by performing a Lowess intra-array and Quantile inter-array

normalizations. Statistically significant variations were detected using Limma

(Bioconductor). Gene expression differentials were considered significant when they were

at least 1.2 and the cut-off adjusted p-value was less than 0.01. Pathway analyses and

downstream exploitation of gene lists were carried out using Ingenuity Pathway Analysis

Software Version 8.6 (Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA, USA).

Validation of mRNA levels by quantitative RT-PCR

Microarray results were validated using single embryos (n = five biological replications

per group). Total RNA (extracted as described above) was reverse-transcribed using the

qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) with oligo-dT to

prime the reaction as per the manufacturer‟s recommendations. Primers of candidates

(acetyl-CoA acyltransferase 2 or ACAA2, Ca+2

transporting plasma membrane 4 ATPase or

ATP2B4, NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 7 or NDUFS7, 20 kDa NADH-

coenzyme Q reductase, ceramide synthase 2 or CERS2, mitochondrial ribosomal protein S7

or MRPS7) were designed using the Primer3 Web interface (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-

bin/primer3/primer3_www.cgi) and synthetized at IDT (Coralville, IA, USA). The reaction

mixture was composed of the LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit

components (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada) and real-time measurements were

187

performed in a LightCycler 2.0 apparatus (Roche Diagnostics). GeneBank accession

number, primer sequences, annealing temperatures, and product sizes are shown in

Supplemental Table 9.

For quantification, real-time PCR was performed as described previously [Bermejo-

Alvarez et al., 2010]. The comparative cycle threshold (ΔCT) method was then used to

quantify expression levels, as described by Schmittgen and Livak [2008]. Quantification

was normalized to the endogenous control (β-actin to account for cell numbers). Change in

the relative level of gene expression of the target was calculated as 2 - ΔΔCT.

Electron Microscopy

Early blastocysts (n = five biological replicates for both treatments) classified as

good quality were washed three times in PBS containing 10 % foetal calf serum at 4 °C.

Embryos were fixed in freshly prepared 3 % glutaraldehyde (Electron Microscope

Solutions, Ft. Washington, Pennsylvania, USA) in 0.1 M PBS for 1 h at 4 °C, stored in 0.1

M PBS and later embedded individually at 37 °C in 4 % (w/v) agarose (low melting

temperature, prepared at about 55 °C) and isolated as blocks using a razor blade and a

stereomicroscope. The blocks were washed twice in PBS for five minutes at room

temperature then post-fixed for 1 hour at room temperature in 4 % osmium tetraoxide

(OsO4) in PBS, dehydrated gradually in a series of acetone solutions and then embedded in

Epon 812 epoxy resin. Sections of 1 μm thickness were sliced through the entire embryo

using a glass knife on a Reichert Jung Ultracut E ultramicrotome and stained with toluidine

blue. Sections 80-100 nm thick were sliced with a diamond knife and collected on

Formvar-carbon-coated 200 mesh nickel grids. Sections were then stained with uranyl

acetate and lead citrate and examined using a FEI Tecnai 12 (Eindhoven, The Netherlands)

transmission electron microscope operated at 80 kV.

Statistical Analyses

Samples were distributed randomly among the vitamin-treated and control groups.

Blastocyst rate (percentage) was calculated from the total number of oocytes selected for

188

maturation and data was analyzed with ANOVA followed by Tukey‟s test. Mitochondrial

activity based on Mitotracker Red intensity was analysed using Student‟s t-test to identify

significant differences between groups. All tests were performed with the Prism Version

5.0 statistical software package (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Differences

between groups were declared significant when P < 0.05.

189

4.5 RESULTS

Effects of vitamin K2 on bovine embryo development in vitro

Timing of vitamin K2 supplementation of the culture medium was based on preliminary

experiments that showed detrimental effects when the vitamin was added during oocyte

maturation or early post-fertilization stages (data not shown). It was noted that vitamin K2

supplementation was effective from the 8-cell stage onward. All measurements were done

on embryos treated at 72 h post-fertilization.

Supplementation of the culture medium with vitamin K2 increased the percentage of

blastocysts by 8.6 %. The overall appearance of the blastocysts is shown in Figure 24.

Visible differences were few and trivial (e.g. extruded blastomeres) and observed more

frequently in the control group. On day 7, the percentage of expanded blastocysts (Figure

25) was significantly higher in the vitamin-treated group (17.19 %) than in the control

group (10.0 %). The quality of the embryos in the vitamin-treated group may be classified

as “excellent” compared to the control group, based on IETS criteria.

Blastocyst rate and mitochondrial activity are both increased in embryos treated with

vitamin K2

Figure 26 (A and B) shows the distribution of active mitochondria (red) in bovine embryos

obtained in vitro, as observed using confocal microscopy. As expected, mitochondrial

activity (based on Mitotracker fluorescence intensity, Figure 26C) was greater in embryos

cultured in the vitamin-K2-supplemented medium (12603 ± 88 AU) than in control

embryos (8960 ± 92 AU). The mitochondrial DNA contents normalized on a per cell basis

(Rao et al., 2009) did not differ, suggesting that the mitochondria were more active and not

simply greater in number (Figure 26D).

190

Vitamin K2 supplementation of the early embryo in vitro culture medium influences

gene expression at the blastocyst stage

Of the 37,238 gene transcripts surveyed in the bovine in vitro embryos using the

microarray, only 37 showed a significant (P < 0.01) change in expression level (by a factor

of at least 1.2) in association with the addition of vitamin K2 to the culture medium.

Enrichment analysis showed that the cellular functions with the most significant values

were calcium transport and beta-oxidation of fatty acids. These suggest that vitamin K2 had

an impact on mitochondrial functions. The microarray results were validated by qRT-PCR

analysis using five candidate genes (ACAA2, ATP2B4, NDUFS7, CERS2 and MRPS7)

associated with mitochondrial functions (Table 9). The increased expression of ACAA2 in

the vitamin K2 group based on hybridization results was thus confirmed (Figure 27). In the

case of the other genes, qRT-PCR analysis tended to confirm the increased expression,

albeit with a lesser degree of certainty.

Effect of vitamin K2 on mitochondrial morphology in bovine embryos in vitro

The potential impact of vitamin K2 on mitochondrial maturation was investigated

using electron microscopy. Mitochondria of different morphological types in bovine

blastomeres have been reported in several studies (Crosier et al., 2001; Abe et al., 2002a;

Fair et al., 2001; Abe et al., 2002; Crocco et al., 2011; Crocco et al., 2013). The two most

frequently noted types are known as “mature” (i.e. round or elongated with transverse

cristae distributed either in only part of or in the whole organelle) and “immature” (i.e.

rounded and swollen forms in which the matrix is less dense, cristae area is small and

retracted towards the periphery or absent and small vacuoles may be present).

Both of these mitochondrial types were present in blastocysts obtained by culture in both

the medium supplemented with vitamin K2 and in the control medium. We observed a

larger proportion of mitochondria of swollen shape in embryos in the control group

(Figures 28A and 28C), while the blastomeres of embryos cultured in medium with added

vitamin K2 contained more mitochondria of the mature shape (Figures 28B and 28D).

191

4.6 DISCUSSION

Mitochondria are vital organelles that play crucial roles in eukaryotic cells not only by

generating metabolic energy and managing lipid reserves but also by controlling apoptotic

equilibrium and thereby determining cell fate (Dumollard et al., 2009; Van Blerkom,

2009). Mitochondrial disorders can lead to the arrest of early development (Trimarchi et al.,

2009; Van Blerkom, 2009; Bavister, 1995). In cattle embryos, effects of the suboptimal in

vitro microenvironment on mitochondria have been shown to decrease developmental

competence (Crosier et al., 2001; Abe et al., 2002a; Fair et al., 2001; Abe et al., 2002;

Crocco et al., 2011; Crocco et al., 2013). We have observed that developmental

competence during in vitro production of embryos is improved to 55 % for immature

oocytes collected by transvaginal pick-up following a dedicated ovarian stimulation

regimen, compared to 35 % for those collected from ovaries post-mortem (Plourde et al.,

2012). Analysis of the transcriptome showed that the resulting embryos at a given stage of

development were very similar regardless of the oocyte collection method, except for the

expression levels of genes associated with mitochondrial functions, which were not

affected when the oocytes were collected from live cows. It is well accepted that

developmental competence is influenced greatly by the quality of the oocyte (Rizos et al.,

2002). We hypothesized that this maternal preparation is associated in part with the state of

readiness of the mitochondrial contingent found in the oocyte and that providing support

for mitochondrial functions might compensate for suboptimal preparation and thus result in

higher developmental competence.

The possibility that the impaired mitochondrial function observed in embryos

developed under in vitro conditions could be due to increased free radical stress has been

investigated in several studies. Reducing oxygen tension and adding antioxidants such as

vitamins C and E to the culture medium have been investigated as means of reducing the

free radical load (Olson and Seidel, 2000; Sudano et al., 2010) and reducing free radical

generation associated with lipid catabolism (Takahashi et al., 2012; Phongnimitr et al.,

2013). The antioxidant approach so far has brought only marginal improvements in

developmental competence. This indicates either that free radicals are not the source of the

192

problem or that the ability of mitochondria to fulfil their multifaceted role is compromised

even in presence of lower levels of free radicals.

In the present study, we tested the effect of vitamin K2 on bovine embryonic

development in vitro. Vitamin K2 has been shown recently to restore mitochondrial

function by acting as an electron carrier (Vos et al., 2012). We have shown here that adding

vitamin K2 to the culture medium 72 h after fertilization significantly increased the

percentage of embryos that reach the blastocyst stage. Preliminary tests suggested that

adding the vitamin earlier does not have this effect and may even be detrimental. The

timing of the supplementation thus coincides with the slight increase in mitochondrial

activity observed at the morula stage (72–168 h after fertilization), which is when

activation of the embryonic genome occurs in cattle (Thompson et al., 1996; Tarazona et

al., 2006; Crocco et al., 2011). It is known that this transition is critical for bovine early

development, since most developmental failures occur prior to this activation (Niemann

and Wrenzycki, 2000; Meirelles et al., 2004; Gad et al., 2012). Our results suggest adding

vitamin K2 at the time of genome activation, a phase marked by an extended cell cycle and

substantially increased demand for metabolic energy (Thompson et al., 1996; Tarazona et

al., 2006), helps embryos complete this developmental step by increasing mitochondrial

activity.

Since the treatment did not increase the number of hatched blastocysts, it appears that

vitamin K2 did not stimulate developmental kinetics but rather rescued embryos that would

otherwise have failed to develop. It has been proposed that development is affected by

lower numbers of mitochondria or at least of copies of mitochondrial DNA (Ge et al.,

2012). Vitamin K2 was shown not to have any impact on the mtDNA/nDNA ratio, and may

thus be considered to have no effect on a metric found previously to be an indicator of

physiological soundness (Rao et al., 2009).

Embryo quality is evaluated routinely on the basis of morphological criteria in order to

select embryos most likely to survive cryopreservation (Abe et al., 2002a; Rizos et al.,

2003; Hasler, 2001) and produce gestation (Linder and Wright, Abe et al., 2002; Linder

193

and Wright, 1983; Hasler, 2001; Van Soom et al., 2003). Culture conditions are known to

have a major impact on the quality of embryos produced in vitro (Abe et al., 2002a; Rizos

et al., 2003; Abe et al., 2002; Van Soom et al., 2003). We observed that supplementation of

the culture medium with vitamin K2 resulted in a high proportion of high-quality embryos.

Abe et al. (2002) observed that the blastomeres of bovine embryos obtained in vivo and

classified as “excellent” quality contained a larger proportion of mature mitochondria. We

likewise observed a higher yield of high-quality embryos and increased proportion of

mature mitochondria in blastomeres, in association with vitamin K2 supplementation of the

culture medium. Furthermore, the improved mitochondrial activity in the supplemented

culture was most likely due to this increased proportion of mature mitochondria. The

conditions that provide the signal for the maturation of the mitochondrial contingent are

unknown. Mitochondria adopt their swollen immature shape with limited cristae during

oocyte growth and keep a limited capacity to produce ATP until genome activation and

thereafter acquire the mature shape (Mohr and Trounson, 1981; Plante and King, 1994). It

has been reported in several studies that the developmental competence of mammalian

oocytes and embryos is related to the state of maturity of the mitochondrial cohort (Van

Blerkom, 2009; Crocco et al., 2011; Shepard et al., 1998; Van Blerkom, 2004).

One reported manifestation of improved mitochondrial activity is increased beta-

oxidation of fatty acids, which generates ATP necessary for embryo development

(Ferguson and Leese, 2006). Accordingly, the greater mitochondrial activity in the vitamin-

K2-treated embryos coincided with increased expression (based on microarray analysis) of

ACAA2, a gene known to play a role in beta-oxidation of fatty acids in rat hepatocytes by

regulating the generation of acetate (Yamashita et al., 2006). Embryos in this group also

tended to show greater abundance of transcripts of CERS2. This gene is also involved in

regulating mitochondrial function, since its ablation disrupts respiratory chain activity and

leads to chronic oxidative stress and activation of stress-signalling pathways (Pewzner-Jung

et al., 2010; Zigdon et al., 2013). Consistent with these findings, embryos cultured in the

presence of vitamin K2 also tended to exhibit heightened expression of NDUFS7 and

MRPS7. Deregulation of the former has been associated with impairment of the

194

mitochondrial complex I of the electron transport chain (Triepels et al., 2001), while the

latter gene has been associated with resistance to oxidative stress (Harding et al., 2003).

Based on transcriptome analysis, vitamin K2 supplementation was also found to have an

impact on the transport of calcium, which plays a central role in the regulation of

mitochondrial oxidative metabolism and is a co-factor of a major rate-limiting

dehydrogenase of the TCA cycle (Duchen, 2000; Dumollard et al., 2004). Impaired

mitochondrial uptake of Ca2+

alters the spatiotemporal characteristics of cellular [Ca2+

]

signalling and mitochondrial metabolism and might trigger pathological states that lead to

cell death (Duchen, 2000). Our findings might be related to differential expression of the

ATP2B4 gene, the transcripts of which tended to be more abundant in the vitamin-K2-

treated embryos. Several studies confirm that intracellular Ca2+

levels are related to

expression of ATP2B4 (Usachev et al., 2002; Schuh et al., 2004).

In conclusion, bovine embryos produced in vitro benefit significantly from vitamin K2

supplementation of the culture medium. This vitamin appears to improve embryonic

phenotype when added at the onset of embryonic genome activation, a stage at which the

initiation of mitochondrial maturation is also known to occur. The next step in this research

is to determine the potential of the resulting embryos to lead to healthy gestations that go

full term.

195

4.7 ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank Isabelle Laflamme and Alexandre Bastien (Université Laval,

Canada) for technical assistance with respectively in vitro embryo procedures and confocal

microscopy and image analysis.

197

4.8 REFERENCES

Abe H, Matsuzaki S, Hoshi H. Ultrastructural differences in bovine morulae classified as

high and low qualities by morphological evaluation. Theriogenology 2002; 57:1273–

1283.

Abe H, Yamashita S, Satoh T, Hoshi H. Accumulation of cytoplasmic lipid droplets in

bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different culture systems

using serum-free or serum-containing media. Mol Reprod Dev 2002a; 61:57–66.

Abramoff MD, Magalhaes PJ, Ram SJ. Image Processing with ImageJ. Biophotonics

International 2004; 11:36–42.

Bavister BD. Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts. Hum Reprod Update

1995; 1:91–148.

Bermejo-Alvarez P, Rizos D, Rath D, Lonergan P, Gutierrez-Adan A. Sex determines the

expression level of one third of the actively expressed genes in bovine blastocysts.

PNAS. 2010; 107: 3394–3399.

Crocco M, Alberio RH, Lauria L, Mariano MI. Effect of serum on the mitochondrial active

area on developmental days 1 to 4 in in vitro-produced bovine embryos. Zygote 2011;

19:297–306.

Crocco MC, Kelmansky DM, Mariano MI. Does serum cause lipid-droplet accumulation in

bovine embryos produced in vitro, during developmental days 1 to 4?. J Assist Reprod

Genet 2013; 30:1377–1388.

Crosier AE, Farin PW, Dykstra MJ, Alexander JE, Farin CE. Ultrastructural morphometry

of bovine blastocysts produced in vivo or in vitro. Biol Reprod 2001; 64:1375–1385.

Duchen MR. Mitochondria and calcium: from cell signalling to cell death. J Physiol 2000;

529:57–68.

Dumollard R, Carroll J, Duchen MR, Campbell K, Swann K. Mitochondrial function and

redox state in mammalian embryos. Semin Cell Dev Biol 2009; 20:346–353.

Dumollard R, Marangos P, Fitzharris G, Swann K, Duchen M, Carroll J. Sperm-triggered

[Ca2+] oscillations and Ca2+ homeostasis in the mouse egg have an absolute

requirement for mitochondrial ATP production. Development 2004; 131:3057–3067.

Fair T, Lonergan P, Dinnyes A, Cottell DC, Hyttel P, Ward FA, Boland MP. Ultrastructure

of bovine blastocysts following cryopreservation: effect of method of blastocyst

production. Mol Reprod Dev 2001; 58:186–195.

Ferguson EM, Leese HJ. A potential role for triglyceride as an energy source during bovine

oocyte maturation and early embryo development. Mol Reprod Dev 2006; 73:1195–

1201.

Gad A, Hoelker M, Besenfelder U, Havlicek V, Cinar U, Rings F, Held E, Dufort I, Sirard

MA, Schellander K, Tesfaye D. Molecular mechanisms and pathways involved in

bovine embryonic genome activation and their regulation by alternative in vivo and in

vitro culture conditions. Biol Reprod 2012; 87:100.

Ge H, Tollner T, Hu Z, Dai M, Li X, Guan H, Shan D, Zhang X, Lv J, Huang C, Dong Q.

The importance of mitochondrial metabolic activity and mitochondrial DNA replication

during oocyte maturation in vitro on oocyte quality and subsequent embryo

developmental competence. Mol Reprod Dev 2012; 79(6):392-401.

198

Harding HP, Zhang Y, Zeng H, Novoa I, Lu PD, Calfon M, Sadri N, Yun C, Popko B,

Paules R, Stojdl DF, Bell JC, Hettmann T, Leiden JM, Ron D. An integrated stress

response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell

2003; 11:619–633.

Hasler JF. Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle.

Theriogenology 2001; 56:1401–1415.

Lindner GM, Wright RW Jr. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology

1983; 20:407–416.

Meirelles F, Caetano A, Watanabe Y, Ripamonte P, Carambula S, Merighe G, Garcia S.

Genome activation and developmental block in bovine embryos. Anim Reprod Sci 2004;

82: 13–20.

Mohr LR, Trounson AO. Structural changes associated with freezing of bovine embryos.

Biol Reprod 1981; 25:1009–1025.

Niemann H, Wrenzycki C. Alterations of expression of developmentally important genes in

preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions: implications for

subsequent development. Theriogenology 2000; 53:21–34.

Olson SE, Seidel GE Jr. Culture of in vitro-produced bovine embryos with vitamin E

improves development in vitro and after transfer to recipients. Biol Reprod 2000;

62:248–252.

Pewzner-Jung Y, Brenner O, Braun S, Laviad EL, Ben-Dor S, Feldmesser E, Horn-Saban

S, Amann-Zalcenstein D, Raanan C, Berkutzki T, Erez-Roman R, Ben-David O, Levy

M, Holzman D, Park H, Nyska A, Merrill AH Jr, Futerman AH. A critical role for

ceramide synthase 2 in liver homeostasis: II. insights into molecular changes leading to

hepatopathy. J Biol Chem 2010; 285:10911–10923.

Phongnimitr T, Liang Y, Srirattana K, Panyawai K, Sripunya N, Treetampinich C, Parnpai

R. Effect of L-carnitine on maturation, cryo-tolerance and embryo developmental

competence of bovine oocytes. Anim Sci J 2013; 84:719–725.

Plante L, King WA. Light and electron microscopic analysis of bovine embryos derived by

in vitro and in vivo fertilization. J Assist Reprod Genet 1994; 11:515–529.

Plourde D, Vigneault C, Lemay A, Breton L, Gagné D, Laflamme I, Blondin P, Robert C.

Contribution of oocyte source and culture conditions to phenotypic and transcriptomic

variation in commercially produced bovine blastocysts. Theriogenology 2012; 78:116–

131.

Poot M, Zhang YZ, Krämer JA, Wells KS, Jones LJ, Hanzel DK, Lugade AG, Singer VL,

Haugland RP. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable

fluorescent stains. J Histochem Cytochem 1996; 44:1363–1372.

Rao M, Li L, Demello C, Guo D, Jaber BL, Pereira BJ, Balakrishnan VS. Mitochondrial

DNA injury and mortality in hemodialysis patients. J Am Soc Nephrol. 2009; 20(1):

189–196.

Rizos D, Gutiérrez-Adán A, Pérez-Garnelo S, de la Fuente J, Boland MP, Lonergan P.

Bovine Embryo Culture in the Presence or Absence of Serum: Implications for

Blastocyst Development, Cryotolerance, and Messenger RNA Expression. Biol Reprod

2003; 68:236–243.

Rizos D, Ward F, Duffy P, Boland MP, Lonergan P. Consequences of bovine oocyte

maturation, fertilization or early embryo development in vitro versus in vivo:

199

implications for blastocyst yield and blastocyst quality. Mol Reprod Dev 2002; 61: 234–

248.

Robert C, Nieminen J, Dufort I, Gagne D, Grant JR, Cagnone G, Plourde D, Nivet AL,

Fournier E, Paquet E, Blazejczyk M, Rigault P, Juge N, Sirard MA. Combining

resources to obtain a comprehensive survey of the bovine embryo transcriptome through

deep sequencing and microarrays. Mol Reprod Dev 2011; 78:651–664.

Schmittgen T, Livak K. Analysing real-time PCR data by the comparative CT method.

Nature Protocols. 2008; 3:1101–1108.

Schuh K, Cartwright EJ, Jankevics E, Bundschu K, Liebermann J, Williams JC, Armesilla

AL, Emerson M, Oceandy D, Knobeloch KP, Neyses L. Plasma membrane Ca2+

ATPase 4 is required for sperm motility and male fertility. J Biol Chem 2004;

279:28220–28226.

Shepard TH1, Muffley LA, Smith LT. Ultrastructural study of mitochondria and their

cristae in embryonic rats and primate (N. nemistrina). Anat Rec 1998; 252:383–392.

Sudano MJ, Mattos MC, Fernandes CB, Mazieiro RR, Landim-Alvarenga FC. In vitro

production of bovine embryos using Sigma antioxidant supplement, α-tocopherol and L-

ascorbic acid. Anim Reprod 2010; 7:42–48.

Takahashi T, Inaba Y, Somfai T, Kaneda M, Geshi M, Nagai T, Manabe N.

Supplementation of culture medium with L-carnitine improves development and

cryotolerance of bovine embryos produced in vitro. Reprod Fertil Dev 2013; 25:589–

599.

Tarazona AM, Rodríguez JI, Restrepo LF, Olivera-Angel M. Mitochondrial activity,

distribution and segregation in bovine oocytes and in embryos produced in vitro. Reprod

Domest Anim 2006; 41:5–11.

Thompson JG, McNaughton C, Gasparrini B, McGowan LT, Tervit HR. Effect of

inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylation during compaction and

blastulation of bovine embryos cultured in vitro. J Reprod Fertil 2000; 118:47–55.

Thompson JG, Partridge RJ, Houghton FD, Cox CI, Leese HJ. Oxygen uptake and

carbohydrate metabolism by in vitro derived bovine embryos. J Reprod Fertil 1996;

106:299–306.

Triepels RH1, Hanson BJ, van den Heuvel LP, Sundell L, Marusich MF, Smeitink JA,

Capaldi RA. Human complex I defects can be resolved by monoclonal antibody analysis

into distinct subunit assembly patterns. J Biol Chem 2001; 276:8892–8897.

Trimarchi JR, Liu L, Porterfield DM, Smith PJ, Keefe DL. Oxidative phosphorylation-

dependent and -independent oxygen consumption by individual preimplantation mouse

embryos. Biol Reprod 2000; 62:1866–1874.

Usachev YM, DeMarco SJ, Campbell C, Strehler EE, Thayer SA. Bradykinin and ATP

accelerate Ca(2+) efflux from rat sensory neurons via protein kinase C and the plasma

membrane Ca(2+) pump isoform 4. Neuron 2002; 33:113–122.

Van Blerkom J. Mitochondria in early mammalian development. Semin Cell Dev Biol

2009; 20:354–364.

Van Blerkom J. Mitochondria in human oogenesis and preimplantation embryogenesis:

engines of metabolism, ionic regulation and developmental competence. Reproduction

2004; 128:269–280.

200

Van Soom A, Mateusen B, Leroy J, de Kruif A. Assessment of mammalian embryo quality:

what can we learn from embryo morphology?. Rep BioMed Online 2003; 7:664–670.

Vos M, Esposito G, Edirisinghe JN, Vilain S, Haddad DM, Slabbaert JR, Van Meensel S,

Schaap O, De Strooper B, Meganathan R, Morais VA, Verstreken P. Vitamin K2 is a

mitochondrial electron carrier that rescues pink1 deficiency. Science 2012; 336:1306–

1310.

Yamashita H, Itsuki A, Kimoto M, Hiemori M, Tsuji H. Acetate generation in rat liver

mitochondria; acetyl-CoA hydrolase activity is demonstrated by 3-ketoacyl-CoA

thiolase. Biochim Biophys Acta 2006; 1761:17–23.

Zigdon H, Kogot-Levin A, Park JW, Goldschmidt R, Kelly S, Merrill AH Jr, Scherz A,

Pewzner-Jung Y, Saada A, Futerman AH. Ablation of ceramide synthase 2 causes

chronic oxidative stress due to disruption of the mitochondrial respiratory chain. J Biol

Chem 2013; 288:4947–4956.

201

4.9 FIGURES

Figure 24. Bovine embryos produced in vitro and matured for seven days in synthetic oviduct fluid,

A) control group, B) treated with vitamin K2.

a)

202

Blastocyst rate Early blasts. Expanded blasts. Hatched blasts.

0

10

20

30

40Control

Vitamin K2

*

*

Day 7

(%

)

Figure 25. Effect of vitamin K2 on bovine embryo development in vitro. Embryos were cultured in

synthetic oviduct fluid without (white) or with vitamin K2 (grey). Values represent a mean ± SEM.

*Significantly different (P < 0.05).

203

Figure 26. Confocal microscopy images of bovine blastocyst stage embryos obtained in vitro and

stained with Mitotracker Red (CMX-rosamine) to show active mitochondria and nuclear DNA: A)

embryo cultured in synthetic oviduct fluid, B) embryo cultured in synthetic oviduct fluid enriched

with vitamin K2 72 h after fertilization, C) Mitotracker Red fluorescence intensity (CCCP =

carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone, used as a negative control), D) Ratio of mitochondrial

to nuclear DNA in single blastocysts. Values are mean ± SEM. *Significantly different (P < 0.05).

AU = arbitrary unit.

204

AACA2 ATP2B4 NDUFS7 CERS2 MRPS7

0

2

4

6

8

*

Control

Vitamin K2

mR

NA

ab

un

dan

ce

Figure 27. Validation by quantitative RT-PCR of the differential expression of bovine embryo

genes indicated by microarray analysis: Embryos were produced in vitro and cultured in synthetic

oviduct fluid without (white) or with vitamin K2 (grey). Values are mean ± SEM. Quantification

was normalized to endogenous beta-actin transcript levels. *Significantly different (P < 0.05).

205

Figure 28. Electron micrographs showing mitochondrial morphological types in bovine embryos

(blastomere stage) produced in vitro, A, C – embryo cultured in synthetic oviduct fluid without

added vitamin K2, B, D – embryo cultured in synthetic oviduct fluid with added vitamin K2. The

mitochondria of the control group have fewer cristae than those of the vitamin-K2-treated group. N

= nucleus, M = mature mitochondria, im = immature mitochondria

206


Tableau 9. Characteristics of the primers used for gene candidate transcript

quantification

Symbol Accession

number


temp

(°C)

Acquisition

temp

(°C)

Product

size

(bp) Fw (5’-3’) Rv (5’-3’)

ACAA 2 NM_001035342 TGGTTTCCAGTCCATTGTGA TTCCACCTCTGCTGTGATTG 57 81 291

ATP2B4 NM_001172594 ACGGCTGTGGGTATCAACTC TCAGACCAGCTTTCCCAATC 57 85 256

NDUFS7 NM_001038022 GTCCGACGTGATGATTGTGG CCCGTTTGATCTTCTTCTGC 57 89 263

CERS2 NM_001034667 CACCCAGTTGCCTTTAAACC CCACAGGTGGGACAGTAAGG 57 82 254

MRPS7 NM_001034343 TGAGTGCAGGGAGAAGAAGC CTGGCCTTAAGAGGGAACG 57 89 256



207

Conclusion

L‟augmentation continue de la production laitière au cours des dernières années au

Canada est le résultat d‟un long processus qui implique plusieurs facteurs. L‟utilisation des

technologies de reproduction assistée et la sélection des individus de haute performance

sont deux de ces facteurs clés qui expliquentcette croissance. En effet, une augmentation

du nombre d‟enregistrement des vaches de la race Jersey par rapport aux autres races a été

observée au cours des dernières années (Statistique Canada, 2012). La race Jersey présente

des caractéristiques d‟intérêt économique pour les producteurs laitiers. Le contenu élevé en

protéine et en gras dans le lait sont des particularités remarquables chez les vaches Jersey

comparativement aux autres races laitières. Cependant, l‟utilisation massive de cette race

présente des limitations dans l‟application de techniques de reproduction assistée. Suite au

transfert embryonnaire, un faible taux de gestation a été observé après la cryopréservation

en comparaisson avec les embryons de la race Holstein (Steel et Hasler, 2004). Cependant,

la littérature n‟a pas encore élucidé les raisons pour lesquelles l‟effet de la race peut limiter

l‟utilisation de la cryopréservation.

L‟objectif général de cette thèse était d‟étudier les caractéristiques spécifiques de ces races

au niveau du phénotype et du génome dans le but de mieux comprendre les raisons pour

lesquelles la race peut être un facteur critique de la cryopréservation. L'hypothèse générale

derrière notre travail était que les embryons de la race Jersey ont un faible tauxde survie

après la cryopréservation par rapport aux embryons de la race Holstein en raison de

caractéristiques spécifiques de la race dont des différences au niveau du phénotype et du

génome.

Dans notre première étude décrite au chapitre II, nous avons étudié l‟influence de la race

sur les différences phénotypiques et génomiques des embryons Holstein et Jersey. Nous

avons évalué le phénotype par observation de la couleur, du contenu lipidique, de la

caractérisation de l‟activité mitochondriale et du profil lipidique des embryons tandis que la

stratégie suivie pour l‟évaluation génomique a été l‟utilisation de micropuce pour mesurer

208

la quantité d‟ARNm de plusieurs gènes de fonctions. Nos résultats ont démontré que les

embryons Jersey ont une couleur foncée corrélée à une dysfonction mitochondriale laquelle

peut influencer la concentration des lipides des embryons. Celle-ci est une caractéristique

particulière de la race Jersey et peut ainsi expliquer les différences dans la cryopréservation

comme le suggèrent Steel et Hasler (2004). De plus, les analyses de spectrométrie de masse

des lipides ont déterminé que plusieurs lipides ont une présence différentielle relative entre

les deux races. Les résultats concernant l‟expression des gènes renforcent l'idée proposée

dans le paragraphe précédent. Le faible niveau d‟expression des gènes qui influence le

nombre et la taille des GL ainsi que la présence de certains lipides qui peuvent modifier la

fluidité de la membrane mettent en évidence le fait que les embryons Jersey ont une faible

cryorésistance. L‟ensemble de nos résultats dans le chapitre II souligne l‟influence de la

race dans les différences du phénotype et du génome nous permettant ainsi d‟assurer que la

race peut avoir une influence sur le processus de cryopréservation. De même façon, nos

résultats en contenu lipidique et génomique suggèrent que la race Jersey montre un

métabolisme lipidique différent comparativement à la race Holstein.

À la lumière de cette étude et de nos spéculations suite à nos résultats du chapitre II, nous

avons choisi une méthode qui peut corriger le problème de la faible survie des embryons

congelés de la race Jersey lors de leur transfert. L‟utilisation de la L-carnitine dans le milieu

de culture a été étudiée pour améliorer l‟activité mitochondriale reliée au métabolisme des

lipides. La L-carnitine devait réduire la teneur en lipides des blastomères afin de favoriser

la cryopréservation des embryons bovins. Cependant, en accord avec nos résultats

précédents (chapitre II), nous avons considéré l‟effet de la race comme un facteur limitant

dans la réponse au traitement. Les embryons ont été caractérisés phénotypiquement ainsi

qu‟au niveau de l'expression des gènes à la fois chez les Jersey et chez les Holstein, ces

dernières ayant servi de référence. En lien avec cette hypothèse, nos résultats énoncés dans

le chapitre III confirment que la supplémentation en L-carnitine dans le milieu de culture a

eu une réponse faible chez les embryons de la race Jersey par rapport à ceux de la race

Holstein.

209

Bien que nous ayons observé des changements majeurs sur le phénotype, tels que le

changement de couleur comme conséquence de la réduction des GL, la réponse était

toujours variable ou faible chez les embryons Jersey. Nos résultats sur l‟expression génique

et le profil lipidique des embryons ont supporté l‟idée que les embryons Jersey n‟ont pas

réagi autant que les embryons Holstein. De cette façon, les résultats montrés dans le

chapitre III nous donnent l‟idée que l‟influence de la race sur la génétique était aussi

évident sur le phénotype et le métabolisme des embryons. Cette information apporte de

nouvelles perspectives pour des études complémentaires nécessaires à l‟amélioration du

milieu de culture afin de compenser l'influence de la race sur le métabolisme embryonnaire.

Une constatation très importante que nous pouvons effectuer suite à la présentation de nos

résultats dans les chapitres II et III est l‟importance de l‟activité mitochondriale sur

l‟ensemble de la viabilité de l‟embryon bovin. Au cours des dernières années, l‟impact de la

fonction mitochondriale sur le développement et la compétence embryonnaire ont été

d‟intérêt croissant pour la recherche. La mitochondrie est une organelle primitive qui est à

charge de fonctions métaboliques très importantes pour la viabilité des embryons lors des

premières étapes du développement embryonnaire. Il a été démontré que les mitochondries

présentent une réduction de leur activité avant l‟activation du génome embryonnaire

environ au cours du stade de morula (entre 72 à 168 heures post fécondation) chez les

embryons bovins. En plus, les mitochondries sont très sensibles au déséquilibre redox qui

peut affecter l‟activité de la chaine respiratoire et le bon fonctionnement de l‟organelle. Ces

facteurs peuvent causer la dysfonction mitochondriale qui est l‟origine de l‟arrêt ou du

blocage du développement des embryons.

Afin de compenser la dysfonction mitochondriale des embryons, la préparation des

conditions de culture favorables à l‟amélioration de l‟activité métabolique des

mitochondries serait potentiellement favorable à l‟amélioration de la viabilité

embryonnaire. Finalement, le chapitre IV de cette thèse démontre que l'utilisation d‟une

méthodologie développée chez les drosophiles peut être un outil afin de corriger la

dysfonction mitochondriale laquelle a un impact sur le métabolisme des embryons et est

210

décrite aux chapitres II et III. De ce fait, l‟ajout de la vitamine K2 dans le milieu de culture

pendant le développement post-compaction serait un moyen d‟étudier le rôle de la fonction

mitochondriale dans la viabilité des embryons in vitro chez les bovins. La supplémentation

en vitamine K2 montre des effets sur le phénotype et l‟expression des gènes du

métabolisme mitochondriale notamment la β-oxydation et le transport du calcium. Cette

information apporte de nouvelles perspectives quant à l'amélioration de la fonction

mitochondriale en utilisant de nouvelles conditions de culture. D‟autre part, il serait

intéressant de déterminer l‟effet de la vitamine K2 pour compenser les effets négatifs de la

faible fonction mitochondriale présente en conditions in vivo (Abe et al., 2002) afin

d‟apaiser le blocage du développement embryonnaire.

L‟ensemble des résultats présentés dans cette thèse procurent de nouvelles connaissances

au sujet de l‟impact de la race sur la viabilité et la performance des embryons chez les

bovins lors de l‟application de techniques de reproduction assistée. Nos observations de

l‟impact de la race sur le métabolisme des embryons fournissent une grande diversité

d‟hypothèses pouvant lancer de nouveaux projets de recherche afin de mieux comprendre

les conditions métaboliques nécessaires pour le succès de la compétence des embryons. Il a

été démontré que la race Jersey a une concentration différente de lipides dans le lait produit

par rapport à d‟autres races avec les mêmes conditions d‟alimentation (Beaulieu et al.,

1996).

Il serait intéressant d‟évaluer si l‟effet de la race des embryons Jersey peut aussi montrer

ces caractéristiques observées dans notre étude en d‟autres conditions d‟alimentation

(réduction de contenu du gras) afin d‟obtenir des embryons qui ne montrent pas de

difficultés à la cryopréservation. Il est évident que l‟alimentation a des effets variables sur

la qualité des embryons. Cependant, la plupart des études n‟ont pas considéré la race

comme une raison d‟une possible différence au niveau métabolique. L‟état physiologique

peut être responsable de la qualité des embryons des vaches (Leroy et al., 2008), ce qui

peut affecter la variabilité de la réponse dans les études sur l‟ajout des acides gras dans la

diète (Thangavelu et al., 2007; Fouladi-Natasha et al., 2007).

211

Un autre facteur important pour la viabilité embryonnaire chez les bovins est la fonction

mitochondriale qui a été étudiée dans cette thèse. La dysfonction mitochondriale est un

élément clé qui peut fournir une meilleure compréhension du blocage du développement

embryonnaire. Nous avons proposé l‟utilisation de la vitamine K2 pour améliorer la

fonction mitochondriale dans le développement précoce des embryons. Il serait alors

intéressant de voir l‟interaction de la vitamine K2 sur les embryons Jersey car celle-ci

semble avoir un effet sur la fonction globale de la mitochondrie. Les résultats de

l‟utilisation de la L-carnitine dans le chapitre III suggèrent qu‟elle avait un effet variable

sur le métabolisme des lipides chez les embryons Jersey. Le métabolisme des lipides est

une partie des nombreuses fonctions qu‟ont les mitochondries (Dumollard et al., 2009). De

cette façon, nous croyons que la vitamine K2 peut avoir un effet global sur la dysfonction

mitochondriale démontrée chez les embryons Jersey. Ainsi, il serait aussi intéressant

d‟évaluer l‟effet de la vitamine K2 sur les ovocytes obtenus par ovum pick up (OPU) afin de

vérifier si la faible fonction mitochondriale est observée au niveau des ovocytes et si la

vitamine K2 peut améliorer leur performance. L'observation de la performance

mitochondriale dans ces conditions fournira une meilleure compréhension de ce facteur

crucial du développement embryonnaire.

213

Bibliographie

Aardema, H., Vos, P.L., Lolicato, F., Roelen, B.A., Knijn, H.M., Vaandrager, A.B., Helms,

J.B., Gadella, B.M. (2011) Oleic acid prevents detrimental effects of saturated fatty

acids on bovine oocyte developmental competence. Biol Reprod 85(1), 62-69.

Abe, H., Yamashita, S., Itoh, T., Satoh, T., and Hoshi, H. (1999) Ultrastructure of bovine

embryos developed from in vitro–matured and –fertilized oocytes: comparative

morphological evaluation of embryos cultured either in serum-free medium or in

serum-supplemented. Mol Reprod Dev 53, 325-335.

Abe, H., Otoi, T., Tachikawa, S., Yamashita, S., Satoh, T., and Hoshi, H. (1999a) Fine

structure of bovine morulae and blastocysts in vivo and in vitro. Anat Embryol 199,

519-527.

Abe, H., Matsuzaki, S., and Hoshi, H. (2002) Ultrastructure differences in bovine morulae

classified as high and low qualities by morphological evaluation. Theriogenology

57, 1273-1283.

Abe, H., Yamashita, S., Itoh, T., Satoh, T., and Hoshi, H. (2002a) Accumulation of

cytoplasmic lipid droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos

developed in different culture systems using serum-free or serum-containing media.

Mol Reprod Dev 61, 57-66.

Abou-Haila, A., and Tulsiani, D.R.P. (2000) Mammalian sperm acrosome: formation,

contens, and function. Arch Bioch Biophys 379(2), 173-182.

Aguilar, M.M., Galina, C.S., Merchant, H., Montiel, F., Canseco, R., and Márquez, Y.C.

(2002) Comparison of stereoscopy, light microscopy and ultrastructural methods for

evaluation of bovine embryos. Reprod Domest Anim 37(6), 341-346.

Al Naib, A., Hanrahan, J.P., Lonergan, P., and Fair, S. (2011) In vitro assessment of sperm

from bulls of high and low field fertility. Theriogenology 76, 161-167.

Ambruosi, B., Lacalandra, G.M., Iorga, A.I., De Santis, T., Mugnier, S., Matarrese, R.,

Goudet, G., Dell'aquila, M.E.(2009) Cytoplasmic lipid droplets and mitochondrial

distribution in equine oocytes: Implications on oocyte maturation, fertilization and

developmental competence after ICSI Theriogenology 71(7), 1093-104.

Anderson, S., Bankier, A.T., Barrell, B.G., de Bruijn, M.H., Coulson, A.R., Drouin, J.,

Eperon, I.C., Nierlich, D.P., Roe, B.A., Sanger, F., Schreier, P.H., Smith, A.J.,

Staden, R., and Young, I.G. (1981) Sequence and organization of the human

mitochondrial genome. Nature 290(5806), 457-465.

214

Antunes, G., Chaveiro, A., Santos, P., Marques, A., Jin, H.S., and Moreira da Silva, F.

(2010) Influence of apoptosis in bovine embryo's development. Reprod Domest

Anim 45(1), 26-32.

Bao, B., and Garverick, H.A. (1998) Expression of steroidogenic enzyme and gonadotropin

receptor genes in bovine follicles during ovarian follicular waves: a review. J Anim

Sci 76, 1903-1921.

Barnes, F.L., and Eyestone, W.H. (1990) Early cleavage and the maternal zygotic transition

in bovine embryos. Theriogenology 33(1), 141-152.

Barnett, D.K., Kimura, J., and Bavister, B.D. (1996) Translocation of active mitochondria

during hamster preimplantation embryo development studied by confocal laser

scanning microscopy. Dev Dyn 205, 64-72.

Barnett, D.K., Clayton, M.K., Kimura, J., and Bavister, B.D. (1997) Glucose and phosphate

toxicity in hamster preimplantation embryos involves disruption of cellular

organization, including distribution of active mitochondria. Mol Reprod Dev 48,

227-237.

Bartlett, K., and Eaton, S. (2004) Mitochondrial β-oxidation. Eur J Biochem 271, 462-469.

Bavister , B.D. (1995) Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts. Hum Reprod

Update 1(2), 91-148.

Bavister, B.D., and Squirrell, J.M. (2000) Mitochondrial distribution and function in

oocytes and early embryos. Hum Reprod 15, 189-198.

Betteridge, K.J., and Fléchon, J.E. (1998) The anatomy and physiology of pre-attachment

bovine embryos. Theriogenology 29(1), 155-187.

Beaulieu, A.D., and Palmquist, D.L. (1995) Differential effects of high fat diets on fatty

acid composition in milk of Jersey and Holstein cows. J Dairy Sci 78(6), 1336-

1344.

Bilby, T.R., Block, J., do Amaral, B.C., Sa Filho, O., Silvestre, F.T., Hansen, P.J., Staples,

C.R., and Thatcher, W.W. (2006) Effects of dietary unsaturated fatty acids on

oocyte quality and follicular development in lactating dairy cows in summer. J

Dairy Sci 89(10), 3891-3903.

Blondin, P., and Sirard, M.A. (1995) Oocyte and follicular morphology as determining

characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Mol Reprod Dev

41, 54-62.

215

Blondin, P., Coenen, K., Guilbault, L.A., and Sirard, M.A. (1997) In vitro production of

bovine embryos: developmental competence is acquired before maturation.

Theriogenology 47, 1061-107.

Bousquet, D., Burnside, E.B., and Van Doormaal, B.J. (2003) Biotechnologies of

reproduction applied to dairy cattle production: Embryo transfer and IVF. Canadian

J Anim Sci 83(3), 403-407.

Braw-Tal, R., and Yossefi, S. (1997) Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle

growth in the bovine ovary. J Rep Fert 109, 165-171.

Bulankina, A.V., Deggerich, A., Wenzel, D., Mutenda, K., Wittmann, J.G., Rudolph, M.G.,

Burger, K.N., and Höning, S. (2009) TIP47 functions in the biogenesis of lipid

droplets. J Cell Biol 185(4), 641-655.

Camargo, L.S.A., Viana, J.H.M., Sá1, W.F., Ferreira, A.M., Ramos, A.A., and Vale Filho,

V.R. (2006) Factors influencing in vitro embryo production. Anim Reprod 3, 19-

28.

Cerri, R.L., Juchem, S.O., Chebel, R.C., Rutigliano, H.M., Bruno, R.G., Galvão, K.N.,

Thatcher, W.W., and Santos, J.E. (2009) Effect of fat source differing in fatty acid

profile on metabolic parameters, fertilization, and embryo quality in high-producing

dairy cows. J Dairy Sci 92(4), 1520-1531.

Charpigny, G., Guesnet, P., Marquant-LeGuiene, B., Heyman, Y., Mermillod, P., Humblot,

P. (2003) Fatty acid composition of triglycerides, phosphatidylcholines and

phosphatidylethanolamines of bovine embryos. BRG 4, 159–172.

Chi, M.M., Hoehn, A., and Moley, K.H. (2002) Metabolic changes in the glucose-induced

apoptotic blastocyst suggest alterations in mitochondrial physiology. Am J Physiol

Endocrinol Metab 283(2), E226-E232.

Chiaratti, M.R., Bressan, F.F., Ferreira, C.R., Caetano, A.R., Smith, L.C., Vercesi, A.E.,

and Meirelles, F.V. (2010) Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during

early embryogenesis in cattle. Biol Reprod 82, 76-85.

Christie, W.W. (1982) Lipid Analysis: Isolation, separation, identification and structural

analysis of lipid (2nd

Edition), Pergamon Press, Oxford, UK pp. 2-10.

Coleman, R.A., and Lee, D.P. (2004) Enzymes of triacylglycerol synthesis and their

regulation. Pgrs Lipid Resch 43, 134-176.

Cook, H.W., and McMaster, C.R. (2002), Fatty acid desaturation and chain elongation in

eukaryotes, In : Vance, D.E., and Vance, J.E. (eds.), New Comprehensive

Biochemistry, Elsevier, pp. 181-204.

216

Cook, H.W. (1996), Fatty acid desaturation and chain elongation in eukaryotes, In : Vance,

D.E., and Vance, J.E. (eds.), New Comprehensive Biochemistry, Elsevier, pp. 129-

152.

Côté, I., Vigneault, C., Laflamme, I., Laquerre, J., Fournier, É., Gilbert, I., Scantland, S.,

Gagné, D., Blondin, P.,and Robert, C. (2011) Comprehensive cross production

system assessment of the impact of in vitro microenvironment on the expression of

messengers and long non-coding RNAs in the bovine blastocyst. Reproduction

142(1), 99-112.

Crocco, M., Alberio, R.H., Lauria, L., and Mariano, M.I. (2011) Effect of serum on the

mitochondrial active area on developmental days 1 to 4 in in vitro-produced bovine

embryos. Zygote 19(4), 297-306.

Crosier, A.E., Farin, P.W., Dykstra, M.J., Alexander, J.E., and Farin, C.E. (2000)

Ultrastructural morphometry of bovine compact morulae produced in vivo or in

vitro. Biol Reprod 62, 1459-1465.

Crosier, A.E., Farin, P.W., Dykstra, M.J., Alexander, J.E., and Farin, C.E. (2001)

Ultrastructural morphometry of bovine blastocysts produced in vivo or in vitro. Biol

Reprod 64, 1375-1385.

Cummins, J.M. (1998) Mitochondrial DNA in mammalian reproduction. Rev Reprod 3(3),

172-182.

Cummins, J.M. (2000) Fertilization and elimination of the paternal mitochondrial genome.

Hum Reprod 15(2), 92-101.

Cummins, J.M. (2004) The role of mitochondria in the establishment of oocyte functional

competence. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 115(1), S23-S29.

Dieleman, S.J., Hendriksen, P.J., Viuff, D., Thomsen, P.D., Hyttel, P., Knijn, H.M.,

Wrenzycki, C., Kruip, T.A., Niemann, H., Gadella, B.M., Bevers, M.M., and Vos,

P.L. (2002) Effects of in vivo prematuration and in vivo final maturation on

developmental capacity and quality of pre-implantation embryos. Theriogenology

57(1), 5-20.

Detmer, S.A., and Chan, D.C. (2007). Functions and dysfunctions of mitochondrial

dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 870-879.

Dobson H., Smith, R., Royal, M., Knight, Ch., and Sheldon, I. (2007) The high-producing

dairy cow and its reproductive performance. Reprod Domest Anim 42(2), 17-23.

217

Dorland, M., Gardner, D.K., and Trounson, A.O. (1994) Serum in synthetic oviduct fluid

causes mitochondrial degenerationin ovine embryos. J Reprod Fertil 13, 70 (Abstr).

Driancourt, M.A. (1991) Follicular dynamics in sheep and cattle. Theriogenology 35, 55-

79.

Duchan, M.R. (2000) Mitochondria and calcium: from cell signalling to cell death. J

Physiol 529, 57-68.

Ducharme, N.A., and Bickel, P.E. (2008) Lipid droplets in lipogenesis and lipolysis.

Endocrinology 149(3), 942-949.

Dumollard, R., Marangos, P., Fitzharris, G., Swann, K., Duchen, M, and Carroll, J. (2004)

Sperm-triggered [Ca2+] oscillations and Ca2+ homeostasis in the mouse egg have

an absolute requirement for mitochondrial ATP production. Development 13, 3057-

3067.

Dumollard, R., Duchen, M., and Sardet, C. (2006) Calcium signals and mitochondria at

fertilisation. Biol Reprod 53(6), 1385-1391.

Dumollard, R., Duchen, M., and Carroll, J. (2007) The role of mitochondrial function in the

oocyte and embryo. Curr Top Dev Biol 77, 21-49.

Dumollard, R., Carroll, J., Duchen, M.R., Campbell, K., and Swann, K. (2009)

Mitochondrial function and redox state in mammalian embryos. Semin Cell Dev

Biol 20(3), 346-353.

Eppig, J.J., Wigglesowrth, K., and O'Brien, M.J. (1992) Comparison of embryonic

developmental competence of mouse oocytes grown with and without serum. Mol

Reprod Dev 32(1), 33-40.

Erickson, B.H. (1966) Development and senescence of the postnatal bovine ovary. J Anim

Sci 25, 800-805.

Fahy, E., Subramaniam, S., Brown, H.A., Glass, C.K., Merrill, A.H., Murphy, R.C., Raetz,

C.R.H., Russell, D.W., Seyama, Y., Shaw, W., Shimizu, T., Spener, F., van Meer,

G., VanNieuwenhze, M.S., White, S.H., Witztum, J.L., and Dennis, E.A. (2005) A

comprehensive classification system for lipids. J Lipid Res 46, 839-861.

Fair, T., Hyttel, P., and Greve, T. (1995) Bovine oocyte diameter in relation to maturational

competence and transcriptional activity. Mol Reprod Dev 42, 437-442.

Fair, T., Hulshof, S.C.J., Hyttel, P., Greve, T., and Boland, M.P. (1997) Oocyte

ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anat Embryol 195,

327-336.

218

Fair, T., Lonergan, P., Dinnyes, A., Cotell, D.C., Hyttel, P., Ward, F.A., and Boland, M.P.

(2001) Ultrastructure of bovine blastocysts following cryopreservation: Effect of

method of blastocyst production. Mol Reprod Dev 58, 186-195.

Fair, T. (2003) Follicular oocyte growth and acquisition of developmental competence.

Anim Rep Sci 78, 203-216.

Ferguson, E.M., and Leese, H.J. (1999) Triglyceride content of bovine oocytes and early

embryos. J Reprod Fertil 116, 373-378.

Ferreira, C.R., Saraiva, S.A., Catharino, R.R., Garcia, J.S., Gozzo, F.C., Sanvido, G.B.,

Santos, L.F., Lo Turco, E.G., Pontes, J.H., Basso, A.C., Bertolla, R.P., Sartori, R.,

Guardieiro, M.M., Perecin, F., Meirelles, F.V., Sangalli, J.R., and Eberlin, M.N.

(2010) Single embryo and oocyte lipid fingerprinting by mass spectrometry. J Lipid

Res 51(5), 1218-1227

Florman, H.M., Arnoult, C., Kazam, I.G., Li, C., and O‟Toole, C.M.B. (1999) An intimate

biochemistry: egg-regulated acrosome reactions of mammalian sperm. Adv Devel

Biochem 5, 147-186.

Fortune, J.E. (1986) Bovine theca and granulosa cells interact to promote androgen

production. Biol Rep 35, 292-299.

Fortune, J.E., and Quirk, M. (1988) Regulation of steroidogenesis in bovine preovulatory

follicles. J Anim Sci 66(2), 1-8.

Fouladi-Nashta, A.A., Gutierrez, C.G., Gong, J.G., Garnsworthy, P.C., and Webb, R.

(2007) Impact of dietary fatty acids on oocyte quality and development in lactating

dairy cows. Biol Reprod 77, 9-17.

Frey, T.G., and Mannella, C.A. (2000) The internal structure of mitochondria. Trends in

Biochem Sci 25, 319-324.

Gao, J., Ye, H., and Serrero, G. (2000) Stimulation of adipose differentiation related

protein (ADRP) expression in adipocyte precursors by long-chain fatty acids. J Cell

Physiol 182(2), 297-302.

Girard, J., Perdereau, D., Foufelle, F., Prip-Buus, C., and Ferré, P. (1994) Regulation of

lipogenic enzyme gene expression by nutrients and hormones. J Fed Amer Soc Exp

Biol 8(1), 36-42.

Graham, J.K., Kunze, E., and Hammerstedt, R.H. (1990) Analysis of sperm cell viability,

acrosomal integrity, and mitochondrial function using flow cytometry. Biol Reprod

43, 55-64.

219

Guérin, P., El Mouatassim, S., and Ménézo, Y. (2001) Oxidative stress and protection

against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its

surroundings. Hum Reprod Update 7(2), 175-189.

Guignot, F. (2005) Cryoconservation des embryons des espèces domestiques. INRA Prod

Anim 18 (1), 27-35.

Gurr, M.I., Harwood, J.L., and Frayn, K.N. (2002) Lipid Biochemistry (5th Edition).

Blackwell Science Ltd, Oxford, UK, pp. 13-30.

Houten, S.M., and Wanders, R.J.A. (2010) A general introduction to the biochemistry of

mitochondrial fatty acid β-oxidation. J Inherit Metab Dis 33, 469–477.

Hanukoglu, I. (1992) Steroidogenic enzymes: structure, function, and role in regulation of

steroid hormone biosynthesis. J Steroid Biochem Mol Biol 43(8), 779-804.

Hasler, J.F. (2001) Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in

cattle. Theriogenology 56(9), 1401-1415.

Hawk, H.W. (1983) Sperm Survival and Transport in the Female Reproductive Tract. J

Dairy Sci 66(12), 2645-2660.

Hillier, S.G., Whitelaw, P.F., and Smyth, C.D. (1994) Follicular oestrogen synthesis: the

'two-cell, two-gonadotrophin' model revisited. Mol Cell Endocrinol 100(1-2), 51-54.

Hochi, S., Kimura, K., and Hanada, A. (1999) Effect of linoleic acid-albumin in the culture

medium on freezing sensitivity of in vitro-produced bovine morulae.

Theriogenology 52(3), 497-504.

Holm, P., Shukri, I.N.N., Vajta, G., Booth, P., Bendixen, C., and Callesen, H. (1998)

Developmental kinetics of the first cell cycles of bovine in vitro produced embryos

in relation to their in vitro viability and sex. Theriogenology 50, 1285-1299.

Holm, P., Booth, P., and Callesen, H. (2002) Kinetics of early in vitro development of

bovine in vivo- and in vitro-derived zygotes produced and/or cultured in chemically

defined or serum-containing media. Reproduction 123, 553-565.

Hoppins, S., and Nunnari, J. (2012) Mitochondrial dynamics and apoptosis-the ER

connection. Science 337, 1052-1054.

Hyttel, P., Callesen, H., and Greve, T. (1986) Ultrastructural features of preovulatory

oocyte maturation in superovulated cattle. J Repro Fert 76, 645-656.

220

Hyttel, P., Callesen, H., and Greve, T. (1989) A comparative ultrastructural study of in vivo

versus in vitro fertilization of bovine oocytes. Anat Embryol 179, 435-442.

Hyttel, P., Fair, T., Callesen, H., and Greve, T. (1989) Oocyte growth, capacitation and

final maturation in cattle. Theriogenology 47, 23-32.

Imai, K., Kobayashi, S., Goto, Y., Dochi, O., and Shimohira, I. (1997) Cryopreservation of

bovine embryos obtained by in-vitro culture of IVM-IVF oocytes in the presence of

linoleic acid albumin. Theriogenology 47(1), 347 (Abstr).

Jenkins, T.C. (1994) Regulation of lipid metabolism in the rumen. J Nutr 124(8), 1372S-

1376G.

Jeong, W.J., Cho, S.J., Lee, H.S., Deb, G.K., Lee, Y.S., Kwon, T.H., and Kong, I.K. (2009)

Effect of cytoplasmic lipid content on in vitro developmental efficiency of bovine

IVP embryos. Theriogenology 72(4), 584-589.

Kameyama, Y., Filion, F., Yoo, J.G., and Smith, L.C. (2007) Characterization of

mitochondrial replication and transcription control during rat early development in

vivo and in vitro. Reproduction 133(2), 423-432.

Kątska-Książkiewicz, L., Alm, H., Torner, H., Heleil, B., Tuchscherer, A., and Ryńska, B.

(2011) Mitochondrial aggregation patterns and activity in in vitro cultured bovine

oocytes recovered from early antral ovarian follicles. Theriogenology 75, 662-670.

Kerner, J., and Hopel, C. (2000) Fatty acid import into mitochondria. Bioch Biophy Acta

1486, 1-17.

Kim, K. (1997) Regulation of mammalian acetyl-coenzyme A carboxylase. Annu Rev Nutr

17, 77–99.

Kim, J.Y., Kinoshita, M., Ohnishi, M., and Fukui, Y. (2001) Lipid and fatty acid analysis of

fresh and frozen-thawed immature and in vitro matured bovine oocytes.

Reproduction 122, 131-138.

Kölle, S., Dubielzig, S., Reese, S., Wehrend, A., König, P., and Kummer, W. (2009) Ciliary

transport, gamete interaction, and effects of the early embryo in the oviduct: ex vivo

analyses using a new digital videomicroscopic system in the cow. Biol Rep 81, 267-

274.

Kölle, S., Reese, S., and Kummer, W. (2009) New aspects of gamete transport, fertilization,

and embryonic development in the oviduct gained by means of live cell imaging.

Theriogenology 73, 786-795.

221

Krisher, R.L., and Bavister, B.D. (1998) Responses of oocytes and embryos to the culture

environment. Theriogenology 49, 103-114.

Kroemer, G., and Reed, J.C. (2003) Mitochondrial control of cell death. Nat Med 6(5), 513-

519.

Kruip, T.A.M., Cran, D.G., van Beneden, T.H., and Dieleman, S.J. (1983) Structural

changes in bovine oocytes during final maturation in vivo. Gamete Research 8, 29-

47.

Lee, AG. (2004) How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim

Biophys Acta 1666(1-2), 62-87.

Leibo, S.P. (1986) Commercial production of pregnancies from one-step diluted frozen-

thawed bovine embryos. Theriogenology 25, 166 (Abstr).

Lequarre, A.S., Marchandise, J., Moreau, B., Massip, A., and Donnay, I. (2003) Cell cycle

duration at the time of maternal zygotic transition for in vitro produced bovine

embryos: effect of oxygen tension and transcription inhibition. Biol Reprod 69(5),

1707-1713.

Lequarre, A.S., Vigneron, C., Ribaucour, F., Holm, P., Donnay, I., Dalbiès-Tran, R.,

Callesen, H., and Mermillod, P. (2005) Influence of antral follicle size on oocyte

characteristics and embryo development in the bovine. Theriogenology 63(3), 841-

859.

Leroy, J.L., Opsomer, G., De Vliegher, S., Vanholder, T., Goossens, L., Geldhof, A., Bols,

P.E., de Kruif, A., and Van Soom, A. (2005) Comparison of embryo quality in high-

yielding dairy cows, in dairy heifers and in beef cows. Theriogenology 64(9), 2022-

2036.

Linder, G.M., and Wright, R.W. (1983) Bovine embryo morphology and evaluation.

Theriogenology 20(4), 407-416.

Lingwood D., and Simons, K. (2010) Lipid rafts as a membrane-organizing principle.

Science 327(5961), 46-50.

Londos, C., Brasaemle, D.L., Schultz, C.J., Segrest, J.P., and Kimmel, A.R. (1999)

Perilipins, ADRP, and other proteins that associate with intracellular neutral lipid

droplets in animal cells. Semin Cell Dev Biol 10(1), 51-58.

Londos, C., Sztalryd, C., Tansey, J.T., and Kimmel, A.R. (2005) Role of PAT proteins in

lipid metabolism. Biochimie 87(1), 45-49.

222

Lonergan, P., Rizos, D., Ward, F., and Boland, M.P. (2001) Factors influencing oocyte and

embryo quality in cattle. Reprod Nutr Dev 41(5), 427-437.

Lucy, M.C., De La Sota, R.L., Staples, C.R., and Thatcher, W.W. (199l) Effect of dietary

calcium salts of long chain fatty acids (CaLCFA), energy intake, and lactation on

ovarian follicular dynamics in Holstein dairy cows. J Anim Sci 69( 1), 451 (Abstr).

Mahmoudzadeh, A.R., Van Soom, A., Bols, P., Ysebaert, M.T., and de Kruif, A. (1995)

Optimization of a simple vitrification procedure for bovine embryos produced in

vitro: effect of developmental stage, two-step addition of cryoprotectant and sucrose

dilution on embryonic survival. J Reprod Fertil 103(1), 33-39.

Mannella, C.A. (2006) Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane

cristae. Biochim Biophys Acta (5-6), 542-548.

Marei, W.F., Wathes, D.C., and Fouladi-Nashta, A.A. (2009) The effect of linolenic Acid

on bovine oocyte maturation and development. Biol Reprod 81(6), 1064-1072.

Marei, W.F., Wathes, D.C., and Fouladi-Nashta, A.A. (2010) Impact of linoleic acid on

bovine oocyte maturation and embryo development. Reproduction 139(6), 979-988.

Massip, A. (2001) Cryopreservation of embryos of farm animals. Reprod Domest Anim

36(2), 49-55.

Matwee, C., Betts, D.H., and King, W.A. (2000) Apoptosis in the early bovine embryo.

Zygote 8(1), 57-68.

Mattos, R., Staples, C.R., and Thatcher, W.W. (2000) Effects of dietary fatty acids on

reproduction in ruminants. Rev Reprod 5, 38-45.

Mattson, B.A., and Albertini, D.F. (1990) Oogenesis: chromatin and microtubule dynamics

during meiotic prophase. Mol Reprod Dev 25, 374-383.

May-Panloup, P., Chrétien, M., Malthièry, Y., and Reynier, P. (2004) Mitochondries et

reproduction. Médecine sciences 20(8-9), 779-783.

May-Panloup, P., Vignon, X., Chrétien, M.F., Heyman, Y., Tamassia, M., Malthièry, Y.,

and Reynier, P. (2005) Increase of mitochondrial DNA content and transcripts in

early bovine embryogenesis associated with upregulation of mtTFA and NRF1

transcription factors. Reprod Biol Endocrinol 14, 3:65.

May-Panloup, P., Chretien, M.F., Malthiery, Y., and Reynier, P. (2007) Mitochondrial

DNA in the oocyte and the developing embryo. Curr Top Dev Biol 77, 51-83.

223

McKeegan, P.J., and Sturmey, R.G. (2011) The role of fatty acids in oocyte and early

embryo development. Reprod Fertil Dev 24, 59-67.

McStay, G.P. et Green, D.R. (2011) Mitochondria and Cell Death, In : Reed J.C. et Green,

D.R. (eds.), Apoptosis : Physiology and Pathology, Cambridge University Press,

New York, pp. 37-43.

McEvoy, T.G., Coull, G.D., Broadbent, P.J., Hutchinson, J.S., and Speake, B.K. (2000)

Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with

intact zona pellucida. J Reprod Fertil 118, 163-170.

Memili, E., Dominko, T., and First, N.L. (1998) Onset of transcription in bovine oocytes

and preimplantation embryos. Mol Reprod Dev 51, 36-41.

Mermillod, P., Dalbiès-Tran, R., Uzbekova, S., Thélie, A., Traverso, J.M., Perreau, C.,

Papillier, P., and Monget, P. (2008) Factors affecting oocyte quality: who is driving

the follicle?. Reprod Dom Anim 43(2), 393-400.

Mohr, L.R., and Trounson, A.O. (1981) Structural changes associated with freezing of

bovine embryos. Biol Reprod 25(5), 1009-1025.

Moran, L.A., Horton, R.H., Scrimgeour, K.G., and Perry, M.D. (2012), Structure and

function : Lipids and membrane, In : Moran, L.A., Horton, R.H., Scrimgeour, K.G.,

and Perry, M.D. (eds.), Principles of Biochemestry (5th

Edition), Pearson Editions,

Boston, pp. 20-43.

Morio, B., Yeckel, C.W., and Wolfe, R.R. (2003) Fatty acid oxidation. Encyclopedia of

live sciences 2, 1-13.

Motta, P.M., Nottola, S.A., Makabe, S., and Heyn, R. (2000) Mitochondrial morphology in

human fetal and adult female germ cells. Hum Reprod 15(2), 129-147.

Murphy, D.J., and Vance, J. (1999) Mechanisms of lipid-body formation. Trends Biochem

Sci. 24(3), 109-115.

Nakamura, M.T., and Nara, T.Y.(2004) Structure, function, and dietary regulation of

delta6, delta5, and delta9 desaturases. Annu Rev Nutr 24, 345-376.

Nohl, H., Gille, L., and Staniek, K. (2005) Intracellular generation of reactive oxygen

species by mitochondria. Biochem Pharmacol 69(5), 719-723.

Parson, M.J., et Green, D.R. (2010) Mitochondrial in cell death, In : Brown, G.C., et

Murphy, M.P. (eds.), Essays in Biochemistry: Mitochondrial Function, Portland

Press Limited, London, pp. 99-111.

224

Pereira, S.L., Leonard, A.E., and Mukerji, P. (2003) Recent advances in the study of fatty

acid desaturases from animals and lower eukaryotes. Prostaglandins Leukot Essent

Fatty Acids 68(2), 97-106.

Pereira, R.M., Baptista, M.C., Vasques, M.I., Horta, A.E., Portugal, P.V., Bessa, R.J., Silva,

J.C., Pereira, M.S., and Marques, C.C. (2007) Cryosurvival of bovine blastocysts is

enhanced by culture with trans-10 cis-12 conjugated linoleic acid (10t,12c CLA).

Anim Reprod Sci 98(3-4), 293-301

Perkins, G.A., and Frey, T.G. (2000) Recent structural insight into mitochondria gained by

microscopy. Micron 31, 97-111.

Petit, H.V., Cavalieri, F.B., Santos, G.T., Morgan, J., and Sharpe, P. (2008) Quality of

embryos produced from dairy cows fed whole flaxseed and the success of embryo

transfer. J Dairy Sci 91, 1786-1790.

Picton, H., Briggs, D., and Gosden, R. (1998) The molecular basis of oocyte growth and

development. Mol Cell Endcr 145, 27-37.

Pinyopummintr, T., and Bavister, B.D. (1991) In vitro-matured/in vitro-fertilized bovine

oocytes can develop into morulae/blastocysts in chemically defined, protein-free

culture media. Biol Reprod 45(5), 736-742.

Pinyopummintr, T., and Bavister, B.D. (1994) Development of bovine embryos in a cell-

free culture medium: Effects of type of serum, timing of its inclusion and heat

inactivation. Theriogenology 41(6), 1241-1249.

Plante, L., and King, W.A. (1994) Light and electron microscopic analysis of bovine

embryos derived by in vitro and in vivo fertilization. J Assist Reprod Genet 10, 515-

29.

Plourde, D, Vigneault, C., Lemay, A., Breton, L., Gagné, D., Laflamme, I., Blondin, P.,

Robert, C. (2012) Contribution of oocyte source and culture conditions to

phenotypic and transcriptomic variation in commercially produced bovine

blastocysts. Theriogenology 78(1), 116-131.

Ponter, A.A., Parsy, A.E., Saadé, M., Mialot, J.P., Ficheux, C., Duvaux-Ponter, C., and

Grimard, B. (2006) Effect of a supplement rich in linolenic acid added to the diet of

post partum dairy cows on ovarian follicle growth, and milk and plasma fatty acid

compositions. Reprod Nutr Dev 46, 19-29.

Rieger, D., Loskutoff, N.M., and Betteridge, K.J. (1992) Developmentally related changes

in the metabolism of glucose and glutamine by cattle embryos produced and co-

cultured in vitro. J Reprod Fertil 95(2), 585-595.

225

Royère, D.(2006) Maturation ovocytaire: peut-on définir la compétence d‟un ovocyte ?. J

Gynecol Obstet Biol Reprod 35, 2S8-2S13.

Ratnayake, W.M.N., and Galli, C. (2009) Fat and fatty acid terminology, methods of

analysis and fat digestion and metabolism: a background review paper. Ann Nutr

Metab 55, 8-43.

Rich, P.R., and Maréchal, A. (2010) The mitochondrial respiratory chain, In : Brown,

G.C., et Murphy, M.P. (eds.), Essays in Biochemistry: Mitochondrial Function,

Portland Press Limited, London, pp. 1-23.

Rivera, R.M., Kelley,K.L., Erdos, G.W., and Hansen, P.J. (2003) Alterations in

ultrastructural morphology of two-cell bovine embryos produced in vitro and in vivo

following a physiologically relevant heat shock. Biol Reprod 69, 2068-2077.

Rizos. D., Ward, F., Duffy, P., Boland, M.P., and Lonergan, P. (2002) Consequences of

ovine oocyte maturation, fertilization or early embryo development in vitro versus

in vivo: implications for blastocyst yield and blastocyst quality. Mol Reprod Dev

61(2), 234-248.

Rizos, D., Gutierrez-Adan, A., Perez-Garnelo, S., De La Fuente, J., Boland, M.P., and

Lonergan, P. (2003) Bovine embryo culture in the présence or absence of sérum:

implications for blastocyst development, cryotolerance, and messenger RNA

expression. Biol Reprod 68, 236-243.

Robel P. (2001), La stéroïdogenèse : les enzymes et la régulation de leur expression

génomique, In : Thibault C., Levasseur M.-C. (eds.), La reproduction chez les

mammifères et l‟Homme, INRA Editions, Paris, pp. 144-153.

Robenek, H., Robenek, M.J., Buers, I., Lorkowski, S., Hofnagel, O., and Troyer, D.,

Severs, N.J. (2005) Lipid droplets gain PAT family proteins by interaction with

specialized plasma membrane domains. J Biol Chem 280(28), 26330-26338.

Robenek, H., Hofnagel, O., Buers, I., Robenek, M.J., Troyer, D., and Severs, N.J. (2006)

Adipophilin-enriched domains in the ER membrane are sites of lipid droplet

biogenesis. J Cell Sci 119(20), 4215-24.

Robinson, R.S., Pushpakumara, P.G., Cheng, Z., Peters, A.R., Abayasekara, D.R., and

Wathes, D.C. (2002) Effects of dietary polyunsaturated fatty acids on ovarian and

uterine function in lactating dairy cows. Reproduction 124, 119-131.

Romek, M., Gajda, B., Rolka, M., and Smorąg, Z. (2010) Mitochondrial activity and

morphology in developing porcine oocytes and pre-implantation non-cultured and

cultured embryos. Reprod Domest Anim 46(3), 471-480.

226

Saeki, K., Kato, H., Hosoi, Y., Miyake, M., Utsumi, K., and Iritani, A. (1991) Early

morphological events of in vitro fertilized bovine oocytes with frozen-thawed

spermatozoa. Theriogenology 35(5), 1051-1058.

Santos, J.E., Bilby, T.R., Thatcher, W.W., Staples, C.R., and Silvestre, F.T. (2008) Long

chain fatty acids of diet as factors influencing reproduction in cattle. Reprod Domest

Anim 43, 23-30.

Sata, R., Tsuji, H., Abe, H., Yamashita, S., and Hoshi, H. (1999) Fatty acid composition of


embryonic development. J Repro Dev 45, 97-103.

Sastre, D., da Costa, N.N., de Sá, A.L., Conceição, S.D., Chiaratti, M.R., Adona, P.R.,

Guemra, S., Meirelles, F.V., Santos Sdo, S., Sena, L., Ohashi, O.M., dos Santos,

E.J., and Miranda Mdos, S. (2014) Expression of PLIN2 and PLIN3 during oocyte

maturation and early embryo development in cattle. Theriogenology 81(2), 326-331.

Scheffler, I. (2008) Mitochondria (2nd

Edition). J. Willey & Sons, Inc., New Jersey, USA.

Semenkovich, C.F. (1997) Regulation of fatty acid synthase (FAS). Prog Lipid Res 36(1),

43-53.

Senger, P.L., and Saacke, R.G. (1970) Unusual mitochondria of the bovine oocyte. J Cell

Biol 46(2), 405-408.

Shoubridge, E.A. (2000) Mitochondrial DNA segregation in the developing embryo. Hum

Reprod 15(2), 229-234.

Sinowatz, F., Töpfer-Petersen, E., Kölle, S., and Palma, G. (2001) Functional morphology

of the zona pellucida. Anat Histol Embryol 30, 257-263.

Sirard, M.A., Richard, F., Blondin, P., and Robert, C. (2006) Contribution of the oocyte to

embryo quality. Theriogenology 65, 126-136.

Soumano, K., Silversides, D.W., Doiz, F., and Price, C.A. (1996) Follicular 3β-

hydroxysteroid dehydrogenase and cytochromes P450 17α-hydroxylase and

aromatase messenger ribonucleic acids in cattle undergoing superovulation. Biol

Reprod 55, 1419-1426.

Soumano, K., and Price, C.A. (1997) Ovarian follicular steroidogenic acute regulatory

protein, low-density lipoprotein receptor, and cytochrome P450 side-chain cleavage

messenger ribonucleic acids in cattle undergoing superovulation. Biol Reprod 56,

516-522.

Spector, A.A., and Yorek, M.A. (1985) Membrane lipid composition and cellular function.

J Lipid Res 26(9), 1015-35.

227

Statistique Canada. (2012) Statistiques canadiennes du secteur de la génetique animale.

http://www.infolait.gc.ca/pdf/genetics_publication_2012f.pdf. Accessed, 18

Septembre 2013.

Staples, C.R., Burke, J.M., and Thatcher, W.W. (1998) Influence of supplemental fats on

reproductive tissues and performance of lactating cows. J Dairy Sci 81, 856-871.

Steele, R., and Hasler, J.F. (2004) Pregnancy rates resulting from transfer of fresh and

frozen Holstein and Jersey embryos. Reprod Fert 16, 182(Abstr).

St John, J.C., Facucho-Oliveira, J., Jiang, Y., Kelly, R., and Salah, R. (2010) Mitochondrial

DNA transmission, replication and inheritance: a journey from the gamete through

the embryo and into offspring and embryonic stem cells. Hum Reprod Update

16(5), 488-509.

Stojkovic, M., Machado, S.A., Stojkovic, P., Zakhartchenko, V., Hutzler, P., Gonçalves,

P.B., and Wolf, E. (2001) Mitochondrial distribution and adenosine triphosphate

content of bovine oocytes before and after in vitro maturation: correlation with

morphological criteria and developmental capacity after in vitro fertilization and

culture. Biol Reprod 64, 904-909.

Sturmey, R.G., O'Toole, P.J., and Leese H.J. (2006) Fluorescence resonance energy transfer

analysis of mitochondrial:lipid association in the porcine oocyte. Reproduction

132(6), 829-837.

Sturmey, R.G., Reis, A., Leese, H.J., and McEvoy, T.G. (2009) Role of fatty acids in

energy provision during oocyte maturation and early embryo development. Reprod

Domest Anim 44(3), 50-58.

Sudano, M.J., Santos, V.G., Tata, A., Ferreira, C.R., Paschoal, D.M., Machado, R.,

Buratini, J., Eberlin, M.N., and Landim-Alvarenga, F.D. (2012)

Phosphatidylcholine and sphingomyelin profiles vary in Bos taurus indicus and Bos

taurus taurus in vitro- and in vivo-produced blastocysts. Biol Reprod 87(6), 130.

Sutovsky, P., Moreno, R.D., Ramalho-Santos, J., Dominko, T., Simerly, C., and Schatten,

G. (2000) Ubiquitinated sperm mitochondria, selective proteolysis, and the

regulation of mitochondrial inheritance in mammalian embryos. Biol Reprod 63,

582-590.

Takahashi, M., Keicho, K., Takahashi, H., Ogawa, H., Schultz, R.M., and Okano, A. (2000)

Effect of oxidative stress on development and DNA damage in in-vitro cultured

bovine embryos by comet assay. Theriogenology 54(1), 137-145.

http://www.infolait.gc.ca/pdf/genetics_publication_2012f.pdf

228

Takahashi, M. (2012) Oxidative stress and redox regulation on in vitro development of

mammalian embryos. J Reprod Dev 58(1), 1-9.

Talbot, P., Barry, D.S., and Diana, G.M. (2003) Cell adhesion and fertilization: steps in

oocyte transport, sperm-zona pellucida interactions, and sperm-egg fusion. Biol Rep

68, 1-9.

Tansey, J.T., Sztalryd, C., Gruia-Gray, J., Roush, D.L., Zee, J.V., Gavrilova, O., Reitman,

M.L., Deng, C.X., Li, C., Kimmel, A.R., and Londos, C. (2001) Perilipin ablation

results in a lean mouse with aberrant adipocyte lipolysis, enhanced leptin

production, and resistance to diet-induced obesity. Proc Natl Acad Sci U S A

98(11), 6494-6499.

Tarazona, A.M., Rodríguez, J.I., Restrepo, L.F., and Olivera-Angel, M. (2006)

Mitochondrial activity, distribution and segregation in bovine oocytes and in

embryos produced in vitro 41, 5-11.

Thangavelu, G., Colazo, M.G., Ambrose, D.J., Oba, M., Okine, E.K., and Dyck, M.K.

(2007) Diets enriched in unsaturated fatty acids enhance early embryonic

development in lactating Holstein cows. Theriogenology 68, 949-957.

Thiele C., and Spandl, J. (2004) Cell biology of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol 20(4),

378-85.

Thomas, M.G., Bao, B., and Williams, G.L. (1997) Dietary fats varying in their fatty acid

composition differentially influence follicular growth in cows fed isoenergetic diets.

J Anim Sci 75(9), 2512-2519.

Thompson, J.G., Gardner, D.K., Pugh, P.A., McMillan, W.H., and Tervit, H.R. (1995)

Lamb birth weight is affected by culture system utilized during in vitro pre-

elongation development of ovine embryos. Biol Reprod 53(6), 1385-1391.

Thompson, J.G., Partridge, R.J., Houghton, F.D., Cox, C.I., and Leese, H.J. (1996) Oxygen

uptake and carbohydrate metabolism by in vitro derived bovine embryos. J Reprod

Fertil 106(2), 299-306.

Thompson, J.G., Allen, N.W., McGowan, L.T., Bell, A.C., Lambert, M.G., Tervit, H.R.

(1998) Effect of delayed supplementation of fetal calf serum to culture medium on

bovine embryo development in vitro and following transfer. Theriogenology 49(6),

1239-1249.

Thompson, J.G., McNaughton, C., Gasparrini, B., McGowan, L.T., and Tervit, H.R. (2000)

Effect of inhibitors and uncouplers of oxidative phosphorylation during compaction

and blastulation of bovine embryos cultured in vitro. J Reprod Fertil 118(1), 47-55.

229

Thompson, J.G. (2000a) In vitro culture and embryo metabolism of cattle and sheep

embryos - a decade of achievement. Anim Reprod Sci 60-61, 263-275.

Trimarchi, J.R, Liu, L., Porterfield, D.M., Smith, P.J., and Keefe, D.L. (2000) Oxidative

phosphorylation-dependent and -independent oxygen consumption by individual

preimplantation mouse embryos. Biol Reprod 62(6), 1866-1874.

Turrens, J.F. (2003) Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol 552(2),

335-344.

Van Blerkom, J. (2009) Mitochondria in early mammalian development. Semin Cell Dev

Biol 20(3), 354-364.

Van Blerkom, J. (2011) Mitochondrial function in the human oocyte and embryo and their

role in developmental competence. Mitochondrion 11(5), 797-813.

Van den Hurk, R., and Zhao, J. (2005) Formation of mammalian oocytes and their growth,

differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology 63, 1717-

1751.

Vance, J.E., and Vance, D.E. (2004) Phospholipid biosynthesis in mammalian cells.

Biochem Cell Biol 82, 113-128.

Van Langendonckt, A., Donnay, I., Schuurbiers, N., Auquier, P., Carolan, C., Massip, A.,

and Dessy, F. (1997) Effects of supplementation with fetal calf serum on

development of bovine embryos in synthetic oviduct fluid medium. J Reprod Fertil

109, 87-93.

Van Soom, A., Van Vlaenderen, I., Mahmoudzadeh, A.R., Deluyker, H., and de Kruif, A.

(1992) Compaction rate of in vitro fertilized bovine embryos related to the interval

from insemination to first cleavage. Theriogenology 38, 905-919.

Van Soom, A., and de Kruif, A. (1998) Bovine embryonic development after in vivo and in

vitro fertilization. Reprod Dom Anim 33, 261-265.

Van Soom, A., Mateusen, B., Leroy, J., and de Kruif, A. (2003) Assessment of mammalian

embryo quality: what can we learn from embryo morphology?. Rep BioMed Online

7(6), 664-670.

Visintin, J.A., Martins, J.F., Bevilacqua, E.M., Mello, M.R., Nicácio, A.C., and

Assumpção, M.E. (2002) Cryopreservation of Bos taurus vs Bos indicus embryos:

are they really different? Theriogenology 57(1), 345-359.

230

Viuff, D., Hyttel, P., Avery, B., Vajta, G., Greve, T., Callesen, H., and Thomsen, P.D.

(1998) Ribosomal ribonucleic acid is transcribed at the 4-cell stage in in vitro-

produced bovine embryos. Biol Reprod 59(3), 626-631.

Viuff, D., Rickords, L., Offenberg, H., Hyttel, P., Avery, B., Greve, T., Olsaker, I.,

Williams, J.L., Callesen, H., and Thomsen, P.D. (1999) A high proportion of bovine

blastocysts produced in vitro are mixoploid. Biol Reprod 60(6), 1273-1378.

Viuff, D., Hendriksen, P.J., Vos, P.L., Dieleman, S.J., Bibby, B.M., Greve, T., Hyttel, P.,

and Thomsen, P.D. (2001) Chromosomal abnormalities and developmental kinetics

in in vivo-developed cattle embryos at days 2 to 5 after ovulation. Biol Reprod

65(1), 204-208.

Voelkel, S.A., and Hu, Y.X. (1992) Effect of gas atmosphere on the development of one-

cell bovine embryos in two culture systems. Theriogenology 37(5), 1117-1131.

Wagner, R.P. (1972) The role of maternal effects in animal breeding. II. Mitochondria and

animal inheritance. J Anim Sci 35, 1280-1287.

Wai, T., Ao, A., Zhang, X., Cyr, D., Dufort, D., and Shoubridge, E.A. (2010) The role of

mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biol Reprod 83, 52-62.

Wakil, S.J., Stoops, J.K., and Joshi, V.C. (1983) Fatty acid synthesis and its regulation.

Ann Rev Biochem 52, 537-79.

Wakil, S.J., and Abu-Elheiga, L.A. (2009) Fatty acid metabolism: target for metabolic

syndrome. J Lipid Res 50, S138-S143.

Wakefield, S.L., Lane, M., Schulz, S.J., Hebart, M.L., Thompson, J.G., and Mitchell, M.

(2008) Maternal supply of omega-3 polyunsaturated fatty acids alter mechanisms

involved in oocyte and early embryo development in the mouse. Am J Physiol

Endocrinol Metab 294, E425-E434.

Wallace, D. C. (2005) A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases,

aging, and cancer: A dawn for evolutionary medicine. Annu Rev Genet 39, 359-

407.

Wolins, N.E., Rubin, B., and Brasaemle, D.L. (2001) TIP47 associates with lipid droplets. J

Biol Chem 276(7), 5101-5108.

Wrenzycki, C., Herrmann, D., Carnwath, J.W., and Niemann, H. (1996) Expression of the

gap junction gene connexin43 (Cx43) in preimplantation bovine embryos derived in

vitro or in vivo. J Reprod Fertil 108, 17-24.

231

Wrenzycki, C., Herrmann, D., Carnwath, J.W., and Niemann, H. (1999) Alterations in the

relative abundance of gene transcripts in preimplantation bovine embryos cultured

in medium supplemented with either serum or PVA. Mol Reprod Dev 53, 8-18.

Wrenzycki, C., Herrmann, D., Keskintepe, L., Martins Jr., A., Sirisathien, S., Brackett, B.,

and Niemann, H. (2001) Effects of culture system and protein supplementation on

mRNA expression in pre-implantation bovine embryos. Hum Reprod 16(5), 893-

901.

Yeagle, P.L.(1989) Lipid regulation of cell membrane structure and function. J Fed Amer

Soc Exp Biol 3(7), 1833-1842.

Yuan, Y.Q., Van Soom, A., Coopman, F.O., Mintiens, K., Boerjan, M.L., Van Zeveren, A.,

de Kruif, A., and Peelman, L.J. (2003) Influence of oxygen tension on apoptosis and

hatching in bovine embryos cultured in vitro. Theriogenology 59(7), 1585-1596.

Zachut, M., Dekel, I., Lehrer, H., Arieli, A., Arav, A., Livshitz, L., Yakoby, S., and

Moallem, U. (2010) Effects of dietary fats differing in n-6:n-3 ratio fed to high-

yielding dairy cows on fatty acid composition of ovarian compartments, follicular

status, and oocyte quality. J Dairy Sci 93, 529-545.

Zeng, H.T., Yeung, W.S., Cheung, M.P., Ho, P.C., Lee, C.K., Zhuang, G.L., Liang, X.Y.,

and O, W.S. (2009) In vitro-matured rat oocytes have low mitochondrial

deoxyribonucleic acid and adenosine triphosphate contents and have abnormal

mitochondrial redistribution. Fertil Steril 91(3), 900-9007.

Zeron,Y., Sklan,D., and Arav, A. (2002) Effect of polyunsaturated fatty acid

supplementation on biophysical parameters and chilling sensitivity of ewe oocytes.

Mol Reprod Dev 61, 271-278.

Analyses génomiques et phénotypiques contrastant les ...

Documents

Transcript of Analyses génomiques et phénotypiques contrastant les ...