Analyse de Spectres Issus Du Couplage Gc Ou Lcms

Spectrométrie de Spectrométrie de massemasse

Atelier Atelier

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chromatographie-MS »chromatographie-MS »

1. Ions moléculaire et pseudo-1. Ions moléculaire et pseudo-moléculairemoléculaire

2. Massifs isotopiques2. Massifs isotopiques

3. Résolution3. Résolution

4. Fragmentations et règle de l’azote4. Fragmentations et règle de l’azote

5.5. Ions pseudo-moléculaires Ions pseudo-moléculaires multichargés multichargés et formation d’adduitset formation d’adduits

Analyse de SM issus du Analyse de SM issus du couplage chromatographie-MScouplage chromatographie-MS

analyse de spectres de masseanalyse de spectres de masse33

Ion moléculaireIon moléculaire = radical-cation* provenant de l’arranchement d’un = radical-cation* provenant de l’arranchement d’un

électron à la molécule neutre : Mélectron à la molécule neutre : M+ + (masse M, charge +1)(masse M, charge +1)

Ion moléculaire ou pseudo-moléculaireIon moléculaire ou pseudo-moléculaire

Source Source

d’ionisation :d’ionisation :Impact Impact

électronique (EI)électronique (EI)

Ion pseudo-moléculaireIon pseudo-moléculaire : :

En mode positif : ajout d’un proton sur M : (M+H)En mode positif : ajout d’un proton sur M : (M+H)+ + (masse : M+1, charge+1)(masse : M+1, charge+1)

En mode négatif : perte d’un proton : (M-H)En mode négatif : perte d’un proton : (M-H) -- (masse : M-1, charge -1) (masse : M-1, charge -1)

Ions pseudo-moléculaires multichargésIons pseudo-moléculaires multichargés (voir plus loin) (voir plus loin)

!! Le pic à rechercher diffère selon la source!! Le pic à rechercher diffère selon la source d’ionisationd’ionisation

La plupart desLa plupart dessources sources

(CI, APCI, ..)(CI, APCI, ..)

ElectrosprayElectrospray (ESI)(ESI)

* La notation M* La notation M+ + signifie qu’il s’agit de la molécule entière (après perte d’un électron), qu’elle est signifie qu’il s’agit de la molécule entière (après perte d’un électron), qu’elle est

chargée positivement (+), et qu’elle comporte un électron non apparié (chargée positivement (+), et qu’elle comporte un électron non apparié ())


Ion pseudo-moléculaire :Ion pseudo-moléculaire :

Exemple : analyse HPLC/APCI d’un mélange de 5 benzodiazépinesExemple : analyse HPLC/APCI d’un mélange de 5 benzodiazépines

(Solvant = CH(Solvant = CH33CN-HCN-H22O)O)

287

300

271

309

285

1. Ions moléculaire et pseudo-moléculaire1. Ions moléculaire et pseudo-moléculaire

2. Massifs isotopiques 2. Massifs isotopiques



5.5. Ions pseudo-moléculaires multichargés Ions pseudo-moléculaires multichargés et et formation d’adduitsformation d’adduits



1. Massifs isotopiques1. Massifs isotopiques

Isotopes : Isotopes : atomes d’un même élément qui contiennent un nombre identique de protons atomes d’un même élément qui contiennent un nombre identique de protons

mais un nombre différent de neutronsmais un nombre différent de neutrons

Abondance isotopique = pourcentage des isotopes d’un élément dans la natureAbondance isotopique = pourcentage des isotopes d’un élément dans la nature

Masse moyenne pondérée (MM) = Masse atomique apparaissant sur le tableau périodique Masse moyenne pondérée (MM) = Masse atomique apparaissant sur le tableau périodique

et qui tient compte des isotopes et de leur abondanceet qui tient compte des isotopes et de leur abondance

Exemple : nbre de nbre deprotons : nucléons :

nbre nbre de nbre masse abondance abondanceatomique masse neutrons isotopique en % (1) relative(2)

Chlore-35 17 35 35-17 = 18 34,97 75,8% 100Chlore-37 17 37 37-17 = 20 36,97 24,2% 32,5

Masse moyenne pondérée du chlore = (0,758 * 34,97 uma) + (0,242 * 36,97 uma) = 35,454 uma

(1) = nombre moyen d’isotope cité pour 100 atomes de l’élément(2) = nombre moyen d’isotope cité pour 100 isotopes majoritaires


Principaux isotopes en chimie organiquePrincipaux isotopes en chimie organique

N.B. Pour une liste complète des isotopes de tous les éléments : voir fichier « excel » sur www.ipl.be

ElémentElément isotopisotopee

%% Masse Masse isotopiqisotopiq

ueue

isotopisotopee

%% Masse Masse isotopiqueisotopique

isotopisotopee

%% Masse Masse isotopiquisotopiqu

ee

Masse Masse moyennemoyenne

CC 1212CC 100100 12.000012.0000 1313CC 1.11.1 13.003313.0033 12.01112.011

HH 11HH 100100 1.00781.0078 22HH0.010.01

552.01402.0140 1.00791.0079

NN 1414NN 100100 14.003114.0031 1515NN 0.370.37 15.000115.0001 14.006714.0067

OO 1616OO 100100 15.994915.9949 1717OO 0.040.04 16.999116.9991 1818OO 0.200.20 17.999217.9992 15.999415.9994

SS 3232SS 100100 31.972131.9721 3333SS0.780.78

9932.971532.9715 3434SS 4.444.44 33.967933.9679 32.06632.066

FF

ClCl

1919FF

3535ClCl

100100

100100

18.998418.9984

34.968834.9688 3737ClCl31.931.9

8836.965936.9659 35.45335.453

BrBr 7979BrBr 100100 78.918378.9183 8181BrBr 97.297.288

80.916380.9163 79.90479.904


Calcul de masses exactesCalcul de masses exactes

Masse moyenne :

(20 * 12.011)

+ (42 * 1.0079)

= 282,55

282

nbre masse masse A isotopique moyenne

Hydrogène-1 1 1.0078 1.0079Hydrogène-2 2 2.0140

Carbone-12 12 12.0000 12.011Carbone-13 13 13.0034

Soit la molécule

d’eicosane C20H42 :

Masse exacte M : (12C20

1H42)

(20 * 12.000)

+ (42 * 1.0078)

= 282,33

Masse exacte M+1

avec un 13C :

(19 * 12.000)

+ (1 * 13.0034)

+ (42 * 1.0078)

= 283,33

Masse exacte M+1

avec un 2H :

(20 * 12.000)

+ (41 * 1.0078)

+ (1 * 2.0140)

= 283,33

N.B. Pour le calcul de masse moyenne et exacte : voir fichier « excel » sur www.ipl.be

La différence entre masse exacte M et masse moyenne MM augmente avec la taille de la molécule : entre MM et M = 1 Da / 1500 Da


Calcul de l’abondance relative des satellites Calcul de l’abondance relative des satellites isotopiques M+1, M+2 pour des petites isotopiques M+1, M+2 pour des petites

moléculesmolécules

Typed’élément Caractéristiques Exemple Abondance relative du 2ème isotope*

1! Isotope ou F - Q plusieurs isotopes I -

dont un est majoritaire P -(A > 99,9%) H 0,015

Q+1 Isotope M+1 C 1,08

non négligeable N 0,37

O 0,2 Q+2 Isotope M+2 S 4,43

non négligeable Cl 31,98Br 97,28

* Abondance

de l’isotope

majoritaire

= 100

M+1 (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N )M

M+2 (31,98 . Nombre de Cl) + ( 4,43 . Nombre de S ) + ……M

Satellite M+1 :

Satellite M+2 :

100

100


Exemple 1 : soit l’eicosane C20H42

Estimation du rapport M+1 / M : 20 x 1,08 % = 21,6 / 100

M282,3

M+1283,3

Abondance des satellites isotopiquesAbondance des satellites isotopiques

Exemple 2 : soit un pic de masse 282 dont M+1 / M = 11%.

Ce pic ne peut correspondre qu’à une molécule de maximum 10 C

(ou moins de 10 C et d’autres éléments Q+1 tels que N)


Massifs isotopiques complexesMassifs isotopiques complexes

Si la molécule contient plusieurs atomes d’un même élément dont le 2ème isotope a

une abondance non négligeable (ex : plusieurs Cl ou plusieurs Br)

Ou si la molécule a une masse élevée (> 500 Da) :

La probabilité d’avoir 2 ou >2 isotopes minoritaires dans une même molécule devient

non négligeable. Cette probabilité augmente avec la masse de la molécule.

Présence de satellites isotopiques M+3, M+4, …..

Le massif isotopique se complexifie*

Exemple 1 : Allure du massif isotopique de molécules contenant 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl

* Le détail des calculs de ces massifs complexes dépasse le cadre de cet exposé.


Exemple 2Exemple 2 : Allure du massif isotopique de molécules contenant un nombre croissant : Allure du massif isotopique de molécules contenant un nombre croissant d’atomes de carbone.d’atomes de carbone.

Si le nombre de C augmente, la probabilité de trouver plusieurs Si le nombre de C augmente, la probabilité de trouver plusieurs 1313C dans une même C dans une même molécule augmente molécule augmente le nombre de satellites isotopiques augmente le nombre de satellites isotopiques augmente

Molécule à 50 C : à côté du M+1, apparition de satellites M+2, M+3,… non négligeables

Rapport M / M+1 pour

C 50 H 102

( MM = 703,3 )

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

702 703 704 705 706 707

m/z

ab

on

dan

ce

Rapport

M / M+1 pour C 100 H 202

( MM = 1404,7 )

01402 1405 1408 1411

m/z

ab

on

dan

ce

Rapport M / M+1 pour C 500 H 1002

( MM = 7015,4 )

07008 7015 7022 7029

m/z

ab

on

dan

ce

Rapport M / M+1 pour C 1000 H 2002

( MM = 14 028,8 )

014017 14028 14039

m/z

ab

on

dan

ce

Molécule à 1000C : la valeur de masse moyenne (MM) s’éloigne de celle de M – Distribution gaussienne des satellites - Le plus abondant a une masse proche de la masse moyenne


Table de massifs isotopiquesTable de massifs isotopiques

Chaque formule brute est associée à un massif isotopique qui lui est

propre et dont l’allure (masse et abondance des satellites) peut être

calculée à priori.

Programmes de calcul à partir d’une formule brute : Excel (voir fichier sur Programmes de calcul à partir d’une formule brute : Excel (voir fichier sur

www.ipl.be), Xcalibur, www.ipl.be), Xcalibur, http://www.webelements.com/http://www.webelements.com/ , , http://www.chemcalc.org/http://www.chemcalc.org/, …, …


En Conclusion :En Conclusion :

Chaque formule brute est associée à un massif isotopique qui lui est propre

Pour des molécules de masse < 500 Da :

L’abondance des pics « M+1 » renseigne sur le nombre d’éléments Q+1 :

M+1/M (1,08 . Nombre de C) + ( 0,37 . Nombre de N ) /100

L’abondance des pics « M+2 » et suivants renseigne sur la présence d’éléments

Q+2 (S, Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes :

M+2/M (31,98 . Nombre de Cl) + ( 4,43 . Nombre de S ) + …… /100

Un pic « M+1 » anormalement faible peut être le signe de la présence d’éléments

monoisotopiques (éléments Q) : P, I, F

Pour des molécules de masse > 500 Da

Le nombre de satellites isotopiques augmente le massif isotopique se complexifie !

Le pic le plus abondant d’un massif isotopique a une masse qui se rapproche de la

masse moyenne. Selon la résolution, le massif isotopique peut apparaître sous

forme d’une bande dont le maximum est la masse moyenne.


Formules brutes* contenant Formules brutes* contenant 1212C, C, 11H, H, 1414N et N et 1616OO entre 180.000 et 180.200 :entre 180.000 et 180.200 :

! Le nombre de formules brutes dont la masse est

comprise entre deux valeurs données augmente avec la

masse de l’entité

Formules brutes* Formules brutes*

contenant contenant 1212C, C, 11H, H, 1414N et N et 1616O O

entre 28.000 et 28.200 :entre 28.000 et 28.200 :

CO : 28.000

N2 : 28.006

CH2N : 28.019*

C2H4 : 28.031

La capacité d’un spectromètre à distinguer une masse x d’une masse y dépend

de la résolution …

* Certaines de ces formules brutes ne correspondent à aucune molécule : ex : C15 ou CH2N


RésolutionRésolution = m / = m / mm

Deux pics sont séparés si la profondeur de la vallée qui

les sépare ne dépasse pas une fraction donnée de la

hauteur du pic le moins intense (généralement 10% pour

la haute résolution et 50% pour la basse résolution)

Autre définition (pour un pic isolé) = résolution FWHM :

m = largeur à mi-hauteur. Définition plus flatteuse :

résolution FWHM / résolution à 10% = 2,2

Si la résolution est suffisante, on peut alors associer une masse donnée à une seule

formule brute

Remarque : Un autre paramètre important de l’analyseur est l’exactitude en masse càd la

précision, ou plus exactement la justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de la stabilité

et du pouvoir de résolution de l’analyseur.

m = différence de masse correspondant à deux pics adjacents tout juste séparés

m = masse du premier pic (ou moyenne des masses des deux pics)

Dès lors, un spectromètre dont la résolution est de 2000 peut séparer des pics

situés à des valeurs m/z de 2000 et 2001 (ou de 200 et 200,1 ou de 20,00 et 20,01)


Basse Résolution et Haute RésolutionBasse Résolution et Haute Résolution

Formule Brute : Masse exacte M12C

1H4 16,031313C

1H4 17,0346

12C2571H383

14N6516O77

32S6* 5 803,6377

13C12C2561H383

14N6516O77 32S6

* 5 804,6401

14N2 28,0061512C2 1H4 28,0312

12C9 14N4

16O 180,007312C11

1H2 14N 16O2 180,0085

12C2571H383

14N6516O77

32S6* 5 803,6377

12C2591H385

14N6216O78 32S6 5 803,6390

m R = m/m

1,0033 16

1,0033 6 000

0,025 1 100

0,0013 140 000

0,0013 4 500 000

* Insuline

Les spectromètres commerciaux actuels peuvent avoir une résolution allant jusque 500 000

HR = haute résolution : R de l’ordre de 104 -105 - BR = Basse résolution : R de l’ordre de 103

SpectromètreHR ou BR ?

BR

HR

BR

HR

Impossibleà séparer

Entités ≠ mais de masses

très proches

Entitésidentiques dont l’une

contient un 13C


Résolution : exemple :Résolution : exemple :

Spectre de masse de l’insuline :

Masse moyenne : 5807,2222 ; Masse exacte du satellite le plus léger : 5803,6377

Résolution : 6000 500


En Conclusion :En Conclusion :

La résolution détermine la capacité d’un spectromètre de masse à différencier

deux masses : R = m / m

Pour des molécules de masse < 1000 Da :

Les spectromètres à haute résolution permettent d’associer une masse donnée à

une formule brute

Pour des molécules de masse > 1000 Da

Ce n’est plus le cas. A haute résolution et selon la taille de la molécule, on peut

parfois distinguer les satellites isotopiques (m = 1)

Remarque : Les journaux de l’ « American Chemical Society » accepte la masse à

haute résolution (R > 200000) comme étant une preuve d’existence du produit

NB : N’oubliez pas que l’analyse des massifs isotopiques est une aide précieuse dans l’attribution d’une formule brute


FragmentationFragmentation

La fragmentation dans la source du pic moléculaire (ou pseudo-moléculaire)

génère des pics de masse inférieure à M (ou MH+)

Source : APCI, Détecteur : ion-trap

L’abondance, le nombre, la distribution des fragments obtenus dans des

conditions d’analyse données sont caractéristiques de la molécule analysée.

MH+ molécule neutre + cation

m/z = 300.1

Invisible dans le spectre m/z =

227.1

Déduction

M = 73


Analyse des fragmentsAnalyse des fragments

1./1./ Il existe des “règles de fragmentation” qui permettent d’identifier une substance inconnue à partir de l’étude de sa Il existe des “règles de fragmentation” qui permettent d’identifier une substance inconnue à partir de l’étude de sa fragmentation. fragmentation.

Si on travaille en EI (Impact Electronique), ces règles reposent sur les principes suivants :Si on travaille en EI (Impact Electronique), ces règles reposent sur les principes suivants :

- Toutes les liaisons n’ont pas la même prédisposition à se couper;Toutes les liaisons n’ont pas la même prédisposition à se couper;

- Deux facteurs principaux favorisent le processus de fragmentation :Deux facteurs principaux favorisent le processus de fragmentation :

- Les liaisons les plus faibles se coupent plus facilement;Les liaisons les plus faibles se coupent plus facilement;

- Les fragments stables ont plus tendance à se formerLes fragments stables ont plus tendance à se former

En ionisation chimique, les ions pseudo-moléculaires MHEn ionisation chimique, les ions pseudo-moléculaires MH+ + donnent seulement quelques ions fragments et ces ions sont donnent seulement quelques ions fragments et ces ions sont différents de ceux obtenus sous impact électronique. différents de ceux obtenus sous impact électronique.

2./ Il existe des tables 2./ Il existe des tables

- de compositions possibles d’ions fragments fréquemment observés dans les spectresde compositions possibles d’ions fragments fréquemment observés dans les spectres

- de compositions possibles de molécules neutres formées lors de la fragmentationde compositions possibles de molécules neutres formées lors de la fragmentation


Règle de l’azoteRègle de l’azote

Une molécule de masse impaire Nombre impair d’atomes d’azote

Règle valable pour tous les composés contenant du carbone, de l’hydrogène, de l’oxygène, de l’azote, du soufre, des halogènes, du phosphore, du bore, du silicium, de l’arsenic et des alcalino-terreux.

Une molécule de masse paire Nombre pair d’atomes d’azote(ou aucun atome d’azote)

Rem : L’ion pseudomoléculaire (M+H)+ correspondant à une molécule de masse

impaire protonée sera de masse paire et inversément.


Ion moléculaireIon moléculaire = radical-cation* provenant de l’arranchement d’un = radical-cation* provenant de l’arranchement d’un

électron à la molécule neutre : Mélectron à la molécule neutre : M+ + (masse M, charge +1)(masse M, charge +1)

Ion moléculaire ou pseudo-moléculaireIon moléculaire ou pseudo-moléculaire

Source Source

d’ionisation :d’ionisation :Impact Impact

électronique (EI)électronique (EI)

Ion pseudo-moléculaireIon pseudo-moléculaire : :

En mode positif : ajout d’un proton sur M : (M+H)En mode positif : ajout d’un proton sur M : (M+H)+ + (masse : M+1, charge+1)(masse : M+1, charge+1)

En mode négatif : perte d’un proton : (M-H)En mode négatif : perte d’un proton : (M-H) -- (masse : M-1, charge -1) (masse : M-1, charge -1)

Ions pseudo-moléculaires multichargésIons pseudo-moléculaires multichargés : :

En mode positif : ajout de z protons sur M : (M+zH) En mode positif : ajout de z protons sur M : (M+zH) z+z+ (masse : M+z, charge +z) (masse : M+z, charge +z)

En mode négatif : perte de z protons sur M : (M-zH) En mode négatif : perte de z protons sur M : (M-zH) z-z- (masse : M-z, charge –z) (masse : M-z, charge –z)

! Plusieurs pics pseudo-moléculaires ! Plusieurs pics pseudo-moléculaires déconvolution déconvolution

La plupart desLa plupart dessources sources

(CI, APCI, ..)(CI, APCI, ..)

ElectrosprayElectrospray (ESI)(ESI)


Exemple : spectre ESI du lysozyme Exemple : spectre ESI du lysozyme

M + 17H+ = (M + 17)17+ 1049.8 = ( 17 825 + 17 ) / 17


ESI : Déconvolution d’iESI : Déconvolution d’ions pseudo-moléculaires ons pseudo-moléculaires

multichargésmultichargés : (M+nH)(M+nH)n+n+ ou (M-nH)ou (M-nH)n-n-

0 2000 m/z Da

m/z = 901 M = 18.000 Da

(M + 20 H)20+

n = 20

m/z = (M + 20) / 20

ACQUIRED spectrum DECONVOLUTED spectrum

2

22 n

nMm

1

11 n

nMm

2n

1n21

12

mm

nn

m/z

[1]

[2]

21

12

1

mm

mn

11 .)1( nmM

[1]+[2]

et

n2 = n1+ 1 [3] + [3]


Déconvolution du spectre ESI+ d’un Déconvolution du spectre ESI+ d’un mélange de 2 protéines : cytochrome C + mélange de 2 protéines : cytochrome C +

glucagonglucagon

Remarque : la charge courante des protéines est au environ de « 1 proton » / 1000 Da

Glucagon : hormone secrétée par le pancréas qui exerce un rôle dans le métabolisme des sucres, peptide de 29AA – MM 3483Cytochrome C : protéine hèmique qui joue un rôle dans la chaîne respiratoire cellulaire


Dimère, Trimère : 2M + HDimère, Trimère : 2M + H++, …, …

Molécule - Solvant : M + S + HMolécule - Solvant : M + S + H++

Molécule - Ion : Molécule - Ion :

En mode positif : M + NaEn mode positif : M + Na++, M + K, M + K+ + , M + NH, M + NH44+ + , …, …

En mode négatif : M + ClEn mode négatif : M + Cl--, M + CH, M + CH33COCO22- - , …., ….

En ESI+ : (M + nH + mNa) En ESI+ : (M + nH + mNa) (m+n)+(m+n)+ , … , …

En ESI- : (M – nH + mNa) En ESI- : (M – nH + mNa) (n-m)-(n-m)- (avec n > m),(avec n > m), …. ….

Molécule – Ion – Solvant : M + S + NaMolécule – Ion – Solvant : M + S + Na++

Sources ESI, APCI, ... : Formations d’adduitsSources ESI, APCI, ... : Formations d’adduits


Exemple 1 : Spectre ESI+ de la dicentrine : M = 339Exemple 1 : Spectre ESI+ de la dicentrine : M = 339

d63-3 #5-27 RT:0.06-0.40 AV: 23 NL:2.74E9F:+ c Full ms [ 50.00-1000.00]

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bu

nda

nce

702.2

341.5

703.2309.4 342.5

678.3 717.0 765.8279.5 362.3 618.1 978.6420.3 893.6832.2 935.5606.0533.1251.5 481.8178.2127.766.3

340

362

[M + H]+

[M + Na ]+

679[2M + H ]+

701

717 [2M + K]+

[2M + Na ]+

N

OCH3

CH3O

CH3O

O


Eau-Aceto-2 #8-10 RT: 0.12-0.16 AV: 3 NL: 1.20E8T: + c Q1MS [ 50.00-300.00]

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

220.97

179.98

202.98162.00

83.13242.96 278.97

143.96 189.9472.15 233.8084.13 126.01 171.04 267.00212.92 286.9298.15 117.03 258.93 295.9660.20

Exemple 2 : Spectre ESI+ de la D-glucosamine :Exemple 2 : Spectre ESI+ de la D-glucosamine : M = 179M = 179

O

CH2OH

H

NH2

HOH

H

HO

H OH

H

180 [M + H]+

221 [M + CH3CN + H]+

243

Solvant : H2O + CH3CN (Masse CH3CN = 41)

-H2O-H2O

[M + CH3CN + Na]+


Exemple 3 : Analyse HPLC-APCI (mode négatif) Exemple 3 : Analyse HPLC-APCI (mode négatif)

d’un mélange de glucoconjugués d’un mélange de glucoconjugués

Pas de pic de l’ion

pseudo-moléculaire (M-H)-.

La masse moléculaire M = 387

est déduite des adduits

35


Récapitulatif sur Récapitulatif sur l’identification l’identification d’un composé à partir d’un SMd’un composé à partir d’un SM

Formuledéveloppée**

Formulebrute*

MM

Identification dupic moléculaire(ou apparenté)

Identification dupic moléculaire (ou apparenté)

à haute résolution

Analyse des satellites

isotopiques

Analyse des fragments

* Formule brute : Nombre et nature des atomes de la molécule

** Formule développée = structure :

Façon dont les atomes sont agencés

Analyse de Spectres Issus Du Couplage Gc Ou Lcms

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