Analyse de polluants organiques et organométalliques dans...

Analyse de polluants organiqueset organométalliquesdans l’environnement

Rapport final

BRGM/RP-53749-FRfévrier 2005

Analyse de polluants organiqueset organométalliquesdans l’environnement

Rapport final

BRGM/RP-53749-FRfévrier 2005

Étude réalisée dans le cadre de laconvention Région Centre et BRGM

T. Dagnacavec la collaboration de

S. Bristeau, C. Coton, C. Leroy, N. Fleury & R. Jeannot

Vérificateur :

Original signé par : R. JEANNOT

Approbateur :

Original signé par : A.M. FOUILLAC

Le système de management de la qualité du BRGM est certifié AFAQ ISO 9001:2000.

Mots clés : Polluants organiques et organométalliques, Analyse, Région Centre.

En bibliographie, ce rapport sera cité de la façon suivante :

Dagnac T. avec la collaboration de Bristeau S., Coton C., Leroy C., Fleury N. & Jeannot R.(2005) – Analyse de polluants organiques et organométalliques dans l’environnement. Étuderéalisée dans le cadre de la convention Région Centre et BRGM. BRGM/RP-53749-FR, 53 p.,13 ill., 3 ann.

© BRGM, 2005, ce document ne peut être reproduit en totalité ou en partie sans l’autorisation expresse du BRGM.

Analyse de polluants organiques et organométalliques

BRGM/RP-53749-FR – Rapport final 3

Synthèse

evant la nécessité de fournir aux pouvoirs publics les éléments d’information,d’interprétation et de prédiction dans le domaine de l’environnement, associés à

l’évaluation de la qualité des milieux et de leur impact sur la santé humaine, le BRGM,avec le soutien financier de la région Centre, a décidé en 2001 et pour une durée detrois ans de créer un projet de R et D nommé « métrologie de l’environnement ». Lesoutien financier de la région Centre a permis la réalisation de ce travail sur lesannées 2002 à 2004. Ce projet est appliqué à l’analyse de pesticides et de leursprincipaux métabolites dans les eaux et les sols, ainsi qu’à la recherche etl’identification de polluants émergeants dans des effluents de station d’épuration enrégion Centre.

La première partie traite des analyses d’herbicides (triazines, phénylurées,chloroacétanilides) et de leurs produits de dégradation, dans des sols et des eauxsuperficielles. Ce développement visait à améliorer les performances analytiques grâceà l’utilisation de nouveaux instruments analytiques (chromatographie liquide etgazeuse couplée à la spectrométrie de masse en mode tandem). Les performancesont été nettement améliorées avec l’abaissement des limites de quantification dans leseaux à des seuils de 1 à 10 ng/l pour les triazines et les chloroacétanilides et de 5 à30 ng/l pour les phénylurées, et dans les sols à des seuils de 1 à 3 µg/kg pour lestriazines et les chloroacétanilides et 10 µg/kg pour les phénylurées.

Ces résultats devraient permettre de mener des études sur les transferts dephénylurées dans les sols et dans la zone non saturée (sol profond entre 2 et 14 m), àl’image de celles réalisées sur les triazines et chloroacétanilides.

La deuxième partie traite de la méthodologie de recherche et d’identification depolluants émergents : hormones et composés pharmaceutiques, dans des stationsd’épuration en région Centre.

Les hormones stéroïdiennes ou synthétiques, les alkyls phénols ainsi que le bisphénolsont des substances suspectées d’effets perturbateurs endocriniens. Les techniquesde chromatographie gazeuse et liquide couplées à la spectrométrie de masse en modetandem ont permis de quantifier quinze de ces composés à des concentrations del’ordre de quelques ng/l. Ces techniques appliquées à des échantillons naturels de typerejets urbains ont montré la présence de quelques composés dans l’effluent. La toxicitéd’un des composés (bisphénol) a été évaluée sur deux espèces zooplantoniques. Lesconcentrations détectées dans l’environnement ne semblent pas présenter de risquepour ces espèces ; cependant, on ne peut négliger la nécessité d’évaluer les risques àlong terme d’une exposition prolongée, ainsi que la toxicité combinée de plusieurssubstances.

La présence des produits pharmaceutiques et de leurs produits de dégradation estsuspectée dans l’environnement, au niveau d’effluents de stations d’épuration, d’eaux

D


4 BRGM/RP-53749-FR – Rapport final

superficielles, de sédiments, et même d’eaux souterraines. C’est pourquoi, uneméthode d’analyse a été mise au point pour l’identification de dix-sept composéspharmaceutiques, dont cinq antalgiques, sept médicaments psychotropes, deuxhypolipidémiants, deux bêtabloquants et un antiépileptique. Les limites dequantification atteintes sont de l’ordre de la dizaine de ng/l. Il a ainsi été possibled’analyser les rejets de cinq stations d’épuration de la région Centre. Dix molécules yont été détectées, dont deux anti-inflammatoires (kétoprofène et naproxène) et deuxpsychotropes (fluoxétine et zolpidem) à des concentrations de l’ordre du µg/l. Mêmesur une vie complète d’exposition à une eau contaminée, la dose thérapeutiquejournalière n’est pas atteinte. Néanmoins, on ne peut négliger la nécessité d’évaluerles risques à long terme d’une exposition prolongée à des traces de produitspharmaceutiques et de produits de dégradation, notamment pour certaines populationsà risques comme les enfants, les fœtus et les personnes souffrant de déficiencesenzymatiques.

Plusieurs techniques d’analyse et d’extraction ont été nécessaires pour développer cesméthodes d’analyse fiables, sensibles et robustes. Il est important d’insister sur lacomplexité et les difficultés techniques de l’analyse globale de ces différentes famillesde polluants pour la mise en routine.



Sommaire

1. Introduction ...............................................................................................................9

2. Développement de méthodes analytiques pour la détermination depesticides et de leurs principaux métabolites dans les eaux et les sols ........11

3. Développement de méthodologies de recherche et d’identification depolluants émergents dans des effluents de stations d’épuration en régionCentre ......................................................................................................................13

3.1. SUBSTANCES ENDOCRINIENNE ...................................................................133.1.1.Molécules analysées ................................................................................133.1.2.Sources de contamination de l’environnement.........................................143.1.3.Comportements dans les stations de traitements et le milieu

aquatique..................................................................................................15

3.2. RÉSULTATS......................................................................................................15

3.3. SUBSTANCES PHARMACEUTIQUES .............................................................203.3.1.Les substances pharmaceutiques dans l’environnement.........................203.3.2.État des lieux en France...........................................................................273.3.3.Molécules choisies dans le cadre de notre étude.....................................293.3.4.Résultats...................................................................................................30

4. Conclusion ..............................................................................................................37

Bibliographie ...............................................................................................................39



Liste des illustrations

Illustration 1 - Limites de quantification (µg/kg) pour l’analyse d’herbicides par GC - MS/MSet LC - MS/MS dans les sols.............................................................................. 12

Illustration 2 - Limites de quantification (ng/l) pour l’analyse d’herbicides par GC - MS/MSet LC - MS/MS dans les eaux. ........................................................................... 12

Illustration 3 - Rendements de récupération après dopage à deux niveaux deconcentration pour 16 composés classés comme perturbateursendocriniens....................................................................................................... 16

Illustration 4 - Limites de quantification pour l’analyse de substances endocriniennes parGC - MS/MS et LC - MS/MS. ............................................................................. 17

Illustration 5 - Paramètres physico-chimiques des effluents analysés..................................... 18

Illustration 6 - Composés détectés dans les effluents de STEP : phases dissoute+ particulaire. ..................................................................................................... 19

Illustration 7 - Composés détectés dans les effluents de STEP : répartition dissous/particulaire.......................................................................................................... 19

Illustration 8 - Données sur le rendement d’élimination de certains composés dansdiverses stations d’épuration ............................................................................. 22

Illustration 9 - Données environnementales sur la teneur maximale de plusieursmédicaments dans différentes matrices. ........................................................... 24

Illustration 10 - Données sur les quantités de médicaments vendues sur prescription etretrouvées en France......................................................................................... 28

Illustration 11 - Limites de quantification des substances pharmaceutiques choisiesen GC - MS/MS et LC - MS/MS. ........................................................................ 31

Illustration 12 - Rendements d’extraction de substances pharmaceutiques - Protocole debase et protocole modifié (suppression du lavage basique et élutionà 100 % de méthanol)........................................................................................ 33

Illustration 13 - Concentrations en substances pharmaceutiques détectées dans la phasedissoute de cinq échantillons de rejets de stations d’épurationde la région Centre. ........................................................................................... 34

Liste des annexes

Annexe 1 - Analyse de Bisphénol A par GC - MS/MS sur un échantillon d’effluents urbains..... 43

Annexe 2 - Voies possibles d’entrée des produits pharmaceutiques dans l’environnement ...... 47

Annexe 3 - Recherche de l’oxazépam dans l’effluent D en LC - MS/MS.................................... 51



Liste des abréviations

DEA : Déséthylatrazine

DIA : Désisopropylatrazine

DIPU : Didesméthyl isoproturon

MIPU : Monodesméthylisoproturon

µg : microgramme

ng : nanogramme

SPE : Extraction solide/liquide

LC-MS : Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse

LC-MS/MS : Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en modetandem masse/masse

GC-MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse

GC-MS/MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masseen mode tandem masse/masse

LC-APCI/MS : Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse avec sourced'ions par ionisation chimique à pression atmosphèrique

LC-ESI/MS : Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse avec sourced'ions électrospray

LC-APCI/MS/MS : Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en modetandem masse/masse avec source d'ions par ionisation chimique à pressionatmosphèrique

LC-ESI/MS/MS : Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en modetandem masse/masse avec source d'ions électrospray

LVI -GC-MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masseavec dispositif d'injection de grands volumes

LOQs : Limites de quantification



1. Introduction

Les méthodologies analytiques doivent permettre l’acquisition de données fiables,adaptées à l’évaluation des expositions aux substances chimiques sélectionnées, à laprédiction, à la modélisation et à l’interprétation des transferts de ces polluants dansles milieux naturels (notamment les eaux souterraines). Elles doivent également êtrecontributives dans des équipes pluridisciplinaires, notamment en appui à l’écotoxi-cologie, l’hydrogéologie et la géochimie dans le cadre de projets de recherchecommuns.

Ce projet vise à développer et améliorer des techniques et méthodologies analytiquescouvrant non seulement la recherche et l’identification de phytosanitaires et desubstances polluantes prioritaires et émergentes dans le milieu naturel (substances àeffets perturbateurs endocriniens et résidus de médicaments notamment), maiségalement les produits de dégradation qui résultent de leurs transformations par voiephysico-chimique ou métabolique. Les techniques de concentration sur phases solides(SPE) et les couplages chromatographiques avec la spectrométrie de masse en modetandem seront tout particulièrement exploités dans le cadre de ces travaux derecherche.

Ces développements analytiques ont été orientés sur les thèmes suivants :

- améliorations des performances de l’analyse de pesticides ;

- méthodologie de recherche et d’identification des substances émergentes dans deseffluents de stations d’épuration représentatifs en région Centre.



2. Développement de méthodes analytiquespour la détermination de pesticides

et de leurs principaux métabolitesdans les eaux et les sols

Ce module traite des analyses d’herbicides communément recherchés dans les sols etdans les eaux superficielles et souterraines (triazines, urées, chloroacétanilides,hydrosolubles, etc.) et de certains de leurs principaux composés de dégradation.

Rappelons que l’extraction sous fluide pressurisé fut optimisée pour l’extractionsimultanée de l’acétochlore, de triazines et d’urées dans des sols (0-5 cm) et solideséchantillonnés en dessous de la zone racinaire (jusqu’à 1 m). L’acétochlore a étéquantifié à 15 µg/kg à la profondeur maximale, proche de la concentration relevéeentre 10 et 20 cm et prouvant par la même que cette molécule fut rapidementtransférée. Ce comportement n’avait pas été observé lors de précédentes études carles auteurs obtenaient des limites de quantification plus élevées (environ 40 µg/kg).Par ailleurs, nos précédents travaux avaient montré que l’acétochlore était rapidementdégradé en acide oxanilique et sulfonique, métabolites détectés jusqu’à 50 cm deprofondeur à quelques µg/kg. Ce monitoring avait aussi indiqué que l’atrazine et l’un deses principaux métabolites, la DEA, pouvaient être quantifiés entre 2 et 5 µg/kg jusqu’à30 cm, alors même que l’atrazine n’avait pas été récemment appliquée sur cesparcelles.

Pour les eaux, les premiers essais sur l’instrument LC - MS/MS avaient été menés sursix herbicides communément recherchés, en particulier pour les agences de l’Eau etreprésentatifs des familles urées et triazines (rapport précédent). Cette étude a étépoursuivie dans le but d’établir les performances analytiques pour un bien plus grandnombre de substances phytosanitaires en LC - MS/MS.

Les illustrations 1 et 2 regroupent respectivement les limites de quantification obtenuesen GC - MS/MS, LC - MS et LC - MS/MS, pour un échantillon de sol et pour unéchantillon d’eau après concentration d’un facteur 1 000, soit par extraction liquide, soitsur phase solide polymérique.

Pour les triazines et les chloroacétanilides, les performances sont meilleures en GC - MS/MS qu’en LC - APCI/MS, avec des LOQs dans les sols comprises entre 1 et 3 µg/kg.La LOQ de l’acétochlore est largement améliorée par la GC - MS/MS ou la LC - MS/MS,car il était très peu détecté en LC - APCI/MS (simple quadrupôle). Les LOQs sontd’environ 10 µg/kg pour les phénylurées en LC - MS, sauf pour le didesmethyl-isoproturon(LOQ proche de 20 µg/kg). Pour les phénylurées, ces LOQs sont nettement améliorées enutilisant le tandem LC - MS/MS. Ces performances devraient permettre de mener desétudes sur les transferts de phénylurées dans les sols et la zone non saturée, à l’image decelles réalisées sur les triazines et chloroacétanilides.



Herbicide GCMS/MS LC-APCI/MS LC-ESI/MS/MS LC-APCI/MS/MS

Atrazine 1,9 5,4 0,15 0,3

DIA 1,6 22 4,5 11

DEA 2,5 13 0,7 1,2

Metolachlor 0,3 6,3 0,3 0,3

Acetochlor 0,9 22 0,7 1,5

Alachlor 2,2 1,5 1,5

DIPU 22 6 1,5

MIPU 11 0,7 0,7

Isoproturon 4,8 0,7 3

Chlortoluron 10 7,5 3

Linuron 7,5 0,7

Diuron 4,5 4,5

Illustration 1 - Limites de quantification (µg/kg) pour l’analyse d’herbicidespar GC - MS/MS et LC - MS/MS dans les sols.

Herbicide GC-MS/MS LC-APCI/MS LC-ESI/MS/MS LC-APCI/MS/MS

Atrazine 14,2 40,5 1,1 2,2

DIA 12 165 33,7 8,2

DEA 18,7 97,5 5,2 9

Metolachlor 2,2 47,2 2,2 2,2

Acetochlor 6,7 165 5,2 11,2

Alachlor 16,5 11,2 11,2

DIPU 165 45 11,2

MIPU 82,5 5,2 5,2

Isoproturon 36 5,2 22,5

Chlortoluron 75 56,2 22,5

Linuron 56,2 5,2Diuron 33,7 33,7

Illustration 2 - Limites de quantification (ng/l) pour l’analyse d’herbicidespar GC - MS/MS et LC - MS/MS dans les eaux.



3. Développement de méthodologiesde recherche et d’identification de polluants

émergents dans des effluents de stationsd’épuration en région Centre

3.1. SUBSTANCES ENDOCRINIENNE

Durant ces trente dernières années, il a été constaté qu’une variété de composéschimiques, incluant les hormones naturelles et synthétiques, les pesticides, les additifsutilisés dans l’industrie du plastique et des surfactants pouvaient perturber lesmécanismes hormonaux. Les effets attribués aux perturbateurs endocriniens incluentle développement de cancers de la prostate et des testicules, une diminution de laproduction de spermes chez les hommes ainsi qu’une démasculinisation, uneféminisation, une altération des fonctions immunes et une diminution de la fertilité chezdes oiseaux, poissons et mammifères.

En réponse à ces inquiétantes observations, la communauté scientifique s’est focaliséesur les composés induisant un dérèglement au niveau des hormones stéroïdiennes quijouent un rôle majeur dans le contrôle de la reproduction et du développement. Ainsi,du fait de leur activité oestrogénique, les produits de dégradation des détergents et lesstéroïdes ont été inclus dans la liste des substances dangereuses prioritaires. Enconséquence, des études internationales ont été lancées pour évaluer la présence, ledevenir et la toxicité de ces substances dans l’environnement [1, 2]. À ce titre, desméthodes analytiques robustes, sensibles et reproductibles doivent être mises enplace afin d’identifier et de quantifier ces composés [3, 4] et ainsi permettre l’évaluationde leurs effets sur les populations.

3.1.1. Molécules analysées

Les molécules analysées au cours de ces travaux sont les suivantes :

- des stéroïdes naturels : des estrogènes (β-estradiol, estrone, estriol,hydrocortisone) et des androgènes (testostérone, méthyltestostérone), desprogestogènes (progestérone), ainsi que le coprostane, coprostane-3-one issus dela réduction du cholestérol ;

- des stéroïdes pharmaceutiques : 17 alpha éthynylestradiol (estrogène) etnorethindrone (progestogène) utilisés dans la formulation de pilules contraceptives ;

- des stérols : cholestérol ainsi que coprostane-3-ol ;

- des surfactants et détergents.



Ces agents tensio-actifs entrent dans la composition de tous les produits nettoyants etsont également employés dans l’industrie du textile, du papier, du cuir, ainsi que dansla fabrication de cosmétiques, d’extincteurs.

On distingue généralement trois types d’agents tensioactifs : les agents anioniques, lesagents cationiques et les agents non ioniques. Cette étude va porter sur deuxsurfactants non ioniques, produits de polymérisation comportant des fonctions alcoolset un plastifiant :

- les alkylphénols (AP) : 4-n-nonylphénol et 4-tert-octylphénol. Les AP sont utilisésdans la formation d’alkylphénolpolyéthoxylates (APnEO) qui entrent dans lacomposition de détergents, d’émulsifiants, d’agents de mouillage ainsi que d’agentsdispersants. Les nonylphénols (NP) constituent 85 % de la famille des alkylphénolscommercialisés. Les 15 % restant sont représentés par les octylphénols (OP) ;

- le bisphénol A (BPA) : utilisé pour la synthèse d’époxy-résines, de polycarbonatesainsi que de retardateurs de flamme ; ces polycarbonates sont utilisés pourl’emballage de nombreuses boissons et aliments ; les résines sont employéescomme laque pour revêtir les produits métalliques tels que les conserves et lestuyauteries. Le BPA est également utilisé dans la fabrication d’adhésifs, depeintures, de disques compacts, de verre optique [5].

3.1.2. Sources de contamination de l’environnement

Les hormones stéroïdiennes excrétées par les hommes et les animaux sont introduitesdans l’environnement par le déversement d’effluents d’eaux usées domestiques ainsique par les rejets d’excréments animaux.

Les estrogènes sont synthétisés naturellement par l’homme et autres vertébrés. Cesmolécules sont excrétées sous forme conjuguée dans les urines et constituent lasource principale d’estrogènes dans les eaux usées. La production et l’excrétion deces composés varient entre les deux sexes et au cours de la vie. Chez la femmemature, l’excrétion des estrogènes varie durant le cycle menstruel, la grossesse, ainsiqu’à la ménopause, et peut atteindre plusieurs mg/jour.

Les estrogènes administrés lors de thérapies de substitution hormonale (chez desfemmes ménopausées ou ayant subi une ablation des ovaires ou de l’utérus), ainsi queceux contenus dans les contraceptifs (éthynylestradiol) ou encore présents dans lestraitements contre certains cancers (prostate, sein), représentent également unesource de contamination environnementale. D’après la quantité d’éthynylestradiolprésent dans les pilules contraceptives, il a été estimé que son excrétion journalièreétait de 35 µg/jour/femme [6].

Les estrogènes rejetés de façon relativement importante par l’homme vont se retrouverdans les eaux usées et, suivant l’efficacité du traitement des stations d’épuration,peuvent aboutir dans les cours d’eau.

Les APnEO, les AP, ainsi que le BPA, sont relargués dans l’environnement, à partir dela formulation et l’utilisation des produits dont ils sont les constituants. Les AP sont les



produits de dégradation des APnEO. À titre d’exemple, il faut savoir que les rejets deNP et BPA dans eaux usées du Danemark atteignent respectivement 37 à996 tonnes/an et 735 tonnes/an.

3.1.3. Comportements dans les stations de traitements et le milieuaquatique

L’élimination de ces composés de la phase aqueuse, grâce aux processus debiodégradation (plus efficace en condition d’aérobie) et d’adsorption sur les bouesactivées (du fait de leur caractère hydrophobe), peut atteindre des taux de 45 à 95 %suivant les composés. L’efficacité d’élimination de ces composés lors du traitementd’épuration ne dépend pas seulement de leurs propriétés intrinsèques (propriétésphysico-chimiques et dégradabilité), mais également de la chaîne de traitementsréalisés et des conditions d’opération. Suivant celle-ci, une quantité plus ou moinsimportante de contaminant va être rejetée dans le milieu aquatique.

Les connaissances sur le comportement, le devenir et la persistance des estrogènes,des alkylphénols et du BPA dans l’environnement, sont encore relativement limitées.Lorsque l’effluent est rejeté au niveau des eaux de surface, la concentration en cescomposés peut être réduite par dilution, dégradation (bactérienne ou photolyse) ouadsorption des composés sur les particules en suspension ou les sédiments.

Les demi-vies des estrogènes et BPA sont estimées à 2-6 jours dans l’eau et lessédiments [6] et de 7 à 28 jours pour le NP. Dans les effluents traités et les eaux desurfaces, les concentrations en estrogènes, NP et BPA sont généralement faibles, carces substances se dégradent relativement rapidement et s’absorbent sur les particulesde boues.

D’après l’excrétion journalière d’estrogènes par l’homme, les facteurs de dilution et lesprélèvements déjà réalisés, des niveaux de l’ordre du ng/l sont attendus dans leséchantillons environnementaux aqueux. Les AP, BPA ainsi que les stérols sont quant àeux généralement présents à des concentrations plus importantes de l’ordre du µg/l.

3.2. RÉSULTATS

Nos travaux antérieurs ont permis de développer les méthodes d’extraction-dérivationet d’analyses quantitatives par chromatographie en phase gazeuse couplée à laspectrométrie de masse (GC-MS) pour 12 de ces substances endocriniennes. Ainsi,12 molécules avaient été séparées et quantifiables jusqu’à des teneurs allant de 0,1 à20 ng/l dans les eaux. Les rendements de récupération sur cartouches polymériquesétaient satisfaisants pour l’ensemble des composés à l’exception des alkylphénols pourlesquels les pourcentages restent inférieurs à 50 %.

De nouveaux développements, en particulier grâce à la LC-MS/MS ont conduit àaméliorer les rendements de récupération et à agrandir la liste des molécules quicompte à présent 16 molécules. L’illustration 3 contient les rendements derécupération après dopage à bas niveaux (2 à 70 ng/l) et hauts niveaux (13 à 600 ng/l).



À l’exception de quelques molécules non détectées au niveau bas de dopage, lesrésultats sont satisfaisants pour l’ensemble des composés. Toutefois, les rendementsen estriol et estrone sont anormalement bas au niveau haut de dopage. Ce point devraêtre approfondi lors de prochaines études.

Les performances de la méthode sur les phases dissoutes (< 0,45 µm) et particulaires(> 0,45 µm) sont regroupées dans l’illustration 4. Il apparaît clairement que la mise aupoint d’une méthode GC - LVI (injection large volume), directement couplée à laspectrométrie de masse en mode MS/MS, nous a permis d’abaisser nos seuils dedétection. C’est notamment le cas d’un facteur 10 pour le 17-α-ethynylestradiol, le 4-nonylphénol et l’estrone.

Composés % récupérationbas niveaux

% récupérationhauts niveaux

4-tert-octylphenol Surfactant 155 135

4-nonylphenol Surfactant 95 107

Bisphenol A Additif auxpolymères ND 63

Estrone Stéroïdes ND 21

Estradiol-17β Stéroïdes 97 100

Methyltestostérone 92 74

Testostérone Stéroïdes 106 111

17-α-ethynylestradiol(contraceptif) Stéroïdes 113 119

Coprostane Stéroïdes 50 86

Estriol Stéroïdes 136 34

Coprostane-3-ol Stérols 135 74

Coprostane-3-one Stéroïdes ND 73

norethindrone Progestogène 108 101

progesterone Progestogène 97 114

Hydrocortisone Stéroïdes 86 55

Cholestérol Stérols 49 85

Illustration 3 - Rendements de récupération après dopage à deux niveaux de concentrationpour 16 composés classés comme perturbateurs endocriniens.



Composés Classe

LQ enLVI/GC/MS/MS

(ng/l)< 0,45 µm

LQ enGC/MS/MS

(ng/l)< 0,45 µm

LQ enLVI/GC/MS/MS

(ng/l)> 0,45 µm

4-tert-octylphenol Surfactant 2 1 80

4-nonylphenol Surfactant 0,1 1 4

Bisphenol A Additif auxpolymères 0,2 0,5 8

Estrone Stéroïdes 0,1 2 4

Estradiol-17β Stéroïdes 0,8 3 32

Methyltestostérone* (1,5) 18

Testostérone* Stéroïdes 5(1) 20 60

17-α-ethynylestradiol(contraceptif) Stéroïdes 5 20 200

Coprostane Stéroïdes 2 5 80

Estriol Stéroïdes 0,3 2 12

Coprostane-3-ol Stérols 5 30 200

Coprostane-3-one Stéroïdes 4 5 160

Norethindrone* Progestogène 20(4) 50

Progesterone* Progestogène 10(2) 25

Hydrocortisone* Stéroïdes (1) 12

Cholesterol Stérols 25 40 1 000

* meilleures LOQ en LC - MS/MS (entre parenthèses).

Illustration 4 - Limites de quantification pour l’analyse de substances endocriniennespar GC - MS/MS et LC - MS/MS.



Après ces travaux de mise au point méthodologique, un criblage analytique a été menésur plusieurs effluents pouvant représenter une source potentielle significative decontamination en région Centre ; il s’agit de rejets d’eaux usées urbaines au niveau decinq stations d’épuration. Les prélèvements ont été effectués dans cinq stations quidiffèrent par leur taille, leurs procédés et leur ancienneté. Les échantillons ont étérecueillis dans des bouteilles en verre pyrex borosilicate ambré, et conservés àl’obscurité et à 4 °C avant l’extraction. Ils ont également été filtrés sur des membranesd’acétate de cellulose de 0,45 µm. L’illustration 5 regroupe les paramètres physico-chimiques de chacun de ces effluents.

Date / Heure

Moyennesur 24 h

Stationd'épuration

M.E.S.en mg/l

D.C.O.en mg/l

DBO5Jen mg/l

NH4+

en mg/lN.T.K.

en mg/lNO3

-

enmg/l

P totalen mg/l Ph

28/11/2003 E 10 44 5 0,79 3,1 2,3 0,2

02/12/2003 C 8,4 13 2,44 0,7 0,26 7,66

02/12/2003 D 26 53 35,3 39,2 11

du 1 au 2/12/03 B 8,2 36 3,2 1,6 1,1

03/12/2003 B

du 4 au 5/12/03 B 8 28 9 7,25 1,8 1,9

03/12/2003 A (9,2) 26,6 4,93 1,43 1,38 7,71

Illustration 5 - Paramètres physico-chimiques des effluents analysés.

Pour la station B, on ne dispose que des valeurs de la veille et du lendemain duprélèvement.

À la station A, la valeur réelle des MES est 3 à 4 fois plus importante que la valeurmoyennée sur 24 h.

Une précédente étude que nous avions réalisée sur ce type d’effluents avait montréque les principales substances détectées sont souvent des indicateurs decontamination fécale tels que le cholestérol, le coprostane-3-one, le coprostane-3-ol etl’œstrogène bisphénol A. Nous proposons ici de déterminer également lesconcentrations de ces substances sur les phases colloïdales (> 0,45 µm), afin de lescomparer à celles relevées en phase dissoute (< 0,45 µm).

Ainsi, les résultats pour les cinq effluents (ill. 6) confirment la présence de cholestérol,de coprostane-3-one, de coprostane-3-ol et dans une moindre mesure de bisphénol Aet de ter octyl phénol. Les concentrations les plus élevées atteignent 20 à 40 µg/l de



cholestérol et coprostane 3-ol dans l’effluent de la station A. Un chromatogrammeGC - MS/MS démontrant la présence de Bisphénol A est reporté en annexe 1.

Plus de 80 % de composé se retrouve généralement dans la phase particulairecolloïdale, mais cette tendance est inversée pour le bisphénol A pour lequel 50 à 70 %se retrouve dans la phase dissoute (ill. 7).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

CO

NC

ENTR

ATI

ON

(µg/

L)

STEP A STEP B STEP C STEP D STEP E BLANC

STEP

BPA 4-ter-octylphenol Estrone coprostane-3-ol coprostane-3-one cholesterol

Illustration 6 - Composés détectés dans les effluents de STEP : phases dissoute + particulaire.

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

% c

ompo

sé e

n ph

ase

diss

oute

STEP A STEP B STEP C STEP D STEP ESTEP

BPA coprostane 3-ol coprostan 3-one cholesterol

Illustration 7 - Composés détectés dans les effluents de STEP : répartition dissous/particulaire.



3.3. SUBSTANCES PHARMACEUTIQUES

Les progrès liés à la découverte, la production et l’utilisation thérapeutique des produitspharmaceutiques ont eu une conséquence inattendue bien que prévisible : la pollutiondes eaux superficielles et souterraines par ces composés et leurs métabolites. En effet,la présence de produits pharmaceutiques dans l’environnement a été mise enévidence pour la première fois dans les années 80 et de nombreuses études réaliséesen Europe et aux États-Unis depuis 1998 confirment cette présence.

Les concentrations retrouvées sont de l’ordre de la dizaine de nanogrammes par litredans les eaux de surfaces, mais on retrouve certains produits très persistants dans leseaux souterraines et même dans le réseau d’eau potable. Ces concentrations sontfaibles, bien en deçà des doses thérapeutiques usuelles, mais les principes actifsayant été choisis ou conçus pour avoir un effet biologique, on ne peut négliger leurseffets potentiels sur des organismes pour lesquels ils ne sont pas destinés. De plus,même s’ils ont été dosés pour une durée d’exposition de quelques heures aumaximum dans l’organisme, ils peuvent persister dans l’environnement pendantplusieurs années.

Il s’agit donc de sélectionner des substances pharmaceutiques susceptibles de setrouver dans des effluents de stations d’épuration et les eaux superficielles etsouterraines et de mettre au point un protocole d’analyse des plus performants.

3.3.1. Les substances pharmaceutiques dans l’environnement

L’annexe 2 résume schématiquement les voies possibles d’entrée des substancespharmaceutiques dans l’environnement.

a) Origine

En général, les médicaments ingérés par les patients sont excrétés principalementsous leur forme inactivée (métabolites). Cependant, pour certaines molécules lesproduits excrétés peuvent présenter une activité biologique une fois dansl’environnement pour deux raisons [7, 8] :

- si la métabolisation n’est pas complète et que la forme active prédomine commec’est le cas par exemple pour le bézafibrate ;

- ou si les métabolites sont eux-mêmes actifs.

Ces produits se retrouvent alors dans le réseau d’eaux usées et sont traitésvariablement dans les stations d’épuration [7]. Il existe une autre voie de contaminationdu milieu naturel : les médicaments jetés avec les déchets ménagers peuvent polluerles sols et les eaux souterraines en cas d’enfouissement en décharge (V2, ann. 2).

On peut également remarquer que les animaux sont une source de pollution del’environnement par des produits vétérinaires (notamment les antiparasitaires et lesantibiotiques), soit par le biais de leurs excréments (épandage du purin, contamination



des sols de prairies) (V3), soient par les produits qui leur ont été administrés en usageexterne (V4). Ces produits et leurs métabolites se retrouvent alors sur les sols, puisdans les eaux superficielles par ruissellement (V5) et les eaux souterraines parlixiviation (V6). Il faut également tenir compte des cas d’aquaculture où les produitsadministrés se retrouvent directement dans les eaux superficielles et s’adsorbent auxsédiments (V7) [7].

Par ailleurs, les hôpitaux sont une source de rejets de certains médicaments,d’anesthésiques, de désinfectants et de produits d’aide au diagnostic (produits decontraste pour l’imagerie par rayons X par exemple). Toutes ces substances peuventse retrouver dans les eaux usées [8].

b) Devenir dans les stations d’épuration

Les résidus de produits pharmaceutiques présents dans les réseaux d’eaux uséesdomestiques sont traités dans les stations d’épuration. Ils y sont éliminés partiellementet les métabolites conjugués peuvent même être hydrolysés lors d’un traitementbiologique pour donner à nouveau le composé parent [7]. Le rendement d’éliminationdes molécules pharmaceutiques dans les stations d’épuration est fonction descaractéristiques des stations (procédés, taille, nature des influents), mais égalementdes propriétés physico-chimiques des molécules et de leurs métabolites [9].

Le devenir des molécules (principes actifs ou métabolites) selon leurs propriétésphysico-chimiques peut se résumer ainsi :

- les composés biodégradables comme l’aspirine sont minéralisés en CO2 et en eau ;

- les composés lipophiles comme le bézafibrate vont s’adsorber dans les boues (V8,ann. 2) ;

- et les composés hydrophiles tels que le paracétamol se retrouveront directementdans les effluents (V9) puis dans les eaux de surface.

Kanda [10] a montré que l’élimination de l’ibuprofène dans différentes stationsd’épuration du Royaume Uni pouvait varier considérablement selon les procédés miseen place dans ces stations : pour une grande station avec procédé de traitement desboues activées ou bassin d’oxydation, le taux de dégradation est de 80 à 100 %, alorsque pour une petite station avec filtre biologique ou lits tubulaires ce taux n’est que de14 à 44 %. Stumpf [11] avait déjà noté ce fait en 1999 dans des stations d’épurationbrésiliennes pour neuf anti-inflammatoires et hypolipidémiants, dont l’ibuprofène (ill. 8).



Tauxd’élimination Auteur Réf. Pays

Bézafibrate 27 % - 50 % Stumpf et al. [11] Brésil

83 % Ternes [9] Allemagne

Carbamazépine 7 % Ternes Allemagne

Diclofénac 9 % - 75 % Stumpf et al. Brésil

69 % Ternes Allemagne

Ibuprofène 22 % - 75 % Stumpf et al. Brésil


63 % Rodriguez et al. [12] Espagne

Kétoprofène 48 % - 69 % Stumpf et al. Brésil

Métoprolol 83 % Ternes Allemagne

Naproxène 15 % - 78 % Stumpf et al. Brésil


43 % Rodriguez et al. Espagne

Propranolol 96 % Ternes Allemagne

Illustration 8 - Données sur le rendement d’élimination de certains composésdans diverses stations d’épuration.

L’influence des traitements oxydants et particulièrement de l’ozonation sur lesproduits pharmaceutiques et leurs métabolites ont été étudiés à plusieurs reprises.Zwiener et Frimmel [13] ont observé que le diclofénac, l’ibuprofène et l’acide clofibriqueétaient mieux dégradés par un mélange ozone/eau oxygénée que par l’ozone seulgrâce à la formation de radicaux libres réactifs : plus de 98 % des molécules étaientainsi éliminées avec une concentration de 5 mg/l en ozone et 1,8 mg/l en H2O2 pendant10 minutes. Ternes [14], quant à lui, a montré qu’à des concentrations suffisammentélevées (10 - 15 mg/l) pendant 18 minutes, l’ozone seul était suffisant pour éliminerplusieurs classes de composés : bêtabloquants, analgésiques, métabolites d’hypolipi-démiants, antiépileptiques, estrogènes et parfums musqués. Seuls les produits decontraste pour l’imagerie par rayons X ne sont pas dégradés suffisamment ni parozonation seule, ni par des procédés plus avancés (O3/H2O).



Les conditions atmosphériques peuvent également avoir un impact sur l’efficacitédes stations d’épuration : Ternes [9] a ainsi aussi montré que les rendementsd’élimination de certains composés pharmaceutiques, comme les anti-inflammatoires,étaient considérablement diminués en période de pluies intenses, en raison del’augmentation des débits et de la dilution, qui ont modifié les conditions de floculationet d’adsorption.

Cependant, il ne faut pas oublier que l’élimination des produits pharmaceutiques nesignifie pas leur destruction complète : ils peuvent être dégradés en produitségalement actifs. La présence de métabolites dans les effluents est rarement mesurée,car peu d’entre eux sont disponibles comme standards chimiques et il peut y avoir denombreux métabolites possibles pour chaque molécule. Il faut remarquer que lesmétabolites sont en général plus polaires que les composés parents et sont doncpersistants dans l’environnement [7].

Les composés se trouvant dans les effluents après traitement sont distribuésdirectement dans les eaux superficielles. Ceux contenus dans les boues viendrontcontaminer les sols et de là les eaux souterraines et les eaux de surface, notammenten raison de l’épandage.

c) Présence dans les eaux de ressources

Du fait de leur élimination incomplète dans les stations de traitement des eaux usées,certains produits pharmaceutiques se retrouvent dans les rivières, où ils sont présentsen quantités détectables malgré la dilution, et dans les eaux souterraines même si lesol fait office de filtre naturel. Certains composés présents dans les effluents vontégalement s’adsorber sur les sédiments (V10, ann. 2).

Certaines concentrations relevées dans différentes matrices environnementales depuisquelques années sont regroupées dans l’illustration 9.

- Une des études les plus complètes sur la présence de produits pharmaceutiquesdans l’environnement a été réalisée en Allemagne en 1998 [9]. Elle montre laprésence de nombreux d’entre eux dans les effluents en raison de leur mauvaiseélimination dans les stations d’épuration et de leur persistance dans les eaux derivières.

- Zuccato [16] a révélé la présence de 14 médicaments et produits vétérinaires dansles eaux de rivières (10 - 100 ng/l), dans les sédiments (100 - 1 000 ng/kg) et dansl’eau de boisson (1 - 10 ng/l).

- Ashton [17] a détecté 10 médicaments et antibiotiques dans des effluents destations d’épuration et 8 dans des rivières anglaises. Par ailleurs, il a remarqué laprésence de certains de ces composés (surtout l’ibuprofène) non seulement en avaldes rejets de stations d’épuration, mais également en amont, ce qui dénoterait lagrande persistance dans l’environnement de ces molécules et également de lapossibilité d’autres voies de contamination des rivières (ruissellement).



- Une recherche assez exhaustive a recensé la présence de 95 composésorganiques dont des produits pharmaceutiques et des hormones dans 139 coursd’eaux des États-Unis en 1999-2000 [15].

Pays Molécule Effluents(µg/l)

Rivières(µg/l)

Sédiments(ng/kg) Auteur Réf

Allemagne Bézafibrate 4,6 3,1 Ternes [9]

Carbamazépine 6,3 1,1

Diazépam 0,04 nd

Diclofénac 2,1 1,2

Ibuprofène 3,4 0,53

Kétoprofène 0,38 0,12

Métoprolol 2,2 2,2

Naproxène 0,52 0,39

Paracétamol 6 nd

Propranolol 0,29 0,59

États-Unis Fluoxétine 0,012 Kolpin et al. [15]

Ibuprofène 1

Paracétamol 10

Italie Bézafibrate 0,2 130 Zuccato et al. [16]

Diazépam 0,001 nd

Ibuprofène 0,09 220

Royaume-Uni Diclofénac 2,3 0,57 Ashton et al. [17]

Ibuprofène 27,3 5

Propranolol 0,28 0,21

Illustration 9 - Données environnementales sur la teneur maximale de plusieurs médicamentsdans différentes matrices.



Les eaux souterraines sont également contaminées : Sachez [18] a analysé105 échantillons d’eaux souterraines en Allemagne. Huit molécules y ont été détectéesau moins trois fois, notamment le diclofénac présent dans 4 échantillons avec uneconcentration maximale de 590 ng/l, et la carbamazépine présente dans13 échantillons avec une concentration maximale de 900 ng/l. La grande persistancede certains composés les amène même jusqu’à la mer : Thomas [19] a mis enévidence la présence de neuf médicaments dans les estuaires anglais, notammentl’ibuprofène à une concentration maximale de 930 ng/l.

On constate donc que de nombreux produits pharmaceutiques sont présents dans leseaux de rivières, mais également dans les sédiments et les eaux souterraines.

d) Dégradation dans l’environnement

Outre les phénomènes de dégradation « contrôlés » dans les stations d’épuration, ilexiste également des phénomènes spontanés de bio- et photodégradation ayant lieudans le milieu naturel. Il a ainsi été observé que le diclofénac est naturellementphotodégradé, notamment à la surface des lacs [20].

Par ailleurs, Andreozzi [21] a observé que la photodégradation divise environ par 5 letemps de demi-vie de certains composés pharmaceutiques en milieu aqueux : ainsi lacarbamazépine a un t1/2 de 100 jours en été contre 500 en hiver et le diclofénac de0,25 et 1,5 respectivement (latitude 40° N). Par ailleurs, la présence de nitratesaugmente en général le taux de photodégradation par la formation de radicaux libresHO° qui réagissent avec le substrat. La présence d’acides humiques peut égalementaugmenter la photodégradation par formation d’espèces réactives de l’oxygène (cas dupropranolol), ou au contraire la diminuer en absorbant les radiations UV et agissantainsi comme un filtre (cas de la carbamazépine).

e) Toxicité pour les organismes vivants

Des molécules actives peuvent donc contaminer les sols et les eaux superficielles. Laflore et la faune locales sont donc susceptibles d’en subir des effets indésirables. À cejour, les principales études écotoxicologiques portent sur la toxicité aiguë de certainesmolécules sur les organismes aquatiques. En général, la toxicité aiguë (EC50) pour cesorganismes est de l’ordre de 1 - 100 mg/l [7], soient des valeurs bien supérieures auxconcentrations détectées dans l’environnement.

En ce qui concerne la toxicité chronique, Ferrari [22] a montré que la carbamazépineétait plus toxique que le diclofénac, alors qu’en toxicité aiguë ce serait plutôt lecontraire. En effet, les EC50 sont toujours de l’ordre de 10 à 100 mg/l selon les tests,mais sont plus faibles pour le diclofénac. En revanche, les LOEC sont de l’ordre de 0,7à 100 pour la carbamazépine et varient de 2 à 25 pour le diclofénac. On peutremarquer que les tests effectués n’ont pas tous la même sensibilité.

Par ailleurs, on ne peut négliger le risque que certains composés pharmaceutiquespuissent avoir un effet de perturbateur endocrinien. Les médicaments hormonaux



(œstrogènes, stéroïdes) tout d’abord, mais également d’autres substances pourraientréagir différemment et à plus faibles doses sur des organismes « non-cibles » que surl’organisme humain [23]. Par exemple, la fluoxétine est soupçonnée d’avoir un impactimportant sur les mollusques chez qui la sérotonine contrôle de nombreuses fonctionsphysiologiques, notamment reproductives.

Par conséquent, à l’heure actuelle on ne peut accuser les résidus de produitspharmaceutiques d’avoir des effets nocifs sur les écosystèmes. Cependant, il n’a pasnon plus été prouvé qu’ils sont sans danger et d’avantages d’études écotoxicologiquessont nécessaires pour déterminer leurs toxicités chroniques, leurs effets combinés etleurs effets potentiels de perturbateurs endocriniens.

f) Un danger pour l’homme ?

Les eaux superficielles et souterraines constituant la ressource pour la productiond’eau destinée à la consommation humaine, l’homme est le dernier maillon de lachaîne qui provoque la pollution par les médicaments.

Zuccato [16] n’a décelé que 3 composés dans un réseau d’eau potable en Italie, dontle diazépam à des concentrations comprises entre 20 et 24 ng/l. Heberer [24] aremarqué que certains médicaments et certains métabolites de produitspharmaceutiques sont très persistants dans l’environnement aqueux. Ainsi, l’acideclofibrique, métabolite du clofibrate (hypolipidémiant), ainsi que le diclofénac, ont étéretrouvés à l’état de traces dans le réseau d’eau potable de Berlin (de l’ordre de10 ng/l).

D’après Webb [25], il y aurait au moins un facteur 1 000 entre la dose ingérée par lebiais d’une eau potable contaminée et la dose thérapeutique. En général, ce facteurest même de 150 000. Ainsi, même sur une vie complète d’exposition à une eaucontaminée, la dose thérapeutique journalière n’est pas atteinte. Néanmoins, on nepeut négliger la nécessité d’évaluer les risques à long terme d’une expositionprolongée à des traces de produits pharmaceutiques et de produits de dégradation,notamment pour certaines populations à risques comme les enfants, les fœtus et lespersonnes souffrant de déficiences enzymatiques.

Les procédés de traitement de potabilisation sont donc à modifier afin d’éliminer toutetrace de ces composés. Le comportement de la carbamazépine dans les stations depotabilisation a été particulièrement étudié en raison de sa faible biodégradabilité etdonc de sa forte présence dans les eaux de ressources [26]. Il a été montré que lacarbamazépine était entièrement éliminée dans des conditions normales de traitementde potabilisation (10 minutes à 1 mg/l d’ozone).

g) Les traceurs de pollution anthropogénique

Certains produits pharmaceutiques pourraient constituer de bons traceurs de pollutionde l’environnement par des eaux usées domestiques. Par exemple, la carbamazépineest peu biodégradable et est faiblement éliminée lors de son passage en station



d’épuration [9, 27]. De plus, elle n’est pas toxique pour les algues et ne démontre pasde capacité à se bio-accumuler [26]. D’autres composés pouvant être utilisés commetraceurs sont à l’étude. Ainsi, la caféine est la preuve d’une pollution par les eauxusées, mais c’est une molécule facilement biodégradable et qui peut êtreconsidérablement éliminée dans les stations d’épuration selon les procédés utilisés. Lebore pourrait également constituer un bon traceur [18].

3.3.2. État des lieux en France

a) Habitudes de consommation

D’après les données de la Caisse Nationale d’Assurance Maladie en 2002 [28],confirmées par celles de 2003, les quatre premiers médicaments les plus prescrits enquantité en France sont des antalgiques à base de paracétamol seul (Efferalgan®,Doliprane®, Dafalgan®) ou associé (Di-Antalvic®). Il ne faut pas oublier que certains deces médicaments sont également vendus sans prescription, ce qui augmente encoreles quantités consommées et par conséquent excrétées.

Après les antalgiques, ce sont les psychotropes qui sont le plus prescrits :l’hypnotique Stilnox® est au cinquième rang. D’ailleurs, avec près de deux millions etdemi de français qui consomment des médicaments psychoactifs (80 millions de boîtesvendues par an), la France est le premier consommateur mondial de médicamentspsychotropes [29]. Les benzodiazépines comme le Xanax®, le Lexomil®, le Temesta®,et le Seresta® sont parmi les 75 spécialités les plus prescrites. Et si certains de cesmédicaments psychoactifs semblent être moins prescrits (notamment le Prozac® et leValium®), c’est en fait parce qu’ils ont à présent des génériques. Par conséquent, leurprincipe actif est toujours autant consommé. Une étude de l’agence française deSécurité Sanitaire des Produits de Santé [30] montre d’ailleurs qu’entre 1991 et 2001,« les ventes des médicaments du système nerveux ont augmenté à un rythmesupérieur à celui de l’ensemble des spécialités pharmaceutiques » et plusparticulièrement les analgésiques, les antiépileptiques et les psycholeptiques.

b) Études environnementales en France

Parmi les rares données actuellement publiées sur la présence de produitspharmaceutiques dans l’environnement en France, l’on trouve celles provenant duprojet européen Rempharmawater « Évaluation écotoxicologique et technologiesd’élimination des produits pharmaceutiques dans les eaux usées » [31]. D’après lesétudes de Andreozzi [21] et Ferrari [22], sur 26 principes actifs recherchés dans deuxeffluents de stations proches de Lyon, 22 ont été retrouvés au moins une fois, dontl’ibuprofène, le naproxène, le kétoprofène et la carbamazépine à des concentrationssupérieures à 1 µg/l (ill. 10).



Prescriptions*

Rang 2002 Unités (10/an) Quantités(T/an)en 2002 **

Concentrationsdans

2 effluents àLyon (µg/L) ***

Alprazolam 29 11 159

Bézafibrate 1,07

Bromazépam 33 10 2

Carbamazépine 0,98 – 1,2

Diazépam

Diclofénac 25 11 16 0,25 – 0,41

Fénofibrate 31 11 64 0,02 – 0,12

Fluoxétine 39 9 5

Ibuprofène 5 17 136 0,02 – 1,82

Kétoprofène 20 12 37 1,62

Lorazépam 43 8 0,6

Métoprolol 0,08

Naproxène 0,51 – 1,73

Oxazépam 89 5 5

Paracétamol 1 270 2 160

Propranolol 0,01 – 0,04

Zolpidem 10 20 3

* : Données de la Caisse Nationale d’Assurance Maladie [28].** : Évaluations à partir de données de la Caisse Nationale d’Assurance Maladie [28] et du Biam [32].*** : Andreozzi et al. [21].

Illustration 10 - Données sur les quantités de médicaments venduessur prescription et retrouvées en France.



3.3.3. Molécules choisies dans le cadre de notre étude

Ainsi, les principes actifs étudiés ont été choisis en raison de leur grand volume deprescription en France [28, 32], de leur présence prouvée dans des effluents destations d’épuration de Lyon [21] ou du grand nombre d’études réalisées dans lemonde quant à leur présence dans l’environnement.

a) Les analgésiques et les anti-inflammatoires

Le paracétamol est un analgésique : médicament qui diminue ou supprime la douleur.C’est la molécule la plus prescrite en France en volume : 270 millions de boîtesvendues en 2002, soit plus de 2 000 tonnes de principe actif par an.

L’ibuprofène, le kétoprofène, le naproxène et le diclofénac sont des anti-inflammatoires non stéroïdiens : ils soulagent l'inflammation, la douleur et la raideurassociées à diverses affections en inhibant la production de prostaglandines. Ils ontégalement un effet analgésique. L’ibuprofène, le diclofénac et le kétoprofène font touspartie des 25 molécules les plus prescrites en France. Ils ont par ailleurs tous lesquatre été détectés dans les effluents des stations d’épuration de Lyon incluses dansle projet Rempharmawater [21].

b) Les psychotropes

Le zolpidem est un hypnotique de type benzodiazépine prescrit pour provoquer et/oumaintenir le sommeil. Le Stilnox® est le cinquième médicament le plus prescrit enFrance (le premier psychotrope) et le zolpidem est la dixième molécule la plus vendue.

La fluoxétine est un antidépresseur de type inhibiteur sélectif de la recapture de lasérotonine (ISRS). Bien que les ventes du Prozac® soient en baisse depuis quelquesannées, l’existence de génériques fait que cela reste une des molécules les plusconsommées.

L’alprazolam, le bromazépam, le diazépam, le lorazépam et l’oxazépam sont desanxiolytiques de type benzodiazépine prescrits pour les traitements longue durée desmanifestations d’anxiété et d’angoisse. Ces cinq molécules font partie des100 molécules les plus prescrites en France, à l’exception du diazépam pour lequel iln’y a pas de données de consommation, mais qui fait partie des molécules les plusétudiées par les auteurs européens [9, 16].

c) Les bêtabloquants

Le métoprolol et le propranolol sont des substances s'opposant de façon compétitiveà la stimulation des récepteurs ß-adrénergiques provoquée par les médiateursadrénergiques ou par les sympathomimétiques et réduisent ainsi le rythme cardiaque.Il n’existe pas de données de consommation de ces molécules en France, mais parmiles différents bêtabloquants recherchés dans l’environnement, ce sont les deux qui



sont le plus fréquemment détectés et en plus grandes quantités [9, 17, 33]. Elles ontété également quantifiées dans les effluents lyonnais [21].

d) Les hypolipidémiants

Le fénofibrate et le bézafibrate réduisent le taux de lipides sanguins en empêchantl'absorption des sels biliaires dans l'intestin ou en modifiant la métabolisation dans lefoie des acides gras sanguins en divers types de lipides. Le fénofibrate se trouve autrente et unième rang des molécules les plus prescrites, notamment pour sa spécialitéLipanthyl®, qui est au rang 48 des médicaments les plus prescrits. Par ailleurs, cesdeux composés ont été retrouvés à plusieurs reprises dans l’environnement [9, 16],notamment en France [21].

e) Les antiépileptiques

La carbamazépine est un anticonvulsivant qui permet de prévenir, réduire ou fairecesser les crises convulsives (en général causées par l’épilepsie), en inhibant l'activitéélectrique des cellules du cerveau. C’est une molécule particulièrement étudiéeactuellement, en raison de sa forte persistance dans l’environnement [9, 21, 27].

3.3.4. Résultats

Ce chapitre traite de mises au point méthodologiques et expose des résultats obtenussur un « screening » de cinq effluents de stations d’épuration ,afin de déterminer s’ilscontenaient certaines molécules parmi les 17 produits pharmaceutiques choisis.

a) Identification des molécules en LC - MS/MS

• Ionisation APCI

Treize molécules ont pu être ionisées en mode positif sous forme protonée [M+H]+. Lemode négatif a également été testé mais les signaux étaient très peu intenses. Leslimites de quantification des 13 molécules détectées en APCI apparaissent comprisesentre 2 et 50 µg/l (ill. 11). Il est intéressant de constater que les psychotropesprésentent tous des limites de quantification du même ordre de grandeur (2 - 8 µg/l). Ilen est de même pour les bêtabloquants (10 - 30 µg/l).



LQ (ng/l)

APCI-MS/MSmode positif

ESI-MS/MSmode positif

ESI-MS/MSmode négatif GC-MS/MS

Ibuprofène 50 4

Paracétamol 30 2

Métoprolol 10 3 32

Naproxène 150 5

BPA D16 0,5

Propanolol 30 1 118

Kétoprofène 15 39

Diclofénac 5 3 30 21

Fluoxétine 50 30 5

Carbamazépine 5 10 25

Bézafibrate 15

Fénofibrate 5 5 25

Diazépam 6 2 3

Testostérone D3 53

Bromazépam 8 10 81

Lorazépam 2 2

Oxazépam 6

Zolpidem 5 1 18

Alprazolam 5 5 11

Illustration 11 - Limites de quantification des substances pharmaceutiques choisiesen GC - MS/MS et LC - MS/MS.



• Ionisation ESI

Six molécules testées sont ionisées en mode négatif sous forme déprotonée [M-H]− et16 en mode positif sous forme protonée [M+H]+. Les limites de quantification des6 molécules détectées en ESI négatif sont comprises entre 15 et 150 µg/l, tandis quecelles des molécules détectées en ESI positif sont de l’ordre de 1 à 30 µg/l (ill. 11).Pour une même molécule visible dans les deux modes d’ionisation, l’ESI positif est« plus sensible » que le négatif, sauf pour le bézafibrate. Par ailleurs le naproxène etl’ibuprofène ne sont visibles qu’en mode d’ionisation négative. L’ESI positif estégalement généralement plus sensible que l’APCI dans nos conditions opératoires. Onpeut constater à nouveau que les molécules d’une même classe se comportentsensiblement de la même manière (psychotropes, bêtabloquants). L’exemple d’unchromatogramme LC - MS/MS obtenu sur un effluent de station d’épuration, avec untraitement en MS et en MS2 pour la détection de l’oxazépam, sont présentés enannexe 3.

b) Identification des molécules en GC - MS/MS

Quatorze molécules ont été détectées en GC - MS/MS, avec des limites dequantification comprises entre 2 et 120 µg/l (ill. 11). Certains composés ont unemeilleure limite de quantification sur cet instrument qu’en LC - MS/MS, notamment lescomposés acides qui n’étaient détectables qu’en ESI négatif comme l’ibuprofène et lenaproxène.

Les molécules manquantes font partie des composés nécessitant une dérivation : lebézafibrate, le lorazépam et l’oxazépam. Il n’existe pas de données particulières aubézafibrate dans la littérature. En revanche, on a pu se référer aux travaux de Pirnay[34] et de Reddersen [35] pour les deux benzodiazépines manquantes. En réalité, pourles 14 autres molécules et les standards internes, seules les dérivations surgroupement hydroxyle ont été avérées, mais aucune dérivation sur site amine. Uneétude plus détaillée des mécanismes de la dérivation serait donc nécessaire.

c) Taux de récupération en SPE

L’objectif de cette phase d’extraction est de concentrer suffisamment les échantillonsenvironnementaux à analyser et avoir ainsi des limites de quantification de l’ordre de10 à 100 ng/l. Trois types de cartouches ont été testés avec le même protocole debase : Oasis® HLB de Waters, Chromabond® Easy de Macherey-Nagel et AbselutNexus de Varian. Comme attendu en raison de la variété de propriétés physico-chimiques des substances étudiées, les rendements d’extraction se sont révélésparticulièrement faibles (ill. 12), surtout pour l’Absolut Nexus : seules trois moléculesont un rendement d’extraction supérieur à 60 % : le diazépam, le fénofibrate et lezolpidem.



0

20

40

60

80

100

120

140

Alpraz

olam

Bézafi

brate

Bromaz

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Carbam

azép

ine

Diazép

am

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pam D

5

Paracé

tamol

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%

Chromabond Easy - protocole normalChromabond Easy - protocole modifiéOasis HLB - protocole normalOasis HLB - protocole modifié

Illustration 12 - Rendements d’extraction de substances pharmaceutiques - Protocole de baseet protocole modifié (suppression du lavage basique et élution à 100 % de méthanol).

Le protocole a donc été modifié en conséquence et testé sur les cartouchesChromabond® Easy et Oasis® HLB : le second lavage à pH basique a été supprimé etune élution supplémentaire à 100 % de méthanol a été effectuée. Ces améliorationsont été concluantes et tous les rendements ont été augmentés au-delà de 60 % sur lesdeux types de cartouche (ill. 12). Cela est particulièrement remarquable pour lescartouches Oasis® HLB qui fournissent des rendements supérieurs à 80 % pour denombreuses molécules. Toutefois, les molécules basiques comme les bêtabloquants etpolaires comme le paracétamol, ne sont pas convenablement extraites par ceprotocole consensuel. Des cartouches Oasis® MCX de Waters (échangeur cationique),spécialement conçues pour les composés basiques, seraient probablement plusadaptées, seules ou en série avec des cartouches Oasis® HLB. L’influence du pHdevrait également être étudiée comme l’a montré une étude assez complète [36] sursept types de cartouches polymériques pour des substances pharmaceutiques acides,neutres et basiques.

d) Analyse d’effluents de stations d’épuration

Les résultats présentés ici concernent les mêmes effluents de station d’épurationprélevés en région Centre, au sein desquels avait été réalisé le « screening » deperturbateurs endocriniens. À la différence des substances endocriniennes, seules lesphases dissoutes des effluents ont pu être analysées lors de cette étude.



0

400

800

1200

1600

2000

Con

cent

ratio

n (n

g/L)

STEP A STEP B STEP C STEP D STEP ESTEP

Ibuprofen Kétoprofen Diclofénac OxazépamLorazépam Zolpidem Bézafibrate Carbamazépine

Illustration 13 - Concentrations en substances pharmaceutiques détectées dans la phasedissoute de cinq échantillons de rejets de stations d’épuration de la région Centre.

Les résultats du « screening » sont présentés en illustration 13. Le paracétamol et lesbêtabloquants n’ont pas été détectés dans les effluents, probablement à cause d’unprotocole d’extraction peu approprié. Le fénofibrate, l’alprazolam, le bromazépam et lediazépam semblent être absents de ces effluents. Toutes les autres molécules ont étédétectées au moins une fois. Les cinq effluents sont contaminés par au minimum huitdes substances recherchées. Les quantités retrouvées varient de quelquesnanogrammes à quelques microgrammes par litre, ce qui correspond aux ordres degrandeur de la littérature. Les molécules les plus concentrées sont le kétoprofène, lenaproxène, la fluoxétine et le zolpidem, à des concentrations supérieures à 1 µg/l.

On constate également de grandes disparités entre les concentrations de chaquemolécule dans les cinq échantillons. Les effluents de la station d’épuration D sont lesplus chargés. Cela peut s’expliquer par le fait que c’est une station de traitementd’eaux usées assez ancienne qui devrait être réhabilitée et remise aux normes en2005. La station la plus efficace en terme d’élimination des produits pharmaceutiquessemble être la station E. C’est effectivement la plus récente des stations où nousavons effectué des prélèvements ; elle est équipée de procédés biologiques et ellefonctionne actuellement uniquement à 50 % de sa capacité maximale.

Les profils de concentrations sont similaires à ceux obtenus précédemment pour lessubstances endocriniennes, à savoir des concentrations plus élevées au sein desrejets des stations A et D. Ce phénomène semble indiquer que de nombreux



composés, bien que chimiquement différents, sont susceptibles d’être relargués enmême temps dans le milieu naturel, en cas dysfonctionnement des stations d’épurationou avec des procédés de traitements obsolètes.

L’étude devrait être complétée par l’analyse des phases colloïdales dont le rôle s’estrévélé fondamental dans le cas des substances endocriniennes. Il sera égalementintéressant de développer des méthodes pour rechercher les métabolites de cescomposés, mais le manque de produits standards ne facilitera pas la tâche pour lesquantifier correctement.



4. Conclusion

Cette étude a permis de développer des méthodes d’extraction et d’analyses fiables etsensibles pour l’analyse de substances phytosanitaires et de polluants émergents :substances à effets perturbateurs endocriniens et résidus de médicaments.

Les performances obtenues notamment l’abaissement des limites de quantificationdans les eaux et les sols doivent permettre de mettre en évidence les mécanismes detransfert des composés phytosanitaires dans les sols profonds.

Appliquées aux effluents de station d’épuration, ces analyses ont montré la présencede plusieurs substances à effets perturbateurs endocriniens et de plusieurs résidus demédicaments.

Ces travaux montrent qu’il apparaît nécessaire d’étendre la recherche de polluantsémergents dans les eaux souterraines et superficielles, au-delà des effluents.

D’après le rapport de la commission d’orientation du plan national Santé-Environnement, publié en juin 2004 [37], certaines recommandations relatives aux huitthématiques prioritaires trouvent parfaitement leurs échos dans ce projet, en particulier,la prévention des risques reprotoxiques liés aux expositions environnementales et laprévention des risques liés à l’eau.

Pour continuer de répondre à l’action nationale de recherche et de réduction des rejetsde substances dangereuses dans les eaux, nous proposons de poursuivre toutparticulièrement nos développements analytiques sur les alkylphénols (surfactants), lescomposés polybromés (ignifugeants) et les organoétains (biocides).

Un autre thème important à valoriser pour une participation de la région Centre : lesétudes de transport et transfert de pesticides par voie atmosphérique, en collaborationavec LIGAIR qui possède d’excellentes compétences dans le domaine du prélèvementd’échantillons d’air. Notre savoir-faire analytique sur les pesticides devrait permettre demener à plus grande échelle les travaux entrepris par LIGAIR depuis plusieurs années.



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[37] Plan national Santé Environnement 2004-2008.



Annexe 1

Analyse de Bisphénol A par GC - MS/MSsur un échantillon d’effluents urbains



Annexe 2

Voies possibles d’entrée des produitspharmaceutiques dans l’environnement



Annexe 3

Recherche de l’oxazépam dans l’effluent Den LC - MS/MS

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