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AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes04/03/2015 (10h-11h)ALLEGRO Mégane (CR: Hamza Berguigua)AIHPr. Fenollar18 Pages

Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes

Plan :

A. Diagnostic direct I. Examen microscopiqueII. Détection immunologiqueIII. Détection moléculaireIV. Isolement bactérieV. Spectrométrie de masse

B. Diagnostic indirect I. Sérologie par immunofluorescence indirecteII. Sérologie par ELISAIII. Sérologie par Western Blot

Stratégie diagnostique :

Le diagnostic non spécifique permet une orientation. On peut prendre les exemples suivants :

-Hémogramme :Hyperleucocytose à polynucléaire neutrophiles souvent associée aux infections bactériennes.Leuconeutropénie souvent associée aux infections à bactéries intracellulaires et virales.

-Dosage Protéine C-réactive :Elévation en cas d'infection.

-Dosage de la Procalcitonine :Elévation en cas d'infections bactériennes, parasitaires, ou fongiques (mais pas virales).

Le diagnostic spécifique permet diagnostic étiologique.

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AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes

*Diagnostic direct

Examen microscopique ++Détection immunologique Mise en évidenceDétection moléculaire du microorganismeIsolement bactérie (Culture axénique++) à partir de prélèvementsSpectrométrie de masse

*Diagnostic indirect = Sérologie ++ Mise en évidence à partir du sérum du patient de la réponse immunitaire

Les prélèvements :

Ils sont faits en fonction de la symptomatologie et de la symptomatologie clinique.

Les 2 grands types de prélèvements :-provenant d'un site contaminé-provenant d'un site stérile

Les grandes catégories :-hémocultures-fluides biologiques-collections-biopsiques-cutanéo-muqueux

Pré-requis pour un prélèvement réussi :-Quand prélever ?Le plus tôt possible, avant tout traitement (sauf en cas de purpura fébrile où il faut traiter directement).Lors de pic fébrile.Lors d'échec thérapeutique ou d'évolution défavorable.

-Précautions indispensablesStérilement (attention à la contamination avec la flore commensale).Transport rapide au laboratoire (idéal utilisation de milieu de transport).Si écouvillonnage : charger un maximum l'écouvillon.

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A. Diagnostic direct :

I. Examen microscopique :

Microscopie optique (+) permet de réaliser :-Etat frais

-Coloration de Gram-Coloration de Ziehl Neelsen

- Examen au MO à l'état frais :Préparation faite avec lame et lamelle au MO (Grossissement x 100, x 400).Bactéries vivantes en suspension, de levures et de parasites.Corps réfringents d'aspects différents suivant les espèces (caractère constant) : cocci, bacilles, cocco-bacilles, vibrions, spirilles, fuseaux...Certaines espèces sont mobiles, d'autres immobiles.Certaines espèces ont des individus isolés et d'autres des bactéries groupées par deux ou en amas, chaînettes..Examen de routine dans tous les laboratoires.

- Coloration de Gram :Etalement du prélèvement sur une lame.Fixation puis coloration.Mise en évidence de bactéries au grossissement x 1000.Sépare les bactéries en 2 groupes suivant la structure et la composition de la paroi.Gram positif (+) colorés en violet et Gram négatif (-) colorés en rose.Examen de routine dans tous les laboratoires.

Exemple de prélèvement où réside une flore bactérienne commensale :

Coloration de Gram d’un prélèvement vaginal= Flore bactérienne polymicrobienne.

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Exemple de prélèvement normalement stérile :Coloration de Gram de liquide céphalo-rachidien.

Méningite à méningocoques = Diplocoques à Gram négatif dans un polynucléaire.

Mise en évidence de levures (gros grains violets regroupés) :A ne pas confondre avec des bactéries à Gram positif.

-Coloration de Ziehl-NeelsenMise en évidence de bacilles acido-alcoolo résistants

Ex : Myxobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose

- Examen au microscope à fond noir : Exemples :

Mise en évidence de Treponema pallidum, bactérie responsable de la syphilis. Ici dans une ulcération génitale.

Examen réservé à des laboratoires très spécialisés

Non réalisé en routine.

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II. Detection immunologique :

Recherche d'antigène par technique d'immunochromatographie

Des anticorps ciblant spécifiquement le microorganisme recherché :-Présents sur un support inerte-Marqués par des particules permettant de visualiser le résultat

Intérêts : Précocité, simplicité, rapidité, diagnostic tardif.

Limites: pas d'isolement de la bactérie certaines souches ne peuvent pas être détectées positivité pouvant persister plusieurs mois après la guérison

Tests immunochromatographique sur membrane :

-Détection d'antigènes urinaires de Legionella pneumophila sérogroupe 1 ou Streptococcus pneumoniae ++ : Des anticorps anti-Legionella pneumophila sérogroupe 1 marqués par des particules permettant de visualiser le résultat sont présents sur un support inerte.

Rôle dans le diagnostic des pneumopathies à L.pneumophila séropgroupe 1.

-Détection d'antigènes de Streptococcus pyogenes (A) 1 ++ :

rôle dans le diagnostic des angines et pharyngites à Streptococcus A.

-Détection de toxines de Clostridium difficile -> diarrhée et colite pseudo-membraneuse

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III. Diagnostic moléculaire :

Amplification génique par Polymérase Chain Reaction (PCR)

Principe général par Polymerase Chain Reaction : 1. Extraction de l'ADN à partir des prélèvements

2. PCR

-Mise en évidence du matériel génétique des bactéries

-Gênes cibles des réactions de PCR et méthodes d'identification :

1. Gène "universel" pour les bactéries : ARN 16 S ribosomique : Identification précise des bactéries par séquençage par comparaison aux banques de séquences (GenBank)

Identification de nouvelles bactéries par séquençage (=Séquence nouvelle)

2. Gènes spécifiques de bactéries : Identification précise d'une bactérie par séquençage ou sonde spécifique d'une bactérie.

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Une fois l'ADN extrait on a deux techniques différentes :

-la PCR quantitative spécifique en temps réel (réponse en 2 ou 3 heures maximum)

-PCR classique à large spectre ciblant ARN 16S : *Amplification par PCR classique (environ 3h) *migration sur gel (20 mn)

*séquençage du produit amplifié (24h) *analyse informatique

Intérêts :

Utile pour les bactéries difficilement ou non cultivables.

Intérêt si le patient a eu des antibiotiques.

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AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennesAutomatisation possible.

Diagnostic moléculaire rapide (<3h) disponible de nos jours :méningite, purpura fulminans (méningocoque et pneumocoque)portage vaginal du streptocoque B chez les femmes enceintesNeisseria gonorrhae, Chlamydophila trachomatis, Treponema pallidum (IST)

Limites :

Risques de contamination pour les techniques de PCR (donc de faux positif)

Coût encore relativement élevé

Pas réalisé en routine dans la plupart des laboratoires

IV. Isolement bactérie : Diagnostic direct par culture :

Sur gélose ou milieu liquide (culture axénique) ++

milieux solides (= milieux gélosés)milieux séléctifsmilieux non séléctifs

milieux liquides

milieux spéciaux

Sur support vivants tels que des cellules (culture xénique)

Sur inoculation animale

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Diagnostic par culture sur gélose (Culture axénique) :

Examen de routine dans tous les laboratoires (hôpital + ville)

Objectif : isoler les bactéries (levures aussi) présentes dans les prélèvements

-Gélose non séléctive (pour les prélèvements normalement stériles) et riche. Exemple : Milieu chocolat ou sang cuit

-Gélose sélective (Présence d’antibiotiques):

Exemple: Milieu CIN (cefsulodine-irgasan novobiocine)

Culture de Yersinia enterocolitica à partir de prélèvements de selles. Les antibiotiques permettent de tuer la flore commensale des selles pour que Yersinia enterocolitica puisse pousser plus facilement.

Incubation des milieux dans une étuve :

Durée : au minimum 24h, parfois plus d'un mois.Température : À 37° le plus souvent, parfois 4°C (Listeria monocytogenes), 30°C (Yersinia sp).

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AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennesA partir d'une colonie isolée : identification phénotypique par galerie biochimique de la bactérie. On recherche un certain nombre de réactions biochimiques (ex : consommation des sucres …).

Compte bactérien : Exemple des urines

Seuil de positivité: 105/ml (parfois 103 pour certaines bactéries comme E. Coli par exemple)

*UFC= Unité Formant Colonies

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Exemple de la gestion des hémocultures :

Devant tout patient fébrile ou hypothermique :Réalisation systématique de la culture du sang des patients = Hémoculture.

Idéalement avant toute antibiothérapie (sauf purpura fébrile).

Prélèvement par ponction veineuse au pli du coude après désinfection de la peau (attention au risque contamination du prélèvement).

Prélèvement dans les flacons d'hémocultures -aérobies -anaérobies

Classiquement on prélève 3 paires d’hémoculture, soit à 30 mn d’intervalle soit à chaque pic fébrile.Les flacons sont mis dans des automates qui vont détecter ou non des dégagements de CO2 (qui peut être synonyme de croissance bactérienne).

-Interpretation des résul tats Intérêt de l'examen se définit par sa valeur prédictive (VP) incriminant 1 bactérie dans la fièvre-1 hémoculture unique positive à Staphylococcus epidermidis : très faible VP

le plus souvent contaminant meilleur VP chez les patients avec un cathéter ou porteur d'une prothèse cardiaque

Staphyococcus aureus : VP de 70%

Salmonella enterica Typhi : VP de 100%

-3 paires d’hémocultures sur 3 positives : Rechercher une prolifération endovasculaire : infection sur cathéter, valve cardiaque…

Automates ( Identification bactéries + Antibiogramme) : 11/18

AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes- Identification des bactéries isolées par automate- Permettant la réalisation de la sensibilité aux antibiotiques

Culture cellulaireTechnique de microculture cellulaireSupport de culture : Fibroblastes humains par exemple

Détection de croissance et identification des bactériesColoration de GimenezImmunofluorescence (IFI)PCR ciblant l’ARNr 16S

Poste de travail pour les cultures cellulaires : Hotte à flux laminaire, matériel jetable et stérile

Observation de cultures cellulaires (tubes, boîtes multi-puits de plastique et flacons) au microscope optique inversé.

Intérêts : isolement de microorganismes intracellulaires strictes (certaines bactéries = Coxiella burnetii, Rickettsia sp, Chlamydophyla sp) et des bactéries de culture fastidieuse (Brucella sp, Francisella tularensis)

Etude de leur résistance aux antibiotiques !!

LimitesDélai usuel d’obtention du résultat (variable selon les microorganismes)Culture cellulaire est pratiquée dans des laboratoires spécialisés

Microorganismes hautement pathogènes (+/- agents de bioterrorisme). Exemple: Coxiella burnetii, Rickettsia prowazekii

Culture dans un laboratoire de niveau de sécurité biologique III

Inoculation animale : 2 exemples : Treponema pallidum

Agent de la syphilisNon cultivable pour le moment en milieux axénique ou cellulaireInjection intra-testiculaire chez un lapinEn quelques jours une orchite riche en tréponèmes

Mycobacterium leprae

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AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennesAgent de la lèpreNon cultivable pour le moment en milieux axénique ou cellulaireInjection dans le coussinet du Tatou à 9 bandes

Non réalisée en routine

V. Spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) :

Principe :-identification bactérienne : lyse acide (acide formique, acide trifluoro-acétique, les 2...) et matrice (acide cinnamique) qui fournit l'énergie pour ioniser les protéines quand on envoie le laser.-Ionisation essentiellement de protéines par un laser -> obtention de spectres.Les peptides vont s’accélérer, les petits vont arriver les premiers, les plus gros seront les derniers, grâce au détecteur on obtient un spectre en fonction de la masse sur charge.

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B. Diagnostic indirect ( Sérologie ++ ):

Le prélèvement : sérum +++ (sang sur tube sec)

Type d'antigène : bactéries totales, antigènes ou épitopes isolés.

Les principales techniques :Screening : immunofluorescence indirecte ou ELISAConfirmation : Western Blot

Mise en évidence :De la présence d ’IgM = Infection précoce le plus souventd'IgG = Persiste très longtemps

2 prélèvements consécutifs à 2 semaines minimum d’intervalle =Recherche de l’élévation des anticorpsRecherche d’1 séroconversion

Limite : Manque de spécificité = Réaction croisée entre bactéries

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En cas d’infection virale : stimule le système immunitaire donc risque de faux positif -Patients transfusés

I. Sérologie par immunofluorescence indirecte :

Lame où on dépose l’antigène de la bactérie que l’on recherche puis incubation avec le sérum du patient.Deuxième incubation avec les anticorps dirigés contre les Ig humaines et marqués à la fluoroscéine.

II. Sérologie par ELISA :

On met l’antigène sur un support, puis le sérum du patient et enfin l’anticorps ciblant l’Ig humaine que l’on recherche couplé cette fois ci à une ENZYME. Ensuite on rajoute le substrat, si les anticorps du patient sont fixés il y a une coloration qui apparait.

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AIH – Diagnostic des maladies infectieuses bactériennes-Mesure de la densité optique-Lecture par un automate

III.Sérologie par Western Blot :

C’est une technique de confirmation.

1. Séparation des protéines en fonction de leur PM sur gel de polyacrylamide : électrophorèse de type SDS-PAGE2. Transfert sur une feuille de nitrocellulose3. Incubation avec le sérum du patient4. Incubation avec anticorps ciblant les Ig humaines et couplés à une enzyme5. Revelation par un substrat

Intérêt principal: Diagnostic sérologique spécifique

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Principales sérologies d'intérêt dans le diagnostic des infections bactériennes

Bactéries responsables d'infections pulmonairesCoxiella burnetiiChlamydophila pneumoniaeMycoplasma pneumoniaeLegionella spp

Bactéries responsables d'infections génitalesTreponema pallidum

Bactéries responsables de maladies disséminéesBrucelloseMaladie de Lyme

Rickettsioses

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