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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2007, 146, 271-288

ÉVALUATION DE L’EFFETANTIMYCOBACTÉRIEN DE PLANTES DU

CENTRE-NORD DU MAROC (*)

Hakima SQALLI ( 1 ) , Asmae EL OUARTI ( 1 ) ,Abdeslam ENNABILI ( 2 ) , Saad IBNSOUDA ( 1 ), Abdellah

FARAH ( 2 ) , Abdellati f HAGGOUD ( 1 ) , Abdellah HOUARI ( 1 ) ,Mohammed IRAQUI ( 1 )

Trente-six espèces de plantes correspondant à vingt-deuxfamilles de la région Centre-Nord du Maroc ont été testées pourleur activité antimycobactérienne. Des extraits aqueux etéthanoliques de chaque plante ont été testés contre la croissancedes mycobactéries : M. aurum, M. smegmatis, M. kansasii,M. bovis et M. vaccae. Quatorze espèces se sont révéléesinhibitrices : Juniperus oxycedrus, Pistacia lentiscus et Rutamontana déjà citées dans des travaux antérieurs, et Populus alba,Cistus albidus, C. monspeliensis, C. salviifolius, Pistacia atlantica,Tamarix africana, Rubia peregrina, Thymus pallidus, Vitexagnus-castus, Verbascum sinuatum et Dittrichia viscosa.

(*) Manuscrit reçu le 27 mars 2007.(1) Laboratoire de Biotechnologie Microbienne, Faculté des Sciences et Techniques

de Fès, Université Sidi Mohammed Ben Abdellah, BP 2202, Fès, Maroc.hsqal l i2004@yahoo.fr , ibnsouda@hotmail.c o m , ahaggoud@yahoo.fr,houariab@hotmail.com, mhiraqui@yahoo.fr

(2) Institut National des Plantes Médicinales et Aromatiques, Université SidiMohammed Ben Abdellah, BP 159 Taounate Principale, Maroc.aennabili@yahoo.fr, hybride_farah@yahoo.fr

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INTRODUCTION

La tuberculose, due à plusieurs espèces de mycobactéries etparticulièrement à Mycobacterium tuberculosis, demeure de nos joursincontestablement une maladie sociale préoccupante.

L’amélioration de l’hygiène et la découverte de traitements efficaces(streptomycine, éthambutol, isoniazide, pyrazinamide et rifampicine), ainsique la découverte de vaccins antituberculeux ont permis de réduirel’incidence de cette maladie, surtout dans les pays développés. On a penséun moment que ce fléau était vaincu [25].

Cependant, au début des années 90, on a observé une augmentationde l’incidence de cette maladie à l’échelle mondiale suite à la mobilitécroissante, aux migrations d’origine économique et politique et auxdéficiences des programmes de lutte, de nombreux patients ne recevant pasun traitement adéquat. Cela a favorisé l’apparition problématique demycobactéries multirésistantes aux antituberculeux [25]. En outre, lespatients immunodéprimés, surtout ceux infectés par le VIH, sontparticulièrement menacés [36].

En 1990, l’OMS [59] estimait qu’un tiers de la population mondialeétait infecté par le bacille de Koch, 8 millions de cas de tuberculose étaientdéclarés dont 95 % dans les pays en voie de développement, et 3 millions dedécès sont survenus du fait de cette maladie. Les prévisions vont dans lesens d’une détérioration de la situation. Ainsi, toujours selon l’OMS, en2005, la situation s’est aggravée : le nombre annuel de nouveaux cas detuberculose dépassait les 10 millions et le nombre de décès a atteint 3,5millions. La tuberculose prédomine dans le tiers monde, particulièrementdans certaines régions d’Afrique et d’Asie, où l’épidémie du SIDA continueà se développer [70-71].

Les prévisions de l’OMS estiment que pour la période 2000-2020, unmilliard de personnes seront nouvellement infectées par Mycobacteriumtuberculosis, 200 millions développeront la maladie et 35 millions mourrontde tuberculose si aucune amélioration n'est apportée dans le traitement et lecontrôle de cette infection [46]. Pour mieux contrôler les infectionsmycobactériennes et diminuer la fréquence des souches multirésistantes, ilest donc urgent de mettre en évidence de nouveaux agentsantimycobactériens efficaces [43].

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Le règne végétal est une source inépuisable de nouveaux agentsantituberculeux. Des plantes médicinales et aromatiques pourraientpermettre le traitement ou la prévention de maladies chroniques et/ougraves, et résoudre le problème de la résistance bactérienne vis-à-vis desagents antibactériens actuels. Les recherches sur les activitésantimycobactériennes, le mode d’action et la composition chimique desplantes connaissent un regain d’intérêt [43].

C’est dans ce cadre que s’inscrit le présent travail. Nous avons testél’aptitude d’extraits de diverses plantes marocaines à inhiber la croissancede mycobactéries.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Matériel végétal

En 2005, diverses parties de 36 espèces de plantes ont été collectées(Tableau I). 31 ont été récoltées entre 150 et 425 m dans la région deBellota, faisant partie du site d’intérêt biologique et écologique deBrikcha/Chefchaouen. Thymus pallidus provient de la région deBoufekrane/Meknès et les quatre espèces restantes d’un herboriste de Fès :Rubia peregrina, Origanum majorana, Anacyclus pyrethrum et Matricariarecutita. Ces échantillons ont été séchés à l’ombre et à l’air libre puisbroyés. Des spécimens ont été conservés à l’herbier de l’Institut national desPlantes médicinales et aromatiques à Mezraoua-Taounate (Maroc).

Ces espèces correspondent à 22 familles : une de Gymnospermes(Cupressaceae), 5 de Monocotylédones et 16 de Dicotylédones.

Préparation des extraits

Différents extraits aqueux ou éthanoliques ont été préparés à raisonde 15 g de poudre pour 100 ml d’eau ou d’éthanol :

Infusion : la poudre est infusée 24 heures dans l’eau, puis filtrée ;

Décoction : la poudre mélangée à l’eau bouillante est portée àébullition pendant quinze minutes, puis filtrée ;

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Extraction à l’éthanol : la poudre est macérée 24 heures dansl’éthanol absolu à l’ombre. Après filtration, le solvant est évaporé àsec et sous vide au rotavapor à 37°C. L’extrait est ensuite repris dans5 ml d’eau distillée stérile.

La filtration des différents extraits est assurée par filtration sous videavec une pompe à eau et un filtre Millipore de porosité 0,45 µm. Le pH dechaque extrait est neutralisé en cas de besoin. Ces extraits sont incorporésdans le milieu de culture Sauton [6,48] à base de 160 mg de matièresèche/ml, concentration relativement élevée. En effet, l’utilisation deconcentrations plus faibles pourrait rendre impossible la mise en évidencede l’effet antimycobactérien dans les extraits des plantes dont le principeactif est présent en très faible quantité. De plus, plusieurs travaux antérieursont utilisé la matière sèche à des concentrations supérieures ou égales à100 mg/ml [4,14,45].

Mycobactéries testées

Les mycobactéries utilisées sont :

- Mycobacterium aurum A+, mycobactérie non pathogène à temps degénération d’environ 6 h, espèce modèle qui peut être utilisée pourévaluer l’effet des substances actives sur la croissance deM. tuberculosis [11]

- Mycobacterium smegmatis MC2 155, mycobactérie atypique nonpathogène et à temps de génération d’environ 3 h

- Mycobacterium kansasii ATCC 12478, mycobactérie atypiquecausant des infections opportunistes

- Mycobacterium bovis BCG IPP

- Mycobacterium vaccae ATCC 1548314.

Ces mycobactéries ont été aimablement fournies par Dr. S. David(Centro de Tuberculose e Micobactérias, Instituto Nacional de Saúde Dr.Ricardo Jorge Delegação do Porto, Portugal).

Elles ont été cultivées sur le milieu Sauton à 37°C [6,48].

Screening de l’activité antimycobactérienne

Les titres des différentes cultures mycobactériennes sont environ 106

UFC/ml. Des aliquotes de 100 µl de ces cultures ont été étalées sur lesboites renfermant 15 ml de milieu Sauton préparées avec les extraits de

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plantes et non contaminées après préincubation 24 h à 37°C. Les boitestémoins contiennent du milieu Sauton dépourvu d’extrait de plante. Lesboites ainsi préparées ont été incubées à 37°C. La lecture des résultats a étéfaite quotidiennement durant six jours pour les mycobactéries à croissancerapide (M. smegmatis, M. aurum et M. vaccae). Pour M. kansasii etM. bovis, les résultats sont notés après 7 et 21 jours d’incubation.

Le screening de l’activité antimycobactérienne a été égalementréalisé par la méthode de diffusion. Des disques de papier Whatman de6 mm de diamètre ont été stérilisés, puis posés sur des boites préalablementinoculées par les souches mycobactériennes. Les disques ont été imprégnésensuite avec l’extrait éthanolique à raison de 160 mg de matièresèche / disque. Le témoin correspond à un disque imprégné d’eau distillée.Les conditions de culture et les titres bactériens utilisés sont identiques auxprécédents.

RÉSULTATS

Sur les 36 espèces végétales testées pour leur activité contre lacroissance des cinq espèces de mycobactéries, 22 sont dénuées d’effet.Parmi les 14 autres ayant montré une activité, 13 sont récoltées et uneprovenait de chez l’herboriste (Tableau I). L’activité se traduit parl’inhibition totale de la croissance des bactéries sur les milieux de culturecontenant les différents extraits à 160 mg/ml (Tableau I). La méthode dediffusion en milieu gélosé confirme ces résultats. Les espèces végétales nonactives n’ont montré la formation d’aucune auréole d’inhibition ; par contre,les extraits des espèces actives ont abouti à l’apparition d’un halod’inhibition.

Les espèces inhibitrices correspondent aux Cupressacées (Juniperusoxycedrus) , Salicacées (Populus alba), Cistacées (Cistus albidus,C. monspeliensis et C. salviifolius), Anacardiacées (Pistacia atlantica etP. lentiscus), Rutacées (Ruta montana), Tamaricacées (Tamarix africana),Rubiacées (Rubia peregrina), Lamiacées (Thymus pallidus, Vitex agnus-castus), Scrofulariacées (Verbascum sinuatum) et Astéracées (Dittrichiaviscosa).

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Tableau I : Effet antimycobactérien des extraits de plantes duCentre-Nord marocain.

Effet anti-mycobactérien

Famille Espèce Partieutilisée

Nbreessais

I D E

Cupressaceae Juniperus oxycedrus♣ F 4 - - -Asparagaceae Asparagus stipularis♣ F 2 + + +Cyperaceae Cyperus longus♣ PA 3 + + +

Scirpoides holoschoenus♣ PA 3 + + +Hyacinthaceae Charybdis maritima♣ B 2 + + +Poaceae Phragmites australis♣ PA 2 + + +Ruscaceae Ruscus hypophyllum♣ F 2 + + +Adoxaceae Viburnum tinus♣ F 2 + + +Anacardiaceae Pistacia atlantica♣ F 4 - - -

Pistacia lentiscus♣ RF 2 - - -Apiaceae Visnaga ammoides♣ RF 2 + + +Asteraceae Anacyclus pyrethrum PS 2 + + +

Dittrichia viscosa♣ F 2 - - -Matricaria recutita RF 2 + + +Sonchus oleraceus♣ RF 3 + + +

Cistaceae Cistus albidus♣ F 2 - - -Cistus monspeliensis♣ RF 2 - - -Cistus salviifolius♣ F 2 - - -

Crassulaceae Sedum sediforme♣ BF 2 + + +Dipsacaceae Dipsacus fullonum♣ F 2 + + +Gentianaceae Centaurium erythraea♣ F 2 + + +Lamiaceae Lavandula stoechas♣ F 2 + + +

Origanum majorana F 3 + + +Teucrium fruticans♣ F 3 + + +Thymus pallidus F 4Calamintha nepeta♣ RF 2 + + +Vitex agnus-castus ♣ RF 3 - - -

Ranunculaceae Clematis cirrhosa♣ T 2 + + +Clematis flammula♣ F 2 + + +Clematis vitalba♣ PA 2 + + +

Rubiaceae Rubia peregrina PS 3 - - -Rutaceae Ruta montana♣ F 2 - - -Salicaceae Populus alba♣ F 3 - - -

Salix pedicellata♣ PA 2 + + +Scrophulariaceae Verbascum sinuatum♣ F 2 - - -Tamaricaceae Tamarix africana♣ F 4 - - -

♣ : Plante récoltée dans la région de Bellota/ChefchaouenB = bulbe, F = feuilles, RF = rameaux feuillés, PA = parties aériennes, PS = partiessouterraines, T = tigesI : infusé, D : décocté, E : extrait éthanolique ; la concentration de matière sèche est de160 mg/ml de milieu de culture- : Inhibition totale de la croissance des cinq mycobactéries testées+ : Croissance des cinq mycobactéries testées.

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DISCUSSION ET CONCLUSION

Sur les 36 plantes marocaines testées, 14 possèdent une activitéantimycobactérienne. Les principes actifs sont solubles dans l’eau etl’éthanol et leur activité ne disparait pas après traitement des extraits 15 minà 100°C.

Les résultats ont été comparés avec ceux de la littérature traitant del’activité antimycobactérienne d’une centaine d’espèces végétalesappartenant aux familles testées (Tableau II).

Juniperus oxycedrus [16], Pistacia lentiscus [47] et Ruta montana[47] ont déjà été signalées comme renfermant un ou plusieurs principesactifs antimycobactériens. Ces auteurs ont utilisé les mêmes parties de laplante, sauf Pistacia lentiscus pour laquelle nous avons testé les rameauxfeuillés au lieu des feuilles.

Populus alba, Pistacia atlantica et l’espèce endémique Thymuspallidus ont un potentiel inhibiteur de la croissance des mycobactéries.

Aux Astéracées antimycobactériennes déjà signalées [5,9,14,20,24,30-

31,37,41,43,56,61,64-65,68-69], on peut ajouter Dittrichia viscosa. Cette espèceest utilisée en médecine traditionnelle marocaine dans le traitement de latuberculose et des affections pulmonaires [8].

Nous ajoutons Tamarix africana aux Tamaricacées, Rubia peregrinaaux Rubiacées, Vitex agnus-castus aux Lamiacées et Verbascum sinuatumaux Scrofulariacées.

Le genre Cistus, avec ses trois espèces inhibitrices, apparait trèsprometteur.

Les genres Cyperus [39], Clematis [43] et Salix [43] présentent desespèces antimycobactériennes, mais les plantes marocaines examinées dansce travail se sont révélées inactives. Il en est de même pour les genresLavandula [43], Origanum [17 ,49] et Teucrium [43] de la famille desLamiacées.

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Tableau II :Principales espèces reportées comme antimycobactériennes

appartenant aux familles testées.

Famille, ordre Présent travail Autres travauxCupressaceae Juniperus oxycedrus♦ Chamaecyparis nootkatensis [12]

Juniperus communis [24,42-43]Juniperus excelsa [43,67]Juniperus oxycedrus [16]Juniperus procera [40, 43]

Asparagales Asparagus stipularisCharybdis maritimaRuscus hypophyllum

Allium cepa [22]Allium sativum [15,42,50-51]Allium schoenoprasum [22]Aloe chinensis [43]Aloe succotrina [43]Aloe vera [19]Chlorophytum inornatum [44]Pancratium maritimum [72]

Cyperaceae Cyperus longusScirpoides holoschoenus

Cyperus articulatus [39]

Poaceae Phragmites australis Avena sativa [35]Anacardiaceae Pistacia atlantica♦

Pistacia lentiscus♦Mangifera indica [43]Pistacia lentiscus [47]Pistacia terebinthus [17]Schinus molle [69]Spondias mombin [13]

Apiaceae Visnaga ammoides Angelica pancini [57]Azorella madreporica [43]Centella asiatica [43]Ducrosia anethifolia [57]Ferula communis [40, 43]Glehnia littoris [43]Heracleum maximum [43]Lomatium dissectum [43]Peucedanum ostruthium [54]Pimpinella aurea [62]Pimpinella corymbosa [62]Pimpinella isaurica [62]

Asteraceae Anacyclus pyrethrumDittrichia viscosa♦

Matricaria recutitaSonchus oleraceus

Achillea millefolium [9]Achillea wilhelmsii [68]Arctotis auriculata [52]Arnica montana [43]Artemisia ludoviciana [24]Artemisia monosperma [56]Balzoamorhiza sagittata [43]Bidens pilosa [43]Borrichia frutescens [43]Calendula suffruticosa [68]Camchaya calcarea [69]

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Chaenactis douglasi [43]Chromolaena odorata [60]Chrysoma pauciflosculosa [43]Chrysanthum sinense [43]Chrysanthemum morifolium [5]Chrysanthemum segetum [43]Erigeron philadelphicus [43]Erigeron strigosus [43]Euthamia leptocephala [43]Flourensia cernua [37]Haplopappus sonorensis [41]Helichrysum crispum [52]Helichrysum melanacme [30-31]Inula helenium [43]Nidorella anomala [31]Rudbeckia subtomentosa [43]Santolina chamaecyparissus [43]Saussurea lappa [43]Senecio chionophilus [20]Solidago arguta [43]Solidago canadensis [43]Solidago rugosa [43]Sphagneticola trilobata [64]Spilanthes mauritiana [43]Tanacetum argyrophyllum [68]Tridax procumbens [65]Vernonia amygdalina [14]

Cistaceae Cistus albidus♦

Cistus monspeliensis♦

Cistus salviifolius♦

---

Crassulaceae Sedum sediforme ---Dipsacales Dipsacus fullonum

Viburnum tinusLonicera japonica [43]Valeriana laxiflora [21]

Gentianaceae Centaurium erythraea Canscora decussata [43]Swertia purpurascens [43]Swertia randaiensis [29]

Lamiaceae Calamintha nepetaLavandula stoechasOriganum majoranaThymus pallidus♦

Teucrium fruticansVitex agnus-castus♦

Ajuga remota [10]Hyssopus officinalis [42]Lantana hispida [24]Lavandula angustifolia [43]Leucas volkensii [43]Mentha piperita [42,55]Origanum sp. [49]Origanum vulgare [17]Orthosiphon labiatus [23]Rosmarinus officinalis [17,32]Salvia aethiopis [68]Salvia africana-lutea [23]Salvia forskahlei [68]

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Salvia hypargeia [43]Salvia kronenburgii [68]Salvia macrochlamys [63]Salvia miltiorrhiza [33]Salvia multicaulis [43]Salvia officinalis [43]Salvia przewalskii [33]Stachys sylvatica [68]Tetradenia riparia [43]Teucrium chamaedrys [42-43]Thymus eigii [66]Thymus revolutus [28]Thymus vulgaris [31]

Ranunculaceae Clematis cirrhosaClematis flammulaClematis vitalba

Actaea spicata [43]Clematis integrifolia [43]Clematis virginiana [43]Coptis coinensia [43]Hydrastis canadensis [43]Nigella sativa [42]

Rubiaceae Rubia peregrina♦ Morinda citrifolia [53]Neonauclea sessilifolia [26]Pentas longiflora [43]Prismatomeris fragrans [27]

Rutaceae Ruta montana♦ Amyris elemifera [43]Aegle marmelos [42]Clausena excavata [61]Coleonema album [18]Commiphora mukul [42]Evodia elleryana [7]Evodia rutaecarpa [2]Galipea officinalis [43]Lunasia amara [3]Micromelum hirsutum [34]Pilocarpus racemosus [43]Ruta montana [47]Tetradium daniellii [1]Triphasia trifolia [43]

Salicaceae Populus alba♦

Salix pedicellataPopulus tremuloides [43]Salix caprea [43]

Scrophulariaceae Verbascum sinuatum♦ Leucophyllum frutescens [38]Scrophularia deserti [58]Verbascum thapsus [42]

Tamaricaceae Tamarix africana♦ ---

♦ : Espèces examinées dans le présent travail et se révélant antimycobactériennes.

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Parmi les Asparagales, les Gentianacées et les Apiacées citées dansplusieurs travaux [15,19,22,29,40,42-44,50-51,54,57,62,72], nous n’avons pastrouvé de nouvelles espèces possédant une activité antimycobactérienne.

Les Poacées, Crassulacées et Dipsacales testées n’ont pas permis detrouver in vitro de propriétés antimycobactériennes.

La toxicité et l’effet in vivo des plantes dont les extraits sontcapables de bloquer la croissance mycobactérienne mériterait d’être étudiée.Les principes des extraits non toxiques et actifs in vivo pourraient ensuiteêtre purifiés et identifiés.

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ABSTRACT

Evaluation of antimycobacterial plants originating from centre northMorocco

Thirty-six plant species belonging to 22 families were collected fromCentral North Morocco. The aqueous and ethanolic extracts were testedagainst the mycobacteria M. aurum, M. smegmatis, M. kansasii, M. bovisand M. vaccae. Thus, 14 plants were able to inhibit the growth ofmycobacteria. Besides Juniperus oxycedrus, Pistacia lentiscus, and Rutamontana, 11 species (Populus alba, Cistus albidus, C. monspeliensis,C. salviifolius, Pistacia atlantica, Tamarix africana, Rubia peregrina,Thymus pallidus, Vitex agnus-castus, Verbascum sinuatum and Dittrichiaviscosa) are reported here for the first time as having antimycobacterialactivity.

Key-words: antimycobacterial properties, Cistus, Mycobacterium

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