Activité technologique en analyse biochimique N°3

E.T.S.L. - 95, rue du Dessous des Berges - 75013 PARIS Tél: 01 45 83 76 34 - Fax: 01 45 83 58 85 - Site: www.etsl.fr - Mail: [email protected]

Année 2020 - 2021

2ème année BTS Bioanalyses et Contrôles

Activité technologique en analyse biochimique N°3

L. GODIN [email protected] http://ligodin.free.fr

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Chromatographie sur gel 3.1/12

TP n°3 : CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION-

DIFFUSION SUR GEL

1. PRINCIPE 2

1.1 Le gel de dextrane 2

1.2 L’exclusion-diffusion sur gel 2

1.3 La manipulation 3

2. MATÉRIEL ET RÉACTIFS 3

2.1. Casier de la manipulation 3

2.2. Matériel et réactifs fournis 3

3. DOSAGE DES PROTÉINES DANS L'UV 4

3.1. Préparation des solutions et des inconnues 4

3.2. Détermination de la concentration inconnue de SAB 4

4. DESSALAGE DE LA SOLUTION DE SAB 5

4.1. Détermination de la longueur d'onde d'absorbance maximale du bleu dextran. 5

4.2. Détermination du volume mort de la colonne. 6

4.3. Dessalage de la SAB 7

4.4. Analyse des éluats. 8 4.4.1. Détermination du volume mort de la colonne 8 4.4.2. Dessalage de la solution de SAB 8

4.4.2.1. Analyse spectrophotométrique 8 4.4.2.2. Analyse visuelle 9

5. DÉTERMINATION DES RENDEMENTS 10

5.1. Détermination du rendement de colonne, Rc 10

5.2. Détermination du rendement de séparation, RS 11

5.3. Conclusions sur les calculs des rendements 12

6. CONCLUSION GÉNÉRALE 12


1. PRINCIPE Dans cette manipulation, on réalise une chromatographie d’exclusion-diffusion à l’aide d’une phase stationnaire commerciale, le Séphadex. Il s’agit d’un gel de dextrane qui se présente sous forme de billes.

1.1 Le gel de dextrane Le dextrane est un polymère de glucose exopolysaccharidique de type a-1,6 , a-1,4 et a-1,3 glucane (les liaisons a-1,6 sont majoritaires à 90 %). Il est produit par culture d’une bactérie, Leuconostoc mesenteroïdes, sur du sucre de canne. Ce polymère présente une grande solubilité due aux nombreux groupements hydroxyles présents (3 par unité de glucose). En présence d’un agent pontant, l’épichlorhydrine, et en milieu alcalin, une solution de dextrane prend en masse. Les chaînes de polymères solubles sont reliées les unes aux autres par des ponts d’éther glycérique. Ceci résulte de la réaction entre l’épichlorhydrine et deux groupements hydroxyles portés par des chaînes de dextrane différentes : Dextrane¾OH + CH2¾CH¾CH2Cl ¾¾¾¾> Dextrane¾O¾CH2¾CH¾CH2Cl \ / ½ O OH NaOH Dextrane¾O¾CH2¾CH¾CH2Cl ¾¾¾¾> Dextrane¾O¾CH2¾CH¾CH2 ½ \ / OH O + NaCl + H2O Dex¾OH Dextrane¾O¾CH2¾CH¾CH2 ¾¾¾¾> Dextrane¾O¾CH2¾CH¾CH2¾O¾Dex \ / ½ O OH Les gels de dextrane du commerce, comme le Séphadex, sont préparés sous forme de billes de grosseur bien définie (les modes opératoires pour préparer ces billes sont brevetés). Le gel comporte un grand nombre de groupements hydroxyles, il est par conséquent fortement hydrophile et gonfle dans l'eau et dans les solutions d'électrolytes.

1.2 L’exclusion-diffusion sur gel La séparation des molécules s'effectue selon leurs tailles (et par conséquent selon leurs masses moléculaires). Pour un gel donné, les molécules de dimensions supérieures aux plus gros pores du Séphadex (c'est à dire au-dessus de la limite d'exclusion du gel) ne peuvent pénétrer dans les grains du gel et passent par la phase liquide extérieure à ces grains. Les molécules plus petites, par contre, pénètrent plus ou moins profondément dans le gel suivant leurs dimensions et leurs formes. Elles sont donc retardées par rapport aux premières. L'élution des différents composés se fait finalement dans l'ordre des masses moléculaires décroissantes.


1.3 La manipulation La manipulation comprend trois grandes étapes : • Le dosage des protéines de l'échantillon dans l'UV, • Le dessalage de l'échantillon sur un gel G 25, • L'analyse des éluats par spectrophotométrie dans l'UV et par le chlorure de baryum. A partir de ces

données, les rendements de colonne et de séparation seront calculés.

2. MATÉRIEL et RÉACTIFS 2.1. Casier de la manipulation • 1 porte-cuve

• 60 tubes en verre de 3 mL

• 2 cuves quartz 103 UV

2.2. Matériel et réactifs fournis • Colonne de Séphadex® G25 de 12 x 240 mm.

• Solution de bleu dextran dans de l'eau distillée.

• Eau distillée contenant de l'azoture de sodium à la concentration de 0,2 g.L-1 utilisé comme éluant.

• Solution étalon de sérum albumine bovine (SAB) à exactement 2 g.L-1 dans du sulfate d'ammonium à 20 g.L-1. [≈ 5 mL].

• Solution de sérum albumine de concentration inconnue dans du sulfate d'ammonium à 20 g.L-1.

[≈ 2,5 mL].

• Solution de chlorure de baryum à 10 % (p/v).

• Spectrophotomètre UV/visible double-faisceau CAMSPEC M550.

• Collecteur de fractions BIO-RAD 2110.

• Sulfate d'ammonium à 20 g/l.

Remarque

Utiliser un faible volume pour rincer la pipette (pas plus de 0,8 mL).


3. DOSAGE des PROTÉINES dans l'UV. 3.1. Préparation des solutions et des inconnues.

• Diluer la solution mère d'étalon SAB de manière à obtenir 2 mL de solution à 0,5 g.L-1 et 2 mL de solution à 1,5 g.L-1.

• Diluer la solution inconnue de SAB au 1/5ème, 1/10ème et au 1/20ème. Fabriquer 2 mL de chacune de ces dilutions.

Q Quel diluant faut-il utiliser pour la gamme et les inconnues SAB ?

Q Préparer un tableau des dilutions en suivant le modèle ci-après.

Solution à

0,5 g.L-1 Solution

à 1,5 g.L-1 Inconnue

diluée au 1/5 Inconnue

diluée au 1/10 Inconnue

diluée au 1/20 Solution mère étalon à 2 g.L-1 (mL)

Solution inconnue (mL)

Diluant (mL)

• Remplir une des cuves avec le blanc adéquat et une autre avec une solution étalon.

• Faire le spectre de la solution mère étalon entre 250 et 350 nm, le sauvegarder puis l’imprimer.

• Déterminer la longueur d’onde d’absorption maximale de la SAB.

3.2. Détermination de la concentration inconnue de SAB

Q Comment faut-il procéder pour repérer rapidement l’inconnue diluée de SAB qui rentre dans la gamme ?

• Prendre deux cuves en quartz de 1 cm de trajet optique et les remplir d'eau distillée.

• Placer une des cuves dans le bloc référence du spectrophotomètre et l'autre dans le bloc mesure.

Remarque

Bien repérer la cuve référence et la cuve mesure qui devront rester strictement les mêmes tout au long de cette manipulation.


• Faire un spectre de différence entre ces deux cuves, le sauvegarder puis l'imprimer.

• Tracer les spectres des solutions à 0,5 et 1,5 g.L-1.

• Soustraire le spectre de différence des cuves à ceux des solutions étalons.

• Tracer les spectres définitifs des solutions à 0,5 et 1,5 g.L-1 et sauvegarder-les.

• Tracer les spectres des solutions inconnues et soustraire le spectre de différence. À la longueur d’onde d’absorption maximale de la SAB, lire l’absorbance des trois dilutions de l’inconnue.

• Repérer la dilution de l’inconnue qui rentre entre les deux solutions étalons.

• Imprimer les trois spectres sur un même graphe (spectres définitifs des solutions à 0,5 et 1,5 g.L-1 et la dilution de l’inconnue qui rentre entre les deux solutions étalons) sur une pleine page avec une échelle commençant à 0 pour l’absorbance.

Q Pour le dosage de la SAB, faut-il utiliser la droite d’étalonnage corrigée ou celle non corrigée ?

Q A quoi sert la droite d’étalonnage non corrigée ?

4. DESSALAGE de la SOLUTION de SAB. 4.1. Détermination de la longueur d'onde d'absorbance maximale du bleu dextran. Le bleu dextran est une molécule de poids moléculaire élevé (2.000.000 Da).

• Établir la courbe de variation de l'absorbance A du bleu dextran en fonction de la longueur d'onde l, A = f(l).

Rapport

Rendre les spectres d'absorbance de la SAB.

Rapport

•À cette même longueur d'onde et en partant du graphe précédent, tracer la droite de variation de l'absorbance en fonction de la concentration en protéine, A = f(C), avant correction du décalage des cuves.

•Dans une autre couleur, tracer la droite A = f(C) obtenue après correction.

•Déterminer la concentration de la solution inconnue de SAB à partir des graphes.


Q Quelle gamme de longueur d'onde faut-il balayer pour étudier le spectre d’absorbance du bleu dextran ?

Q Quelles cuves faut-il utiliser pour établir le spectre d’absorbance du bleu dextran ?

Q Quelle est la composition du blanc de mesure pour le spectre d’absorbance du bleu dextran ?

Q Comment faire pour éviter qu'il y ait saturation du spectrophotomètre lors de l'établissement du spectre du bleu dextran ?

• Déterminer les longueurs d’onde des pics d’absorbance du bleu dextran. Relever les longueurs d'onde d'absorbance du bleu dextran.

4.2. Détermination du volume mort de la colonne. Elle s'effectue en faisant percoler à travers la colonne un composé totalement exclu du gel, le bleu dextran.

• Vérifier que le niveau de l'éluant se situe à environ 3 cm au dessus du lit de gel. Si besoin est, repérer ce niveau à l'aide d'un marqueur (un seul trait suffit pour toute l'année).

• Le dépôt est effectué, sous éluant, juste à la surface du gel et en prenant bien soin de ne pas soulever ce dernier.

• A l'aide d'une micropipette automatique (méthode inverse avec P1000), déposer avec précaution 0,2 mL de bleu dextran concentré. Attendre une quinzaine de secondes que le dépôt s'uniformise.

• Faire pénétrer doucement le bleu dextran dans le gel en éluant puis stopper l'élution.

Rapport

Rendre le spectre d’absorbance du bleu dextran et déterminer la longueur d’onde à utiliser pour suivre l’élution du bleu dextran.

Remarque

La colonne ne doit jamais être sèche.

Remarque

Il faut procéder rapidement pour que le dépôt n'ait pas le temps de diffuser dans le gel.


• A l'aide d'une pipette, ajuster le niveau de l'éluant jusqu'au trait, en faisant attention de ne pas soulever le gel.

• Eluer à raison de 1 goutte toutes les 5 secondes environ.

• Recueillir l’éluat dans une éprouvette jusqu’à ce que le bleu ait atteint la moitié de la colonne ; arrêter l’élution du bleu, et noter le volume Vd écoulé.

• Comprendre le mode de fonctionnement du collecteur de fractions

• Passer à la séparation de la SAB et du sulfate d'ammonium.

Q Pourquoi utilise-t-on le bleu dextran pour déterminer le volume mort de la colonne de gel ?

4.3. Dessalage de la SAB Il s'agit de faire passer dans la colonne la solution de SAB inconnue dans du sulfate d'ammonium à la concentration de 20 g.L-1.

Q Que cherche-t-on à faire au cours du dessalage de la solution de SAB ?

Q Quel autre procédé permet d'accéder au même résultat que le dessalage de la SAB ?

• Laisser pénétrer l'éluant dans la colonne jusqu'à ce qu'il arrive à environ 3 cm au-dessus du lit de gel (au niveau du trait).

• Déposer (méthode directe avec P1000) 1 mL exactement de la solution inconnue non diluée de SAB dans du sulfate d'ammonium à 20 g.L-1.

• Remplir ensuite l’éprouvette jusqu’au maximum de sa capacité (25 mL), puis recueillir des fractions de 1 mL dans des tubes. Cela correspond à environ 18 gouttes sur le collecteur de fractions (à vérifier). Ajouter 1 mL d'eau distillée dans chaque tube.

Remarque

Le débit se règle en jouant sur la pression de travail. A l'aide de la molette crantée, régler le débit à la valeur désirée. La mise en route et l’arrêt de l'élution sont ensuite contrôlés à l'aide d'un clamp.

Remarque

•Les précautions opératoires sont identiques à celles observées pour effectuer le dépôt de bleu Dextran

•Ne pas oublier de relever le volume d'élution au moment où la SAB a été déposée.


4.4. Analyse des éluats. 4.4.1. Détermination du volume mort de la colonne

• Mesurer l'absorbance de chacune des fractions dans des cuves en quartz de 1 cm de trajet optique à (aux) la longueur(s) d’onde choisie(s).

Q Que doit contenir la cuve de référence pour les mesures des fractions collectées ?

• Établir le graphe de la variation de l'absorbance du bleu dextran en fonction du volume d'élution.

Q Quelle est la signification physique de ce volume mort, Vm ?

• Déterminer graphiquement, par la méthode des tangentes, le volume mort, Vm, de la colonne.

4.4.2. Dessalage de la solution de SAB 4.4.2.1. Analyse spectrophotométrique

• Établir le graphe, sous Regressi, de la variation de l'absorbance de la SAB en fonction du volume d'élution. (Cf rapport)

Q Quelle est la composition du blanc de mesure nécessaire pour établir le graphe de la variation de l'absorbance de la SAB en fonction du volume d'élution ?

• Déterminer graphiquement, par la méthode des tangentes, le volume d'élution de la SAB. (Cf rapport)

Rapport

Rendre le graphe exploité, sous Regressi, de la variation de l'absorbance du bleu dextran en fonction du volume d'élution.

Rapport

Justifier le choix de la longueur d'onde utilisée nécessaire pour établir le graphe de la variation de l'absorbance de la SAB en fonction du volume d'élution.


Q Soit Vd, le volume d'élution recueilli avant le dépôt de la SAB. Établir le volume d'élution attendu, Ve, pour la SAB.

4.4.2.2. Analyse visuelle • Après chaque mesure spectrophotométrique, récupérer soigneusement chaque éluat dans le tube qui

lui correspond et ajouter trois gouttes de chlorure de baryum à 10 % (p/v).

• Noter la présence éventuelle d'un précipité.

Q Quel est l'intérêt du test au chlorure de baryum ?

Q Est-il possible d'apprécier le précipité formé à l'aide d'un spectrophotomètre ?

Rapport

•Rendre le graphe, sous Regressi, de l’absorbance de la SAB en fonction du volume d’élution : A = f(Ve).

•Déterminer graphiquement le volume d'élution expérimental pour la SAB.

•Comparer le volume d'élution de la SAB attendu avec le volume d'élution observé expérimentalement.

•Le protocole de dessalage a été modifié par rapport à ce qui se fait classiquement. Il est d'usage de faire un dépôt d'un mélange de la solution à dessaler et de bleu dextran. Qu'aurait-on observé si on avait procédé de cette façon ?

Remarque

•Le précipité n'est pas facile à mettre en évidence. Se placer à la lumière ou sur un fond sombre et créer une turbulence dans le tube (petit mouvement sec du poignet).

•L'appréciation du précipité se fait à l'œil. On notera : "-" : en absence de précipité "+" : pour un précipité léger "++" : pour un précipité moyen "+++" : pour un précipité important


• Reporter sur le graphe de la variation d'absorbance de la SAB en fonction du volume d'élution un diagramme d'évolution du précipité en fonction du volume d'élution.

5. DÉTERMINATION des RENDEMENTS 5.1. Détermination du rendement de colonne, Rc Le rendement de colonne se détermine à l'aide de la relation :

La quantité totale de matière recueillie en sortie de colonne correspond à la somme des quantités de SAB de chaque éluat contenant de la SAB. On considère donc pour ce calcul tous les tubes contenant de la SAB (cf schéma).

Q En pratique, que représente ce rendement de colonne ?

Q Que signifie un rendement de colonne, Rc, de 100 % ?

Q Que signifie un rendement de colonne, Rc, inférieur à 100 % ?

Q Pourrait-on utiliser directement les concentrations pour calculer le rendement de colonne ? Expliquer.

+ + + + ++ + ++

+

Vélution

Rc = Quantité totale de matière recueillie en sortie de colonneQuantité de matière déposée en tête de colonne

x100

+ + + + ++ + ++

+

Tube

Rapport

Interpréter le graphe obtenu de la variation d’absorbance de la SAB et de l’évolution du précipité en fonction du volume d’élution.


n° du tube … Volume d’élution (mL) … Absorbance à ? nm … [SAB] dans la cuve (mg/mL) … Quantité de SAB dans la cuve (mg) …

Q Expliquer comment on calcule la quantité de SAB dans une cuve (formules littérales).

5.2. Détermination du rendement de séparation, RS Le rendement de séparation se détermine à l'aide de la relation :

La quantité totale de matière pure recueillie en sortie de colonne correspond à la somme des quantités de SAB de chaque éluat contenant de la SAB pure. On considère donc pour ce calcul tous les tubes contenant uniquement de la SAB ( (cf schéma).

Q En pratique, que représente ce rendement de séparation, Rs ?

RS =Quantité totale de matière pure recueillie en sortie de colonne

Quantité de matière déposée en tête de colonnex100

+ + + + ++ + ++

+

Tube

Rapport

Rendre un tableau de résultat en suivant le modèle ci-après.

Rapport Déterminer le rendement de colonne, Rc.

Rapport

Rendre un tableau de résultats en suivant le modèle ci-après.


n° du tube … Volume d'élution (mL) … Absorbance à ? nm … [SAB] dans la cuve (mg/mL) … Quantité de SAB dans la cuve (mg) …

5.3. Conclusions sur les calculs des rendements

6. CONCLUSION GÉNÉRALE

Rapport

Déterminer le rendement de séparation de la colonne, Rs.

Rapport

Comparer les valeurs de rendement de colonne et de séparation déterminées puis conclure.

Rapport

Conclure sur l'ensemble des manipulations réalisées.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Préparation 3.1/5

Eléments de réponse aux questions de préparation

3. DOSAGE des PROTÉINES dans l'UV Q Quel diluant faut-il utiliser pour la gamme et les inconnues SAB ?

Le sulfate d’ammonium à 20 g.L-1.

Q Préparer un tableau des dilutions en suivant le modèle ci-après.

Solution à

0,5 g.L-1 Solution à 1,5 g.L-1

Inconnue diluée au 1/5



Solution mère à 2 g.L-1 (mL)

0,5 1,5 - - -

Solution inconnue (mL)

- - 0,4 0,2 0,1

Diluant (mL)

1,5 0,5 1,6 1,8 1,9

Q Comment faut-il procéder pour repérer rapidement l’inconnue diluée de SAB qui rentre dans la gamme ? Il suffit de mesurer l'absorbance à 280 nm des points de la gamme et des inconnues après avoir fait le zéro sur le blanc et de repérer ainsi l’inconnu qui rentre dans la gamme.

Q Pour le dosage de la SAB, faut-il utiliser la droite d’étalonnage corrigée ou celle non corrigée ? Il faut utiliser la droite corrigée de l’absorbance des cuves (décalage) car le dosage réalisé est quantitatif.

Q A quoi sert la droite d’étalonnage non corrigée ?

Elle permet de visualiser puis de quantifier l’incidence du décalage des cuves sur le dosage.


4. DESSALAGE de la SOLUTION de SAB 4.1. Détermination de la longueur d'onde d'absorbance maximale du bleu dextran

Q Quelle gamme de longueur d'onde faut-il balayer pour étudier le spectre d’absorbance du bleu dextran ? Le composé étant coloré, il faut balayer la plage du visible soit 400 à 800 nm.

Q Quelles cuves faut-il utiliser pour établir le spectre d’absorbance du bleu dextran ? Il faut utiliser des cuves qui n’absorbent pas dans la plage de longueur d’onde choisie.

Q Quelle est la composition du blanc de mesure pour le spectre d’absorbance du bleu dextran ? En l’absence d’information, il faut prendre de l’eau distillée.

Q Comment faire pour éviter qu'il y ait saturation du spectrophotomètre lors de l'établissement du spectre du bleu dextran ? Il faut réaliser des dilutions successives jusqu’à obtenir des absorbances inférieures à 1.

4.2. Détermination du volume mort de la colonne.

Q Pourquoi utilise-t-on le bleu dextran pour déterminer le volume mort de la colonne de gel ? Le bleu dextran est une molécule de haut poids moléculaire (2 000 000 Da). Elle est exclue du gel utilisé qui a un domaine de séparation de 1 000 à 5 000 Da donc sort avec le volume mort. De plus, sa couleur permet de suivre facilement son déplacement dans la colonne.


4.3. Dessalage de la SAB

Q Que cherche-t-on à faire au cours du dessalage de la solution de SAB ?

Le but est de séparer le sulfate d’ammonium (sel) de la SAB (protéine).

Q Quel autre procédé permet d'accéder au même résultat que le dessalage de la SAB ? La dialyse permet également de séparer des molécules de poids moléculaires suffisamment différents.

4.4. Analyse des éluats. 4.4.1. Détermination du volume mort de la colonne

Q Que doit contenir la cuve de référence pour les mesures des fractions collectées ?

De la phase mobile c'est-à-dire de l’azoture de sodium à 0,2 g.L-1.

Q Quelle est la signification physique de ce volume mort, Vm ?

Il s’agit du volume à l’extérieur des billes de dextrane (polymère de sucre) ou volume interstitiel.

4.4.2. Dessalage de la solution de SAB 4.4.2.1. Analyse spectrophotométrique

Q Quelle est la composition du blanc de mesure nécessaire pour établir le graphe de la variation de l'absorbance de la SAB en fonction du volume d'élution ? Il faut utiliser l’éluant soit 2 mL d’azoture de sodium à 0,2 g.L-1, éventuellement diluée au demi comme les éluats.

Q Soit Vd, le volume d'élution recueilli avant le dépôt de la SAB. Établir le volume d'élution attendu, Ve, pour la SAB. Ve = Vd + Vm car la SAB est exclue du gel comme le bleu dextran.


4.4.2.1. Analyse visuelle

Q Quel est l'intérêt du test au chlorure de baryum ?

Ce test permet de détecter la présence de sulfate d’ammonium dans les éluats. En présence de chlorure de baryum et de sulfate d’ammonium, un précipité blanc de sulfate de baryum :

BaCl2 + SO4(NH4)2 ® BaSO4 (s) + 2 NH4Cl

Q Est-il possible d'apprécier le précipité formé à l'aide d'un spectrophotomètre ?

Non, car les particules en suspension diffuseraient la lumière et fausseraient ainsi la mesure. Il faudrait idéalement utiliser un turbidimètre ou un néphélomètre.

5. DÉTERMINATION des RENDEMENTS 5.1. Détermination du rendement de colonne, Rc

Q En pratique, que représente ce rendement de colonne ?

Il représente la quantité de matière recueillie par rapport à la quantité de matière déposée.

Q Que signifie un rendement de colonne, Rc, de 100 % ?

Cela signifie que l’on a récupéré tout ce qui a été déposé.

Q Que signifie un rendement de colonne, Rc, inférieur à 100 % ?

Cela signifie que de la SAB est restée dans la colonne (adsorption…).

Q Pourrait-on utiliser directement les concentrations pour calculer le rendement de colonne ? Expliquer. Non, car il y a dilution de l’échantillon lors de l’élution.


Q Expliquer comment on calcule la quantité de SAB dans une cuve (formules littérales). A l’aide des absorbances corrigées, on détermine grâce à la gamme d’étalonnage la concentration en SAB dans la cuve. Celle – ci correspond à la concentration dans le tube contenant l’éluat (sauf s’il y a eu des dilutions). On calcule la quantité de SAB par la relation : Qcuve = Ccuve * Vcuve.

5.2. Détermination du rendement de séparation, RS

Q En pratique, que représente ce rendement de séparation, Rs ?

Le rendement de séparation est un paramètre quantitatif indiquant la proportion de SAB purifiée c'est-à-dire dessalée.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS Rapport 3.1/11

Rapport TP n° 3 3. DOSAGE des PROTÉINES dans l'UV Rendre le spectre d'absorbance de la solution mère étalon de SAB, à coller ci-dessous :


Rendre le spectre de différence entre les deux cuves remplies de solvant, à coller ci-dessous :


Rendre les 3 spectres définitifs des solutions à 0,5 et 1,5 g.L-1 ainsi que celui de la dilution de l'inconnue qui rentre entre les deux solution étalons, à coller ci-dessous :


les graphes A = f(C) obtenus par report avant et après correction du décalage des cuves, à coller ci-dessous :


.

4. DESSALAGE de la SOLUTION de SAB 4.1 Détermination de la longueur d’onde d’absorbance maximale du bleu dextran. Rendre le spectre d’absorbance du bleu dextran, à coller ci-dessous :

Déterminer la concentration de la solution inconnue de SAB à partir des graphes :


4.4.1. Détermination du volume mort de la colonne

Rendre le graphe exploité de la variation de l'absorbance du bleu dextran et du SAB en fonction du volume d'élution (sur le même graphe), à coller ci-dessous :


4.4.4.2. Dessalage de la solution de SAB

4.4.2.1 Analyse spectrophotométrique

Justifier le choix de la longueur d’onde utilisée pour établir le graphe de la variation de l’absorbance de la SAB en fonction du volume d’élution :

Calculer le volume d’élution attendu de la SAB en expliquant votre raisonnement, et indiquer la valeur de ce volume qui est observé expérimentalement :

Comparer les volumes d’élution attendu et observé de la SAB. Critiquer les valeurs obtenues.

Justifier le choix de la longueur d’onde utilisée pour la détermination du volume mort. Déterminer le volume mort et expliquer votre raisonnement :


4.4.4.2.1. Analyse visuelle

4.4.4.2.1. Analyse visuelle Reporter sur le graphe de la variation d’absorbance de la SAB en fonction du volume d’élution un diagramme d’évolution du précipité en fonction du volume d’élution.

5. DÉTERMINATION des RENDEMENTS 5.1. Détermination du rendement de colonne, Rc

Le protocole de dessalage a été modifié par rapport à ce qui se fait classiquement. Il est d’usage de faire un dépôt d’un mélange de la solution à dessaler et de bleu dextran. Qu’aurait-on observé en opérant de la sorte ?

Interpréter le graphe obtenu de la variation d’absorbance de la SAB et de l’évolution du précipité en fonction du volume d’élution. Conclure sur le dessalage.

Expliquer le raisonnement utilisé pour calculer la concentration en SAB dans les cuves et la quantité de SAB dans les cuves.


Remplir le tableau ci-après. N° du tube Volume d’élution (mL)

Absorbance à nm

[SAB] dans la cuve (mg/mL)

Quantité de SAB dans la cuve (mg)

N° du tube Volume d’élution (mL)

Absorbance à nm




Absorbance à nm



Déterminer le rendement de colonne Rc :


5.2. Détermination du rendement de séparation, RS N° du tube Volume d’élution (mL)

Absorbance à nm




Absorbance à nm




Absorbance à nm



Déterminer le rendement de séparation Rs :


5.3. Conclusions sur les calculs des rendements

6. CONCLUSION GÉNÉRALE

Comparer les valeurs de rendement de colonne et de séparation déterminées puis conclure :

Conclure sur l’ensemble des manipulations réalisées :

Activité technologique en analyse biochimique N°3

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