Mesure de l’activité enzymatique

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dans cette section, nous traiterons des aspects plus pratiques

de la mesurede l’activité

d’une enzyme

A. Principes de base-

l’activité

enzymatique est influencée à

la fois par des propriétés spécifiques àl’enzyme

(concentrations des substrats, activateurs, et inhibiteurs) et par des effets non spécifiques,

soit: des sels et tampons, pH, force ionique, température, et dans certain cas d’autres protéines

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typiquement, les conditions sont arrangées pour que l’enzyme ait une activité-

maximale

(Vmax

)

A.1 Concentration de substrat, activateurs, inhibiteurs.

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de règle générale, la mesure de l’activité

d’une enzyme demande des concentrations élevées de substrat qui sont parfois difficiles à

atteindre

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si l’enzyme obéit à

la cinétique Michaelis-Menten, une concentration de substrat dépassant 10 X le Km

doit être utilisée (Figure 1A)

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à

cette concentration de substrat, la vitesse mesurée représente 91% de la vitesse à

concentration infinie; des complications apparaissent si une concentration faible de substrat est utilisée (Figure 1B)

Effet de la consommation de substrat sur l’activité

enzymatique: (a) relation entre la vitesse et la

concentration de substrat

; (b) vitesse observée en fonction du substrat transformé

en produit, lorsque [substrat] = 10 Km (ligne solide) et [substrat] = 2 Km (ligne pointillée)

Temps[Substrat]

A B

Figure 1

[Produit]

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considérant que toutes les déterminations de l’activité

prennent un certain temps àêtre complétées, il est important que la vitesse soit linéaire pendant la période d’incubation utilisée

pour détecter convenablement la formation du produit de la réaction

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s’il y a accumulation du produit, la vitesse de la réaction peut être compromise par la réaction de retour

(retro-inhibition).

Plusieurs stratégies peuvent être utilisées, qui incluent :

1.

mesurer la réaction enzymatique pour une courte durée afin de minimiser l’accumulation du produit

2.

l’utilisation de hautes concentrations de substrat,

3.

des pH non physiologiques (s’il s’agit d’un proton) pour enlever le proton et déplacer la réaction dans la direction de produit,

4.

l’utilisation de méthodes très sensibles pour détecter le produit afin de minimiser sa concentration

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l’inhibition par le substrat à

des hautes concentrations peut aussi être due àla formation d’interactions non appropriées au site actif et qui mènent à

l’inhibition de l’activité

enzymatique

A.2 Effets du pH, de la Force Ionique et de la Température

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les valeurs de Vmax

et KM

sont influencées par le pH, la force ionique, et la température

le pH

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la valeur maximale de l’activité

de certaines enzymes peut être très loin du pH physiologique

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par exemple, la phosphatase alcaline possède une activité

maximale à

pH 10-11. Cependant, son KM

est plus bas à

pH 7 qu’à

pH 10-11; ceci est important afin de comparer les activités entre les essais avec des conditions différentes

le tampon/force ionique

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certains tampons peuvent agir comme inhibiteurs-

par exemple, le phosphate et certaines tampons anioniques, possédant des charges multiples tel que le citrate, compétitionnent

avec des substratspossédant des charges négatives pour lier le site actif

-

puisque les concentrations de tampon sont souvent élevées, entre 10 et 100mM, même une association faible par le tampon peut provoquer

une inhibition importante

-

des ions métalliques, essentiels pour l’activité, peuvent être complexés par des tampons tels que le citrate et l’imidazole, et compromettre l’activité

enzymatique

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la force ionique physiologique est entre 0.1 -

0.2M; les enzymes sont très souvent moins actives à

une force ionique inférieure par rapport à

la valeur physiologique

la température

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la température en soit n’est pas une propriété

essentielle mais elle intervient en ce qui concerne le temps d’incubation

-

la vitesse d’une réaction augmente en règle générale d’un facteur 2 pour chaque 10°C

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cependant, à

de hautes températures, même si la température augmente la vitesse d’une enzyme, l’enzyme peut être dénaturé

pendant la période d’incubation de l’essai

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plus la période d’incubation est courte, plus la température apparente de l’activitémaximale peut être élevée

puisqu’il y a moins de temps pour que l’enzyme dénature

-

la température de référence et celle choisie est très souvent est 25°C mais la température physiologique 37°C est fréquemment utilisée

A.3 Mesure de l’activité enzymatique par méthodes discontinues

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la mesure de l’activité

d’une enzyme dépend d’une méthode qui détermine la quantité

de produit généré

durant la réaction;

-

ceci peut impliquer la séparation du produit et du substrat après la réactions’il est impossible de doser le produit en présence du substrat

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il y a deux façons de mesurer l’activité

enzymatique

:

1) par des méthodes discontinues

(flot arrêté)2) par des méthodes continues

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les méthodes discontinues possèdent l’avantage qu’elles peuvent s’appliquer àn’importe quel système enzymatique

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avec une méthode discontinue, l’enzyme est incubé

avec ses substrats pendant une certaine période de temps et la réaction est ensuite arrêtée.

-

le produit est dosé

et son évolution est assumée linéaire pendant la période de l’incubation

ProduitVraie vitesse initiale à l’état stationnaire

Vitesse mesurée

Arrêt de la réaction

enzymatique

Temps

-

une des premières choses à

vérifier est l’évolution linéaire de la réaction->une seule donnée peut sous-estimer la vitesse initiale dû

à

des tempsd’incubation trop longs

-

également, un délai dans la réaction peut sous-estimer la vitesse à

partir d’unseul point

- il est essentiel de faire plusieurs incubations à

des temps différents afin de vérifiersi la réaction est linéaire

-

ceci est très important dans le cas d’

extraits à

partir d’une lyse cellulaire à

causede la possibilité

de réactions secondaires-

par exemple dans un extrait contenant l’enzyme subséquent dans une voie métabolique, une autre enzyme consume le produit qu’on veut mesurer

A.3.1 Conditions d’incubation.

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il n’y a pas des contraintes véritables en ce qui concerne des conditions d’incubation

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l’échantillon contenant l’enzyme est ajusté

à

temps zéro et rapidement mélangé; la réaction est incubée pendant des temps fixe et ensuite arrêtée.

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la réaction est arrêtée par une méthode qui provoque la dénaturation instantanée de l’enzyme

ou déplace l’équilibre de la réaction afin que l’enzyme ne soit plus active

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les méthodes souvent utilisées sont la précipitation

par acide trichloracétique ou perchlorique ou par dénaturation thermique

de l’enzyme

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on peut également utiliser le SDS pour dénaturer l’enzyme

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la réaction peut être arrêtée également par des méthodes non dénaturantes

qui inactivent l’enzyme

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i.e. changement de pH, ajout d’EDTA si des ions métalliques sont essentiels, dilution avec un substrat non-radioactif si un produit marqué

par un isotope radioactif est mesuré

A.3.2 Mesure du produit.

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la mesure du produit par des méthodes enzymatiques est très souvent employée

•

plusieurs produits de réactions enzymatiques peuvent être difficile à

détecter

-

une

approche

utilisée

pour les détecter

est

de convertir le produit directement ou indirectement en un autre produit qui lui est plus facile à

détecter

-

les techniques de détection utilisées le plus fréquemment sont la spectrophotométrie

ou la fluorométrie

Figure montrant le principe de la spectrophotométrie

- -

le but de ces méthodes est que la détection du produit final dépend de la production d’un chromatophore ou fluorophore

important et qui est facile à

détecter.

- Les approches utilisées sont

:

(a) Spectre d’absorption du NADH, comparé avec celui du NAD+

(b) Spectre d’émission de fluorescence du NADH, avec excitation à 365 nm

1) la détection directe un des produits de la réaction enzymatique absorbe la lumière, par exemple, la formation de NADH par réduction de NAD+

(le NADH absorbe la lumière à

340 nm et émet de la fluorescence à

450 nm)

2) détection indirecte ajoute une enzyme qui utilise le produit de la réaction pour former du NADH par couplage

avec une autre réaction.

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méthode par essais couplés

P r oduit P

Temps

Temps

Échantillon pris pour mesurer [P]

Enzymes couplées

Réaction observée

Première incubation

Deuxième incubation

Principe de mesure du produit par essai couplé

Fo rmation de R

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pour cette approche, il est essentiel que la réaction couplée détecte de façon stœchiométrique la formation du produit original

(une molécule de P produit une molécule de R)

Détermination enzymatique du glucose

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la formation d’un produit possédant un chromatophore représente une autre approche; par exemple, la formation de nitrophénolate

qui absorbe à

400 nm.

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des techniques comme la chromatographie

peuvent être utilisées afin de séparer les réactants (substrats et produits) avant qu’ils soient dosés.

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la figure suivante montre l’utilisation d’un essai couplé

afin de déterminer la concentration de glucose sanguin

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les enzymes utilisés sont la glucose oxydase (enzyme P) et la peroxydase (enzyme Q) qui donne lieu à

un produit coloré

vert détecté

par spectrophotométrie

A.4 Mesure de l’activité enzymatique par méthodes continues

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les méthodes continues impliquent que le progrès de la réaction soit observépendant toute la réaction et généralement de façon instantanée

- il y a un nombre important d’enzymes dont l’activité

peut être suivie directement grâce à

la différence en absorbance ou fluorescence entre le produit et le substrat

Détermination de l’activité de la lactate-déshydrogénase (LDH) par spectrophotométrie

lactate -----→ pyruvateLDH

NAD NADH

(ncat= nombred’unité cata-lytique)

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les catégories d’enzymes dont ont peut mesurer l’activité

en méthode continue sont: -

les déshydrogénases

qui utilisent NAD ou NADP, -

les hydrolases

qui peuvent utiliser des substrats synthétiques qui libèrent des produits colorés ou fluorescents

-

polymères endohydrolases

qui par leur activité

réduisent la viscosité

d’un polymère

A.4.1 Méthodes couplés.

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le principe de la méthode couplée est comme celui de l’essai couplé

où

le produit qui ne peut pas être observé

directement est transformé

chimiquement ou enzymatiquement

en un composé

qui peut être observé

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mais en méthode continue, les réactants utilisés doivent fonctionner sous les conditions de la réaction enzymatique à

mesurer

-

dans la mesure de la vitesse de la réaction, la vitesse de transformation du produit par le système d’enzyme couplé

ajouté

doit être suffisante afin de suivre quantitativement la formation du produit

-

une réponse linéaire par le système d’enzyme couplé

assure le couplage quantitatif avec la formation du produit de l’enzyme d’intérêt

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réponse linéaire veut dire que l’activité

mesurée par le système coupléaugmente de façon proportionnelle avec la quantité

d’enzyme utilisé

dans l’essai