Biochimie structurale et régulation enzymatique

BIOCHIMIE STRUCTURALE ET REGULATION ENZYMATIQUE

Introduction

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques très importantes puisqu’elles sont

présentes dans la majorité des réactions métaboliques. En effet, elles ont pour rôle

principal d’augmenter la vitesse de celle-ci. De plus ce sont les meilleurs

catalyseurs existant à ce jour.

Biochimie structurale et régulation enzymatique

Page 1

REGULAT ION ENZYMAT IQUE

I. Buts et moyens de l’enzymologie

Connaître la séquence d’étape élémentaires impliquées dans le processus catalytique

(nombre de complexes intermédiaires, ordre d’entrée des substrats, ordre de sortie des

produits)

Déterminer les vitesses de chaque étape élémentaire

Identifier les structures de chaque complexe intermédiaire.

Moyens mis à disposition de l’enzymologiste pour ce faire :

Études cinétiques.

Détection et isolement d’intermédiaires.

Cristallographie à rayon X ou RMN

Modification des enzymes (mutagénèse ou juste modification chimique).

II. Facteurs responsables de l’efficacité enzymatique

A. Formation du complexe de Michaelis

Théorie de l’état de transition mis en évidence en 1935 par Eyring.

Prenons comme support une réaction : 𝐴+𝐵→𝐶+𝐷

On remarque que pour activer la réaction il faut fournir une certaine énergie (énergie d’activation)

qui va permettre aux réactifs de passer à un état intermédiaire (complexe d’activité). Cette énergie

est principalement sous forme d’agitation thermique.


Page 2

En effet, pour qu’une réaction chimique ait

lieu spontanément, nous savons qu’il est

nécessaire que la différence entre les niveaux

d’énergie des réactifs et produits doit être

négative, incidemment que la réaction puisse

libérer de l’énergie. On parle de variation

d’énergie libre de Gibbs.

Il s’agit d’une barrière énergétique qui va

permettre de contrôler la vitesse (nombre de

molécule qui réagissent par unité de temps)

de la réaction : Si l’énergie d’activation

augmente, la vitesse globale de la réaction va

diminuer.

Il est difficile d’établir une vitesse en prenons en compte la vitesse de chaque molécule mais on peut

faire une moyenne qui va se traduire par une température.

Il est évident que les molécules qui vont le plus vite sont les plus susceptibles à donner assez

d’énergie pour activer la réaction. Néanmoins si la barrière énergétique est trop grande la partie

infime de molécule rapide ne suffit plus (il y a trop peu de molécules).

Quand toute l’énergie d’activation est absorbée, la molécule de substrat est dans l’état de transition

(les angles et les longueurs des liaisons chimiques du substrat sont distordues). C’est l’état le plus

instable. La réaction évolue spontanément vers un état énergétique plus faible, la formation du

produit.

Les enzymes et les systèmes biologiques fonctionnent différemment en permettant à une réaction

d’emprunter un chemin énergétique différent, abaissant directement la barrière énergétique. C’est

le principe de réaction catalysée. De cette manière, une enzyme va baisser cette énergie d’activation

en stabilisant l’état de transition (qui est le plus énergétique).

Pour étudier l’évolution d’une réaction, on utilise l’équation de Michaelis et sa représentation

hyperbolique ou en double inverse.

kcat : la constante de capacité de catalyse de l’enzyme considérée (représente l’efficacité de

l’enzyme)

[Et] : l’enzyme total

Vi : la vitesse initiale

Km : constante de Michaelis

[S] : concentration de substrat


Page 3

1. Représentation et interprétation graphique

Pour déterminer les constantes 𝐾𝑚 et 𝑉𝑚𝑎𝑥, il faut

faire une étude cinétique.

Une première méthode consiste à tracer le

graphique représentant les Vi en fonction de la

concentration en substrat utilisé. On remarque que

plus on rajoute de substrat plus la vitesse augmente

jusqu’à un seuil maximum.

Cela nous informe que 𝐾𝑚 devient négligeable à [S]

tendant vers infinie donc :

𝑉𝑖 =𝑘𝑐𝑎𝑡[𝐸𝑡][𝑆]

[𝑆]

Ce qui nous donne la valeur de 𝑉𝑚𝑎𝑥 : 𝑉𝑚𝑎𝑥=𝑘cat[𝐸t]

Ainsi à 𝑉𝑚𝑎𝑥, [ES] est égale à [Et] car toute l’enzyme [E] est sous forme [ES], on appelle cette

condition la saturation.

Il est facile de déterminer 𝑉𝑚𝑎𝑥 graphiquement.

Cela va nous permettre de nous donner l’efficacité de l’enzyme, si 𝑘cat est grand alors l’enzyme est

très efficace

Ainsi, à 𝑲𝒎 petit, [ES] est grand donc il y a une haute affinité de [E] pour [S] et à 𝑲𝒎 grand, [ES] est

petit donc [E] grand, il y a une faible affinité.

Pour améliorer la précision de la détermination graphique de ces deux constantes, il existe des

représentations graphiques qui linéarisent les résultats, permettant des extrapolations plus précises.

On utilise alors la représentation en double inverse (donnant une équation de droite 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏).

𝑦 =1

𝑉𝑖 𝑎 =

𝐾𝑚

𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑥 =

1

[𝑆] 𝑏 =

1

𝑉𝑚𝑎𝑥

Ainsi 𝑎 =𝐾𝑚

𝑉𝑚𝑎𝑥 correspond à la pente de la

droite et 𝑏 =1

𝑉𝑚𝑎𝑥 à l’ordonnée à l’origine

Par ailleurs pour une valeur de 𝑦 = 0, on constate que 𝑥 = −1

𝐾𝑚


Page 4

B. Effet de proximité et d’orientation

La vitesse de réaction dépend de la distance

séparant les substrats ((plus ils sont proches,

plus la vitesse est importante) et de

l’orientation de ceux-ci.

On stabilise les substrats (rapprochement et

orientation) et cela influe sur la vitesse de

réaction.

Si on regarde le schéma, par ordre croissant

on retrouve : substrats libres (1), substrats liés

(2, 3, 4), substrats liés avec double liaison (5)

et cycle (6).

C. Catalyse générale acide-base

Mécanisme courant en enzymologie (liaison peptidique, phosphorylation, etc)

Exemple : ribonucléase catalysant la dégradation de l’ARN (coupent l’ARN en fragment au niveau du

phosphate).

Une catalyse acide-base va jouer sur les protons de l’ARN (des acides aminés sont dans le site

catalytique et sont en charge de l’interaction avec l’ARN). Donc l’accélération de la réaction résulte

d’un transfert de proton (le proton vient de l’acide et est récupéré par la base).

Ce proton peut provenir d’un noyau imidazole (histidine) par exemple. Ces enzymes dépendent donc

beaucoup du pH du milieu.

Une base peut également accélérer une réaction.


Page 5

Selon la différence de protonation des acides aminés, une cascade de réactions aboutit à un état de

transition (dans l’exemple de la ribonucléase il s’agit du phosphore pentagonal) qui suite à une

hydrolyse, sera clivé par attaque acide-base.

Groupements fonctionnels des protéines pouvant agir en tant que catalyseur acide/base :

▪ Imidazole de l’histidine

▪ Alpha-aminé

▪ Alpha-carboxylique

▪ Thiol de Cys

▪ Carboxylique

D. Contraintes et distorsion du substrat

Exemple : lysozyme (catalyse l’hydrolyse des sucres)

On va tordre le substrat à l’aide de l’enzyme pour faciliter

l’hydrolyse entre deux sucres en jouant sur la conformation des

sucres et leur stabilité (chaise/demi-chaise).

Sous forme de chaise, réaction relativement lente

Sous forme de demi-chaise, bonne orientation pour

accélérer la réaction

L’enzyme va forcer le substrat à adopter la conformation demi-

chaise (plus instable, thermodynamiquement coûteuse) pour favoriser la formation de l’état de

transition (dans ce cas-ci, l’ion carbonium).


Page 6

E. Changement d’environnement (en termes de polarité)

Exemple : carboxypeptidase A

Elle agira du côté C-Term en ne reconnaissant non pas un résidu, mais un groupement particulier

carboxyle, et catalysant le clivage de la liaison peptidique en direction N-Term. Une nouvelle

extrémité C-Term sera donc mise à disposition après libération d’un acide aminé, on parle alors

d’enzymes processives.

En effet, on a une attaque d’un atome par un acide aminé polaire induisant le changement de

l’environnement de l’atome générant la stabilisation de l’état de transition via des ions Zn2+ puis

hydrolyse et on obtient le produit.

On constate un changement de position des acides aminés en fonction de la polarité de

l’environnement.

F. Créer un intermédiaire covalent

Exemple : phosphatases, protéases, enzymes à phosphate de pyridoxal (20% des enzymes).

ES’ correspond à l’intermédiaire covalent créé (l’enzyme fait un lien covalent avec une partie du

substrat).


Page 7

L’intérêt d’une telle formation est de pouvoir réduire

radicalement l’énergie d’activation de la réaction, grâce

à une double stabilisation de la barrière énergétique via

le complexe ES puis ES’ (elle interagit de deux manières

avec le substrat, un complexe michaelien et un complexe

covalent).

On a deux petites barrières énergétiques au lieu d’une

seule plus importante. Ainsi on peut surmonter les

barrières qui seraient ou sinon trop importantes.

Exemple d’enzymes formant des intermédiaires covalents :

▪ Phosphatase : formation d’un intermédiaire (transfert du phosphate sur l’enzyme),

on libère le premier produit, récupération du phosphate et libération de l’enzyme.

▪ Les protéases à sérine (endopeptidases : chymotrypsine/trypsine) : toujours le

même site actif composé d’une triade catalytique. En effet, la sérine 195 (sert

d’intermédiaire covalent) est l’acide aminé qui réagit avec le substrat, alors que

l’histidine 57 (catalyseur acide base) et l’acide aspartique 102 contribuent à rendre

la sérine particulièrement réactive (souvent sous la forme O-).

▪ Les enzymes à phosphate de pyridoxal : Formation d’une base de Schiff entre

l’acide aminé donneur et le phosphate de pyridoxal (aldimine), puis on a le départ

du proton α de l’acide aminé suivi d’une stabilisation par résonnance résultant par

la formation de la cétimine et l’hydrolyse de la cétimine produit le phosphate de

pyridoxamine et un α-cétoacide. Lors de la dégradation des acides aminés, il est

nécessaire de séparer le groupement alpha aminé du squelette carboné. La

première étape de ce catabolisme est assurée par les réactions de transamination.

▪ Les enzymes intervenant dans le mécanisme d’ubiquitylation, nécessitant de l’ATP.


Page 8

Néanmoins est-ce-que ce système (à intermédiaires covalences) obéit à la loi de Michaëlis ?

Oui. On part de l’équation de départ :

▪ Expression de la vitesse : 𝑉𝑖 =𝑑𝑃1

𝑑𝑡= 𝑘2[𝐸𝑆] = 𝑘3

[𝐸𝑆’] =𝑑𝑃2

𝑑𝑡 (les deux produits

sont formés à la même vitesse)

▪ Équation de conservation de E : [𝐸0]𝑜𝑢[𝐸𝑡] = [𝐸] + [𝐸𝑆] + [𝐸𝑆’]

▪ Hypothèse de l’état stationnaire : [ES] et [ES’] restent constants (autant de formé

que de détruit).

𝑘1[𝐸][𝑆] = 𝑘−1[𝐸𝑆] + 𝑘2[𝐸𝑆] = ( 𝑘−1 + 𝑘2) [𝐸𝑆]

𝑘2[𝐸𝑆] = 𝑘3

[𝐸𝑆’]

𝐾𝑚 =[𝐸][𝑆]

[𝐸𝑆] 𝑑𝑜𝑛𝑐 𝐸 = 𝐾𝑚

[𝐸𝑆]

[𝑆]

On élimine [E] et [ES] en fonction de [ES’] et des constantes

[𝐸0] = 𝐾𝑚[𝐸𝑆]

[𝑆]+ [𝐸𝑆] +

𝑘2[𝐸𝑆]

𝑘3

[𝐸0] = [𝐸𝑆] (𝐾𝑚

[𝑆]+ 1 +

𝑘2

𝑘3)

[𝐸0] = [𝐸𝑆](𝑘3𝐾𝑚 + 𝑘3[𝑆] + 𝑘2[𝑆])

(𝑘3[𝑆])

[𝐸𝑆] =(𝑘3[𝐸0][𝑆])

(𝑘3𝐾𝑚 + (𝑘2 + 𝑘3)[𝑆])

𝑉𝑖 = 𝑘2[𝐸𝑆] =(𝑘2𝑘3[𝐸0][𝑆])

(𝑘3𝐾𝑚 + (𝑘2 + 𝑘3)[𝑆])

(𝑘2𝑘3)

(𝑘2 + 𝑘3)×

[𝐸0]

𝑘3𝐾𝑚𝑘2 + 𝑘3

=𝑉′𝑚[𝑆]

𝐾′𝑚 + [𝑆]

Sachant que 𝑉′𝑚 =(𝑘2𝑘3)

(𝑘2+𝑘3)[𝐸0] = 𝑘′𝑐𝑎𝑡[𝐸0] et 𝐾′𝑚 = 𝐾𝑚

𝑘3

𝑘2+𝑘3


Page 9

III. Enzymes à plusieurs substrats

Jusqu’à présent nous n’avons considéré que le cas des enzymes catalysant des réactions à 1 seul

substrat (ou 2 substrats l’un étant l’eau qui reste constant lors de la réaction).

La plupart des enzymes catalysent des réactions complexes avec le plus souvent 2 substrats et 1,2

voire 3 produits. Lorsqu’une réaction enzymatique implique deux substrats ou un substrat et un

coenzyme libre, les phases de la réaction enzymatique au niveau moléculaire se compliquent : on

parle de cinétique à deux substrats

Pour les enzymes à 2 substrats, il existe différents types de fixation :

Fixation aléatoire

Fixation ordonnée

Fixation ping-pong

La fixation aléatoire et ordonnée sont des réactions enzymatiques impliquant des complexes ternaires (complexe contenant l’enzyme et deux substrats). On parle de mécanisme séquentiel, la réaction enzymatique n'intervient qu'après formation d'un complexe entre l'enzyme et les deux substrats. La fixation des substrats peut-elle même être ordonnée (l'un des substrats se fixant nécessairement en premier lieu) ou se produire au hasard (l'un ou l'autre des substrats se fixant en premier, sa présence pouvant soit ne pas modifier, soit défavoriser la fixation de l'autre)


Page 10

A. Fixation aléatoire

Deux substrats, A et B, se fixent de

manière aléatoire sur l'enzyme libre

(c'est-à-dire qu'il n'y a pas de fixation

privilégiée de l'un ou l'autre des deux

substrats). L’enzymes reconnait n’importe

lequel des substrats en premier.

Puis elle a besoin d’être liée au deuxième

substrat pour fonctionner.

Deux chemins possibles selon quel substrat elle rencontre en premier.

Elle libère un ou plusieurs produits.

Le sens est unique pour la formation du produit : non favorable énergétiquement, on s’intéresse aux

vitesses initiales (pas encore de produit formé) donc pas de flèche retour.

B. Fixation ordonnée

Dans un tel système, l'ordre de

fixation est obligatoire : l’enzyme va

forcément lier A d’abord puis B. En

d'autres termes, le substrat B ne peut

se fixer qu'au complexe EA

Dans ces deux types de fixation (aléatoire et ordonnée) on aura toujours la formation d’un complexe

dit « ternaire » EAB.

Démonstration aléatoire et ordonnée :

KA et KB étant les constantes d'équilibres entre l'enzyme libre et les substrats.

𝐾𝐴 = ([𝐸][𝐴])

[𝐸𝐴] 𝑒𝑡 𝐾𝐵 =

([𝐸][𝐵])

[𝐸𝐵]

K’A et K’B sont les constantes de Mickaelis des substrats A et B, c'est à dire les [substrat] pour

lesquelles la vitesse (mesurée à concentration saturante de l'autre substrat) est égale à la moitié de

la vitesse maximale. Si l'on peut faire l'hypothèse du quasi-équilibre pour la fixation des substrats et

s'il n'existe qu'une seule étape cinétique pour la transformation de EAB en E + P + Q. Alors, K’A est

égale à la constante de dissociation de l'équilibre EAB en EB + A et K’B à celle de l'équilibre EAB en

EA + B.


Page 11

𝐾′𝐴 = ([𝐴][𝐸𝐵])

[𝐸𝐴𝐵] 𝑒𝑡 𝐾′𝐵 =

([𝐵][𝐸𝐴])

[𝐸𝐴𝐵]

𝐾𝐴 × 𝐾′𝐵 = 𝐾𝐵 × 𝐾′𝐴

Pour déterminer l’équation nous allons également utiliser :

[𝐸0] = [𝐸] + [𝐸𝐴] + [𝐸𝐵] + [𝐸𝐴𝐵]

𝑣 = 𝑘 (𝐸𝐴𝐵)

𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘 [𝐸0]

Il nous faut alors déterminer [E], [EA] et [EB] :

[𝐸𝐴] = 𝐾′𝐵

[𝐵] [𝐸𝐴𝐵]

[𝐸𝐵] = 𝐾′𝐴

[𝐴] [𝐸𝐴𝐵]

[𝐸] = ( 𝐾′𝐵 𝐾𝐴 )

( [𝐴][𝐵]) [𝐸𝐴𝐵]

On utilise par la suite l’équation de [E0] :

[𝐸0] = ( ( 𝐾′𝐵 𝐾𝐴 )

( [𝐴][𝐵]) [𝐸𝐴𝐵]) + (

𝐾′𝐵

[𝐵] [𝐸𝐴𝐵]) + (

𝐾′𝐴

[𝐴] [𝐸𝐴𝐵]) + [𝐸𝐴𝐵]

[𝐸0] = {1 + ( 𝐾′𝐵

[𝐵]) + (

𝐾𝐴′

[𝐴]) + (

( 𝐾′𝐵 𝐾𝐴 )

( [𝐴][𝐵]) )} (𝐸𝐴𝐵)

On remplace dans l’équation de la vitesse :

𝑣 = ( 𝑘 [𝐸0] )

{1 + ( 𝐾′𝐵 [𝐵]

) + (𝐾𝐴′[𝐴]

) + ( ( 𝐾′𝐵 𝐾𝐴 )

( [𝐴][𝐵]) ) }

𝑣 = 𝑘 [𝐸0] [𝐴][𝐵]

{[𝐴][𝐵] + [𝐵]𝐾′𝐴 + [𝐴]𝐾′𝐵 + 𝐾𝐴𝐾′𝐵 }

Il est assez simple de montrer alors l’allure michaelienne à A variable et B paramétrique (v=f(A) à B constant) :

Si on divise le numérateur et le dénominateur par [B] dans la formule ci-dessus, on obtient :

𝑣 =𝑘 [𝐸0] [𝐴]

{[𝐴] + 𝐾′𝐴 +[𝐴]𝐾′𝐵

[𝐵] +

𝐾𝐴𝐾′𝐵[𝐵]

}=

𝑘 [𝐸0] [𝐴]

{[𝐴] (𝐾′𝐵[𝐵]

+ 1) + 𝐾′𝐴 + 𝐾𝐴𝐾′𝐵

[𝐵] }


Page 12

Si on divise le numérateur et le dénominateur par

(𝐾′𝐵

[𝐵]+ 1) dans la formule ci-dessus, on obtient :

𝑣 =

𝑘 [𝐸0] 𝐾′𝐵[𝐵]

+ 1[𝐴]

{[𝐵]𝐾′𝐴 + 𝐾𝐴𝐾′𝐵

𝐾′𝐵 + [𝐵]+ [𝐴]}

=𝑉𝑚

𝐴[𝐴]

𝐾𝑚𝐴 + [𝐴]

Avec : 𝑉𝑚𝐴 =

𝑘 [𝐸0] 𝐾′𝐵

[𝐵]+1

et 𝐾𝑚𝐴 =

[𝐵]𝐾′𝐴+𝐾𝐴𝐾′𝐵

𝐾′𝐵+[𝐵]

Dans une expérience cinétique, la vitesse est mesurée à partir des concentrations de [A] différentes et en gardant [B] constante, ce processus est répété à d’autres valeurs de B afin de balayer une gamme de variation importante en 𝑣.

La pente (a=𝐾𝑚

𝐴

𝑉𝑚𝐴 ) et l’intercepté (b=

1

𝑉𝑚𝐴) sont ensuite retracé en fonction de

1

[𝐵] (représentation

secondaire) pour résoudre les paramètres cinétiques :


Page 13

A partir de ces représentations secondaires, il est possible de déterminer les paramètres cinétiques Vmax, KA, KB et K’A.

Cas particuliers :

▪ KA=K’A : liaison de A indépendante de la liaison de B. Cela signifie que la fixation

d'un substrat sur son site enzymatique ne modifie pas la fixation ultérieure de

l'autre substrat sur son site. Les sites sont indépendants.

▪ Lorsque KA ou KB est infini (très mauvaise affinité et donc l’enzyme n’est pas

capable de lier B) donc mécanisme séquentiel ordonné. Cela signifie que B ne peut

se fixer sur son site enzymatique que si A se trouve déjà fixé.

C. Mécanisme ping-pong

Si la réaction enzymatique ne nécessite pas la

formation d'un complexe ternaire, l'enzyme,

après avoir fixé un des substrats, le transforme et

libère le produit correspondant. L'enzyme

ensuite fixe l'autre substrat, le transforme et

libère le second produit. C'est le mécanisme

ping-pong qui se distingue des précédents par le

fait qu'il intervient, entre les étapes de fixation

des deux substrats, une étape irréversible en

absence des produits de la réaction.

L’enzyme va d’abord interagir avec un des substrats et former un complexe avec celui-ci, puis elle va

transformer ce substrat en un autre, et reformer un complexe avec ce nouveau substrat :

[𝐸0] = [𝐸] + [𝐸𝐴] + [𝐸′𝐵] + [𝐸′]

𝐾𝐴 = ([𝐸][𝐴])

[𝐸𝐴] 𝑒𝑡 𝐾𝐵 =

([𝐸′][𝐵])

[𝐸′𝐵]

[𝐸] = [𝐸𝐴]𝐾𝐴

[𝐴]𝑒𝑡 [𝐸′] =

[𝐸′𝐵]𝐾𝐵

[𝐵]


Page 14

𝑉𝑚 = 𝑘1 [𝐸𝐴]𝑚𝑎𝑥 = 𝑘2 [𝐸′𝐵]𝑚𝑎𝑥

La vitesse maximale est atteinte lorsque toute l'enzyme est complexée, soit :

[𝐸0] = [𝐸𝐴]𝑀𝑎𝑥 + [𝐸′𝐵]𝑀𝑎𝑥

[𝐸′𝐵] = 𝑘1 [𝐸𝐴]

𝑘2

𝑒𝑡 [𝐸′𝐵]𝑚𝑎𝑥 = 𝑘1 [𝐸𝐴]𝑚𝑎𝑥

𝑘2

[𝐸0] = [𝐸𝐴]𝑀𝑎𝑥 (1 +𝑘1

𝑘2

) = [𝐸𝐴]𝑀𝑎𝑥 (𝑘1 + 𝑘2

𝑘2

)

𝑉𝑚 = 𝑘1 [𝐸𝐴]max = 𝑘1[𝐸0]𝑘2

𝑘1 + 𝑘2

[𝐸0] = [𝐸𝐴] (1 +𝐾𝐴

[𝐴]) [𝐸] + [𝐸′𝐵] (1 +

𝐾𝐵

[𝐵])

𝑣𝑖 =𝑘1 [E0]

(1 +𝐾𝐴[𝐴]

) + ((1 +𝐾𝐵[𝐵]

)𝑘1 𝑘2

)

𝑣𝑖 =

𝑘1 𝑘2[E0]𝑘1 + 𝑘2

{[(𝑘1𝑘2

𝑘1 + 𝑘2

)] [(1 +𝐾𝐴[𝐴]

) + (1 +𝐾𝐵[𝐵]

)𝑘1 𝑘2

]}

𝑣𝑖 =𝑉𝑚

{(𝑘2

𝑘1 + 𝑘2

) (1 +𝐾𝐴[𝐴]

) + (𝑘2

𝑘1 + 𝑘2

) ((1 +𝐾𝐵[𝐵]

)𝑘1 𝑘2

)}

𝑣𝑖 =𝑉𝑚

{1 + (𝑘2

𝑘1 + 𝑘2

) (𝐾𝐴[𝐴]

) + (𝑘1

𝑘1 + 𝑘2

) (𝐾𝐵[𝐵]

)}

On peut simplifier cette équation par les termes suivant :

𝑉𝑚 =𝑘1 𝑘2[E0]

𝑘1 + 𝑘2

𝐾’𝐴 =𝑘2

𝑘1 + 𝑘2

𝐾𝐴

𝐾’𝐵 =𝑘1

𝑘1 + 𝑘2

𝐾𝐵

On obtient alors l’équation suivant :

𝑣𝑖 =𝑉𝑚

{1 + (𝐾′𝐴[𝐴]

) + (𝐾′𝐵[𝐵]

)}


Page 15

On fait comme les complexes ternaires v=f(A) à B constant donc on divise par [B] et par (𝐾′𝐵

[𝐵]+ 1)

Si on utilise le mécanisme ping pong : sur la représentation en double inverse, on aura d’abord une

représentation primaire avec des droites parallèles qui nous permettront de définir les constantes

(Km/Vm). La pente est indépendante de [B] et donc la représentation graphique en [B] différentes

donnes des lignes parallèles.

Les paramètres cinétiques : 𝑉𝑚, 𝐾’𝐴, 𝐾’𝐵 sont ensuite déterminés pour le mécanisme à partir de la

représentation secondaire.

Pour résumer ces différents mécanismes :

Mécanisme séquentiel :

▪ Aléatoire : indépendant (Ka=Ka’/Kb=Kb’) ou dépendant(Ka ≠ Ka’/Kb≠Kb’)

▪ Ordonné : Ka ou Kb =0, et du coup si Ka=0, Kb = infini (idem pour Ka si Kb=0).


Page 16

IV. Régulation enzymatique

Il existe beaucoup d’enzymes et de voies métaboliques, d’où le besoin de réguler l’activité des

enzymes pour coordonner les voies métaboliques et permettre une adaptation en temps réel. Il y a

deux grandes possibilités de régulation : soit par contrôle de la disponibilité en enzyme, soit par

contrôle de l’activité enzymatique.

A. Conversion zymogène

Certaines enzymes sont synthétisées sous la forme d’un précurseur inactif (aussi appelé proenzyme

ou zymogène). On va donc transformer l’enzyme pour la rendre active (Un clivage de certaines

liaisons peptidiques engendre ensuite une enzyme active).

Ce processus est surtout présent chez les enzymes utilisées par intermittence (protéases digestives,

facteurs de coagulation) qui doivent par exemple être activées dans un environnement particulier,

parfois différent de leur site de production.

Exemple : Activation simultanée de zymogènes pancréatiques au niveau du duodénum (segment

initial de l’intestin grêle) lors du processus de digestion : le chymotrypsinogène est complètement

inactif. C’est l’activation de la trypsine par une entéropepsidase (L'entéropepsidase est une enzyme

du duodénum qui initie l'activation en cascade des zymogènes, en activant le trypsinogène en

trypsine). La trypsine auto-catalyse ensuite son activation afin d'amplifier la réponse. Elle catalyse

aussi celle d’autres enzymes digestives.

B. Modifications covalentes

Certaines enzymes peuvent être régulées par phosphorylation (par une kinase) et

déphosphorylation (par une phosphatase).

C. Stimulations/Inhibitions par des protéines

Exemple : calmoduline.


Page 17

D. Interactions allostériques

On parle d’allostérie pour les enzymes ne répondant pas de manière Michaelienne. Elle sont plus

sensible à la concentration de substrat (pas forcément plus affines au substrat).

1. Monotonie des systèmes michaeliens

Pour tous les systèmes qui suivent la loi de Michaelis, il y a une contrainte, pour faire varier la vitesse

de la réaction on doit faire varier la concentration en substrat (on augmente d’un facteur 100 la

concentration en substrat pour augmenter d’un facteur 10 la vitesse de réaction).

Exemple : S’il y a un transporteur sensible à la concentration en sucre, à une concentration de

0.1Mm le transporteur est inactif, mais à 8.1mM le transporteur s’active (ce n’est pas très rentable).

Il existe des systèmes ne suivant pas la loi de Michaelis.

Ces systèmes sont caractérisés par des représentations

sigmoïdes sur graphique (La réactivité de l'enzyme est

assurée par une hausse sensible de l'activité pour une faible

variation de concentration en substrat) et non hyperboliques.

Ils dépendent de trois facteurs :

Vm

Km

nH (le nombre de Hill, permettant de mesurer le degré de coopérativité et donc de

quantifier l’allostérie).

2. Nombre de Hill

Pour avoir une sigmoïde, il faut que l’affinité change, qu’elle s’améliore. Une enzyme allostérique

contient plusieurs sous-unités : au moins 2 sites. Les enzymes allostériques ont une structure

quaternaire oligomérique. Ces enzymes sont sous la dépendance d'effecteurs se fixant au niveau

d'un site allostérique. Il y a en général un site actif et un site allostérique par protomère.

On parle de coopérativité lorsque la liaison à un substrat va permettre de renforcer la fixation au

second (pour des enzymes liant plusieurs substrats).


Page 18

La fixation d'une molécule de substrat sur un protomère fait passer celui-ci d’un état à un autre :

transition allostérique. Cette transition se répercute de proche en proche aux autres protomères.

L’enzyme a d’abord une mauvaise affinité pour le substrat (Km élevé), mauvaise réaction (il faut

beaucoup de substrats). Mais une fois que le substrat est entré, le site actif change de conformation.

Ce changement de conformation est transmis à la deuxième sous unité. Ainsi la liaison du substrat

sur la deuxième sous-unité sera donc bien meilleure.

Le nombre de Hill permet de quantifier l’allostérie mais il ne permet pas de comprendre ce qui se

passe en réalité.

Pour comprendre le fonctionnement de l’allostérie dans la régulation enzymatique,

on a mis en place des modèles allostériques. La transition se répercute de proche en

proche aux autres protomères selon 2 modèles :

Le modèle séquentiel (Koshland) : Le substrat se fixe sur un protomère, ce

qui entraine le changement de sa conformation et facilite le changement de

conformation des autres protomères.

Le modèle concerté (Monod) : Le substrat se fixe sur un protomère, ce qui

entraine un changement de conformation de l’ensemble des protomères

simultanément.

L’allostérie peut se résumer par la régulation de l’activité d’une enzyme fonction de la capacité à

fixer un substrat. Celle-ci peut être améliorée (via coopérativité) ou inhibée.

L’hemoglobine, myoglobine présentent des sites de fixations multiples favorisant l’allostérie et donc

la vitesse de réaction.

Biochimie structurale et régulation enzymatique

Documents

Transcript of Biochimie structurale et régulation enzymatique