digital.library.adelaide.edu.au › dspace › bit... · Chapter 1 Introduction . Figure 1.1...

185

Transcript of digital.library.adelaide.edu.au › dspace › bit... · Chapter 1 Introduction . Figure 1.1...

� � �

���������� �������������� ����������

�������������������������������������

���������������������

���������� ��� ����� ��������������� � ���

���� ������������������������� � ���

��������������!�������� ���"�� �������

#�������������$��� ���%�$��� ����

$���� �� ��

&�������!�������������#�������������$��� ��������������������������'����������

���� ����������������������������������������

���!���())*�

+&��� ,���������������������-���� ������!� ������������� .���������������

����� �������-��� ������� .������� ����������-��� ��/�+�

0 ������� �����

+�������1�2�%�� �%�3� ���������� ���������������/�3�.��-������ ������ ���

������� ��-��4��-��./+�

&�� ��$/�5�������

����������������������!��������������!� ������������������������� ���� ���

���.����.��-��./��

&�� ��$/�5�������

�������� � ���

��������

������ �%�������� �����-������ �������������������� ���� �����!�� ����� �����������

���������� �������/� � $ ������ ������������ �������� ����� ������� �� �� �� �������������� 67 8� �����

�������� ���� �� ������ � ��� ���%� �� ��� ���� ���� ���� ����� ��� ���� �/� � ���� �������%�

������ ���� ��� �� ���'�� +������9� � ���������� � ���� ������������ �� ���� � ������� ��� ����� ���

����������6 $8����� $������:���.������� ���������������+������9������ �!����������������� �

� ����-� ������������������ ���%�� ��� ����������� ���/��

����������� ��� ��� 63;8������� ��� ��������������� ! �-���������������� ������������ 6����8�����

� ����� ��� �������������������� ����������������� ���� ��� ����������/� ��������� �� ��� �����

��� �� ������ ��� ���� � ����� ���� �� ����� ���� ��� -���� ��� �������� ���� �� !���� �� ���� �� �� ��

�������� ����� ��� ������ � ��/� ���� ��� �������� ����� 3;�� ����� � ��� ��-��� ��������� ���

����� ���� ��� ��� ������� �������� ��%� ��.��������� ��� � ������ ������������ ��� ���� �������

���� ���������� ������� �� � !�� ������� �� �����<��� ���������� ���� �!����� �� ���� ������ ��/�

� � � �� �� ���� �������� ��� -������ ���� ��� �� ����� ��� ��� ����� ���� �� ��������� ��� �� � ���%�

��-����%� �����������6�8� �� ����-����� ��' ��� �������-� ���������!����� �����!�� ���� � � ��

�� ��������������� ���� ���/�

&�� !� ��� ���� ��� ��� �������� !�� -����� � � � �� �� ���� ��� ��.��� �� ��� ����� � ����� ��� ���� ��

�� �� ��%� 3� ��� ��.� ���� ��� ��� ��� �� ��� ���� �� ���� ������� ��� ��� � � ��� �� ��� ��� �����

�� �� ��� �� ���������� �� 3;�/� &��� ���� �������!��� ���� ��� ���� �� �����%� ����%� -��� ����

������� ����3;������������/�3���������%��-��.����������� ���������������=�;�����������$����>%�

-��������������������������� ����������� ���������� ����������� �������%�-��������� �����>):�����

�� ���� ��� 3;��-��������� ������-����5������<���� /�&����-�.� ��� ���� ����� ������-� ������������

���� 3;������������� �� ��� ������������������������� ���� � �������/�� �����%� �����!���������

$����>�����;�������� �����������������������!��� �������������� ��������/��

$���� ��� ����������� -���� ����� ������������� ���������%� ���� � ������� ��� ���� ���� ����� ��� �������

�� ������ ��� �.��-�/� 3� ��������� ���� ��������� ��� ��������� ����� ����������!������ � ����� ���

��������!������������������������ ���������� ��!�������� ��������������������������� �������/�

���� ��� ����������� ��� ���� ������� ������!������ � ����� ��� �������� ��� 3;�� -��� �!�����/� ��� �����

�������� � ����

�� ��� ��������� -��� ����!��� ��� ���� ����� �� ����� ��� ���� ������ ���� ���� ����������� -���

���� ��������������/������������3;�������-������������������������' ���!����������� �����

������������������������������������������������������������/�3�������!�������!���������� ������

����������3;������������ ������������������������������������� ���������������������! �������-����

������������������������� ��������������������������3;���������������������������� � ����������

��������� ���������� ����������������/� �$������������������������������ ���������� ������� �� ����

�����������������!�����!������� ���3;�����!����� ������ ����� ����������� ����������������������

��� ���� ���������������� ����� �������� � ����� ��� ����������� ���� ����������� � !������/� 3���������

������������ ��������������������� ������ �������������������� 3;�������������� ���������������������!��

-�����3;�����������������������������������������������/�

�&�� ��������� ������ ��������� ����� ���� ������������ 3;�� 3���������� ���!�����������������������

����� ���� ������������������������� ��� �����������������/� �&���������������;������������� 3;��

���������� ����� ���������� ������� ����� ������� ������������ -��� ������ ��� ��������%� !�� ���-����

����������������������������-������������������3;���������/����������������������.�������

!��������������������������������3���������������������������� ������������������������

!�!�� ������ ������� ���� ��������� �����/� &���� -�.� ���� ��������� ��� ������������� ��� �������

�������������-�������������������������3;���������������������������������������������/�

�������� � �����

���������

&����-�.��������������������-���������!���������������������-������������������������������

������������������������ ������� ���������������%� ��� ����!��������� .��-����������!�����%�������������

�������������������!���������-������!��������������%��������-��������������������!��������

�����������/�

3���������������������������������������-���������������������#���������7�!��%�!���������������!���

������������������������%���!,�������������������������������������$���>?@*/�

&�����������.��-��������������������������!�������-�.������������-������������������6����������!���-8�

�������-����������������������6�8����������-�.�/�

��������������������

����!��())*�

�������� ��%� 7�����%� A�-�� �%� B����%� ��!.�� �7%� �������� �7� 6())C8� $������ �������������� ����

������:����������������������������������������������������/� ��������((%�(*D(:E)/�

�������� � ����

��"�#�����������

3� ���������� ��� ����.������������%������������������������!�������!.�� ��� ����������� ����

��������������������������-�����������������������/�$���%��������������������%������������

����������������������������������'��������-������������������������������������������������

������������������������������������/��

&���.��������������������������������������������!������������"������������������������������������

������������ ��������������������%�������������/�&�����������!���������� ��!%�������������������

������������ ����� ����������� ������� ���������%� ����.����1�$��� ���7��%����������%��������� ������ ���

��������������������%�������������!������������!����������������%�3����F��.��-���-�3�-��������������

��������������������-����������/��

&����� �������� -��� ������������ ��������� -���� ����� �������� ��� ���� 0�������� ������ ���� ��������

���������������/� 3� -����� ��.�� ��� ��.��-������ ���������� ������� ��� ���� $������� ��� ������ ��������%�

#��������� ��� $�������%� ���� ����������� ��� �!�������� ���� "����������� ���� ���� �������� ������ ���

������������ ������ ��� ������������� ���� �������� ������ ������������� ���� �� ������������

����������/�

&���.����� ����� ����������� ������ ��������������������������%� ����������� ��� ���� ����� >(������/�

7������ 3�-���� ��� ����.��� �����G%�������-�2����� ��� -��� 3��� ����!���� �����������������������%�

����%��������������������/�&���.���������������1�

�������� � ���

%�&�������������������� ���� �����

>/ ����������%�7�����%�A�-�� �%�B����%���!.���7%����������7�6())C8�$��������������������

���� ������:������� ������������ ������ ��� �������������� ��� �������/� �� ������ ((%�

(*D(:E)/�

(/ �������� ��%� A�-�� �%� &������� H"%� ��!.�� �7%� �������� �7/� ������� ������� ������

$��������������������������������������������/����'�'��������

�������� � ����

�&������������������� ���� �����

())*�

>/ �������� +�%� 7���� �%� A�-�� �%� B��� �%� &������� H"%� ��!.�� �7� ���� �������� �7/�

��� ������� ������������ � ��� ��� �������� ������ ������ ��� �� �������� � ��� ������� ��

$����������������� ���������������A������%�0�����������������%������������0�-�I������%�

�����!��())C/��

(/ ������������7�����%�A�-�� �%�B����%�&�������H"%����!.���7��������������7/��

������ �������� � ��� ��� �������� ������ ������� ������ ��� �� � ����� �������� � ���

���������������������������������())C������������������������������������%�3������������

���������%�H���%�&����%�#�$/�

J� ����������%�7�����%�A�-�� �%�B����%�&�������H"%���!.���7��������������7/��

�� ��� ��� ������������ � ��� ��� �������� ������ ������ ��� �� �������� � ��� ��������

$�����������������������������������%��$����������%�$���������$%�H����())C/�

!!"�

D/ �������� �7%� A�-�� �%�����������%� �������������� ��!.�� �7/��������$����������������

����7��������������������������������5�������������!��������������$����>/�A�������

��������������������())@�

E/ �������������%�2����2�%�����������K����������7/�����#$������� �����%���� � �����

���������� ������ ������� � � �� ������� ��� �� ��� ������ $��������� ������ ���� ��������

�������� �������%� ������ A������� �������� ��� $�������� ���� 0�-� I������%� ���!����%�

0���!��())@/�

@/ �������������%�2������%�����������K����������7/�����#$������� �����%���� � �����

���������������� ������� �� �������������� ���������&������������� 3������������A�����

������������������������%�$����3�����%�����!��())@/�

C/ 2������%����������%����������7�K��������������/�����#$������� �����%���� � �����

���������� ������ ������� � '�� �� ��� ������ $��������� �������� ��� �������� �������%� �$�

�������%�$�������%�H����())@/�

�� �� � �����

!!(�

*/ �������� ��%� B��� �L� ���� �������� �7� ������ ������ �������� � ��� �������� ������

�������������) ��* �������������� ��$�����������������������������������%��$��������%�

$�������%�H����())E/�

?/ �������� ��%� B��� �L� ���� �������� �7� ������ ������ �������� � ��� �������� ������

�������������) ��* �������������� ��$��������������������������������A������%�0��������

���������%������2$%������!��())E/�

�� �� � ������

�&�������������

$!����� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// �

����������/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ���

$�.��-���������////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ��

��!������������������������������� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////�

$!���������������������������� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ��

&�!�������������� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ����

7�������$����� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ����

7�������&�!��� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ���

$!!��������� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// �����

�+�,�-��. �/����0����/,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.

>/> A$��"��#0� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////(

>/( �����050&���$��#�#7#���$&�3L ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////E

����� -������ � ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������E

����� ���������� ��� ��-�1������������� � �������������������������������������������������������������������������C

>/(/(/> 3���:α������������!����63α38///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////C

>/(/(/( &����������������������:���������������@�6&�����@%�&�"@8 ///////////////////////////////////////////////*

>/(/(/& ���������&�6���&8 //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?

>/(/(/D ;������ /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?

>/(/(/E $����>///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>(

>/(/(/@ ���������������������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&

>/& �#�#7#���$&�3L�$0��$5�&373&B //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&

��J�� ��������������������� �������� �� ���������� ����������������������������������������������������������>&>/&/>/> ������������������������������������������� ////////////////////////////////////////////////////////////////////>D

>/&/>/( 5������������������������������������������ ///////////////////////////////////////////////////////////////////>@

��J�� ���� �������2������� �������� ����������� �����������������������������������������������������������>C

>/D ���B&5��$&#�$&3�0 //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>*

��3�� * ���� ����������������������� � �������������������������������������������������������������������������>*

�� �� � ����

��3�� * �������������� �4*%�5���������� �����������������������������������������������������������������������������������()

>/E $#0�&3�0���$�& 5�5L&�$�577#7$���$&�3L /////////////////////////////////////////////////////////////////(>

>/@ ��&50&3$7�$#0�&3�0���$�$�$�&�>�$0��;5��3�$0�30�& 5��#�#7#���$&�3L ///////(D

��.�� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������(D>/@/>/> ��������$����>������������////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////(D

>/@/>/( $����>��������%������������������������������////////////////////////////////////////////////////////////////(D

��.�� %���� �����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������(E>/@/(/> ;��������������%����������������������������///////////////////////////////////////////////////////////////(E

>/@/(/( ;���������������//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////(@

>/C �#��$�B%� B��& 5�5��$0��$3�� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////(*

>/* $3���$0�� B��& 5�5� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&)

�+�,�-�� ���-���6 ��/���-�+�� ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,/

(/> �$&5�3$7�//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&&

(/( �5& ��� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&&

����� � ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������&&

����� ������ ���������������� �� ������������������������������������������������������������������������������������&&

����J 7 ���� ������������� ���������� �����������������������������������������������������������������������������&E

����3 ��������������������� ����������������������������������������������������������������������������������������������&C

����0 8��� �'���� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������&C

����. ��������� ��%���� ���� �'���� �������������������������������������������������������������������������������&C

����9 7 ������������������������ �� ����'1��� �������������� ��%���� ���� ��

�2� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������&*(/(/C/> ������������������������6���8//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&*

(/(/C/( �������������M���������� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&*

(/(/C/& ����������������������������� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&?

(/(/C/D �����������������0$/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&?

(/(/C/E 7��������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&?

(/(/C/@ &��������������5/����� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D)

(/(/C/C ����������:����������////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D)

(/(/C/* ����������:����������////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D>

(/(/C/? ��'������� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D(

�+�,�-��/ �6�-�-�����,� ����/�����+-��0�060 ����:�-����,6-;������;�

�0��/1��!�"��������0�����/�������:�- ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2/

�� �� � ���

&/> 30&���#�&3�0///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////DD

J�� �$&5�3$7��$0���5& ��� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////DE

J���� *������ �� ��������������������������������������������������������������������������������������������DE

J���� *������ �������� ���������� ����� ���������� ���������������������������������������������������������������D@

J���J ��������#1��� �������������������������������������������������������������������������������������������������������������DC

J���3 8��� �'��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������D?

J���0 $���������� ����� �������������������������������������������������������������������������������������������������������������D?

&/& �5�#7&� /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////E)

J�J�� * ����� ������������� ��%���� ������ �*%����� ��������������������

����������� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������E)

J�J�� * ����������������������������������������� �� ������������� 3����)������

������ ��������%���� � ����������������������������������������������������������������������������������������������������������ED

J�J�J ����#$��� ��%��$*��������� ����� ���������� ����������� �����������������������EC

&/D �3��#��3�0////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////E?

�+�,�-��2 �0�060 ����:�-������;��0/����/��0��/1����:�-����0�����/��/��

��06����/�,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,"

D/> 30&���#�&3�0///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@&

D/( �5& ��� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@E

3���� *������ �� ����������������������������������4����5�������������������������������������������@E

3���� ���'����4���<������ ���������������������������������������������������������������������������������������������������@@D/(/(/> "�������#���.��$���� /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@@

D/(/(/( �����������#���.��$���� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@C

D/(/(/& N�������������������!������#���.� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@*

D/(/(/D ������������$������� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////C)

D/& �5�#7&� /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////C)

3�J�� 7������4���<� �4 ��� �������������������������4����5 �����������������������������C)

3�J�� ����������4���<� �4 ��� �������������������������4����5� �����������������������C&

3�J�J �������� ����7������4���<� �4 ��� ���� ������ ��� ��������������������

��������������4����5������������������������������������������������������������������������������������������������������������C&

3�J�3 ����������4���<� �4 ��� ���*�������� ������ ��� ��������������������

��������������4����5� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������CC

�� �� � ����

3�J�0 �������� ����7������4���<� ����� �������������������������4����5������) ��

������ �� �������������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������CC

3�J�. ����������4���<� ����� �������������������������4����5������) �� �����

� �� �������������� ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������*(

D/D �3��#��3�0////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////*E

�+�,�-��( ����� .��/���-� ���/O��-���=�/�/��,���-�/�,���0����/��/��

�0/����/�6���6- ��0��/1��!�"��������:�-����0�����/,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,>!

E/> 30&���#�&3�0///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?>

0���� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������?>E/>/>/> ������������������������������������������������������� /////////////////////////////////////////////////////////?>

E/>/>/( $����>���������������������������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?(

0���� %���� �����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������?DE/>/(/> ����������������������������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?D

E/>/(/( 5���������������������������������������������������������� ////////////////////////////////////////?E

E/( �5& ��� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?C

0���� ����' � ������ ��������� ���������������������������������������������������������������������������������������?CE/(/>/> ���������������������� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?C

E/(/>/>/> �&�$7$"���>%��&�$7$":������>%��&�$7$":�������>�������������������3���������&�$7$"�5<$�

���>�////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?C

E/(/>/>/( �&�$7$":@L ��:">������&�$7$":@L ��:"&////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// >)(E/(/>/( ����������� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>)(

E/(/>/& &���������������!���5���������������!�����������������������������//////////////////////>)E

E/(/>/D ������������������!������������� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>)@

E/(/>/E $���:$����3��������������������2������!������� //////////////////////////////////////////////////////////>)C

E/(/>/@ ����������������������������:�$"5�����///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>)*

E/(/>/C 3��������������������������������������������!������;�����������$����>////////////////>)*

E/& �5�#7&� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>)?

0�J�� *��� ���������� �� ��8��� �'����� �������������' � �������������� � �����������>)?

0�J�� ������ ���������' � �����������������������������������������������������������������������������>>&

0�J�J �������� ��������' � ������������������ �����������������������������������������������������������>>&

0�J�3 ��������������� ��������' � ��%���� ����� � �������������������������������������������������>>@E/&/D/> ;������������������������������� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>>?

E/D �3��#��3�0//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>(D

�� �� � �����

0�3�� ������� �� ���������� ��������' � ����������� ��%���� ��������������������������������>(D

0�3�� ������������%���� �� ���������� ������������ �� ��������������������������������������������>(E

�+�,�-��" ��/�60 ��/ ��/���0�0�-����-����/ ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,. ?

@/> �3"03$3�$0�5�$0���7303�$7��575;$0�5 //////////////////////////////////////////////////////////////////////>(?

@/( �$&�3L��5$3�350�35��30�& 5�30�;3&����#�#7#�����B&5�����75L //////////////////////>(?

@/& $7&5�5��A$��35��$#0�&3�0��30�& 5�30�;3&����$&#�5���#�#7#�����B&5�

����75L////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&)

@/D �5�&��30"�& 5��5$3�350&�30�;3&����$&#�5���$&�3L�23& �;5��3�$0�$0��

$�$�&�> ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&(

@/E $��3&3�0$7���&50&3$7�$�&3�0���$�;5��3�$0�$0��$�$�&�>��#�30"����B&5�

�$&#�$&3�0//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&(

@/@ �#��$�B�$0��$#&#�5��3�5�&3�0�///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&&

�+�,�-��* =�=6��1��,+:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,./2

�+�,�-��? ,0=6������/���� �/1�������+� ��+- � ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,."

�� �� � ������

6��������������

$�����>/>�����������������������������%����������������������6���8����������������������

��������/ ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&

$�����>/(�3������������������� ���������������������������������������������������������////////D

$�����>/&�3������������� ���������-�������������������������������������������������/ //////////////>)

$�����>/D�;������%�$����>�����$����>���������;���������������������������������������������

��� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>>

$�����(/>�5�����������������������������������������������������������-���� ���������������

63;�8/ /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&D

$�����(/(�"������������������������/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&@

$�����&/>� ������������������������������-��������������-���������������������/ ///////////////E>

$�����&/(�3������������������������%���� ��0$� �����!������� ��������������������@����������

���������������/ //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////E(

$�����&/&�3������������������������%���� ��0$� �����!������� ��������������������()����������

���������������/ //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////EE

$�����&/D���������!�����������$����>�����;������������3;���� ���������������/ //////////////////////E@

$�����&/E�����#$�%�%��$*��������-�$���0$�����������������������������������������

����������� ���������������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////E*

$�����D/>�5���������'��������������������������������������������������������������������6���8

///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@?

$�����D/(�"�����������.�����������������������������������������6���8������������������

���������������!�����/ ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////C>

�� �� � �����

$�����D/&����������������.�����������������������������������������6���8������������������

���������������!�����/ ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////CD

$�����D/D�"�����������.������������������������������������������-��������������������/ ////////////////C@

$�����D/E����������������.������������������������������������������-��������������������/ ///////////C*

$�����D/@�&���������������������������������!�������������������������������6���8���������

��������������������-���� ��������������/ ////////////////////////////////////////////////////////////////C?

$�����D/C����������������.�������������������������������������������������������������-���� ������

��������/ /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////*&

$�����E/>����������������������������������������������������������������!��������������

���������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?*

$�����E/(�����������������$����>�M����!������������/ //////////////////////////////////////////////////////////////////////>)&

$�����E/&�����������������������������������������M���������;��������������������%���� �

���������/ ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>)D

$�����E/D�3��������������������2������!�������������������!������$����>��������/ //////////////>>)

$�����E/E�$7$"�����������!������$����>�����������������������-����!����α:$7$"�����α:

$����>�����!�����//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>>(

$�����E/@�����!������$����>������������������������/ //////////////////////////////////////////////////////////////////////>>D

$�����E/C�������������������!������$����>������������������� ///////////////////////////////////////////////////>>E

$�����E/*����������������������������!������$����>�������///////////////////////////////////////////////////////>>C

$�����E/?�����������������������������!������;�������">�������/ //////////////////////////////////////////////>>*

$�����E/>)��������������������!������;�������"&������� //////////////////////////////////////////////////////////////>()

$�����E/>>���������;���������������������������������������������/ ////////////////////////////////////////>(>

�� �� � ����

$�����E/>(�����!������;�����������$����>���������;�����������!���������������������������

���������/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>(&

�� �� � �����

6�������&����

&�!���>/>��������������������������-�������������������������������������������������

���������������������������������� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////>E

&�!���(/>�������������������������������������������������������������� ////////////////////////////////////////&C

&�!���&/>������������&���������'������ /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D*

&�!���&/(� ���������&���������'������/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D?

&�!���E/>�������������������������������������������������%���� ������������������/ //////////////??

�� �� � ������

�&&���������

α�5�� � ������5���������������������

$�$�� � $�������������������������������

$����>� �� ����������:��.�� �������������������� 6��������� ����8� -���� ���!��������� ����� >�

������

$!�� � ������>�������!����<!�.�����

$0�;$�� ��������������������

$� � $��������������

$�&� � ��������������������������������

!�� � !���������

A�$� � !������������!����

�A�� � ���������!��������������

��0$� � ������������0$�

�53� � �����������������������

�3�� � �����3����������$�.�������������������

���� � ���������������������

���� � ���������������������������

��� � ���������������������

��5�� � ���!����F�����������5�����������

�0$� � ������!���������������

5/������ � 5���������������

��"� � 5'��������������������������

5��� � ������������������

5��� � 5���������-���������

5��:7� � 5��:��.����������

5���� � 5����������

5!A(� � �����!����������.�������������������������(�

5��� � 5�����������������:���������.������

$>� � ������������

$$�� � ���������������.�������

$��� � ����������������

�� �� � �������

$$:�$�� $��������������:������:�����������������

$� � � $������������������� ������

"� � ���!�����

">� � ���!����������>�

"(� � ���!����������&�

"$"� � �����������������

"��� � ��������������

"5�� � �������������������������

"7#&� � �����������������

"�5�>�� ������

";� � ���������������

�� � ����

$� � ���������

��>� � ������������������>�

��(� � ������������������(�

��&� � ������������������&�

�� � ������������

��"� � ��������������"������������

�� � �����������������

��"� � ������������������������������

3α3� � ����:α������������!����

�/�/� � ��������������

3&�� � �������������������������

3#� � �������������������

3;�� � ���������������

.��� � .����������

��� � .���.�����

7A�� � �����!����

7 � � 7������M����������

7���� � �������M���������<������������������������

"�� � ������������������

�� �� � �����

�3� � ���������3�

�33� � ���������33�

��� � ������

���� � �����������������������

�0$� � ����������0$�

0��>� � 0�������������������������������>���� � ���������������

� ��� � �����������������������������

�A� � �����!����

�A�� � ����������A���������������

����� � �������������������������

���� � �������������������������

��� � ������������������

����� � ������������������.���.����

����(� � �������������5��������(%���!�����5�(�

����(� � ������������:���������������������(�

���&� � ���������&�

�;�$� � ��������������������������

���� � �$�:��������&�!����������!������>�

� $��� ���������� $:����������������

���$� � ��������������������%��!��$�

�0$� � �!��������������

��3� � ������������������

���� � �����������������������

��� � ��������������������

�&� � ������������������

�&:���� ������������������������������������������������

�/5/�/� � ����������������������

���� � �����������������������

���:�$"5� �����������������������:��������������������������������

&�����@��� &����������������������:���������������@��

&��:>� � ���!��������������3�

�� �� � ����

;5"$� � ;���������������������-���������

;5"$��� ;���������������������-����������������

I�� � M��������������

��

� � �

� #����. �

�����������

�������>�3������������

�� �� � (�

.,. =���1��0/���

������������ �������� ��� ���������� ��� ���� ������������������� ���� ���������� �������� ��������

��� ���������� ��� ���� ����%� ��� �� ������� .��-�� ��� ���������/� &��� ��-��� ��� ������� ���������%� ��

����������������%� ���� ������� ����������� ���� ��������� ��� ������� ����������� ���� ��������

������������������� 65�����())>8�6$�����>/>8/� 3�� ��������������� ��������%��������������������������

.��-�� ��� ������� ������ ������������ ���� ������/� 5���� ������� ��� ��������� !�� ������� ������ ���

�������������-����� �������������'���������������������>))):&)))�����������������6��������������

>??(8/����������������������������������������������������������������������������������6���%�

$�����>/>8/�&���������������������������� ��� ��������������� ��������������������� ,��������%�-�����

����-� ���� ������������������������ 6P>:(.��8������������!������%� ����������������������������%���

������� ����� ����������� ������������-���������!��'������!�������������� 6A��������������>??)=�

"������������())*8/�"���,���������!��-���������������������������������'��������M������������

�������,�����������������������������M��������������6I�8����������������/�&���������M�������,��������

���������������������������������������������������.������������!�����������������������������

����������������������6$�!������������())>8/�$�,���������������������������������������������������������

.��-�����������������������/�&����������������������������������������������������������������

����������������������������������������������������������������������������������������-����������

��������/�

3�� ��������%� ���� �������M���� ������ 67 8� ����� ���������� ��������� ��� ������� ���������� ����� ���

�'������������������6��������������())(8/�&���7 ����������������������������������������������

��������������������������������/��0�����������������������65��8������������������������

����������������������������������������������������������������������������������������������������%�

-����� ��� �'����� ��� ���������� ��� ���� ������/� &��� 7 � ����� ����� ���������� ���� ������� ��� �������

���������� ���������� �������� ��� ����������������� ��������� 6 $8:���������!�� �����������������

6��������������>??(8/�&�������������������������������������:�������������!��-���������������������

���� ���������� ���� ������/� $�� ���� ���������� ��� ������� ���������%� �������� ��� ():����� ���� ��������

���������� ������������� ���� ��������������� ��� ������� 6��������������>??(8�6$�����>/(%��8/��������

���������� ��� ����������� -���� ���� ��������� ��� ������� ���� ������� ��������� ��� ��������� 33/�

$����-��������������������%���������������������������������������������������!��������������

Chapter 1 Introduction

Figure 1.1 Schematic of folliculogenesis, cumulus oocyte complex (COC) expansion and oocytematuration. Folliculogenesis from the primary to the antral stage, whereupon follicles are able to respond to the luteinising hormone (LH) surge, involves granulosa cell proliferation, formation of a fluid filled antral cavity and divergence of the mural granulosa and cumulus cell lineages. Cumulus cells immediately surround the oocyte and mural granulosa cells line the follicle wall. Oocytes remain arrested in prophase I of meiosis during folliculogenesis until the endogenous LH surge or administration of the exogenous LH-analogue, human chorionic gonadotropin (hCG), induce resumption of meiosis and expansion of the cumulus oocyte complex (COC). Following completion of COC expansion the oocyte has extruded the first polar body and reached metaphase II, the COC is ovulated and is capable of being fertilised. Figure modified from (Kimura et al. 2007).

Dunning 3

NOTE: This figure is included on page 43 in the print copy of the

thesis held in the University of Adelaide Library.

�������>�3������������

�� �� � D�

�����������������������������., �����������������+����������� ����#������������#���������������������,����������� ��� ����� ��������� ��������� ���-���� ������������� ��� ��������� 6!�-�� ��������8� ������������������������������������������ ����������!����� 6�%���������������8%��������E������ 6!8�����>)������6�%�������������8�������������������"����������������������������������/�$��������6��������������>??(8/�

��

!�

��

�������>�3������������

�� �� � E�

������������������������������������������������6������������������������8�-��������������������������

!��������������������������������������������������������/�&���������������������������������������

��� ��������������������� -���� ������� !�� ��������� ��� ������������ ������������/� &��� ������������� �����

�������� ����� ��� ���� �� �������� �� �������������� !���������� ������� �������� ���������� �������

��������%����������������������������������������������������������������������������������������%�

�������������������!��'������!��������������6��������������!.��())C8/�

., ���,�/-/� �����0�060 ������;�

., ,. +��������

3�� ���� �������� �������� ����� ��%� ���� �,�� ��������� ��� ���� ����� ��� ��������� 6 $=� ���/%�

�������������%�����������8/�������������� $������� �����-����!���� ����7 ������ ��������� ������

������������������� ��������������������������������-���� �������������������������� 6$� 8� 65�����

>?C?!=� 5����� >?*)=� �������� �� ���� >??(8� �� �������� ��-��� ������ 65��86&����� �� ���� >??C8� ���� ���

������������� ����������������������� ������� ��������������������������������������������� 65�����

>?C?�=�5�����>?*)=���������������>?*?=���������������>??(8/�$����������������"�������������� ����%�

$�������������������������� ������������������ ��������������������� �������������� �������%����� ���

���������������������������,������������������6$�����>/(�!8/�0��������������������������������%�

$�����������������!��-����������������������������������������������������������������6$�����>/(�

�8/�

��������� ��� ��� ������������ ����������������� 6"$"8� -���� �� ��������� ������������ �������� ���

������������:�������������������0:����������������%������������������������������������������������

��� ������ -���� ���� ����� "$"�� ����� ��� ����������� �� ������� ���������� 6����� ���� ����� >?&D=�

2����������������>?ED=�7����������$����>??(8/�

��������� ��� ������������ ��� ���� ��������� !�� ���!���� !����� ��M��%� ��������� ��������%�

-������������������������������������������������������������������������������������!��������

�������� ���� ���������� $������� ������� �����!���� ����� ���� ������������������ 6��������������

���-��M�>?*D=�2������������>??C8/�&������� ������������ �����������������������=�-�$�%�

-�$�� ����-�$J� 63����� ���� ������ >??@=� ���,��� �� ���� >??@=� ������ �� ���� >??C8/� &���� ���-� �����

�������>�3������������

�� �� � @�

������� ��'������ ��������%� !��� ����� ������������ ������� ���������� �������� 63����� ���� ������ >??@=�

���,���������>??@=��������������������>??*=����.�����������())>8���������������� ����������������

����������������63�����������>???8/� ��(�����������!����������������������� $���������������������

���-�������� ���������������-����7 ������������!���� ��������� ������ �������%������������!������

�������������6$�����������>??C!=������������())(=�����������������5���������())&8/� ���������

���������(��������� $��������-��������������������(���>)@��������%� ����� ����� �������������!��

��>��� ��&�63�����������>???8/�

$������������ $���������������������!��.!����������-�������������������������������!����!���

���������������� ���� ���� ���������������� ����������������� ���!������������/����-������������� $� ���

����� ������������������������!���������������� ��������!�� �������������� ���6�8���� $� ��� ��������

6��������������������())@8/� ��������� ����!����������������������������������������������������!��

!������� ��� ����� ������� ����������DD� ���� � $��� 6������� ��� $:���������������8%� �������� ���

������� ����� ������ ���� !�������� -����� ���� ������ ��� ������� ��������%� �������%� �����������%�

��������������%� ����� ������ ���� ��������� 6�������� ���� �������� >??&8/� &��� ����������� ��� $� -����

��DD� ���� !���� ���-�� ��� ������ ��������� ������������ ��-��� ���� ����� �������� ������� ����

��������������5!A(� ������/�&������������ ��� �������� ���������������� ���������������������� ����

���������������DD����� $��������������������� ���������������� ��� ��������%� ����������� !������

6�����������>???=�B�.���������())(=�����������������5���������())&8/�3����������%����������������

���������������������-���� $�������������������������������6����.��������()))=�������������()))8/�3��

������������������������������ ������������ $����������������������������� ����������%��������

����� ���������� ��� !���� ���� ����� ���� !������ ��������� ����������� -���� ������� �������������

����������67���������())>=� ����������())(=�B����������())E8/� �-��������������!��-����� $�

��������������������������� �������!������� �����DD� �����!�!����������������� ������� ��������� �

���%�������� -������������������� �����DD�������������� ��������� 6������������� >??C=� ������������

>???8/� &��� !������� ��� $� ��� ���� ����� ������������ $� ������� � $��%� ��� ������� �� ���������

�������/� 3������ ����� �����%� ���� !���������� $� ��� ������ �������� �������� ��������������������������

������� ����������������-����-���� $�!������ $������������� ���������"&������������ ���������

����-�����!���������� $������DD���������������������������������$�����-���6"��������������())@8/�&���

������������� ���������� ��� � $��� ���� !���� ��������� ��� !������ ������� ������ ���������� ����

������������������-������������������������������������ $����������������������!�������������

6����������������5���������())&8/� 3������!�������-�� ������ $���������DD��������� �������%� ���

�������>�3������������

�� �� � C�

���,�������� -���� $%� ��� �������� ����������� ��� ���� 5��><(� ����������� ����-��� ���� �������� ��DD�

���������� 6&���� �� ���� ())@=� ������� �� ���� ())C8/� ;��� �������� ��� -��� ���-�� ����� $� ��������

�����������������������������������������-����!���������������������������������������������

����.����%�-�������������������������������������������������������������� �����%���������������

�������������������������������������������6�������������())*8/�

���������������,����������������������������������������������������������������������������

����������������-����-������������������������������������������������������������������������

������ 6$���� �� ���� >??C8/� &���� ������� ��� ������� ��� ���� �����!��%� !��� ������� �������� ��������� ���

�������������/� &����������� $:������������������������ ������������� ��������%�����-���� ����

��������� ���� ��� !�������������� ��� ��� ������� ������� ���� ������ ���� ������ ���������%� !���

�������� ���� ������ ����-���/� &���� ������� ��� !�� �������� ��� ���������� ��� ���� ������� ������

���������/� &������������ ��� �����!��� ��� ��������������� ��!���� ����� �������� ������ -���� Q����F�

6B����������� >?**8/��������� ������������������������� ������ ��� �����!���������� ������������������

������������������������������������������������������!�������������������������������6����������

>??)8/�

., , ,�������������+�5��������#�������

$�������������������������������������������'������������������������������� $�!���������������

!������������ ������������������������������!�������������������������������������������

������� ������ ��� ���� ����������� ��������/� &����� �������� ��� �������� ��� ���� ������ �������� ����

���!���M������������������������������������������������������:α������������!����63α38%�������������

�����������:�������� ������:@� 6&�����:@8%� ���������&� 6���&8�����;������� �������� ����-��� ����������

!���-/��

$% % %$ ������αααα����������� ����αααα���

&��� ����:α� ������� ����!���� 63α38� ��������������������������������������������!���� ��������������

������������������������%�-��������������������������������!������������6������������>??@8/�&���3α3�

�������>�3������������

�� �� � *�

�������� ��������� �-�� �������� .��-�� ��� ������ ������� 6 ��8%� -����� ��� ��������� ��� �� �����������

���������6��8��������������������������!�.�����6������������>??@8/������������������������� �����

3α3� ��������� ���� ���� !����� ����������� ����� ���� ���������� �����%� ���� ��� ��������� �����!������ ��� ����

����������������-��������7 �����%�����������������������������������6�����������>??(=���-�����

���� >??E=� ���� �� ���� >??*8/� &��� ������������ ��� 3α3� ����� ���� $:���� �������� ������ ��������� ����

�������������� �������3α3���� $�!����������������������������� ��!������������������!�.�������� $�

6I����������>??E=������������>??@=�0�������������())D8/�A�.���������������������������������������

��������������������������������������������������!����������������������������������������6I������

����())>8/�3α3���������������������������������������������������-������������������������������� �

����%� ��� �����!����������������������������������� 3α3%� $� ��� ��!�������� ������� ����� ����� ���������%�

��������� ��� ���� ���������� ��� �������� ������ ���� ����� ��� ������ ���� ���������� �������� ������

������������� $� 65����� >?C?!=� �������������� >?*?=������������ >??(=�������������� &��������� >??�=�

�����������>??D8/�

%!%!%! "�������������� ������������������� ��������������������

&������������ �����������:���������������@�6&�����@%����������� ������&�"@8� ���������������������

���������� �'����� �������������������������������� 6������������ ())�8/� &�����@� ���������������!��

��������������������������� �����-���� ���� 7 ������ � ������ ���������������������������� �������

���� ����������� 6������������ >??C�=� B�����.�������� ()))=�!�.���������������� ())>=� ;�����������

())(8/�&�����@�!����� $��������� ������� ���� ���.��������6��������������()))8����� ����'����� ��� ����

������������������ ��������!��-���� 3α3� "������ $�-���� ������������������������������ 6������������

())�=�H����������#����())�=������������())E=����������������())E8/�&����!���������&�����@����!����

$�������������������� "�����3α3���������������!�������������������������������������������"#"�������

6"������ �� ���� ())>8/� �-���%� -�.� ������������� ����� ����� ��������������� ��������� ��� $%�

����!��� ��� ����!������ !������� ��� &�����@� ��� $� 67������ �� ���� ())(8%� ��� ���� ������ "#"� ����������

6!�.����������������())D8�����������������������������������"#"����������� $�����������!������

&�����@����������%����������������&�����@�������������������������.������ $�6#������������())�=�����������

������())C8/�$�����������%������ ���� "����� 3α3���� ��������� ��� $%�&�����@� ����������������-����

��-� "�����3α3�6�����������())E8����������������������������� � ������������������������-���� "��

����������� ,���������������������6#������������())�8/�&������������� ���������������-�����&�����@� �������

"������>�3������������

$� �� � ?�

��������������������������������.������� $�6����������������())C8%����������������������������������"#"�

�����%�!��������3α3%�������������������������������������������� "����� $/�$�����������%�&�����@�����!��

�'����� ��� ���� ������������ ��� ��������� �� ����� ���� �������� ������ 6���������� �� ���� ())C8� ��� ���

����������!���-/�

%%&%&%& '�� �����&��' �&��

�����������6����8���������������������������-���������������������������������������>)������������

�������������6������������������DE.��� �����M�8�,������!�� ���������������������!�����6A����MM��������

>??C8/�3������������#��J���������������������������������������-��������7 :�������������������������

�������������������������-����������6;�����������())(8/������������������%��������:����������-���� $�

��� ��������������"#"������� 6;�����������())(=���������������())D8/�2�������������������!���� $�

�������%� ���������������� ��������� ���� ��� ���� ������������ ����������������������!���������� ���������

����� ������� ��� �������������� �����!������ 6;����� �� ���� ())(=� �������� �� ���� ())D8/� ������� ���������

���-�� ����� ����� ��������� �������� -���� ���� "�� ��� 3α3� ���� ����� ����� ����������� ��� �������� ��� ����

�������������������!�������������"#"�������6����������������())C8/�&���!������������������&�����@�����

���� �������� ���.����������� ����������������������!��'��������!�����������������������6������������

����())C8�6������>/���8/�&��� �������������������-���� "�%�������!��'����� ������������������� ����� ����

"#"������%�����������������������������������������-����&�����@���������������������������������

��������������� "������������&�����@���� $�6����������������())C8/�

%%&%&%( )������

;������������ $:!�������������������-��������������������������������6"�8������������/�$���� �

��0$�����!��������������������������������������������������6�""�8������7 �������������-���������

��������������� ����������!���� ��� �����""������ ����5"!��������������"#"�� 6��������������())�!8�

6������>/D�!8/����� ��� ����������������������������;������� ����������������������� � �%� �������

!������������ ����� �����"#"����������������� ����������������� ���� ���� ���������-���� 6��������������

())�!8/�;������� ��������������������� �����������-����� ���������� ������������������������.����� $�

���� ��� ��������� ��� ��������� ���� ����������� ��� ���� �����/� ����������� ;������� ��������� 0:� ���� ":�

"������>�3������������

$� �� � >)�

�������.,/�*�����������+�������,�� �������������#���������� ��������������������,�

6�8 ����������������������������������������6 "8�����3α3���� ���������6 $8%�-������������������!��&�����������������������:���������������@�6&�����@8/�&��� "��!�������� $��������������� ����:���.� ���� ���!������ ���� �������� ������ ������� !������� ��� ��������� �� 6����8/� �������������������6����������������())C8/��

6!8 ���������� �������� ���� �������� ��� ���� ��������� "#"� �����/� ��������� ��� ���� ��,��������������������������������%��!������!����"�DD�����������������������������������!���������������������/�����%� "�����3α3�����;�������!���� $��������/������!������������ "�����������������������.�������� $�������/�&�����������������������������������������������������-�./�&���">�����������;�������!����� $���������"���������!�������������������������������������/�$�����>���������;��������������"#"������%�������������������������������������������������������������������!����������;��������"���������-���������������� �������������5����������/��������������������6��������������!.��())C8/�

�������

�����������

!�

"������>�3������������

$� �� � >>�

��

� �

����������� .,%� �������&� -����.� ��� -����.� ������� �������� ������� �� � �� ������ �� � ����#����������7������������ ��� ;������� ���� $�����>� �������� ��� ������������ ������ ���������� >(� �� �����-���� �""��������������� ��� ��������������������������������������/� 3���������-� ����������������������� 6�8��������������$�����>�6��������������())��8�6!8�������������;�����������6�8���������������������!��$�����>� ��������� ��� ;������� 6�������� ;������� ����������8/� ��$�����>� ���������� ��� ���� �������������������������������������������������������������������������������������������������������6�8/�3�������������������������������;�������������������������������������������������������������"#"�6!8/� $�����>� �������� ;������� ��� ������ ������������� ��� ���� "#"� ������ ���� ������ ����������������������������������������!������ ����������$�����>�6�8/�"#"%�����������������������=��""%�������������������/�

���������� �����������

-����.�

�������������������#��#��

!�

��

,�-����. ����� -����.

����

����

����

����

��

"������>�3������������

$� �� � >(�

�����������!����6"8���������������">�����"�������������%�-�����������������!����"�������������

�����/�&���">�����������������������������!����:��.�����������������!����� $������-�����.�������:

��.����������������67�A����������>??(8/�&���;�������"������������������������'���������������

-���� ���� ��������� ��������� �������� ���� ��������� �-�� ��������� ��-��� ������ 65��8� �������%� ��

��!�����������������������������������������������������������6"��8�������6���������������

>??�8/� &��� "��������� ��� .��-�� ��� �������� -���� ����� ������� �������� ���������� ����������������������

6!����������>???8%������������������������������6#,����������>??D8%���-�����������������6L�������

����())@8����� ���������62��������())(8/�&��������������������������������������;�����������!������

��������-�����������.�����������"�DD�6��-�������������()))8/�;���������������������������.����� $�

���� ������ ��� ���� ���������� "#"� -���� �������� �����%� �� ����� ������ ����������%� �� ������� �����

���������������-�����������!����������"�DD/�3������������������������������%�;������������������������

���������������� ���������� ���������������������� 6I�����������>??*=�B����������>???8%���������������

65���.��������>???8%���������������62��������())E�=�������������())E8/�&���������������;�����������

!������������ !����������� ��� ����"��������� ���������������� ���� �-�����!������������ 6I�����������

>??*=�2��������())>=�L�����������())@8/6B����������>???8�

%%&%&%. '��� %�

&��� ��������$�����>� 6������������:��.����������������������� 6��������� ����8�-���� ����!���������

����� >� ������8� �������� ;������� ��� ���� "�� ����������� ������� 6������ �� ���� ())>8%� ���� $�����>:

���������;��������������������!�������-�����������������������������"#"��6��������������())��8�

6������ >/D� �8/� &��� ���������� ��� �������� ��� �������� ��� �""�� ��� �������� ��� ���� 7 :����� ���

���������������������������� 6��!.��������()))8%���� 65�����������()))8%���-�6!�����������())�8�

�������� 6A��!���������� ())�8����� �������������������� ���������������������� 6H������������

())D8/� ������������ ��������� ������� .��-�%�!��� �������������������������� ������������ ����""������

�������������������������������6���8�����������6��!.��������()))=���������������())��=�������

������())D�8/�������� ���;������%� �����������������$�����>� ��� �������� ��������������������� ��� ����

��������������������-����������������������������������������"#"������%������!����������!����������

������!������ 6�������������� ())��8� 6������ >/D��8/� 3����������� ��������������������������%�$�����>�

��������� �� ������� ���������� ������� ��� ����������� �������� ��� 5"!� ���������� ���� ����� ����:>�

"������>�3������������

$� �� � >��

����!��������:��.������������� ����":�������/� �&�������������� �������������;�����������������!��

$�����>��������"#"%����������������!�������������������������%��������������!���-�6��������>/�8/�

%%&%&%� � ������������������� ��

"�����������.������������!����������������!�������6��!�������������>???=�����������())�8�����������

��������������6���������������>??@=�����������������())E8%����� ��� �������-������-�� ��� �������� ����

���������"#"����������� 6���������� ())(8/�&��� ���.�����������;������� !����� ���.������������ �����

������������������� ���������!���������� $� ���;��������������� �������������� �������!��������� ����

"#"� ������ 6���������� �� ���� ())�8/� $�����������%� ��!�������%� ��������:"� ���� �������� ����� !����

����������� ����������������������� 6��������������� >??@=����������������� ())E8�-���� ��������:"������

�����������������������������������������6 ������M:"��M���M�������())@8/�$�������������!��-����

��������:"%� ;������� ���� $� ��� ������������� ��������� ��� ���� ��������� ��� �������� ����� �������

�������� ������ 6$��!��� �� ���� >??C8/� � &����� ����������� ���� �������� ����� ��� ����������������

�����������������"#"��������������������������:������������������������������%�-���������������������

!�����������������������������������/�

�,/ ���������� !"#��$%��&! "�" '��

�,/,� !����������������������(���������������������

��

2����� ���� ��������� ��� ���� ��������� �������� ������� �������� 6"#"8������� ���� !���� �����!��� ���

������� �������� �������%� ���� ��������� ��� ����������� ��� ���� -���� ���������/� 2���� ��� ���������� ��� ����

����������� ���������� ��� ��������� ��� ���������� ������������ �����-������������������������ �������������

-���� ����"#"������������ ��� ���� �������!���������!�� ���������� ������� ������������ ��� ������������

������������/�&������������������������"#"�����!�����������������������������������!���������������������

���!�������������������������������!��������������������������6#�������A�������>?C�=�7���������

()))8/����� ��� ������������%� �������������� ����� ������� ���� ���������������������������������������

����������������������"#"/�����������������-�������������������������!������������������6��������

������ ())D8/� $������������ ����"#"�������������������� ����� ��������������� 65����!�������� &�:

"������>�3������������

$� �� � >D�

������>???8%�!��������������������������������6;��������������())(8��������������������������!���%�

����-��������������������!�����������!�������������������6 ����������())D8/�&��������"#"�����������

���� ��� ��������������������������������������/� ���� ��� ���� ���� ������������� ������������ �������������

��-���%��������������������������������������� ������������������ �������!���������'�����������

��������������������/� 3�� ����%���������������������� ���"#"����������������������������������������

��.��� ��������� ������� ������������� ��� -���� ��� ��!��'����� ������������� ������������ �������� ����� ���

�������/�&���������������������������!��������!����������������������M�������������������������������

���"#"�������6&�!���>/>8�&��������������������������������������������������������������������

����������6������������>???=� �M�.��������>???=�2�����������()))=�I����������())>=�;�����������())(=�

������ �� ���� ())�8%� ���������� ������������ 6��!.�� �� ���� ()))=� 2����� �� ���� ()))8� ���� ���������

������������������67���������>??C=� �M�.��������>???=�I����������())>=�;�����������())(=���������������

())D8/� &��� ��������� ���������� ��� ������ �������������������� ������� ������������ ���� �����������

������������������������������������������/�

%%&%%%% ������������������ � ������� �������������������

�������������������� ���.����"#"������� ������������!��� �����������������������������!������

������������ ��� �������� �����%� -����� ��� ����������� -���� ������� ���������� 6&�!��� >/>8/� $!������� ���

!�.�����6��)�8%�# ���*���+��J%�-���������������������������������%�����������������������%��������

�����������!������������������������ ���������������������� ����������� ������� ��� ��������� 6&�!��� >/>8�

6�����������())>=�I����������())>=�;�����������())(=�������������())�=���������������())D8/������-����

�����������������+��J�����������%��������������������������"#"�������������������������������������

������������������������������������� $�-����������"#"�6;�����������())(=�������������())�=���������

�� ���� ())D8/� � $� ������� ���������� ��� �!������ �������� ���.���� &�����@� -���� ��������� �������� ���

������������������������-������������������������������6������������())�8/����������%��������������

!�.������#�����%�-����3α3�������������������������������������� "����� $������������%������������

�� ���������� -���!�� "#"� ���������� �����%� ���� ��� $� ���������%� !��� ����� ���������� ����

���������������������������������������-��������������6�����������())>=�I����������())>8/�

$������������������������� ���.���� ���;������%� ��� �������� ���"#"��������������� ������������%���������

!���������������������������������%�������������M���������������������������;�������������������

"������>�3�����������

$� �� � � � � � � � � � ��>E�

/����,��, ����#����������������,�� ������������������������ ����#�����������������#�������������������������#������� � -����$����

.������.�//�

-����

���/��

�(������!���

.R���#������

�����/�

� ����������������������

.R/�

����������#�����0�

��������# ����

!���������

������������������ +��� )� :� �����������!������ 67�����������>??E=���!.��������()))8�

��������������� ��� @(� 0<�� ������������������� 6 ��������())D8�

0�������������������������������>�6�3�>D)8� 0���� )� :� ������������������� 62�����������()))8�

�������������5��������(%���!�����5�(�65�(%�5�(�������%�������(8� +���1� @C� */E� ������������������� 6 �M�.��������>???8�

D)� )2��������������(2��������������� 0���������� 67���������>??C8� �

���

��#��

����

���

����

������������:���������������������(�6"#L(%����������������(8� +���1�

E� 0<�� ������������������� 6������������>???8�

��� 0<�� �����������!������ 6�����M�������())D8�������������:��.�����������������������6�������������8�-����

����!��������������>�������6$�$�&�:>%��5& >8�

��������(�2���������������(2��������������� (C� �����������!������

�!�����������������!������ 6��������������())E8�

����������������������������������������@�

6&�����@%�&�":@%�&��@8� # ���*� D*� )� ������������������� 6������������())�8�

������>��������!����<!�.�����6$��3%� 3:�)%�3����D%�3���%�#�����&������3���!���%�#&38� ��)�� D�� P>)� ������������������� 6I����������())>8�

DE� (� ������������������� 6;�����������())(8�

����

����

���

����#�

���

��

&���

�����

����

����

�#�

����

��

��

���

����

���

���

����

���������������������

6����������%�&�":>D8� +��J�0�����������S� )� ������������������� 6��������������())D8�

S#�������������������>D���6;�����������())(8����()���6��������������())D8�������""��������������������������������������������������+��J�����������������/�&�!����������������6��������������!.��())C8/��

"������>�3�����������

$� �� >@�

����� !�� ��!������ ���� >)/E� ��� �� ������ ��� �� ����� ������� 6�,�������� �� ���� >??*8/� �-���%� ����

������������������������������������������;������� ���"#"�����������!���������������� ���!����

������������ ���� ����������� ������� 6+��8� .���.��������/��������� ����� ���������� ������� ��� ��

�������������������!����������������6�������������()))=������M�������())D8����������������������������

��� ������������� ���� ��:����� ��!��� ������������ ����� 6�������� �� ���� ())E8� 6&�!��� >/>8/� 2�����

���������������������������������������������������������-������������������������6�����M�������

())D8%� ������ ������������������ ����"#"������� !�� ���������������������� $� ���� ;������� �������

������ ����� ����!�������������!������������������������������� �����������!�������� ������� �����-����

���������� 6�������� �� ���� ())E8/� &���� �!������ ������ ����������� ���������� ;������� ���������� ���

������������������������������������-������������������%�-����!�����������������������������/�&���

��������� ��� ������������������ ��� ��.�������� ��� �����!���������������������"#"������� ��� ������������

���������%���-���� ���� ���.����������������M�������������������������������������������'���������

���������/������������� ���.��������������� ������� 6��8����������������!�����������$�����>�

������E)2���������� �������������������;������� ��� ��������������"#"�6��������������())��8/�&�����

����� ����� ��� �������� -����� ���%� ��� ���� !�� ���� ��� ������� ���������� ��� ;������� ������ ��������

���������� � ��6��������������())��8�6&�!���>/>8/�

%%&%%%& 1��� ���������������������������� ��������� ���

&���������� ��� ���������������������%���� ������������� ��������� ��� ���� ��������������������������

���������������������������!���.��������������!����������������������6"������������())�=�A����������

())�8/� $�� ���������� �!���%� ������� ����� ���.���� ���� ����������� ������� 6������8� �������� ���

��������������������������������������������������������������������������������������67�����������

>??E=���!.��������()))8�6&�!���>/>8/�&����!����������������������������������������������������!����

�����!�������������������������������6��!.��������()))=���������������())��8/�

$!������� ��� ���� �������� ������� 6��8� ���� �������� ����������� �������� ���� ���������� ���� ���

��������� ��� �������������������������������/� 5������������ ����������� !������������� ��� !���� ���

6���������()))=��M������������())�8�����������6 ��.���������())E8��������������/�$��������������

6$8� .���.���� ����� ����� ��� ������� ���� ���� ���� ������ ����������� ����� ���� ���!%� ��������� ���

��������� �������� ���������� ���� �������������� ������� ���������� ���� 6 �� �� ���� ())D8� 6&�!��� >/>8/�

�������>�3������������

"� �� >C�

��������%� �������� ��������� ��� ���� ������� ������� ����������� ������� >� 6#���%� ���������� ������

�3�>D)8%� �� �������������� �������� ������� ��� ����������� ��������� �����%� �������� ��� �����������

���������%������������������������ 62����������� ()))8������!��������������������������������

����������� ���� ��������� ��� ������ ���������� ���������%� �������%� ����%� ���J$� ���!$�

������������:������������ ��������� (� 6�����8%����������%� ��������������� !������������ 6&������ �� ����

())E8/��

�������� ���������� ��� ����� ���������� ��� ���������� ��� ������������:������������ ��������� (�

6�����8%� ���� ���:��������� ��M���� ��� ������������� ���������� 62���� ���� �������� >??(=� ������ ����

�������� >??(8/� ������ ���������� ��� ������� �������� �����-���� ���� 7 � ����� ��� �������� ���� �����

��������� ������ 6������ ���� �������� >??(8/� %������ ����� ���.���� ����(� ����� �������� ��������� -����

�������������������������������� ����������������� ����� 67��������� >??C=������������� >???8%�-�����

���� !������!����� ����� ��������� ��� ����������������� ���!� 6������������� ())�8/�&����-�����������

��������� ��� ���� ����(� ������%� ������������� 5� ������� (� 6�����%� �������=� 5�:(8%� �������������

���������!�����������������������%� �������� ������������������������ ����!�����������&�����@� ��� ����

����������6�������������())�8/�

3������%�������!�������������������������������������������������������������������������������

���������������������������������������������������������������������������������������������������

6&�!���>/>8/�&���������������������!��������������-���������������������������������������!�����������

������� ��� �������%� �������� ������������� �� �� ���!�������� ��� ������ ������/� �-���� ���� ����������

-���!������������������������������������������������������.��-�/�&���������������������!���������

�����-��������������������������������������!������!���!���������������������������'������/�

�,/, '�����������(�����������)��#�������#�����

%����-���� ������������%� ������:�������������������������!��� ��� ���� !������������������������������%�

��������������������� �������������� ��� �������� ��� !��������������� ����������������������������%���

'������%���� ����������/�&���������������� ���� � �������������������!����-��������������������%�

�������������������!�������������������� � ���� 6"������ ())(=� ������ ())D=� ����� ������ ())@8/�

&����������������������-����� �����������������������������������������������������������'�������

�������>�3������������

"� �� >*�

6 �������())E=�2������������())C=�����M��������())*8/����������������������������������������

�������������������!�������������-�����������'����������� �������������������������������!����

����������� ����������������� ������� '������� ��� ����� ����� 6A���� �� ���� >?*�=� ������� ������ ())D8/� 3��

�������������%������������������������"**�!����������������6�����������>???8����� $��������������

��� ���������� ������ 6������ �� ���� ()))8� �������� -���� ������ �������������� ����������/� 3�� ���� !����

������� ����� � +J� ���������� ��� �������� ������ ��������� -���� ������� '������� 6I����� �� ���� ())E8/�

�-���%� ����� ���������� -��� ���� ��������� ��� �-�� ����� �������� 6&����M��� �� ���� ())D=������� �� ����

())C8/�&������������������,������� -,��-��������� ����������������������� ���������������������

����� ���������� ����� ��!���� ��� �� ������ '������� -���� �������� ��� ��!���� ��� �� ������ '�������

6&����M��� �� ���� ())D=� ������ �� ���� ())C8/� ����� ����������� ��� ����� ����� ��� ���� ��-� -���� �����

���������������,�%�� -,������ #(�.�!� !�� �������� ������ !����� ��������� -���� ����������������

�������������� ����������� 6$������ �� ���� ())*8/�������%� ����� ���������� ����� ���� ���������� ��� ������

�'����� ��������������������%�������!��'��������������%��������� ��������������������'�����������

��!��'����� ��!��� ������/� &��� ���������� ��� �������� ������ ����� ���������� ���� ������ �������

�����������������������������������������������������������%�����������������������������������

����������������%��������������������������������/�

���

�,3 ���/ 0��� 1'� "�$�

�,3,� "������������������������������ ��� ���

2����������������������%�����������������������������������������������������������%������.��-�����

��������������������6";8������/����������������������������������-�������������������7 �����%���

���������������������������������������������������6��"8�6%�����>/>8/��&���� ���������������!��

";� !��.��-�� �����-��� !���������� ��������%�������������� ������������������ �����'��������� ����

����������������������������������3�6&38%�����������-����������������������������������!���/�&����������

������������� �������������33�����������������������������������6&338/�&������'������������-������

���� ��������� ���� ��� .��-�� ��� ������� �� �������� ���������/� &����� �������� ��� ����� ��������� ����

����!������������������/�������������������������33����������������������/�

$�� ������� �����%� ���� ������� ������� ���������� 6��������������8� ������ �������������� -���� �������

���������%� �������� ��� �������� ��� ���� 7 � ����/� �-���%� �������� ������ ��� ���� ������� ���� 7 �

�������>�3������������

"� �� >?�

�������62����8%������������������������-�����������������������������������������2�������0$�

6�����������>??>8����������6A�.���.��������>??�8%�-����������������������������������!�������/�&�����

�����������2��������������������������!������������� ��� ��������������������������������� ����

�����%�!�����������'�����65�����������>??C=�"������������>???=���!���������())�8/� ��������������7 �

��� ���!��� ��� ���������� �������� ���������� ��� ��������� ����� -����� %� � ����� 65����� >?C?�=� 5�����

>?C?!8/� &������������ ��������� ��������������������� �������� ��� ���� �������� ������ !��� �������� ����

����������������������� ���� ��������%�-����� ����� �������� ����������� ��� �������� ��������������������

��������������������/�&�������������������� �����-� �������� ������������ ��������� ��������������� ����

7 ������6-������>:������8����5��:��.��65��:78� �������%����������%�����������������!�����������%�-�����

��� �������� !�� ��������� ������ ���� �������� ���� ��������� ������� ��� ���� ���� 6��.� �� ���� ())D=�

��.������� �� ���� ())D8/� &����� ��������� ������������� ��� �!��� ��� ������� ���� ���������� ���� ����

�����������������������������!������������5����������������������!���.������������������������������

7 ������ ��� ������� 6��.�������())D=�$��.���M��������())E8/�%����� ��� ����%� ������5��:7� �����������

�!��� ��� ������� �������� ����������� ����� ��������������%� ���!� ���������� ��� ��������� ���������� ���

�������6$��.���M��������())E8/�A�����������������������������������������������������������������

!�� ��������� -���� 7 � 6%������� �� ���� ())D�=� %������� �� ���� ())D!8/� &����� 5��:7� ��������� ���

�����������!�����������������������������������-�����������������������������������������������������

��������� 67�����.��������>???=�7���������())D8/�&���5��:7������������������������� ��� ������� ���������

�������!���� ������� ����� �'����� ��������� ���� ��� ����������� ��� �������� ��� �������� �����%� ���

���������-����������������!���������!������!���.�����7 ����������������������������������6�����������

>???=�$��.���M��������())E8/�3��������������%���������������5��:7�����������������-�����!�����������

!������$�$&�6$����������������&�������������8���������������������������6�����������>???=� ��.���

������ ())D8/������������������������-�� �����$�����>� ����!��� ��� ������������������������ �������5��:7�

��������� ���������������� ��������!����� ������������������ ����5��� �������5!A:(�67���������())E8/�&���

���������'�����������������������������������5��:7�����������������������������������.��-�%�!������

������������!����� ������������������� ������/����� ��� ������������������������ ������������������ ���

��������������%������������!��������$�����>���������������������������5��:7����������������������������-����

����7 �����/�&���%�������������������������$�����>�����!�������������������������������5��:7����������

������!��'���������������������� � �/�

�������>�3������������

"� �� ()�

�,3, "��)������������3"4�5���������

&��� � ���� ���������� ������������� �������� ��� �� ������� �������� ��� ��������� ������� ���� �����

��!��������������/�$�����������%� ������������������ ����������� ��������%� � �������������� 63;&8�

��� �������� ��� ��� ���������� ����������%� -����� ������ ������ ���� �������� ���� ��.�� ����������� -����

������ ������� ���������������� !�� �������� ��������� ��� -����� 62���� ���� "���� ())D8/� 3�� ������

�������%� -����� ��� ���������� ������������ ����� ������ ��� ���������� ������������� ��� ����������

��������� ��������� ��-��� ���� ���������� ��� �������� �������� � �� ���� ��� �������� ��� � ����

������������/� �-���� ������������ �������������� ��'������� ������ ��� ���� ������������ ��� �������

������������������������6� ��8%��������������!��������������������������������������������������

-���� ��������� ����������� ����������� 6������.������ �� ���� ())@8/� ��������� ����������� -����� ���

�������� �!�������� ����%�������%� ��������%� �������%� -������ ����%� ����� ������������ ���� ��������� ���

!�����������-�������������������������������������6���������������M��!���())(8/�&�����.����� ������

��������� ��� -����� ������� ����� �)%� -��� ����� !���� ���������� -���� ����������� ������� ��������

6����8�����������������������������������������������������������������������������������%�������

��������������������� 6��"8� 6���������������M��!��� ())(8/� 3�� ��������� �'������ ��������� ���������

-�������������������������.�������%��������������������������������������������������-�����!����

����� ����������/� $�����������%� ��� �������� ���.���� ��������� ��������� -���� ����� ������ ����������� ���

���������%�������-�����������!��������������.�����������������������������/�. � ��������������

����������� �'����������������������������������������������������� ������������� ���������/� � . �

���� ���������� ��������� ���� ������� ��� ���� �������%� ����������� ���� ���� ������ ���������� ����

��������������������������������6����������338����������/� �-���%������������3;&��������������������

��������������� � ���������������'�������62��������"����())D8/�2��������������� � ���������

�������%���!���������������3;&������������������������������������%����������������������!���

��-��� ������������������ �������������������������� ����� 6"����������>?*C=�A�����������>??@=�

"����������>??*=�����������()))=�&�������������())>=�2��������"����())D8/�&��� � �����������������

�������� ��� ��������� ��������� ��� ��������� �������� ��� �������� ��!���� ���� ������������� �������

6"������������&��������())C8%���������������-���������������������������������������������!����

6&��������������>??E=���M���������())(8/�&�������������������������������������������������������������

���� ������� �������� ���� ��� ���� ��-� �������� ����/� %����� ������������� ��� ���� ������ ����������

��������������-���������������������������-�3;&����������������������������������������������������

��������������������������������������������3;&��������/�

�������>�3������������

"� �� (>�

#������������3;&��������������������������������������������%� ���5�������������,��������-����

��-��� ������� �������� !�� ����������%� ���� ������������������� �'����� ��� �������������� ���������

�������������65�����>?C?�=���������������>?*?=�5�����������>???=���������������())E8%� ���!�6%�����

������>??C�=�B�����.��������()))8%����J�6;�����������())(=���������������())D8�����������6H�����������

())>=���.�������())D8������/�&���������������������������������������%�3α3%������������������������

�������%�������������������������%�����������'���������������������������������������3;&�6�������

���� >??(8/� &���� ������ �������������� �������������� �������%��� ��������� ��� �������������������%�

�����������������������3;&����������������������������������������������������������������������

�������������������������������������������.��-�����!������������������������������������6��������>/�8/�

3��������������!����������������-���%�-������$�����>�����;��������������������<�������������

������������������������3;&����������/�

&��� �������� �������� ���������� �������� ��� ��������� ��� ������� ���������� ���� ��!����������

6"����������>??*=�$����������())E8/�5�!���'������� ���� 3;%���� � ����������������� ������������

-��������������������������������5�&������� 6&����M���������())D=�I�����������())E8/���������

������ ����� ������� �������� ������ ����!������� ��� ���� ������� ����������� 65����� ())E=� ������� �� ����

())E8%�����������������������������������������-�����������������������������'�������6 ���������������

()))=��������������())(=��������������())�8/�&���%�������������������������������!����������������

���� ����������������������� ��������������������������������� 3;&/�2����� ���� �������������������

������������������������������������-�����!���������������������%�������������������������������������

��.��-�/��

�,6 �1$� "�$����� 40�0# '��0��1��'��� '"#��

���-�����������������������������������������������������������������������������������������������

.�������������������������������������/�5�����������������65�&8�����������������-��������������������

�� �������������������-���������������������������� ���-�������������������������������/�&���5�&� ���

��������������������������������������!����������������������� ��������-������������������-����

��,������������/�%����������������5�&���������������������������������-��%����������������������������%�

�������>�3������������

"� �� ((�

���!����� ,���������� �������� ����!��!� ������������� ���������%�����������!���������� �����������!�����

���������������������������������M�/�

&��������������������� ����������������� ����� �������������������-���� Q����F���������������M��%�-����

����������������������������� ��������� ������������� ���������M�� 6������������������>?@>8=� �����

'������� -����� ����� !�� ���������� ��� ���� ������ ��� ��������� ���� ����:���.���� !��-���� ������

���������/� &����� ��������� -����� ���������� ���������� ��� -��������������� ������������ ������� ����

�����/�3����������%��������������������������������������������������������������������������!������

��������� ����������� 6�������� �� ���� ())C8/� � 5�������� ���� � ����������� ����� ������������ ����

���������������������������5�&�������������������������������������������������������������������������

�������� ������� �� ������ ��� ��������� 6������� ���� ������� >?@>=� &���!�� >?C(8/� ��������%�

�����������-���%�������������������������������!��E)7�����������������������������6��������������

>?E>8%� �� ������������ ���� ���������� ��� ���� ������!��� ����� �������!��� ��� �!��!���� �������� ���

������/��

&���� ��������� ������ ���� �����!������ ����� �����-���� ���������%� ���� ������������������ ����� ���� ��� ��

!���������� �����%� ������������ ���������� �������������� ���� ��������������������� ��� ���� ������/� 3�����%�

������������� ��������� ��� ���� �������� ������ ���� ���-�� ����� ��� ����� ��� ��������� ����� �� ����� ��.��

���-�.� 6���� �� ���� >??)8/� $� ������ �������� $:���� ������ ����� ��� ���� ���� ������ ���� !��

��������������� ��� �� �������� ���-�.� ��� ����� !��-���� ���� 5�&� ����������� ������� -����� �����

���������� ����� ������� ��� ���� ��� ������� ������� ���� ������ ��������� !�� �����/� � &��� ������ ���

������������������������������������������������������������������������Q����F%�-�����!�����������

�����������-��������������������������������������������������������6���������8���������/�

&��� ����������!������ ��� �������������� ��� ������ ���������������� ������!������� -����� !�� ��������� ���

���������%� �� ��������%� �������� ��� ���� ������� ��� ����������� ���������� �� ������� ��!�������/� $��

�������� ��� ���� ���������� �������������� ��������� ��� ����� �� ����������� ������� ��� ���� ���������

�'��������������������!���������������������������/�&��������������������� $�����������!����������

������ ��� ������������ -���� ��� �������� ��� �������� ����.�� ���� �������� ����� ������� ���� �����������

����-�������������� $���!������6������:&���-����������())D=�������:&���-����������())E=� ������

����())C8/� �-���%� ��������������������� �������������������-��%����-���������� ��� ���������������

��������������������������� ������������ ��������!����� ����%� ������ ���������������������������������

�������>�3������������

"� �� (��

����������� 6 ��������������� ()))=� ������:&���-���������� ())@=� &�������������� ())C8/� &��������

����������������������������������!������������������� $�������������������������������������

����������������������������� ��� �������������� 3;&/� 3�� ����%������������������������������������ �

���� ��� ���� !���� ���-�� ����� ���� �������� ��� �������� ��� ��������� ��� ���� ����������� ��� ��������

6 ��������� �� ���� ()))8/� �-���%� ���� �������� ��� �������� ��� ���������������� ����� ��������

�������������� �������� ����������� �������� ��� �������������� ����������� 6 ��������� �� ���� ()))=�

�������������())(=��������������())�8/�%�������%�-��������������������������������������%������������

������ ����� ����!������� ��� �������� ������������ ��� �������� ������ ��� ����� ��!������� ��� ������

���������� ������� ���������� ��������������� 6A������ �� ���� >?@C=� 7����� ���� A����� >?*E8/� � &���

��������� �������� �������� ��� �������� ������ ���� �������� �������������������� !������ ������� ��

��������� ������� �������/� � 3�� ����������%��������� ��� ��������!��!�����������!������� !����������

�����%�-��������������������� �������� ����������!�� ������������������� ������������������������������

�������������� !��-���� ���� ������ ������ ���� ���� ���� ���� ������� ��� ���� �����/� 3�� ������� ��� �����

�������%� �����-���� �������� ���������� � �� ����� ��� �� ��������� ��� �������� ����.�� !�� ���� ������%�

-�����-��������������!�%�������.�������������%��������������������������,����������������������!��-����

�����������������������������6������������>??D8%�-����������������-��������7 ������6"������������>?C*=�

7�����������>?*@=�"�����������.���>??D=�����:$!��������������())E8/� �-���%��������������������

���������������������������������������!�����������������������������������������������������/��

3����������� ����������%� ������������������������ .��-�� ����������������������������/� �&����� ��������

�������%���������������������������������6����������&������>?*)=�5�����������>?*�=�A�������

����())D=�"����������())D8%�������������������������������6%%:&$�8%�-������������������������������

��� ������ ��������� -���� ����������� ����� �������� 6"������� �� ���� ()))8� ���� ��������� �������

�������������� ����������� ��� !���� ������ ���� ���� 6&���� A������ �� ���� ())D=� %����� �� ���� ())@=�

��.�����������())C8/� �$���������� ������� ������������������������� ���� �������-����� ����������� ���

�����������������������������������������������������������������������������������������/��

��

�������>�3������������

"� �� (D�

�,) ,� 0$ "��� �1$� "�$�� ��� �%�� ��� �$%� 40'�"��$� "$� 40�

�1�1�1���� '"#��

&����������������%�$�����>�����;�����������!��������������������������������������������������

���������� � �� 6�������������� ())��=� �������������� ())�!8/� �-���%� ����� ������������������������

����������������������%��������������� ������������� �����.��-�/�A����$�����>�����;���������������

�����������������������������������������������������������������������������������������������

�������������������������!�����������!��������������!������������/��

�,),� �������

%%�%%%% 2������'����%� ����� � ���

$���������������������%��!��������������������������������������������������������������������������%�

�������������������:�������!��������������������6�������������()))=�&����M�������())D=���������������

())E8/� 2����� -���� ����������� ����� �������� 6����8� ��� ����������� ���� ���� �����������

�������!��������������������������-���������������/� �-���%��������!���������������������������

������������� 5�&�����������%� �����������"�* ,�%� -����� �����-�� ��������� ��� ����%� ������ �����

����.��������� ������������������� ����� ��� ��������� ��� ��������������� ���������� 6H������������ ())D8/�

&���� ��������� ������������ ����� $�����>� ��� ���������� ��� �������� ���������� ���� ��� ��������� ��� ����

������� ������� ����������� ��������� �'����� ������ ����������������%� ���������� ���� ������������/�

$��������������������������%���������������������������������������������������������!������!����%� ���

���%� ������������� ����������'���������������� ����������������� ����������� ���������������� ��� ��������

���������������������/�

%%�%%%& '����%���������5����� ����������� �������� ���

A����������������� -���� ����������� .��-�� ��������%� ��������������� $�����>���� ��������� ��������

����������%���������%�����:��������������� ����� ����������� ��������/� ������������������������� $�����>�

�������>�3������������

"� �� (E�

�'������������������������������!�������6�����������>???=��������M:&��M���'���������()))8/�3��

��������%�!����������:�������������������$�����>������������%������������>):����%������-��������

7 ������ -������0$���������� ������������� ��� ������������������ ����� 6�������������� ())��8/� ��:

$�����>����������������������������������������������������������������6��������������())��8%�-�����

�������������%�$�����>�!��������������������������������������������������������-���������������

;������� 6�������� �� ���� ())��8� 6%����� >/D� �8/� $�����>� ��������� ��������� ���� !�� ��������� ���

�����������;��������������������������������������6��������>/@/(/>8/��

$�����������������������$�����>�����������������������������������%�������������������!����������

��������� �������������������������%�$�����>� ���.�� ���������"�<L������%�!�����������������������

����������������������������������������������-�������������6������������>??D=�#�����������>??D8/�&���

�:�������� &��:>� ����������� !�� ��������� ��� ��������� $�����>� ��� ���� 5�&� ���� �����!��� ��� ����:

���������������������������������6���������&����������>??*=�;�M'��M�������>???=�3����:$�����������

())�8/�

&��� �������� ��� $�����>� �������� ��� ���� ��������� ��� ���� ������� ��������� ������� ���� ��������%� �����

����������� ���� ����:����������� ��������/� 3�����������%� ������ $�����>� ���������� ��� ���� ������� ���

�������� ����������� ����� $�����>����� !�� ��������� ��� ������:����� ��������������������������������

��������� �� M���� ���������� ����������� 6�������� �� ���� ())��8/� �-���%� ����� �!��������� �'�����

������������ ���������� �� ������'��� ����� ����� �������������������%� ����� ��� ����!������ ��!������

������/���������������� ������������� ��.���� ��� ����������������������������������������������������

������ ���������%� ����������� ��� ������ ��������� ��������� ���� ���������� ��� ����������� !��-����

�����������������<������������%��������!�!������.�����������������������������������������/��

�,), 4�������

%%�%&%% 6�� ������������5� ������������� �������� ���

$���������������������%�;������� ��������������������������������������������������������������������

������/� ;������� ��������� ��� �-�� ���!���� �������%� ">� ���� "�%� ��������� !�� �� ������������������

6"$"8��������-����������������������������������������/�����������������������������"$"���������

���������������������� �������=�;)%�;>%�;(�����;��6���������������>??�=�����:I�������������

�������>�3������������

"� �� (@�

I��������� >??D=� 3��� �� ���� >??E=� I�.�� �� ���� >??E8/� $��� �������%� -���� ���� ���������� ��� ;(%� ���

��������������������%�-����;)�����;>�!����������������6��������������())�!8/�3����������%�;�������

���������� ���������������������������� ����"��������-��������7 ������-����;�������������� �����������

����������������������������������������������6��������������())�!8�6%�����>/D�!8/�

%%�%&%& 6�� �������� ���

&�������������� ������������������������� 6��8�������� ��� ����"$"�����������;��������������-���%�

����������������������!��-���� $�������������� $�����������������������������������������65���.����

���� >???8/�&������������������� �������������������������%�-����� ����!��� �������������� !������-���

������%� ����.����� ���� �����.����� 6�����.:���M���� �� ���� >??D8/� "������������������ ��� �!��� ���

�������� �� ������� ��� ��-��� ������%� -����� ����-�� ���� ������ ��������� ����� ������������ ��� �����

���������������6��������������B���������>??>=�&���.��������>??�8/�;�����������������������������

����������������%���������������-������������������������������������������������������������!������

���<������������������-������������������������������/��

;�������������������������������������������%��!����������!��������������������������������62����

����())E�8/�%����������%��������������������������6���8%��������������������������������-�������

���������������������-������������������������������������������������ ������/� &��������������

;������� ��� ������������������������������������������� ����������� ������������������������� �

��������������������������������������������������������-�������������� � �/�

;������� ���� ������������ ����� ��� ���� ��������%� ��������� ���� ������������ ��� ������ ������� ���

����������� !��-���� ����� �������� ���� ����� ������ �������� 6I��������� ���� ���������� >?*?8/�

�������������������������;������������������������������:��������������������������">�����"����������

������������6$���������>???=�B����������>???=�2��������())(=�7������������())C8/�$�����>����������

������������;������%��������������������������� � ��6��������������())��8%��������������������������

�����������������:���.��������������������">�����"���������%�-�����-���������������������������������

�!���������;������������������-���������������������������������������������������������!�����������%�

�����������������������������������������/�3����������������������;�������������������������������

������ ���� ����� ��� ����:��������� ��������� ��� ��������� ���� ������������� ���� ���� ���������� -���/�

�������>�3������������

"� �� (C�

�-���%� ���� ���������� !�� -����� ��������� ��� ;������� !�� $�����>� �������� ���� ���������� ����

����������������������������������������������������!�������������/�

&���5��:��.�����������������������"������������;�������������������������������6I�����������>??*8�

������������� ����5��� ������� 65���8�������-������������������ ����-���� 6L�����������())@8/� 3�� ����

����%�������������������5�������-�������'��������������������������������������������������������� �

��������������������7 �����/�$��;��������"������������.��-��������������5����%�;�����������!��

��������� ��� ���� ���������� ��� �������� ���������� ���<�� ������� ���������� ������� ���� ����������� ���

�������� ����� 5����/� %����%� ��������� ���� �������� ��� ����� ������������� ��������� ����� ;�������

��������� ��������� ����������� ���� ����� -���� ������� ;������� 6���� �� ���� ())C8%� $�����>� ���������

������������;������� ���������������������-������������� �������������� ����5��:��.���������-���������

������� �������� 6%����� >/�� !8/� A���� $�����>� ���� ;������� ��� ������������ ���� ������������

����������� ����� �������������� � ����� 6%����� >/D8� ���� ��� ������ $�����>� ����!�������� ��� ��������/��

2���� ��� ���� ���� .��-�� ��� ����� ��������� ��� �������%� �� ���� .��� ���������� ��� ����������� ����� �'����

$�����>�����;������/�

�������>�3������������

"� �� (*�

�,8 �1���'/&�4/,� 40�0���$%��"����

&��������������������������������������������������-���� ����������������������������������

��� ������ �������� ���� �!������� ��� �������� ������ ������ ������� ��� ��!��������� �� ����������/� � &���

�������������������������$���� ���0$������-��������7 ������ � �� �����������%����������������

������������������������-����������������������������������������������%�����������������������������

��������������������� ���� ������������������ �������� ���� ������������ ��������/�"����� �������������

������� !�� 3;&� �������� ���� �������������� ����������%� ������ �������� ��� �'����� ��� ���������

-������ ���������������� ��� ���� ��������������������� ��� ������������ ������� ����� ������� �� ���.

of �'���������������������-���������������������������/�

���������� �#� ��������� ��� ��������������������������7������������9��� ���#���������

������)��������� ��#������#�����������������,�

%�����������������'�����������������������������������������������������������������/�3����������

!��������������-��������������������������������������������������������������������������

�����3;&�����������/�������������������������������������������������������������������:�

�� ������� �� ����� ������� �� � ���� ������� ��� ����� ���� �� � ���� �� ����������

�������� ��� ������ ��������� ����5� ��� ������ '����%� ���� 6�� ���5� ���� ����� �� �

�� ������� �������������� ����� ����� �������������������� �%�

A����� ��� �������� ��� ����� �������� ��� 5�&� -���� ������� �����������%� ���������� ������������� ��������

�����������������:��

�5���������� ��������������)�������,������������������������������������������������������

������������!���������������������������������������������������������������������������!��������������

������� ��������������/� "����� ����� � ���� ���� � �� �������� ��� ����� !���������� ��������

�����������������������������%�������������������������������������������%�������������!�������������

����� ���������������������������/�2������ �������������� ����!��� ������������ ��� �������������������

!����������������/��

�������>�3������������

"� �� (?�

��������� �� ����� ������������ ����� � ����� �� ����� ���������� ������ �����������

������� �������������������������������������� ��5����;������������������� ����� ���

��������%��

5���������������������������#�����,�5��:��.�� ����������������!��������������������������

���� 7 ������������� ����������������� ������������������%� ������������������������������� !�������������

�'����������������������������������������������/��;��������:��������5��:��.�����������������������

5��� ������� ����������� ����-���� ��� ����� �������/� � %����%� ������ ��!������ ����� �����������%�

����������������������;�������!��$�����>%������������������������������� � �%���������������������

���;�������������������������������������������������/��2������;�����������5��:��.���������������������%�

����-�������������������!��$�����>�����������������������������������������������!����������������/��

��������� �����������1��� <��������� ����6�� ����; ����������������������� ��� ��

� ����������������� ��������������'����%�; �������������������� ���� ��%�

%���������������������������������$�����>�����;������������ ���������������������-������������!�����

������������� ��� ���� ���� ��� �������� ������ ���������� ��� ������� ����������%� ���� ������������ ���

�������� � �����������������������������������/��

�������>�3������������

"� �� �)�

�,= �"����$%�4/,� 40�0���

�,0�"�"��4/,� 40�0���$%��"���

4�#� ������O������� ��� ��������������������������������� �����#���������������9��

������������������� ���������#�����������������#������,�

&����������������������������������-���������-������������:�

• ���������-������;�����������$�����>���0$������������������������� ��� �������������

������������������������������-���� � ��������������������������/�

• ���������-������$�����>�����;���������������������������������������������������

��������������������-���� � �����������/�

4�#� ����� O� �� ������ �� � �� ��#����� ���� ��������� � �� #����� ��� ��##��� ��

���9��������� ����������� �������������������#�������� ����������"4������,�

&����������������������������������-���������-������������:�

• 5���!������������ �������������� ���������������!��������������!������� ������� ������������

��������������/�

• ��������� -������ ���� ������ ���� ���� ��� �� !���������� �����%� ����������� ���� �������� ���

�������!����������������������!��������������������/�

• ���������-������ ���� ���������� ������������ �������������� ������������ �����-���� � ����

���������/�

�������>�3������������

"� �� �>�

4�#� �����/O�4������������������������������ ������9�����#���������������#�����

��� ���&����������� ������� ��������,�������)���9��������,��

&����������������������������������-���������-������������:�

• "������� ������ ���������� ���������� ��� ;������� ���� $�����>� ���� ��������� �����

�����������������������������������������������������������/�

• ���������������������������������;���������������������������������� � �������������/�

• �������������������������:�������������������;�����������$�����>����������������������

������ � �������������/�

��

� #���� �

�������������� ����

�������(�&������������&��������

"� �� ���

,� �� 0'"�����

5'��������������������������6��"<"�����8�-�������������������������������������������������

$�������%�6������%�0�28/� ��������������������������6��"<������8�-����������������������%�

$�������� 6������%�0�28/���������������$A��-��� �������.���.�� 65����%�������%�&$8/����������

����!���� 6���������� ���������:��!����������:����:�!!��8�-��� ��������� ����&�������� 60��������%�

0�2%� $�������8/� �������� ������� ������� -��� ��������� ���� �$��&5�&� $�������� ���/� 7��/��

6$�������%� �$8/� ������� ������ -��� ��������� ���� "3A��%� 3��������� $�������� ���/� 7��/� 6;3�%�

$�������8/�$����������������-���������������������:$���������/�7��/�6������� ���%�0�2%�$�������8�

������������������-���/�

, �0 4�%��

, ,� �������

$�������� 6%>��ECA�<@� L��A$������������������������������� ����8� -������������������� >(��:>(���

���<������������-�������������-�����-�����������������!����/�$��������������������-�����������

!������#������������$�������F�����������������������-��������������������������-��������$���������

�������������������������������#������$����������������������������/�

, , �����������������������#�����

&��������������������������������� � �������������������-���������������()���3;&���������!���-��

������������!���������������������������������������������!���6;����������������>??)=���������

������())E8/�A�����%�����������)� ���������������������������������������%�U>� �������������� ���������

��������������������=�U(�������������� ������������������������������=�U������ ����������������������

����������������=�UD�����������������������������������������6%�����(/>8/�%�����������������������

������������������������6�538�6)/):D/)8�-�������������/�

Figure 2.1 Example of scoring system used to assess cumulus expansion following in vitro

maturation (IVM)

The degree of cumulus expansion of cumulus oocyte complexes (COCs) following 20 h of maturationwas assessed by two independent blinded assessors using a scale previously described (Vanderhydenet al. 1990). Briefly, a score of 0 indicates no expansion with cumulus cells lost from the oocyte andadhering in a monolayer to the culture dish (a), +1 indicates no expansion however cumulus cellsremain attached to the oocyte (b); +2 expansion of the outer half of cumulus cells (c); +3 all layersexpanded except the corona radiata (d); +4 expansion of all layers of cumulus cells (e). For eachtreatment a mean cumulus expansion index (CEI) (0.0-4.0) was calculated. Scale bar = 50μm and allimages captured at equivalent magnification.

b ca

d e

34Dunning

Chapter 2 Materials and Methods

�������(�&������������&��������

"� �� �E�

, ,/ -����#������'����%����������������

&����������������������������� ����������>(?��H<�ECA�@���������!��.����������� ��� �����������-���

�����!��� ���������� 6&����M� �� ���� ())D8/� ����M������ ������� 6���������>8� ���� ����M������ �����

6����������8� ������� -��� ����������� ��� �� >(� �:>(� �� ���<������ ������ -���� ������ ���-� ���� -����

�������� ��� �)���/� $��� ������ ����������� -��� �������� !�� &��� #��������� ��� $�������F�� �������

��������������-������������� �������������-���� ����$������������������������� ��� ������������

#������$����������������������������/�$�������>?:((�����������������%������-���-��������������������

-���!������������������������������/�"����������������������-�����������!�����������������������

�0$/� "������� �0$� -��� ��������� ���� ����� ���� !�������%� !�� ����!������ ��� EE��� ��� >� ���� 6>�)���

���.���8� ��� !����� 6>)�&� &��: �7� � � C/*%� CE�&� 0���%� (E�&� 5�&$%� >7� 6-<�8� ���8� �����������

)/>@μ�<μ�� ���������� �/� &�� ���� ��������� �����%� (E)μ�� ��� ������� ��������� -��� ������ ���� ������

�����-��� !�� ����������������� >�%)))��� ��� >)��������/� $������������ ())� ��� ��������%��'������

������-��� ��������� �������-� ��!�������0$�-���������������!���������E))���� ����������!�������

�������/��������������0$�-������������!�������������������>�%)))������()��������/�&���������������

�0$� -��� ����������� ��� >))� ��� ��������:���� (�/� &��� �0$� -��� ���������� ��� �-�� ����������

�������������������������������������������������-�����&�!���(/>/�&�������������������������������

���� Q$�����>� ��(� 6%8F� ���� Q$�����>� ���� 6�8F� -����� �������������� (� ���� �� 6%����� (/(��8/� &�����

����������������������������EC@!����������-��������������-���������(�-���������%����������������

��������������������������-���:������������6%�����(/(�!%�7����>8/�&��������������������������������

����������Q$�����>����6%8F�����Q$�����>����6�8F%�-�������������������>������������6%�����(/(��8/�

$� ���������� (C*!�� -������������� -���� ����� (� -��� �������� 6%����� (/(� !%� ������ (����� D8%� �������

����������� ������� ��� >�(�!�� -��� ���������� ��� ���� �������� ��� ����� (� 6%����� (/(� !%� 7���� (8/� &���

���������������������(C*!��������������������������Q$�����>����6%8F�����Q$�����>����6�8F��������

!���� ��� ���� �������� ����������� ����� ���� Q$�����>� ��(� 6%8F� ���� Q$�����>� ��(� 6�8F� ���������� ��

����M����������������� ������� 6%����� (/(� !%� 7����������� D8/� "���������� ��������������� E� EL�

"�&�'� %������ !����� 6����������������%� $��������%� 0�2%� $�������8� ��&�&���(%� )/E�&� �����

�0&�%�E���������������%�>/(E����������"�&�'���������������� (�����(Eμ�/�������������������������

-���?D��%�E��������� 6>������8=�?D��%�>�������=�@)��%�>�������=�C(��%�>�������� 6�E�������8%�C(��%�E�

��������6>������8/�$�����������������-��������������!���������������������������6��������(/(/D8/�

500

1200

1517

300

200

bp

Mark

er

1 2 3 4

Adamts1+/- Adamts1-/-

a

b

Figure 2.2 Genotyping of Adamts1 mice.(a) Schematic representation of the location of oligonucleotides utilised for genotyping in relation to 3 ofthe 9 coding exons of Adamts1. Adamts1 null mice were generated by targeted deletion of exon 2(Mittaz, et al. 2004). (b) Ethidium bromide stained 1% agarose / 0.5 X TBE gel showing PCR productsgenerated using primer pairs Adamts1 ex2 (F) and Adamts1 ex3 (R) (lanes 1 and 3) and primer pairsAdamts1 KO (F) and Adamts1 KO (R) (lanes 2 and 4). Genotyping of a heterozygous offspring yieldedPCR products as seen in lanes 1 and 2, while genotyping of an Adamts1-/- offspring produced thepattern seen in lanes 3 and 4.

Exon 3

Adamts1

ex3 (R)

Exon 2(homozygous

deletion in -/-)

Intron 1

Adamts1

ex2 (F)

Intron 2

Exon 1

Adamts1

KO (R)

Adamts1

KO (F)

36Dunning

Chapter 2 Materials and Methods

�������(�&������������&��������

"� �� �C�

9��� ,����������������#������������������������#������'����%��������,���

,������

��(������36�7/�5� "����80���?�

����������

���9���

3$��@@@@= ,65�

'�)�����

,������

��(������36�7/�5� "����80���?�

����������

���9���

3$��@@@@= ,65�

,���������

,������

��A��39#5�

$�����>�

��(�6%8�

$"&&$��&��$$&"�$"�&�&�$� 5����(�

6(*?�:(?>E8�

$�����>�

����6�8�

$&���"$"$"&"&�$�$�"&"

&�

5������

6�DD*:�D@?8�

EC@�

$�����>�

���6%8�

&��&�$$"����$����&&""� 3�����>��

6(>*>:(()>8�

$�����>�

���6�8�

&��&"�&""""&�$�$&$�$"� 5�������

6�D*D:�E)D8�

>�(��62&8�

(C*�6��8�

, ,3 ����������������# ������

���������������������������������-������������!�����������������������������������������������

>:(7� 6-<�8� ������� 6������� ���������%� $��������%� 0�2%� $�������8<)/EL� &A5� 6DD/E�&� &��%�

DD/E�&�A��������%�>�&�5�&$�� */)8�����(��<���5��������A�����/�5�������������-�����������

���)/EL�&A5�!��������>));/�&�������������%�EL���������!�����6(E7�6�<�8��������%�E)�&�5�&$%�)/(E7�

6-<�8�!����������!���8�-��������������������>L�������������/�&�������������M����������������������

�������� �0$� ��������� ���� �����-���� �0$� ��.��� -��� ��������%� ���><5���3� ���� �#�>?< ��33�

6"���-�.�%�$��������$�������8�����>))!��������6����������������%�$��������%�0�2%�$�������8/�

"����-����������������������#;���������������������������������������������6����.���>()8/�

, ,6 B�������9�������

�������� -��� ��������� ��� D:>E7� &��: ��� ���������� ����� 6A��:���� 7�!�������� ���/� 7��/%�

"����������%�0�2%�$�������8�����������������������������������������6�;�%8����!����63���!����:

�%� &�������%� 0���� ����%� 0�2%� $�������8/� $��� 2������ ����� ��������� ��:�������� ������� ���������

-��������.���6A��:����7�!�����������/�7��/%�"����������%�0�2%�$�������8/��

, ,) ����������4������������9�������

&��!�����-���!���.������&A�&�6>)�&�&���6� �C/E8%�>E)�&�0��������)/)E7�&-����()8������������

�7� 6-<�8� ���:���� ���.� ��� >� �� ��� ���� ���������/� &��!����� -��� ����� ����!����� -���� ������

�������(�&������������&��������

"� �� �*�

����!���������>������������������������7����.<&A�&/�����������!������-��������������>:E)))����

α:$�����>:&&�� 6�������� �� ���� ())��8� �� >:())� ��� α:H����5� 6���������� ������ ����:��5$$58�

6������������())>8/�A�����-��������-���������&A�&���������!�����-�����������������������:���.���

����:�!!��� 3�"� ��� >:>))))� 6&�������%� 0���� ����%� 0�2%� $�������8/� 5�������� ������������������

���������� -��� ����� ��� �������������F�� ������������ 6$������� A����������%� "5� ��������� 7����

��������%����������0�2%�$�������8/�

, ,8 -������ ��� ��� ��� �#��������� ��� ��97������� �� '����%� ���

6�� ������������(�������

&%&%9%% '������������ ��2���� ����'�2��

%�� ��������������������� �0$� �����!�������� ����� ����!���������������� ������%� ���� ����� �������

���������� &�'� �0$� ���������� 63��������� $�������� ���/� 7��/%� &�� 2������%� ;3�%� $�������8� -���

��������/�&��������%����������-����������������E)���������������������>/)�������������������&�'%�E���

>)L� ����%������������A����%�)/(�&�������0&�%�(�&�&���D%�)/D�&����������%�>:>)���������������

�0$� ���� ��,������ ��� �� ������ ������� ��� E)��� -���� (�/��������� ����������� -��� ��� �����-�%� ?D��� (�

��������6>������8%�?D��%��)��������=�EE����)��������=�@*��%�>������<���.!�6(E�������8/�������������

-����������������"����$����$A3�?C))�������������/�

&%&%9%& 2��� �� �����:����� ����

����������� ��M����� -��� ��������� ���� ������� ���������� 6$��������%� 0�2%� $�������8/�

&��������%�������������������-����������� �����()����������������������())��:>�������0$%�(:E#����

��������������������������M���%�(��������������������F�������������>)L�A���������������� (��

��� ()��/� �������� -��� ����!����� ��� �� ��� !���.� ��� >:(� ����� ��� �C��� ���� ��������� !�� ������� ����

��������������6(/(/D8�������������������������������������������������������������������/�

�������(�&������������&��������

"� �� �?�

&%&%9%& 2��������� ����� ������������

%���� ����� ����������� -��� ������� ���� ���������� ��������� ��� ������� �:�������������� ������

��������/�&����()����������������������������>)���������������3����������$�.������������������6�3�%�0�-�

5�������A����!��3��/%�3��-���%�&$%�#�$8�-�����������������!���������C�������)��������������-��������

������/�

&%&%9%( '��� � ��� ������+'�

3��������� ��������� ���� ������������������-��� ��������������������������������������� �����-���

!�� ������������/� &���� �����������,������� ���� ������� ��� >))��� -���� ()%� ��� -���������'���� ����������

������:��������:�������� 6(E:(D:>8� -��� �����/� &���� -��� ������ !�� ��������� ���� ����������� ���

>�%)))������>)��������/�&����'�����������-�������������-�������><>)������������&�0��$�������

� E/(� ���� �� �������� ��� �������� -��� ������ ���� ������ !�� ��������/� &��� �0$� -��� ����-��� ���

�������������� ���� ���������� ���>����� �������������������>�%)))��� ���>����/�&��������������

-�������������������������������0$��������������� (�/�

&%&%9%; 3 ��� ���

������������$���� ����������'�������-����������������������������������������%7$"�:�&;�:>���

������ 6�����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%� $�������8� ��� �����!��� ��� ��������� E/(/>/>/>� ����

E/(/>/>/(/� $��������� ���� �������� -��� �������� ������ ���� 2�M���� ����� �;� ���������:#�� �������

6����������������%�$��������%�0�2%�$�������8%� �������������������-��������������!�������������

�������������� 6(/(/D8%� ���� ���� ������ -��� ��!,������ ��� ���� ���������� ���������� ������6�8/� &���

������������������-�����!,������ ��� ���� ���������� ���������������������������� ���� �����/����������

���� �������� ���� ��������� -��� ���� �������� ������ ���� &��5������ "��� ���������� .��� ��� ���

�����������F� ������������ 6������ $������� �������%� ������� ���%� 0�2%� $�������8/� 7��������� -���

�������� !�� ������� �� �:>���������� �������� �����:�����%� >��������� &D� �0$� ������� 6������ $�������

�������%� ������� ���%� 0�2%� $�������8%� (��� >)L� 7�������� !����� 6������ $������� �������%� ������� ���%�

�������(�&������������&��������

"� �� D)�

0�2%�$�������8����� ()����()�����������!��������>@������>@�����/�$�����������%������������������-���

�����������������������������/�

&%&%9%� ��������� �����1%���� �

��������� -��� ���������� ����� ����������� ���������� 5/� ����� L7>� �� A���� �������������� ������

6���������%�7��H����%��$%�#�$8������� ���������������� �����������/�A�����%��������>/E������������

��!���-�����:����������� ���/����������������������������-��� ���-������ ��������>)������'������ �����

�������!�������-���!��)/(������6>/D(&8��:��������������/�%����-��������!����������������>)��������%�

)/>:E)���������������0$�-��������/�&�����!���-�������������!����������������)������������������:

������� �����D(���-����!���� ���DE��������� �����-���!�� ����!������ ��� �-������������� ���/�&���������

-�����������������?))������D(�������������6()�<7��������%�E�<7�������������%�)/E�<7�0���%�>)�&�

&���(%�()�&��������8%�������������>E������������!�����������!���������C���-������������6(�)��8�

���>����/�&��� ����������5/������-�������������7A:$����������6>)�<7� �������%�E�<7�������������%�

E�<7� 0���%� >E�<7� ���8� ����������� ����������� 6>))��<��%� �����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%�

$����������������!���������C������>@�����/�

&%&%9%9 '��� ��� � ��������� ���

������ ����������-���� ���������������:����������������-�����������!����������������������������

�����������������������������2�M����������;�&�������.���6����������������%�$��������%�0�2%�

$�������8/�����������������-������.�����������������������(������7����!����67A%�>)�<7��������%�E�<7�

������ ������%� E�<7� 0���8� ����������� >))��<��� ����������� 6�����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%�

$�������8����� ����!���������C���-������������ ���>@������6(E)��8/�%��� �������������%�>/E���-���

������%� !������� -��� ��������� !�� �������������� ��� >�%)))��� ��� >� ������� ���� ���� �����������

������/�&����������-�����������������(E)��������������������������������������-���!���������������

���(E)�����������7������������������������!�� ��������/�$�.����������������������� 6>)��8�-��������%�

������!�� ��������%� ����!������������ ���������� ���E��������%� �����-���!�������������������E)������

0������M�������������������������!����������/�&���!���������������-�����������������>�%)))������>)�

�������/�&��������������-��� ����������� ��� ���������������%���������������>�%)))����������� ���-�

������� ������� ���� ���� ����������� ��!�/� &��� ������� -��� -������ -���� CE)��� ��� ������� 2����

�������(�&������������&��������

"� �� D>�

��������%� ����������� ������ ��� >�%)))��� ��� >� ������%� �����-��� !�� �� ������� (E)��� -���� ����

�����������������(��������/�&���������������-������������������������>/E��������������!����������

���������0$���������������)������������� (�/��������-�����!,������ �������������� ������������������

�����-��� !��������������������������� ��� ������� ���� �������� ��� �������� ������/� ��������� ���������

-�����'������������������������������:�������'��������������������������������/���

&%&%9%< '��� ��� � ��������� ���

������� ��������� ����������� ���������� ���������� -��� ��-�� ��� �� ����� ������ ��� ������� ������

�������� ��� ����� ������ ���������:���� �������� �0$� ��� ������������ ����� ���������� �����/� � � (��� ���

�����������7����!����67A%�>)�<7��������%�E�<7�������������%�E�<7�0���8������������>))��<��������������

6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8�-��� ����!���������C���-������������ ���*������

6(�)��8/�%��� �����())���-�������� ��� ����������>))������7A� 6>))��<�������������8����� ����!��������

����!���������C���-������������ 6(�)��8� ��� >@�����/� &��� !�������-��� ��������� !���������������%�

>)%)))��� >)� �������� ���� ���� ����������� ��������/� ��������� -��� �������� ������ ���� ����������

��������&��������������6����������������%�$��������%�0�2%�$�������8�����������������������

�����������/�A�����%��������������!�������-�������������� �����������������������������������������

���� ��� ����� 7����� ��������� -��� �����%� ������ !�� ��������� ���� ����!����� ��� �� �������� ��� ����

�����������������-����������������������!�������������/�0���%�E������0������M���������������-���������

����������!�� ������������� ���������������������������>D%)))��� ����)��������/�&��������������-���

������������������������B�����A��������������������������������>%E))���������������/�&����������

-��� -������ -���� E��� ��� 5��������� �������� -���� ���� ()��� ��� ������� 2���� ��������� -����

�������������� !��-���� -������ ��� >%E))��� ��� E� �������� ���� ������� ��� ���� ���-� ������/� $� ������

�������������� ����� -��� ��������%� >%E))��� ��� >)� �������� ��� ������ ���� �������� �������� ���� ����

-����������������/�&������������0$�-����������-����())������������� (�����������������������>%E))���

��� E� �������/� &��� ������������� ���� ������ ��� �������� ����������� -��� ���������� ������

���������������%�����������������������������������������������(@)�������(*)��/�

�������(�&������������&��������

"� �� D(�

&%&%9%C ��=���� ���

��'�������� ��� ��������� -��� �������� ������ A������ &�������� �/>� .��� 6$������� A���������%�

�����!�%� ;3�%� $�������8/� ��'�������� ��������� ���������� ��� >?)��� ��� �������� �0$%� (/D����� ���

���������������%�)/D���&�����������������������&����/>%�(������EL�A���������'��������A���������

(�����()��/������������������������������'��������-�����������-�%�?@��%�>��������6>������8=�?@��%�>)�

�������=� E)��%� E� �������=� @)��� D� �������� 6(E� ������8/� ��'�������� �������� -��� ������������ !��

������������*)������CE7� ����������� 6�<�8%�!��������������������������������� ���� ���������� ���>E�

�������%� �����-���!�������������������>�%)))��� ���()������������� ���������� ��������������/�&���

�������� -��� -������ -���� (E)��� ��� CE7� ����������� 6�<�8� ���� �:������������� ��� >�%)))��� ��� E�

�������/�&��������������-������������������������ ���������������������!�� ����!������������!��%�

-���� ���� ����� ����%� ��� �� ?)��� ����� !���.� ��� >� ������/� �������� -��� ��������� ��� ���� &��������

������������'��������%�������� 63������������&�����������;���������������%� 3&;�%�$��������$�������8�

!�� ��� $A3� �C�)� ��������� ��'������ 6$������� A���������%� �����!�%� ;3�%� $�������8/� ����������

������������-�����������������������-������!���������'������������������/�

� �

� �

� �

� �

� �

� #����/ �

����������#��������� ����������������

��#����������%������ ��� ��������������

�������

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � DD�

/,� "$ '�%1� "�$��

3�� ���� �������%� ���� �������M���� ������� 67 8:����� ���������� �� ��'������ ��� ������� �'����� ���

���������� ���������� �������������� ��� ���� ������� 6�������� �� ���� ())(8/� $����� ������ ��� ��������

���������%� -���!�� ������������� ��������� 6 $8����� ������� ����������������������������� 65�&8�

���������������������'��������:����������������������������������������������������6���8�6��������

������������())@8/�&����������������������������������������������������������������������������6��������

���� ��!.�� ())C8� ��� ������������ !�� ����������� ��� ������ ��������� ��� �������� ��� �������������� ���

������ �������������������������������������������������������������� ��������67���������>??C=�

��!.��������()))=�I����������())>=�;�����������())(=��������������())�8/�&��������������������

������������������������� !������������� -������������������������������������ 6A���������� >?*�=�

$��-��������$�!������>??�=������������>??�=�&����M���������())D8/�

%����������� �������������� �'������������������������������������!����������������� ��������

������������������������������-��� ������� ������������ ��� ���������� !�� 7 /� ������������������ (�

6����8� ��� ��������� ��� ����� -��� 6&����� �� ���� >??C=� ��� �� ���� ())D=� �������������� ())E8����������

��������������!�������������-������������������������������������������/�;������������ $:!�������

������������ ����� ���� ��������� ���������� ���� ���������� ��� ���� ����/� $���� � ��0$� ���� !����

���������� ��� ������ ����� ��������� ������ 6�"��8� ����� 7 � ������������ -����� ���� �������� �������

�����������������5�&����������������������6��������������())�!8/��;�������������������������������

!�� !������� $� ���� ���� 0:�������� ���.� ������:������%� -����� �����:�������� �������� �������� -���� �����

������� �������� ���������� ���������� ������������ 6&���� �� ���� >???8%� ������� ��������� �������������

6#,����������>??D8%���-�����������������6L�����������())@8��������������62��������())(8/���

;������� ��� �� ��!������ ��� ���� �������� $�����>� 6�� ����������� ���� ����������������� -����

����!���������������� >8� 6������ �� ���� ())>8%� ���� $�����>���������� ;������� ��������� ������ ���

���������������������6��������������())��8/�3����������������$�����>����������������������C)7�

�����������������������������������;�������6��������������())E8�-�����$�����D�����!���������!����������

������������������6��������������())��=���������������())E8/�&��������������������������0$� ���

������������"���������������������7 :�������������6��!.��������()))8%����65�����������()))8%���-�

6&����� �� ���� ())�8� �������� 6A��!���� �� ���� ())�8� ���� ��� �������� ��������� ��� ������ ������

�������6H������������())D8/�$�����>������������������������-����������������������������������������

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � DE�

6&����M�������())D8������������������6A�-�%��������%��������%�����������������������8/�&����;�������

��� ���� ����������<���������� �������������� ���� ����������������������� ���������������������������

���������%��������������<��������������/�

3�� ������ ��������� ����������� ��������%� � ���� ���������� 63;&8� ��� �������� ��� ��� ����������

������������������������������������������������%��������������������������������.�������������-����

��������������������62��������"����())D8/� �-���%������������3;&����������������������������������� �

���������������'�������62��������"����())D8/�2��������������� � ����������������%���!����

������� ���� 3;&� �������� ����� ��������� ��������� ����%� ��������� ������� ��� ��!��� ��-���

�������������������������������������������������6"����������>?*C=�A�����������>??@=�"������

����>??*=�����������()))=�&�������������())>=�2��������"����())D8/�&�����������������������������

�������� ��� ��������� ��� ����������������� ���� ��!���������� 6"���� �� ���� >??*=� $���� �� ���� ())E8/�

5�!���'������� ���� 3;%���� � ����������������� ������������-��������������������������������

5�&� ������ 6&����M��� �� ���� ())D=� I����� �� ���� ())E8/� �������� ������ ����� ������� �������� ������

����!������� �������������������������65�����())E=��������������())E8%����������������������� ����

������� ����������%� -����� �������������� ���������� '������� 6 ��������������� ()))=�������������� ())(=�

�������������())�8/�&���%�������������������������������!�������������������������5�&������������

�����������������������3;&/�

3�����������������������3;&���������������������������������������������"����������������������

������� �������������������������������������%�������������� ;����������� $�����>/� � &�����������

-������ ;������� ���� $�����>� ��� ���������� ��� 3;&������ -�� ��������� �������������� ���� �������

�������!���������� � ������ � ���������������������������/��$�����������%�-������������-������

������ ������ ����������� ��� �������� ������� ��� ������ �������� ���� �"��� �����-���� � ��

���������/�

&%& �� 0'"�����$%��0 4�%��

/, ,� "����������������������������������#������

%�� 3;&%������-��� ��������� ������:��!�����(�:���:����%>��ECA�<@�L��A$������DD:D*�������� �/�/�

��,����������D3#���"/�������-���-������������������&5&�6������&5&��������������������-����E7�

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � D@�

6�<�8� ������ ����� ����� 6%��8%� )/(E� �&� ������� �������� 6"3A��%� 3��������� $�������� ���� 7��%� ;3�%�

$�������8����������������"�6>))#<��8%����������������������6>))��<��88��������������������������)����

�C��%� E7��(%�?E7���� ���������@���()��� ����������� >))�������������&5&������� �-���������!���

���������� ������������ -���� �������������� ���� 6�����:$������ ���/� 7��%�������� ���%� 0�2%� $�������8/�

������� ���������� ��������� ������ ������������� -���� ������ E)�3#<��� ����!������ ������ %� �

6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8������<���5���6�����:$���������/�7��%�������� ���%�

0�2%�$�������8���!����5�������%� ������������������/��

5������������������-����������� �����-����@�����()������ 3;&�������/� �$����@��� �����������������

�������%� $���� � ��������� ����� ���������� !���� ���-�� ��� !�� �������� ����������� ��� ���� �����

6%����������� >??C!=� ��!.�������� ()))=�������������� ())�=� �������������� ())�!8%� -����� ()��� 3;&�

��������������������� !�������-�� ���!�� ���� ����� ���������������������������������� � ���� 65�����

>?C?!=���-���>?*?8/��"���������)������-����������������0$����������������@�����()������������/�

"����������������� ������ ������-����������� ��� � ���������������!������� �����-����@��%�>(���

6����������8���>@���6������������8���"���������/��. � ��������������-����!�������������:

��!����� ����� ������� -���� �/�/� �������������� ��� ��"� 6D3#8� �����-��� ����� DD� �� !�� ��"� 6E3#8� ����

���������������@�����>(���6����������8���>@���6������������8/���������������"�����������-���

���������� !�� �������� ��� ����� ������ ���������� -���� �� (@:������ ������� ��� ������� �����/� ����� -���

�������� ��� ����� ��������������� ����"��� !����� ����������� ��� �0$� �� ������� ���������/����������

�����6>@����������"8�-������������!���������������������������������������/���������������"���

-����������������������0$��������������������!�������������������������������%��������������-��������

��M���������������� :*)��� ��� �������0$������������������������������2������!����������������

�����!���!���-/�

/, , "�������� ����������������������������

5�������������������������������������������-����!���������������2����F�������������F�� ��������

����� �������� 5������ ���������%� $�������� $�������/� 3������� -������ �������� ��� ���� ���� ���

�������� ���� ����� ��������� ������ -��� �!������� ���� �������� ���������� ����������� ��������� ���

�������%����-���%�������$�������/����������-������������� ��������������� ��������������������������

-�����������������������������/��������>D��������������������������������6������������D/E��/C�����8%�

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � DC�

�����������-�������!�������������������6��E8%���!�����������6��D8%���������������6��E8/��2�������������

!����� ����� ��������� �����%� ����� -��� ������������ ������ %� � 6>E):�))3#%� "����:%%� ������ ��

������%�������%�0�2%�$�������8����� �����-����*:>D�����%����������-������������������� �������������

�>*��� �������� �!������ !�� ������������ ���������� ������ -��� ���������� ��� ������� �������/�

%����-���� ����� �!��������%� -����� -��� ������������ >)%)))3#� ��"� 6������%� ������%� 0�2%�

$�������8%�������@�������������-�������������������������/�%����-��������������������������������������

*:(������/��$���������������������������������������%�-�����������@)��)7����������������������6C@7����

3��3� ��E%� �� E(7� ��� 3;%� ��?8/� %����� ������� ��� ��������� ��������� ��������� ���� �� ������� ��!���

���������������������������������%�����������!������������!���������*:-��.�/�2���!���������������

����������������������������������������������������������������������������������������/���������

������-��� ��������� ��������� !��������������� ����������� ��������������������������� !����� 3;%�

6��?8%���������������� �����������������!����� 3��3� ��� ���� ��������������-��������� ������ ����������/�

&����� ��������� ����� ����������� �������� ���-��� ��� ������������ ����������� ��� ���� ���������� ���

$,-,.��#%��"�* ,������,�/�&���������������������� -����������������� ����������� �*)���������

�0$�����������-����������/��

/, ,/ '��������' 7,�'�

&������0$�-������������������&�M���63���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8%�������

����������F�� �����������%�-���� ���� ������������� C/E�A����"�������� 6$�!���%�$�������A���������%�

�����!�%�;3�%� $�������8������� ������������/� &����� �0$� -��� ����� ������� -���� >#���� �0������� ���

����������F�� ������������ 6$�!���%� $������� A���������%� �����!�%� ;3�%� $�������8/� %���� ������

��������������0$� 6��0$8�-��������������� ���� �������0$� 6�E)��� D))��8������� �������������

������ 6"���-�.�%� �������� �$%� $�������8� ���� ���������� 333� ������ ������������ 63���������

$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8/��

���������������������������������&:����-����������������������!���������0$���'�������6&�!���

�/>� ���� �/(8� ������ ����� 5������ ����-��� 6�5� $������� A���������%� �����!�%� ;3�%� $�������8� ����

������������!��������"�������6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8/���������������

��'�����������������������%�$���� %����������-�2�>%������������"�* ,�%�$,-,.��#%���,��

���� -�2�>� ��� ������� ��� &�!���� �/>� ���� �/(� �����������/� ����� ��'������� ����� ������� ������ ;>�

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � D*�

$,-,.��#��������������������������"�* ,��-��������!�������������6�����������())D=��������

����())E8/������ ������&:����-����������� ��� ���������� ���������������������$A3�"���$���EC))�

��'�����������������������6�5�$�������A���������%������!�%�;3�%�$�������8/��3��������������%�(����

��0$� 6�'��������� ��� >)������ �������0$8%� )/(���� ��-������� ������ �����%�>)�����BA��"����

����������-������������� (�����������������������(Eμ�/�$���������-�����������������������������

E)μ&� -���� ���� ���������� ��� ������ ;>�$,-,.��#� �����%� -����� -��� ����� ��� (Eμ&� ���� ������

�"�* ,�%�-�����-�����������@/(Eμ&/������������������������-���E)������(����%�?E������>)����%�

�����-��� !�� D)� �������������� ������� ��� ?E��� ��� >E� �������� ���� @)��� ��� >� ���/� �������� ���������

������������������0$�������������&���M�����������-����������������������������=���������-������

���������������������������������������������/��������%�$���� �������������������������-���

������M��� ��� -�2�>:�������� ������� ���� �"�* ,�%� $,-,.��#� ���� ��,�� ����� ���������� -���

������M������-�2�>������-��������������������������������!����������������������(:6���&8��������

6�/�7���.��5:$A3%���'��������������#���A��������(8� 67���.����������������())>8/��������� ��������

����-���������M��� ��� ��������!���%�-�����-��������� �����!��������������>/�%��������$���� �

�����������%� ���� ������&:���%� ��������!����-����0$� �����"����������"�U���"�>(��� � ��

��������/�%������� ��������!����-���������������"�U���"�@��� � �� ��������/�%��������;>�

$,-,.��#%��"�* ,��������,������������&:���%���������!����-����0$�������������������������

(?�&/�%����-�������� ������&:���%������������� �������������������������������� ���������������������

-����������������������������/�

9���/,���������'��� ����,��������(�������

"���� �����0���� $����������M��6!�8� ��'������6EF:�F8� $�����������/�

�������� $�$&&�>�%� >D*� &"$&$$"&"&""�"&&&"&""� 0&D))?@(>�

�������� $�$&&�>��� � �����&&&"$&&��"$&"&� 0&D))?@(>�

������ ;�������%� >D�� �&&&"�&�$&�"$�"�$�$&� L&DD**E>)�

������ ;��������� � &"&�$&&"$""��"$&��$� L&DD**E>)�

����� ��(�%� >)D� �$"$��&&�&�$�$&"�$�$$&"$"� 0&D))*(>@�

����� ��(��� � &�$"&&$�$"&&�"���$&"&$$$�� 0&D))*(>@�

-���>� 7>?�%� >)�� &&���"$"&$�$"�$��&&&"$�� 0&D))?)C*�

-����>� 7>?��� � �$�""�&&&""�&&�$&&&&$$�� 0&D))?)C*�

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � D?�

9���/, �4����'��� ����,��������(�������

/, ,3 B�������9���

3���-���������������������%������������������������������"���-����������!�����������������

���)/)E&���������������%�@&���������)/>7�&�����!����������������� ����!����� 6)/>&�5�&$%�E��&�

!��M�������%� )/))E&� �������������������� �������%� >)� 3#<��� ��������� ���� >)μ�<��� ������ ��������

����!���� ���.����� 6�����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%� $�������8/� ������� �������������� -���

����������!��A������������ 6A��:����7�!�����������/�7��/%�"����������%�0�2%�$�������8/���������

-����������������� �������!�����������>:E� ���)/D&���������������%�)/>7�A�$�����)/D&�&��: ��%�� �

*/)������������)/)(#<�����������������$A����������!��������>������C��/�&����'������������(>������

-��� ������� ��� ����� ��������/� %�� ��������� ����� �������%� ���������� ��� ���� ����� ����� ��� � ��

������� ����%� ���� ������� '�������� ������� -��� �'�������� ��� ���� �������������� ������� ��� ����-�

������������� �������������!�����������$�����>�����;������� �������� �����������������/���������

-������������!�����:�$"5����� ����!����������������������������������6�;�%8����!����������

�������� (/(/E� ���� ������!�������� �������� ������ ����!������ �������� �������� $�����>� ���� ����

����������� ��������� !�� $�����>� ��������� ��� ;������� 6��5$$58� 6(/(/@8/� &��� !����� ��������� !��

2������!����-���'�����������������������������N�����������6A�����%�����������.%�0�2%�$�������8�

����-�����������������!�����������������������������������/��

/, ,6 �����������������

"���� �����0���� $����������M��6!�8� ��'������6EF:�F8� $�����������/�

�"�* ,�� �$�$&&�>%� *?� "�$�&"�$$""�"&$""$�� 0&D))@?**��"�* ,�� �$�$&&�>��� � $$"�$&""&&&��$�$&$"�"� 0&D))@?**�

$,-,.��#�6;>8� �;>�%� >((� &"$"$$���&"&$&�"&&&&"$"$� L>E??*�

$,-,.��#�6;>8� �;>��� � �&"$$&�&$&&""$&"$��$$&&$�$�� L>E??*�

-�2�>�� �7>?�%� C?� �$&"��$$$&""$��$$&"&�� 0&D)>DC@��

-�2�>�� �7>?��� � &"�&�$""&&��$&"�&�$&&$� 0&D)>DC@��

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � E)�

&���������������&:��������������������������������������������������������-����������� ���

���������� ���� ��������� !�� ��������� �����:2��� $0�;$� ���� �� &�.��� ����� ���� ����� ������ �����

�������>��6����%��������%� 37%�#�$8/�$���������P)/)E�-��������������������������������������/�%�� ����

������ ���� ������&:��������������%� ���������������������������-������������!��-������������

���������������������������������:����/������������-������������������������������������������������

)/)E/�

/,/ '0�1� ��

/,/,� "�������� �� '����%� ��� 6�� ���� �'$�� ��� "4�� )�� �� � ��� �������

����������#�����,��

&������������������������������-������������6��������(/(/(8� ������������-������ 3;&������������

-����������/�$����������%�������������� -�������5�����%� ��������� ������� ��������������������

����������6������53���)/*(%�%������/>8�-�������������������������������������������������6�538�-���

�!������ �������� �������-����5"%� 6���<��%��53����/@8%�%� �6E)�3#<��%��53����/D8���5"%�U�%� �

6���<���UE)�3#<��%��53����/D8%�-����������������������������������53�!��-����������������������������

6%������/>8/�&��������������������������� �������� � �������������������������-���������������

�!������������������������!����������6��-���>?*?=�;����������������>??)=���.�������())D8/�

5������������������������$���� ���0$�-�����������!��@�����(D:������������������������������@�

�� ��"� ��������� � �� �������� ��� ����� ���� ��"� ����� ������� ����� 6%����� �/(%� �� ���� !8/��

�-���%������ 3;&� ��������� ���@��� �����-������������������ �����������������������������$���� ��

!��%� %�5�������������!�������/��&��� �������������������$���� ����������� ���3;&������-���>)�

����>E:�������-�������������������@�������������������������������@��� � ����"���������/��. � ��

���������������������D)7���-���������������������������$���� �������������"����������������

�������������%�!������������������-������������������/��

��!����������������������������������������3;&����������������������������3;&������������-����������/��

�-���%��������'���������������������������������������������������������������������������������

����������-����������������3;&����� � ������������6%������/(��8/�$����������%�����������������

Chapter 3 Altered Composition of the Cumulus Oocyte Complex Matrix During in vitro Maturation of Oocytes

Dunning 51

Figure 3.1 High degree of cumulus expansion was demonstrated with all treatment regimes. Cumulus Oocyte Complexes (COCs) were cultured in the presence of Egf (3ng/mL), FSH (50mIU/mL), Egf (3ng/mL) + FSH (50mIU/mL) or no stimulus (-) at 37ºC/5%CO2/95%air for 20 h. The data is expressed as mean +/-S.E.M. (n = 3 independent experiments).

a

b

b b

Chapter 3 Altered Composition of the Cumulus Oocyte Complex Matrix During in vitro Maturation of Oocytes

Dunning 52

b

a

COC

mGC

Egf + FSH Egf FSH -

eCG in vivo 6 h in vitro maturation

eCG in vivo 6 h hCG in vivo

eCG in vivo

Ada

mts

1 R

elat

ive

mR

NA

Exp

ress

ion

b,c

b

a

a

c

b,c

c

b,c

COC

mGC

eCG in vivo 6 h in vitro maturation

eCG in vivo 6 h hCG in vivo

eCG in vivo

Egf + FSH Egf FSH -

Vcan

Rel

ativ

e m

RN

A E

xpre

ssio

n

a

a

b

b

a a a a

Vers

ican

Chapter 3 Altered Composition of the Cumulus Oocyte Complex Matrix During in vitro Maturation of Oocytes

Dunning 53

Figure 3.2 Induction of Adamts1 and Versican mRNA in vivo but not in vitro in response to 6 h oocyte maturation stimuli. Analysis of mRNA expression in mural granulosa cells (mGCs) or cumulus oocyte complexes (COCs) from equine chorionic gonadotrophin 44 h (eCG) stimulated mice after 6 h of maturation by in vivo hCG treatment or IVM culture with Egf, FSH or a combination of the two. The mRNA expression of (a) Adamts1 (b) Versican and (c) Has2 is normalized to the Rpl19 internal control and presented as mean ± S.E.M. (n=3 independent experiments). (a) Adamts1 and (b) Versican are expressed relative to the calibrator (mGCs treated in vivo with eCG + 12 h hCG), which was set at 1. (c) Has2 is expressed relative to the calibrator (COCs treated in vivo with eCG + 6 h hCG), which was set at 1. Bars with different characters are significantly different (P<0.05).

eCG in vivo 6 h in vitro maturation

eCG in vivo 6 h hCG in vivo

eCG in vivo

Has

2 R

elat

ive

mR

NA

Exp

ress

ion

COC

mGC

d d

b,c

c,d

c,d

a

b

a

Egf + FSH Egf FSH -

c

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � ED�

���@���-�����������������������������%����������������� ����������������������������-���������������

����� �����-�����������������-���%������������������� � ���� ������� ���������-����������5��%�

%� � �� 5��� U� %� � �������������� ��������� ����� ���������� *%� D� ���� @:����� ������������ ���� ����

��������������������(D)%�>()�����()):��������������������������������������������/��&��� � ��

��������������������0$������@��������"����������-���C):�������������������������:���������������

���%�����-�������������������-������������������������5����������3;&�����6%������/(��8/���

&�� ��������� -������ �������� ���� $���� � ���������� ��� ������� �������� ����� 3;&� ����������%�

��0$� ������� -��� ��������� ��� 3;&� �������� ����� ()� �%� -����� ��� ���� ��������� ����� �'����� ���

��������� ���������� �������������� � ���� 65����� >?C?!=� ��-��� >?*?=� ��� 7�� %������ �� ���� >???8�

6%������/�8/�5�������������������!����������������$���� ����3;&������-����������!��������������

��� �������� ������� ����� ����� ��"� ��������� ������ 6%����� �/�8/� 3�� �������� ���������� ��� !����

�������� ���� $���� � -��� ��.����� �������� �������� ������� � �� ��� >(� �� 6(>:� ���� >@:�����

�����������8� �� >@� �� 6�:� ���� E:����� �����������8� �������� ��� �������� �����������/� &��� ������ ���

������������$���� ���0$� ����"���-����������������������� ����� �������� ���� ��������� ����������

�����>(�����"�6(�����>/�:����������������8/��

/,/, ��� � ���� ������� �������� ����� ��#������ ��� ���������� ��� �������

#�����&���,������������������)���4������,�

&������������!���������������0$����������%�-������������������!�����������$�����>%�;�������

��������C).���;��������������������������������!��$�����>��������6��������������())��8/�2������

!�������������-����������������-����()������ � ������������������������������������!�������-�����

!���������������������������������������������� � ����65�����>?C?!=���-���>?*?8/�&����-�����������

�������������"���!���������������������:�������:����������6>(�����>@�����"������������8�����������

���������� !���� ���-�� ����� �������������� ������� �����-���� ���������� � �� ����� ���� �'���������

������� ��� ��������� ��� ����� ��� � ���� ��������� ����� 6�������� �� ���� >??(8/� $!������� �������

��E).��� ;������� -��� ������� ������� �����"�� �������� ����� ��"� >(� �� ��������� 6%����� �/D� �%�

7�����D�����@8�!��������������!�����������������"�������������6%������/D��%�7����>8/�&����-������

�������!�������� �������;������� ����������������-����������������67����(8�������������()���-����5���

67�����8/�&���C).����������������������;�����������!�������������������������������$�����>�

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� ��� EE�

��������/,/�"����������'����%����6�� �����'$�� ��� ���9������ ��� ����������#������ @� ���������������������,��$�������������0$����������� ����������������������������� 6�"��8����������������������������6����8���������������>(���>@��� � ��!����"������������ ���3;&��������-����5�����%� ����()��/�&�����0$��������������6�8�������������6!8�$���� ����������M����������-���>����������������������������� ��� ����� �� �/5/&/� 6���� ������������ ����������8/� 6�8� �������� ���� 6!8� $���� � �������������������� ��� ��������!����6�"��� ������� � ��-������"�U�>(�����"8%�-�����-����������>/�A���-������������������������������������������������6�P)/)E8/�

a

b

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

� � � � � � �

Ada

mts

1 R

elat

ive

mR

NA

Exp

ress

ion

COC

mGC

eCG in vivo20 h in vitro maturation

eCG in vivo 12 h hCG

in vivo

eCG in vivo 16 h hCG

in vivo

eCG in vivo

Egf FSH -

Ada

mts

1 R

elat

ive

mR

NA

Exp

ress

ion

a a a

b

c

a a a

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1 2 3 4 5 6 7 8

Vcan

Rel

ativ

e m

RN

A E

xpre

ssio

n

COC

mGC

eCG in vivo20 h in vitro maturation

eCG in vivo 12 h hCG

in vivo

eCG in vivo 16 h hCG

in vivo

eCG in vivo

Egf FSH -

Vcan

Rel

ativ

e m

RN

A E

xpre

ssio

n

d

c,d c

b

a

d

c,d

d

Chapter 3 Altered Composition of the Cumulus Oocyte Complex Matrix During in vitro Maturation of Oocytes

Dunning 56

Figure 3.4 Protein abundance of Adamts1 and Versican after IVM or in vivo stimulation. Adamts1 and versican protein were analyzed by Western blot in mural granulosa cells (mGCs) and cumulus oocyte complexes (COCs) after in vitro maturation (IVM) or in vivo stimulation. The equivalent of 21 COCs from 3 mice was loaded for each treatment. For mGCs the protein quantity loaded was equalized to the respective COC sample. The blot was probed with antibodies that detect full length versican (a), the ectodomain DPEAAE generated by Adamts1 cleavage of versican (b), or Adamts1 pro- and active isoforms (c) as described in Materials and Methods. Molecular weight marker sizes (kDa) are indicated to the right of the Western blot. Quantified intensities of each protein are shown in d and e. (d) shows relative intensities of full length and cleaved versican bands. (e) Relative intensity of pro- and active Adamts1. Data shown is from one representative of two replicate experiments with identical results.

e d

0

50

100

150

200

250

300

350

COC

P/hCG12h

COC

P/hCG15h

GC P/hCG12h GC P/hCG15h

Den

sity

X10

6

versican

Adamts1 Cleaved

Vcan

COC

12 h hCG

COC

16 h hCG

mGC

12 h hCG

mGC

16 h hCG

0

50

100

150

200

250

COC P/hCG12h COC P/hCG15h GC P/hCG12h GC P/hCG15h

Den

sity

X10

6

Pro Adamts1

Active Adamts1

COC

12 h hCG

COC

16 h hCG

mGC

12 h hCG

mGC

16 h hCG

100 75

c

b

75

50

350

a

in vitro maturation

in vivo maturation

7 6 5 4 1 2 3

COC

44 h

eCG

COC

12 h

hCG

mGC

12 h

hCG

COC

-

20 h

COC

Egf

20 h

COC

16 h

hCG

mGC

16 h

hCG

versican

Adamts1

Cleaved

versican

Pro

Active Adamts1

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � EC�

����������������������������������6��������������())��8�����-��������������������������������������

>(� ���� >@� �� ��"� ��������� 6%����� �/D� !%� 7����� D� ���� E8/� $�����>� �������� ;������� -��� ����

�!������� �������� �����-�������������� 6%������/D� !%� 7����� D����� E�����%������/D��8%���-���� �����

;������� ��������-������������!��� ����"��� 6%������/D�!%� 7����� @�����C8/� � 7�.�-���%� ������������

;������� �������� -������������!��� ��� �������������� ����� ��������� 3;&������ 67����� (� ������

�����������%�%������/D�!8/� � 3������������-���� �����������������������;������%��������$�����>����

*E.���-���������!������� ��� � �������������� 6%������/D��%�7�����D�����E�����%������/D��8/��

&���������� �������� -����/D:����� ��������������� ���� ��:������� 6>>).��8������ >(�����"� � ��

������������ 6%������/D%�7����D�����%������/D��8%����� ������������������ �������������>@��������

��"%�������������$�����>�-����������!��� 6%������/D%�7����E�����%������/D��8/� � 3���"��� ���� ����

�����������������:������������$�����>�-��������������'�����!��������6%������/D��%�7�����@�����C�

����%������/D��8/�A���� ��������������������� ��������$�����>�-����!����� ���������������":�

��������� ����/� � 3���������%������ �������� ������ -������� ������������ �� 5��� ����������� 3;&������

��������������������!���$�����>��������67�����>%�(������%�%������/D��8/�

/,/,/ '�'���%� ���612���'+� �'$�� ��� ���� �������� ��� ����� �������

������

5�������������"�* ,������$,-,.��#���0$� -��� ������������� ������������������������������

��������������������-����������������������������������/�3������������������������������������

����� �������� ���� >D� ��������%� �"�* ,�%� $,-,.��#� ���� ��,�� ��0$� -��� �!��������� �������

6%������/E8/��&������������������,����0$�-�����������������D/�:��������������������������������������

�������� ����� ��������� ����� ����%� ���������� ���� ������ ��� ����� ��������� ����� ����/� � 3�����������%�

$,-,.��#���0$�-����������������������*/(:��������������������������������������������������������

6%������/E8/� � 5�������������"�* ,����� ����� ��������-�����������!�������������0$� ��� !���������

�����������/�

Chapter 3 Altered Composition of the Cumulus Oocyte Complex Matrix During in vitro Maturation of Oocytes

Dunning 58

Figure 3.5 ADAMTS1, VERSICAN and HAS2 mRNA are expressed in human cumulus and granulosa cells after in vivo stimulation. Real Time RT-PCR analysis of mRNA for ADAMTS1, VERSICN (V1 isoform) and HAS2 in paired human cumulus and mural granulosa cells. The data is expressed as mean ± S.E.M. and normalized to RPL19 (n=14 patients). ADAMTS1, VERSICAN (V1 isoform) and HAS2 are expressed relative to the calibrator (293T cells, human embryonic kidney), which was set at 1. Asterix indicate significant difference (P<0.0005).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CSPG2/Versican ADAMTS1 HAS2

Cumulus Granulosa

Rel

ativ

e m

RN

A E

xpre

ssio

n

*

*

Versican (VCAN) ADAMTS1 HAS2

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � E?�

/,3 %"��1��"�$��

&�������������������� � ������������ �������� ���������� ��������������������%� ����������������������

����������������������������"������������������������������������������������-���������������

� ������������6���!������������())(=�2��������"����())D=����!������������())E8/�3�������������

������ -�� ����� ���-�� ����� ������ ����� ������� !�� 3;&� ��� ���������� ��� ���� ������ ����������%�

$�����>�����;������%����������!��������������� � �/��

&����������������������������$���� �-��������������-������@��������-������"���������������!����

�������������"�����������������������������>(�������@:>(��������������������������������������

�"���6��!.��������()))=���������������())�!8/� �-���%����������������������3;&����������@���

()� �� ���-� ��� ������������ ���������� ��� �������� �� $���� � ��0$� ����� %� � ���<�� 5��� ���������

�������� ������������ �������/� &�������������� >):E))� ����� ��-������������ �������� ��������

������"<>(�����"������������/�&��������������������������� � ��������������������!�����������

����� ���������� ��� �������� ����$���� � -����� ��� 3;&� -���� %� � ���<�� 5��� �������� ����� ������ �����

���������� ������������/�&��������3;&���������-��������������������������� ��������������������0$%�

�����'��������������6��������������())E8/�� ��(�����������-�������������������@��3;&�����������

����������@��������������� � ������������ ����� ����������� ����������������������������� ����������

����-����-����������������������3;&�����������/������������������!�������������������������������

$���� %�������������������������� ��� �����"�� ������������������������������� � ��6��!.����

����()))=���������������())�!8/�� �-���%����� �������!����������������'�����������������������������

���������� ��������� ����� ����'������������������� ���������������� ���-�����!����������-�����������

����������������/��2��������-���%�����������������������.��������������6��"<>(�����"8�������������

$���� � ���������� -��� �������������� ������ ��� �"��� ����� ����%� ����������� -���� ������ �����

������������������������������������7 ����-�������������������������������������������������

6��!.�������� ()))=� ������������ ())D!8/� � &����� �-�� ����-�������������������������"�����������

������ �������������������� ���������� 65�����������>??C=���!.��������()))8/� �%�������%�����������

������� ��� ��:$�����>� ������� ������������� �������� ��� �"��� ���� ���� �������� ������� ��������

����������� �������� -������������������� ���������� ������� 6�������������� ())��8/� &������������

������� ���������� ������"������ ������������������$�����>����������� ��������� ���������� � �/�2��

��������������!����������������$���� ����7 :������������������������������������������"��%�

!������������������������������ � �/���

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � @)�

$���� �@� �� ��"� �����������%� ������ $,-,.��#� ���� ��,�� -��� ������������� �������� ���������

�����/� &��� ������� ��� ������ $,-,.��#� ���������� ������� ��� ���� ��������� ���� ����� ��� ������

���������%�-�������������!�������������0$�������� ��������������������������������/�&��������!��

���� �������������� �������������� ������������ �����-�������������������������������������������� ���������

��������� ����������� ��� ��������������� ��� �������� ���������� !��-���� ������ �������� -���� ;�������

!����� ������������� �������� ��������� ��� ������ ���������/� 3�� �������%� �"�* ,�� ��0$� -���

�'��������� ��� !�����������������������"��� �����-���������������%�������� ��� �������������� ���������

���������/� �������%� ����������������������� �����$�$&&�>�����;5��3�$0���� ��������� �������������

����������������������������������%�!���-��������������$,-,.��#������"�* ,���������������

����������������������������3;&��������������������������/�

&������������������������������������ � ���������������������!��������3;&��������������������� �

������������������������������3;&�������������������������������������������������������������

������������������!��������������������'����/�2������$�����>�����;������������������������������

������������������������%����������������������%������������.��-�%�!���������������������-������������

����������� !�� -����� ��������� ����/�%�����%� ��� ��� .��-�� ����� ;������� ������������� ��-��� ������

������� ������������ 62�� �� ���� ())D8%� ���� ����� ;������� ���� ���� ��������� �������� ����� 5��:��.��

�������������������6L�����������())@8/�$�����������%�$�����>�������������������������-��������������������

;5"%�%� %"%�� ���� ���� 5��:��.�� ������� 67�'��� �� ���� ())�=� 7��� �� ���� ())@=� ����� �� ���� ())@8%� ����

���������� ;������� ������� ��� ���� ����������� ����� 6���� �� ���� ())C8/� 3�� �������� ����� $�����>�

�������� ;������� 6�������� �� ���� ())��8� !��� ���� ����� ���� ��� ������� ��������� !����� 5��� ����

������������ ��������������� ��� ����� ������ 67��� �� ���� ())@8/� &��� ���������� 5��:��.�� ��-��� ������� ���

������������������������'�����������������������������������6��������-�!����������������!.��())C8/�

&���%������������������������������:�����������������������������!����-������������������!���������

$�����>� ���<�� ;������� ��� ��.���� ��� !�� ����������� ��� 3;&� ������� '������/� ��������%� ;�����������

��������� �������� ��������� ��� �������� ������� �������� 6���8� ����������� -���� ���� ������������

��������� ����� ����� ������ ���������� � �$� ���� ������ 3;&� -���� ������� ����������� ����� ��� ���

�������� ��� ���� -����� ��� !������ 3;&���������������� ������������!��������������� 67������������

>??@=� ���������������()))8/�&��������������������������������������;������%���������!�����������

������� �������� 62�� �� ���� ())E�8%� ���� ������� �������� ������ ���� �������� ���� �������� ��� ����

�������/�

���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������

"� �� � @>�

���������������-������������������������ � ��������������������!����$�����>�����;���������0$�

���� ������%� ����.�� � �� �����������/� � ����� � �� ������������ �������� ������� ������

������� ����%� ��������� -������ ����� ���������� ��� ���������� ��� ������ 3;&� ����������� ������� ��� !��

�������������������/�&������������������������������������������3;&��������������.������������!����

�����������������������!���������������3;&/��&���������������!��-��������������������������.��

����������'����������-�����������������������������������������$�����>�����;����������3;&������������

������!,��������������������������/�

� �

� �

� �

� �

� �

� #����3 �

�����������������������������������������

������������)������

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � @��

3,� "$ '�%1� "�$��

2����� ���� ������������ ������������������������������������6���8������� ���-���������!��� ��������

�������%���������������������������������������!����'������������������$�&%�������������������������������

���� -���� ���������/� ��� �������� ������������� ��� ���� ����������� ����� �������� ���� ���� ������ ���

��������� ������ ���������%� ��� �������� ������� ���� �������� ���� ��� ������������/� �-���%� ���� ���� ���

������ �������������������� ��� ������������.��-�/� &����������������� ������������������ ��� ��������%����

�����������!������ �������� -������������������� ��� ������ �������������� �������� �����������������

�������������������������6&�!���>/>8�6������������>???=���!.��������()))=��������������()))=������

������())>=�I����������())>=�;�����������())(=�&����M�������())D=���������������())D8/�&�������������

����������������������!��� ������������������������������������� 6������������ >???=� �M�.��������

>???=�2�����������()))=�I����������())>=�;����������� ())(=�%�����������())�8����-������� �������

���������� ����� ����������� �� .��� ���� ��� ������ ��������� 6&�!��� >/>8/� %����� ��� ����%� ����� ����!���

������������ ��������� ��� ������������� ����%� ���� ��� ����� ������ ��� ���� �������� ������ !����� �� ��������

����������� �������� �����������/�$�����������%���������������%�����������������������!������ ���������

���������!�����������������������������'������/�&��������������������������������������������������

���� ���������� !�� -����� ������ ����� ���������� ��� ������ ������ ������ ��� �������� ��������� ��� �������

��.��-�/��

&��� ���������� !��-���� � ���� 63;&8� ���� � �� ������� ���� ������ 6������� �8%� ������� ����

����������� ���������� ���� ����������������'���������� ������������������ ���������������!������ ��� 3;&�

����/�&����!����������������������������%�$�����>�����;��������������������������-���� � ��

���������� !��� ���������������!������ �����-���� 3;&� 6��������8%� ���� ��� ���� ���������������������������

��������������������������������������������������'��������������������3;&������/�

�������������������'����������������������� $�!����������������65�����>?C?�=���������������>?*?8�

������������������!����������������������������.���������������������������������������������-������

����������� $���!������6������:&���-����������())D=�������:&���-����������())E=� ����������())C8/�

$�� ���� ����� ����� ��������� ����������� �����!������ ������ ���������� ����-�� �� ����� ������� ��� !�����

������������������ ������������������ ����� ���� ��������� 6����� >??E=���������������� ())�8/� � &��������

�'����������������������������������� !���������������� ��� ���� ������������� $�������!��'�����

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � @D�

�������� ���������� ������������ ���� ���������� ��� ������ �������� ������� ��� �������/� 3�� ��������%�

�������� ����!��� ��� �������� ���� ��������������� �������������������������������������������������

�����������6 ���������������()))=��������������())(=�������:&���-����������())E=�������:&���-����

������())@8/� �-���%��������������������������������������������������������������������������������

�������������������������6 ���������������()))=��������������())(=��������������())�8/��

&��� ����� �'�������� ��� �������� !�� �������� ������ ���� ���� ��������� �������� ��� ������ ��� �������

���������������������������������������������������������������������%�������������������������������

����������������������������������������%����������������������������������������������������������

����������!������%�!��������������������������������������/�3������������������������%������-������������

���������� � �� ����� ����� ��������� ���������������.�� !�� ����������� 6������������ >??D8/� &��������

����������!�������������������������������������������,���������!��-���������������������������������

6������������>??D8%�-����������������-��������7 ������6"������������>?C*=�7�����������>?*@=�"�����

������.���>??D=�����:$!��������������())E8/�2��������������������������!���������������������������

������� ������������� ���������� ������������ ���� ������������������ ����� ������������������ ��������

�������������� �������������������������������������������� ��������������������� ������������������

���� ������/� 7�������������������� -���� .��-�� ����������� ����� ��� ����������� �������� �������%� ��������

����������� ���� ��������%� -����� ��� .��-�� ��� ��������� ������� ���������� 6������ ���� &������

>?*)=�5�����������>?*�=�A�����������())D=�"����������())D8������������������������������ 6%%:&$�8%�

-���������!�������-�����������������������������������������������-����������������������������

6"�������������()))8����� ���������������������������������������� ���!������������������ 6&����

A������������())D=�%�����������())@=���.�����������())C8/�7����������������������������������������

��� ������ ���������� !�� ���� �������� ������ ���� ����������� ��� ��������� ������� ��!������ �������

�������������������������������������������������������������������������/�

$�� ������������� ��������������������������������!�����������������������������������������������

����/� &��� ������ ���� ������������� ��� ���� �����%� ���� ������� ���� ����-�.� !������� 6������� ����

������� >?@>8/� &��� ������ ��� ����:���.���� !��-���� ������ ���������� -����� ������������� ����������

����������������� �����������'������������ ��������-�./�A���� ���������������-������������������ ����

�!������ ��� ������ ���������� ��� �������� ������� ���� �����%� -���� ���� ������ ��� ���������� ��������� ���

�������� -���� ���������� ������������� ��� �����/� 3�����%� ��� ��� � ���� ������ ������%� ��� ���� !����

������������ ����� ����������������������������� ������� ��������������������� ��������������������

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � @E�

���������� ��������� 6������������������>?@>8/�&���%����������������������-�.�����������������

�!����������������������������������������������� ����%�-�.������������������������67������>??E8/�

%���������%������������������������������%�������������� ��-����������-��������������%� ����������!��

E)7� ��� �� ������ ��� ����������� ��� �� ������������� ����� ��-�� ����� ����� ������� ��� ����� ��������

6&���!�� >?C(8/� $������ -���� ����!������� �������� ��� ���� �������� ��������� ��� ���� ����!��%� ��

���������������������������������;�������6�M���������������())(8%�-���������,����:��.���������������

���������� ��� �����!���� ������� ���� ���� ������!��� ������ ����� ����������� 6 ��M��� ���� �������

>?**8/� &��� ���������� ��� �������� ������� ���� �������� ��������� ��� E)7� ���-�� ����� ���� ���������� ����

�������-����6��������������>?E>8/�&����� � �������� � ��������������������������!���������������

����������������������������������������������!������%�������������������������������/��������!��������

���������������%�3����������M�����������������������������������������������-�.�-�����������������

���������������������������������������������/��%�������%���������������'�����������������������

���������������������������������� ��������������������������������������� ��������������'���������

�������� ������� ��� ����!������ �������������/� &��� ���!�������� ��� ��������� ���������� ���� ���������

�������������������������������������������������-�������������������������������������-������������

������� �������������� ��� ���� ���� ������� ���� ��-�� �������������� ��� ���� ������/� &�����%� 3�

���������M��������������������������������������������-�����!������������3;&�����%���������������.����

.���5�&�����������/��

3� ������������� ��������������=�����������������������%� ��� ����������� ��� ������������ � ���������

�����!����������������.��������������������!����������������!������������������������������������

�������/������������-��������������������������.������������������������� ���������������������

.��-�� ��� ���������� �������� ���������� ���� �������������� ����������� ����� ��� ����������%�

��������%� ������������������%%:&$�/� &����������� -������������������� ����������������� 3;&�

������������������������������%����������������������������������-��������������3;&������� � ��

�����������/�#�������������������������������������������������;����������������!��$�����>�

������������������������������������������������-��������������������/�

3, �0 4�%��

3, ,� "�����������������������������������#������3����5�

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � @@�

����������������������������������������������-���������������������!��������������(/(/�/�. � ��

������������-����!������� ���� ���������:��!�����(>:(E:���:�������������>���������������������

������� -���� �/�/��������������� ��� ��"� 6E3#8� �����-��� D*� �� ����� !�� ��"� 6E3#8/�&���� -��� ������� !��

�����������������������>@����������"%��������-���������%�������� ������������&5&�6α&5&�������

������������� -���� E7� 6�<�8� ������ ����� ����� 6%��8%� )/(E� �&� ������� �������� 6"3A��%� 3���������

$�����������/� 7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8����� ����:������������������������ ������������� !��

!���������������/�%�� �����������������������������%������-����������!�������������������������>>���

����� ��"%� ������� -��� ������%� ������� ��� �������� �������� ���� ������� ����� ��������� &5&/�

�����������������-��������������������������������!��������������������(C:������������/�3�������

���������������� -��� ��������� ��� ���������������� ��������� DD����������"�������������������

������������������������!����������.�������������!,���������3;&/�%�� � �������������%������������

�������������-���-������������������&5&�������������������������>)�����C��%�E7��(%�?E7����

���>@������>))������������������&5&������������������E)�3#<�������!������������%� �6�����:

$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8��������<���5���6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�

$�������8���������-����������������������6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8/��$����>@�

�����������%���������������-������������6��������(/(/(8������������������������������������!������

����.��������/��

3, , ���9�����1#�?�������

N�������������������-����������������������������������������������������.�������������������!������

��� ����� ��� ����!������� -���� ����������� 6�������8� ���� ����������� 6����������8� ��������� ����������

���������������!���������������/��

(%&%&%% �������4���<��'���

$� ���������M�!��� ����������� �������� �������� 6@:60:6C:����!��M:(:���:>%�:���M��:D:��8�����8:@:

������������=�@:0A�:"������%�3���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8�-�����������

������ �������������-�����������!�������!��������-����������� ������ ��������� �������� ��������������

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � @C�

�����������������������������������!������/��@:0A�:"�������-����������������������������&5&������

-�.��������������������>))μ&/�

$����������������������-���������������� ��� �������������������������������!���������.��������

�������.����������������������!��� ���������� ����� ��� ��!���������� ���������������������������� �

�������� � ��������������������������/� ������-���������� ���(E)μ7������-��������������

&5&������������>))μ&�@:0A�:"����������� ����!���������C��� ���)%�(%�C���>E��������� �����-���!��

����������E))μ7���������-������������&5&����(��������/��3����������������������������-���������

��!������������������������!������!���!��!���������������!��-���������%�������������������������������

-������������������������������!��%�!����������������������-���������������������!����������������

�������� ���������������������/���������� ��!���������������������@:0A�:"�������-��������������>E��������

��������������������������!��������-���!����(��������-���<�����������/�&���������������-�������������

����������� ��� �������������!�������.����� ������!������!���������� �����-��� ������-���� ������������%�

������������������������������������������������������������������������� � ������ � ���������

�������������������������6%�����D/(8/�

(%&%&%& �����������4���<��'���

%������������ ��!������ ����������� 6((:60:6C:����!��M:(:���:>%�:���M��:D:��8�����8:(�%(D:!����:E:

������:�:��=� � 0A�:����������%� 3��������� $�������� ���/� 7��/%� &�� 2������%� ;3�%� $�������8� -���

������������� ��� �!������� �������� ��� �� ����.� ������������� ��� E��<��/� &���� -��� �������� ��� �� -�.����

����������������Eμ�<���������������&5&/�

$��-�����������%��� ���������������������-�����������-��������������� �������!����� ����.�����������

����.����������������������!�����������������������!�������������������������������������� � ����

���� � ��������������������������/������-���������� ���(E)μ7������-��������������&5&�

�����������Eμ�<���0A�:��������������� ����!���������C������)%�>���(��������������-���!������������

E))μ7���������-������������&5&����(��������/��

$������������-�����������%�-���������� ����������� ����-��������%� ��!����������������� ����!��� ���!��

�!��!��������������!��-���������%�������������������������������-������������������������������!��%�

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � @*�

!����������������������-���������������������!���������������������������������������������/����������

��!���������������������0A�:�����������-��������������(����������������������������������!��������-���

!�� �� (� ������� -���<������ �����/� &���� ����� ������ -��� ������� ��� ����������� ��� ������� ������!���

����.�����������!������!���������������-���������-����������������%���������������������������������

����������������������������������������� � ������ � ����������������������������������6%�����

D/�8/�

(%&%&%& E���� ��� ������������ ���4���<��

3��������������������-���������%������-�����������!������������ ���>����-�����������������

���� ���������� ��� �� ��������/� 3������ ��� ��������� -��� �������� -������ (��������� �����-���� ����

-���<������!���������������������-�����������������������������������%��������������������������/��

&��� ������ ��� ������ ��� -����� ���� ������� �������� -��� ������� -��� �������� ��� !�� ���� ��������� ����

�������� ���� -��� ��������� ��� �������� ���� ��������/� �%�� ����� ��������� ����� �≥� >C������ -���

���������������������� ����������������������/� &������������� ������������ ������������ -���

'���������� ������ ������3�� ��� ����-��� 6�������� $�������� ���/� 7��/%�&�� 2�����%� ;3�%� $�������8/� $�

�����������������6��38%������������M�%�������������������������������������������������������������

�������������������������������������������������������-����������������������������������������

���������������������������������������������������6%�����D/>��8/�$��������������3�-����������������

���� �����������������/� &���������� ������������ �������� ������ ������������� ���� ��3� ��� �������

������� ��� ������� ������ ��� ���� �������� ������������ ���������� ��� >/((μ&� ���������/� %�� �����

��������%� ���������±��/5/&/�-�������������� �������������������������������������� ����������

����������������������������������������������������6%�����D/>�!8/�

&�� ��������� ���� ���������� ��� ����������� ��!��� ������������ ���������� ��������%� ���� ������� 6U<:

�/5/&/8� ��� ���� ���������� ������� ���� ���� ��������� >)� ��� ����� ���� ��� ���� ��3� -��� ����������/�

��������%� ��� ��������� ����������� ����.�� ������������� ��� �������� �����%� ���� ������� 6U<:�/5/&/8� ���

������������ ����������-�������������� ��� �����������������!��-����>)):>>)�����(D):(E)���� ����

��3%� �-�� ������� ������ ����� ��� ���� ������� ����� ���������� �������� �����%� ��� ����� ���/�

a

b

Figure 4.1 Example of quantification of fluorescence intensity across a cumulus oocyte complex

(COC).

Oocyte and cumulus cell metabolite uptake was quantified using confocal images of COCs andAnalysis Pro Software (Olympus). (a) Example of the quantification process, measuring the distributionof fluorescence intensity across a COC. The highlighted region of interest (ROI) was placed over theCOC such that an equal distance was measured either side of the geometric centre of the oocyte. Theaverage fluorescence in each column of pixels within the ROI is reported. (b) Example of the graphicaloutput obtained using Analysis Pro Software where the data is expressed as mean intensity offluorescence +/- S.E.M. (n=17 COCs, 4 independent experiments).

69Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � C)�

�&�������.�������!��%��������������!���������%�-�������������!����������������������������������������

������ ��3� 6E)�E)μ&8� ����������� ������������� ����������������� ����� ������������ ����������� 6U<:

�/5/&8���������������������������������������������/�3����������������%��������� � ��������������� �

��������������-�����������%���!��������������������������������/�

(%&%&%( ���� � ����'���� �

#���.�� ��� ����������� ��!��� ��� �������%� �������� ������ ���� ���������� ������ -��� ��������� !��

��������������:2���$0�;$�������&�.������������������������������������������������������������

�������E� 6"�����������-��� 3��/%����������%��$%�#������������8/�$��� ������P)/)E�-�������������

�������������������������/�

3,/ '0�1� ��

3,/,� -������1#�?�����1���#���������������������#������3����5�

&���.�����������@:0A�:"������� �������������� ��������������������������������������6���8�����

������������������)%�(%�C���>E����������������������� ��!��������!������6%�����D/(��:�8����-��������

���������������������������������������������������������/�������������������������.��-����!������

-������ �����������-�������� ��!����������������(��������� 6%�����D/(�!%� �8/�&�������������������@:0A�:

"���������!������������������������!����-�����������������������������������-�������������������������

��!������� ����!������ ���C�����>E���������6%�����D/(��������������������8/�%����������� ����������-���

������ ��� �������� ������ ����� ���� ������� �����-���� �� (� �� C� ������� ����!������ ��� ����������� ��!��%�

��-���������-����>E��������%�������������������-�����������������������������������������������������

������6%�����D/(��������8/�&�������������������������������������������������������������������6�P)/)E�

��� ����� �������8����� ��� �� ������ �������� 6�(�� )/??>(=� �P)/)))>8� -���� ��!������� ������ ��� (%� C����� >E�

�������� 6%����� D/(� �������8/� ������ ���� ������ ������� ������%� ������������������������ �����������

��������-������������������������������������������������������.����������������-�����������������

������������6%�����D/(��8/�&������!����������������������������������������'�������������������������

.����������������������������������������/�

e

a b

c d

71Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

f

g

Figure 4.2 Glucose uptake in the unexpanded cumulus oocyte complex (COC) is proportional to

duration of incubation.

Analysis of fluorescently labelled glucose uptake in unexpanded immature COCs from Adamts1+/- mice.Confocal images of unexpanded COCs incubated in 6-NBD-Glucose for 0 min (a), 2 min (b), 7 min (c)or 15 min (d) all followed by a 2 min wash. Quantified intensities of glucose uptake across the diameterof COCs for 0, 2, 7 and 15 min incubation periods is shown in e, data expressed as mean intensity offluorescence +/- S.E.M. (n�16 COCs, 3 independent experiments). Quantification of fluorescenceintensity within oocytes was determined as described in Figure 4.1 with the region of interestencompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) of intensity values was then calculated (f).Glucose uptake was proportional to time of exposure as shown in g. Bars with different characters aresignificantly different (P<0.05). Scale bar = 200μm.

a

b

c

d

72Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � C��

3,/, � ��������1#�?�����1���#���������������������#������3����5,�

&��� .�������������������������������������� ���������������������������������������.��!����������

-���������%�!������� ����� ������������/� �$��������������������������-��������������-���������������

-������ �� >�������� ��!������� ������ 6%����� D/�� !� ���� �8/� &��� ������������� ��� ����������� -������ !����

�����������������������������������������������-���������������������������!�����������6%�����D/��

�������8/����������������.�������������������-����������������������������������������-����!������>�

���� (� ������� ������ 6%����� D/�� �8/� &��� ����� ���������� ��� ������������ ��� �������� -��� ������ 6�(��

)/???�%��P)/)))>8����������������������������6�P)/)E8������-������������������!��������������>�����(�

�������� 6%����� D/�������� �8/� ������ ���� ������ ������� ������%� ������������������������ �����������

����������� -��� ���� ��������� ��� ���� ���������� ������ ��� ������������ !�� ���� ������ �������� ���

����������������������6%�����D/���8��������������������������������-��������!��������������������.��������

������������������.������������/�

3,/,/ ��#����� �� -������ 1#�?�� ��� 1���#����� ��� 0�#����� �� � ���

�����������������������#������3����5,�

$�����������������-��������!��-����������������.������������������������6DD�����"8����� � ��

�������������������������������������������6>>����������"8����������������6>@�����"%���������

D/(/(8/� &��� ������� ���-��� ����� ����������������� -�����.��������� ��������� ��� @:0A�:"�������

����������������>E��������������������������������6%�����D/D��:�8/������.�!��%�������,��������

���� ������������-���������� ��� ���������� ���������������������� ���� � ���������������������

�����(����������<-���� ���E))� �����&5&� 6%�����D/D�!������8/� � �&���� ������������ ���� ��!��� ��� ����

���������������� ��������� ������������������������ �������������������� ��������������� ����� ����

��!��� ��� �������� ��� ���������������/� � "������� ����.�� ��� �������� -��� �������������� ������� ��� ����

��������� ������������ ���� ����������������� �������� ��� �������� ���������������� 6�P)/)E%�

%�����D/D��8/��&�����!�����������������������������������������������������������������/�

74Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

d

a

b c

e

f

Figure 4.3 Cholesterol uptake in the unexpanded cumulus oocyte complex (COC) is proportional

to duration of incubation.

Analysis of fluorescently labelled cholesterol uptake in unexpanded COCs from Adamts1+/- mice.Confocal images of unexpanded COCs incubated in NBD-Cholesterol for 0 min (a) 1 min (b) or 2 min(c) all followed by a 2 min chase wash. Quantified intensities of cholesterol uptake across the diameterof COCs for 0, 1 and 2 min incubation periods is shown in d, data expressed as mean intensity offluorescence +/- S.E.M. (n�19 COCs, 4 independent experiments). Quantification of fluorescenceintensity within oocytes was determined as described in Figure 4.1 with the region of interestencompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) of intensity values was then calculated (e).Cholesterol uptake was proportional to time as shown in f. Bars with different characters aresignificantly different (P<0.05). Scale bar = 200μm.

a

c

b

75Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

Figure 4.4 Glucose uptake in oocytes is significantly reduced following cumulus expansion.

Analysis of fluorescently labelled glucose uptake in unexpanded and expanded in vivo matured COCsfrom Adamts1+/- mice. Confocal images of (a) unexpanded, (b) periovulatory (11 h post hCG) expandedand (c) postovulatory (16 h hCG) expanded COCs incubated in 6-NBD-Glucose for 15 min followed bya 2 min chase wash. Quantification of glucose uptake in oocytes in shown in d. Quantification ofglucose uptake within oocytes was determined as described in Materials and Methods (Section 4.2.2.3)with the region of interest encompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) of intensity valueswas then calculated (n�13 COCs). Bars with different characters are significantly different (P<0.05).Scale bar = 200μm.

a

d

c

b

a

Expanded

a

bb

76Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � CC�

3,/,3 � ��������1#�?�����1���#�����"����������0�#����� ��� ����������

���������������#������3����5,�

����������� ��������������������������������.��!��-������������������� � ����������������-���

���������������-������(�����������������0A�:�����������������(��������-���<������6��������D/(/(/(8/�

�����������������������0A�:���������������.�������������-�������������-�������������%������-���

��������� ��� ����������� �!�������� -���� �������� ��� ����������� ����� 6%����� D/E� �� ���� !8/��

3��������������������������������������������������������������-������������������.�%�!�����-����

���� ������� ��� ���� ���������%� �������� ������ ���� �������� ���������� ����� �������� �����������/��

N��������������������������������������������������������-��������������������������6*:����8������-����

���������� 6%����� D/E��=� �P)/)E8/� � � &������!������������������ ����%����-�����������%� �������������

�����������������������������!�����������������������������������������������������/�

3,/,6 ��#����� �� -������ 1#�?�� ��� 0�#����� �������� ����� ��#������

3����5����,���� ��� ������ ��� �����������,�

3��������������������������������������������������������������!�����������������������������%��-��

������� ���-�����.����������������������� ���.����-�����������/�&�������� ������� � ��������������

��������������������������%�-�����-����������������������������!������������ ���!����$�����>�����

;������� 6��������%�������������/%�())C8/�&���������� ��� ����������������������������� ���-����� �

��������������������������� ���$�����>��������������������;������� 6��������������())E8/�%��

����������������� � �������������������<������������������ -��� ��!,������ ��� ��������!������

����.������������������������ � ����������������>�������/�

%�����%�������������.�� ����������������� �����-���� � ���������������������������� 3;&� 6��������

D/(/>8�-����������������� ����������������������������!����!���/�%�� � ����������������>���

����%� ������,�������������������������������������� ���� ������������������� 6%����� D/@��8%�-���������

������������������������������������ �������������������������������-���� ����������������.������

��������-��������������������������������6%�����D/@��8/�3�������������������-��������������!�������

Figure 4.5 Cholesterol uptake in oocytes is significantly reduced following cumulus expansion.

Analysis of fluorescently labelled cholesterol uptake in unexpanded and expanded in vivo maturedCOCs from Adamts1+/- mice. Confocal images of (a) unexpanded and (b) postovulatory expandedCOCs incubated in NBD-Cholesterol for 2 min followed by a 2 min chase wash. Quantification ofcholesterol uptake in oocytes is seen in c. Quantification of cholesterol uptake within oocytes wasdetermined as described in Materials and Methods (Section 4.2.2.3) with the region of interestencompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) of intensity values was then calculated (n�16COCs, � 3 independent experiments) Bars with different characters are significantly different (P<0.05).Scale bar = 200μm.

c

a b

a

b

78Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

79Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

IVMIVM IVMIVM

-/-

+/-

-/-

+/-

c

e

f

b

d a

g

Figure 4.6 The accumulation of glucose is perturbed in the cumulus oocyte complex (COC) and

its surrounding matrix following in vitro maturation.

Analysis of glucose accumulation in cumulus oocyte complexes (COCs) and their surrounding mediafollowing in vivo and in vitro maturation (IVM). Confocal images of 6-NBD-Glucose uptake in (a) in vivo

matured Adamts1+/-, (b) in vivo matured Adamts1-/- and (c) IVM COCs following an incubation period of15 min followed by a 2 min wash. Quantified glucose uptake across in vivo matured Adamts1+/- andAdamts1-/- and IVM COC is shown in d, e and f respectively, data expressed as mean intensity offluorescence +/- S.E.M. (n�15 COCs, 4 independent experiments). Overlay of the graphical intensityprofiles for all treatments is shown in g. Quantification of glucose accumulation in the surrounding matrixwas determined by calculating the average (+/-S.E.M) of fluorescence intensity values from 10μm fromeach end of the region of interest (h). Similarly, for cumulus uptake, the average (+/-S.E.M) offluorescence intensity values from 100-110μm and 240-250μm for each COC were used (i).Quantification of glucose uptake within oocytes was determined as described in Materials and Methods(Section 4.2.2.3) with the region of interest encompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) ofintensity values was then calculated (j, n�15 COCs, 4 independent experiments) Bars with differentcharacters are significantly different (P<0.05). Scale bar = 200μm.

ih

j

80Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

a

b

b

Adamts1-/-Adamts1+/-IVM

In vivo Matured

bb

a

b

Adamts1-/-Adamts1+/-IVM

In vivo Matured

p = 0.79p = 0.08

Adamts1-/-Adamts1+/-IVM

In vivo Matured

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � *>�

������������ � ������������������������������������������� � ������������������������������������

���@:0A�:"����������������/�$��������������������������������������������������������������� � ��

��������������>��������������-����������������������������������������������������������������

�����������������������������������������-���������������������������!������-�����������������6%�����

D/@��8/�

$����������������������.��-�������� ��� � ������������������������%���������������������������

-��� ����� ��� �������� ������� ��� ����������� ����� �������� ������ ����� ���� �������� ����������� ��������

6%�����D/@�!8/�$����%�'�����������������������������������������������������������������������������

��� �������� ������������� ���������� ���� �� ����� ���������� �������%� ��� �� ���� ��-� ���������� -������ ����

�������6%�����D/@��8/�

$����.������������� ��� ��������.������������� -�������� !��-���� � ������������� 3;&�����������

6%�����D/@��������� �����������8/�%����-���� 3;&����� ��!����������%�!������������������������������

���������� ������ @:0A�:"������� ������������ 6%����� D/@� �8/� &��� ����� ���������� ��� ������������

'���������� ��� 3;&� ���������� 6��� >C�����%� D� ������������ ����������8%� �������� ����� ���� ��������

������������������������-���-������������������������������������������%�-����������-���������������

��� ���� ����� ����� 6%����� D/@� �� ���� �8� ��������� ��� �� ������� �������� �������� ������� ��� ��������

������������� ������ ���� �������� ����� ����������� �������� ��� ����� ����� ����� � �� ����������

6%����� D/@� �:�8/� � &��� ������� �������� ������� ��� �������� ������������� �!������ �����-���� 3;&� -���

������� ��� ����������-�������������������� 6%�����D/(��8/�2������������� ����������%� �������!�����

'������������ ��� �������� ����.�� ��� � ����������������>��� �������������������� ���� 3;&������

6%�����D/@��8%����-����������������������������������������������������������������������������� �

���������� ��� 3;&�����/�&���������������.�� ����������� ���� ������=� �������������������=� ����

����������������������������%�-�����������!��-������������������/�

������������� �������������� ��� ����!��.������@:0A�:"������� ������������!��-���� � ������ �

���������������� 6��������!��� �����������D/(/(/�8����-��� �����-��������������������� �����������

��������������������������������������!������������-���!��-������%���� � ������������������������

3;&������6�P)/)E%�%�����D/@��8/�

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � *(�

�&����������������������������������.�������������!��-���� � �������������3;&�����%�'����������

��� ��� �������� D/(/(/�� ������������� ���-��� �������������� ���� ����������� �������� ��� ���� ��������

����������� ��� 3;&������ �������� ��� � ����������������>��� �������������������� 6�P)/)E%�

%�����D/@��8/�

&��� ����� ���������� ��� �������� ������������ ������� ��� �������� -��� ���������� ������ �� ������ ���

��������������������� ���������������� 6�������� D/(/(/�8� ��� ���� ����������������� ��������������� ���

���-�����%�����D/@�,/�&�������������������������������������������������������������������3;&�-���

������ ����� ���������� ��� � ����������������-���=� �����-������������������������������ 6��)/)*%�

%�����D/@� ,8/�$�����������%� �����-���������������� ����������� ����������!��-���� 3;&���������������� �

�����������������6��)/C?%�%�����D/@�,8/�

3,/,) � �������� 1#�?�� ��� 0�#����� �������� ������ ��#������ 3����5�

���,���� ��� ������ ��� �����������,�

����������� ����.�� !�� �������� ������ ���� �������� ��� �������������� -��� ����� �������� ��� � ��

��������������>���������������������� 3;&��������������!��� �����������D/(/(/(/� �%����-���� � ��

���������� ���� �� (� ������� ��!������� ������ �����-��� !�� �� (� ������� -���<�����%� �������� ������ ����

�������� ��� � ����������������>��� ��������������� ���� 3;&������ �!��!����������� ������� ���

�����������6%�����D/C��:�8/��

&����-������������������������������������!�������������������������������������������������������

3;&� ���� � �� ��������������>�������� 6%����� D/C� �8/� &���� -��� ��-���%� �� ������������ (:�����

�������� ��� !��.������ ������������ ������ � �� ������� ����������� ����� �������� ��� �����

�����M�����������������6%�����D/C��8/��

&�������������������������������������.��-����������!��-����3;&����� � �������������%�-������-�

!��.����������������������������������������������������������������-����������������������������

��-��!�������������������������������������(������������������(��������-���<��������������6%�����

D/C��:�8/�3���������%���������������������������������������������������-����3;&�-���������������!����

���� ������� ���� �������� ������ �������� ��������������� � �� 6%����� D/C� �8/� ������������������

83Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

c

e

f

b

d a +/-

-/-

IVM

+/-

-/-

IVM

g

Figure 4.7 Cholesterol uptake is significantly increased in cumulus cells and oocytes following

in vitro maturation.

Analysis of cholesterol uptake in cumulus oocyte complexes (COCs) following in vivo and in vitro

maturation (IVM). Confocal images of NBD-Cholesterol uptake in (a) in vivo matured Adamts1+/-, (b) invivo matured Adamts1-/- and (c) IVM COCs, following an incubation period of 2 min followed by a 2 minwash. Quantified intensity profiles of cholesterol uptake across in vivo matured Adamts1+/- andAdamts1-/- COCs and IVM COCs, is shown in d, e and f respectively, data expressed as mean intensityof fluorescence +/-S.E.M. (n�13 COCs, 4 independent experiments). Overlay of the graphical intensityprofiles for all treatments is shown in g. Quantification of cholesterol accumulation in the surroundingmatrix was determined by calculating the average (+/-S.E.M) of fluorescence intensity values from 10μm from each end of the region of interest (h). Similarly, for cumulus uptake, the average (+/-S.E.M) offluorescence intensity values from 100-110μm and 240-250μm for each COC were used (i).Quantification of cholesterol uptake within oocytes was determined as described in Materials andMethods (Section 4.2.2.3) with the region of interest encompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) of intensity values was then calculated (j, n�16 COCs) Bars with different characters aresignificantly different (P<0.05). Scale bar = 200μm.

84Dunning

Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation

j

h i

a,b

a

b

Adamts1-/-Adamts1+/-IVM

In vivo Matured

a

bb

j

Adamts1-/-Adamts1+/-IVM

In vivo Matured

a

bb

Adamts1-/-Adamts1+/-IVM

In vivo Matured

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � *E�

�����������-���������� ����������������� �����-���� 3;&� ��������������������������� ���������-���� �

������������6�P)/)E%�%�����D/C��8/�$�����������%����������������������������������.����������������!��

��������-�������������-����3;&�������������������>������������������ � ��������������6%�����

D/C�,8/�

3,3 %"��1��"�$��

&��������������������������������� �������!����������������������.����������� ���!���������-���� ����

����������� ������������� ��� ������ ���������/� � 3� ������������� ����� ��� ���� ����� �� ���� ��� �����������

����!������ ������� ��� ���� ������� ��� ���� !����� ��� ���������� ���������� ��������� ��� �������� ���� ����

.��-����������������������������������������������������������/�&�����������������������������������

������� ����������� ����� ���� �������� ��� �������� ������ �������� ��� �� �������� ���������� ��� ����

�!�����������!��������������������������/�

&-�� ����!������� -��� ������� ����� ��.���� ���������� ������� �������������� ���������� !��� ����� �����

��.����� ��������� ���������������� ��������/� � "������� ��� �� ����������� ��������� ����� ������ ������

������� ������������� ������� ��������� �������� ���� "7#&�� 6&���.��� >??D8/� � ����������� ��� ��

�������!�������������!��� ��� �������������� ������� ���������!����/� � 3�����������%�-�� �������������

���������� ��� ���� �!�������� ��� �������� ���� ����������� ����� ���� ���������� ����������� ����� ����

��������� ���� ������ �������� ��� ������� !���� ��� �������� ���� ����������� ����.�� �������� ���

���������������������������������������������������������������������������������6%�����D/D�����

D/E8/��%�������%������������������������������������� � ������������������������������������

�������!��3;&��������������������������������������������������� $������%�!�����������������������

������������������������/�

����������������%����������������������������������������������������������������������-�������%�

-��������.������������������������-������(�����6%�����D/(�!������8/�%����-������>E������������!�����%�

��������� ����!����������������� ��� �����������������%��������� ����������-������ ������������������

����������������������������������������������������������6%�����D/(��������8/�3���������%������-�����

������������ ������������������������.�� ��� �����������-������ ����� ��������� �����-�������������� 6%�����

D/D��8/� 3�� ����%� ���������� ������������� ��������������������� ���� �����������-���� �������� ������������

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � *@�

������������������ ��� �������������������� ��������� 6%�����D/D�����%�����D/@8/�&����������������

�������� ���� ������������������ �����!���������������������.�� ������������������������� �����������

��� �������.��� ��� 3;&����� ����������� ����� �������� ��� 3;&����������%� �����!��� �����!���������

$�����>� ���� ;������%� ����� �������� ���� ����.�� !�� ���� ������/�������%� ������ ������� ���-� �����

��������������� ����������� �����-������������������ � �� �����������������������/� �&���� ������������

���� ������ ���� !�� ��������� ������ ���� �������� ���������� ���� ������������� ��� �������/� &��� ������

��������� ������ 3;&� ���������� ������� ��� ��������� ����!������ ���������� �������������� ���� �����

��������������������� ��������������������������������������� !�� ������/� �&�����!�������������

��������������������.��-�������������������������������������������������3;&<3;%�������������/�

���������������.���������������������-������������-�������������������������������������-������

>����� 6%�����D/��!8/�%����-���� � �������������������������%����������������.��-��� ������� ���

������������������-���������������������������������������������������������������������������������

6%�����D/E�!8/������������� � �����������%���������������������������������������������������

��������.�� �������������� 3;&������-��������������� ���������6%�����D/C��8/�&������������ ���������

����������������������'������ ���� � �:���������������� ��������� ������������� ���������������������

����������� ������ ���� �������� ���� ����.�� ��� ����������� !�� ���� ������/� ����������� ��� ��������

���������� ��������� ���� ����������������������-����-������������������������������������.�����

�������� ��� �� �������������������/� $�������� ����� 6������ ����� ����8� -��� ������� ��� ���� �������%� -��

�����������������������������������������������������������������������������������������������������

��������������������������������������������������������������������������������������'�������������

��������������6A��������������())C8/������������������������������������!����������������������������

����������� ���������� ����������� �������� ����� ��� ����������� ���� ��������� ��� -���� ��� �������

�����������������������������������������������������������������������������������6����������&������

>?*)=�5�����������>?*�=�"�������������()))=�A�����������())D=�"����������())D=�&����A������������

())D8/�$�����������%�������������������������!��� �����:�����������������������������6���������())*8�

���� ���� ���������� ������� ��� ���� ������� ���� !�� ��������� ��� ���� ������� ��� �����!��� ������ ��������

����������6����������H���!��())D8/��&�������������������������������������������������������������

������������������������������������������������!���� � ������ � ���/�

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � *C�

��� �������� ����� 3;&�����%� -����� ���.� ;������� ���� $�����>%� ����� ������� ����!������ ����������

��������%� -����� ��������� ����� ��������� ����������� ��� ���� �������� ������ ��� �������!��� ��� ����

�������������������������� � ��������������/���!�����������������������������������������������

�������� ������ ������� ���� ����� ����� ����� ������ ����� �� ��������� �����/� � &��� Q��������� ���F� �����

��������������������������� $%��������������������� ������������� ���������� ;������%���� -�������

����:���.���� �������� ����� ��� ���������� 6B��������� ()))=� A��.��� �� ���� ())�8/� &���� ��.�� ����

�������� ���� ������������� ��� ���������� �������� ���� ������������� ������%� ���� ��������� ���� ���

-���������������������������������������������������6&��-�.��������())D8/�;����������������!����

���-�� ������������������������ ���!������������ ���������������������������������� 62��������())E�8/��

%��������������������������������������������������������������������������������������������!��

�������������������6A��.���������>??�=� �����������>???8/��

&�����������������.��������������� ��������������������������������������������������������������

�����������������������������������������������/�;����������� $���������������������������������

������������������� ��������������-��������������!�����������;�����������������-���� ����������

6H������������ ���������())�=� H��������������())@8/�7�.�-���%� �����!��������� �������� ���� 3;&�

���� ������ ������ !�� �������!��� ��� ���� �������� ���������� ��������� �!������ ��� ����� �����/� &���

������������ ��� ������������ !��-���� ��������������� ��� ������������������������� ������ 6"5�8� -���� ����

��������� �������������������������� ������������'����������-���!�� �����������������������������

�������������������������������� !�������� !����������������M�/� &����������������� ��������� ���� ����

"5�������������������������������������������������������������!���������������������6H��������������

())@8%��������������������.����;�����������������������������������������!�����������������������

������M��������� � ��������������/�

&���������� 3;&����������� ����������������'�������������-�����%� ��������� ����!���������!������

��������������������������-����3;&/�������������������������������������������������������������%����

-�������!������������������������������������������������������!������!����������������6A������

�� ���� >?@C=� 7����� ���� A����� >?*E8/� $�����������%� �������� ����!������ ��� �������� ������ ���������

������������ ���������� ���������<����������������� ���� ��� �������� ��� �������� ������� �����������

6������:&���-����������())@8/�2��������������������%������-���������������������� � �%������������

��� �������� ��� �������� ������ ��� �������/� &���� -����� ������!��� ������ ��� �� ������ ���� ��� �������� �����

������������!������������������� �������������!������������!�����/�$������������������ ������������ ���

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � **�

!����������� ��� ������������������������� ��������������� ��� ����������������!��������������������

�������� ���� ��� ������� ��������� ������� ��� ��!������� ���������!������� ��� �������� ������������ �����

���'�������!������'��������/�&�����������������������������������������������������������������

�����������������������!���������������������������������������<���������������%�-���!����������������

-������������'����������������������������������%����������������-�������������������������������

�����������/�5���!��������������������������������������� ��� �����������!�� ������������������-�����

����-�������������������������������������������������������������������������������!������/��3��3;&�

����� ����� ��� ������� ��� ��������� ���� ��� �������� ����.�� -������ ���� �������� ����� ���� �������

�����������������������������������!��������������!��������������������������������������������������������

������������������������������3;&/��3����������������������!���������3;&���������������������������������

����� ��.���� ��� ������ ��� ������� ����� ���� ���� ����������� !������������ ����-��%� -����� ��������� ����

��!���������� ������������������%������:���.�����������������������������������������-����%�����������

���������������������������������������������������6������:&���-����������())@=�&��������������

())C8/� &���� ���� ����������� ����� ���� ��� �������� ���������� ���� ����.�� ��� 3;&� �������� ��� ��������

������������������������������������������������������������������������������������������������

����������6 ���������������()))=�������:&���-����������())@=�&��������������())C8/��

&������������������������������������������������� �������������������������������������� ���

������������������������������������������������������������������������������������3;&������������

������������������������������������������������������������������������������������������3;&�

�������/� ������������������������-�� ����� ��������������������� �������������!������� �����������������

��������������������������������� � 6%%:&$�8%���� ������������ ��� ���������������!����������������-��%�

��������������������-���������������������������������6��.�����������())C=���������������())*8/�

3��������%�����������.��-���!����������������������������������������.��!�������������������������!���������

��������������������������!���������������������������.�������������������������������������������!��

����������/�

&����-�.���������������������������������������������������������/�2����������������������������

���������������������������������������������������������������������������������'���������������

����������� ��� ���� �������� ������/� � %����%� ����� ��������� ��� ������ ��� 3;&� ����������� ���� ����

������������ ������ ����������%� ;������%� ��������� ���� $�����>� �����!���/� $� ������

���������������������������������������������������������������������������������!���������������

�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������

"� �� � *?�

��������� 3;&� ����������/� ������������� ���� �������� ���������������� ��� ������ 3;&� ������ -����

����!������ $�����>� ���� ;������� �������� ��� ����� ��� ����������� ����� ���������� ��� ����������

����%������������� ��������� ���������������� ���� 3;&����� ����������� �����-����������������/� 3�� ����

�������� ������ �������� � ���� ���� !�� �������� ��� ������������ ���� � �� ������� ����������%�

���������� ���������� ������� ��� ����������!������� ���� ��������������������%� 3;&� �������� ����� ����

������� �������������� ����������� ���� !�� �������� �������� ��� 3;&� !�������� �� ���!��� ������� ���

��������� �'������ ��������� ��������%� ����������� ������ ��� ��.� ��� ������� ���������������� ��������

6� ��8�67�����������())E=�����!���������A��.����())*8/�

� �

� �

� �

� �

� �

� #����6 �

����������4������O�'���9�����#������

#�������������������������������� ��� ����

�������������

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� �� �

� � ��?>�

6,� "$ '�%1� "�$��

&����������������%�$�����>�����;�����������!��������������������������������������������������

���������� � �� 6�������������� ())��=� �������������� ())�!=� �������������� ())C8�������������8/�

�-���%� ����� ����������������������������������������������%��������������� ������������� �����.��-�/�

2����������-����������������������������3;&������������������������������������6��������8����������

���� ������� ��������� ��� �������� ���� ������� ��� ������ ����!������� !�� ���� ������� 6������� D8/� A����

$�����>�����;������������������������������� ��������������������������������������� ����������

����������������������������������������������������!����������/�&������� ����.��-�������������

$�����>� ���� ;������� ������ ����������� ���������� ���� ���� ������� ��������� !��� ����� ���� ��� !��

������������/�&���'�����������-������������������������� 3;&��������-���� ����!������$�����>�����

;����������������������������������3;&�����-����������������/�����������������-��������!������

������������������� �������������������������������� ������ �������� ��������������� ������������� ����

����������������������������������$�����>�����;��������������������������������/�

6,�,� �������

;%%%%%% 2������ ���������� ��� ��������������������� ����� � ���

&��������������������������0$� ������������������6"��8� ��� �������� ������������������7 ������ ���

���������������������������6��!.��������()))8����65�����������()))8%���-�6&�����������())�8�����

����6A��!����������())�8/� ������"�* ,����0$�������������������������������������������

6H������ �� ���� ())D8/� $�����������%� -�� ����� ���-�� ����� �@� ����� ����� ��"� �������������%� ������

�"�* ,����0$�����'�������!����������!������������������������������������6��������8%���-���%�

������������������"�* ,����������������������������.��-�/��

$�����>��������������������������������%����������������������������������������������������������������/�3��

������%� ��������"�* ,������������-��� ������� ��� �����������������������-��������������������

�������� 6����8� 6H������ �� ���� ())D8/� 2����� -���� ����� ����� ��� �������� ���� ���� ��������� ��� �����

���������������-�������������=���-���%��������������������������������������������5�&�����������%�

�����������"�* ,�%������!�����������������������������%���������.�������������������������������<��

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� �� �

� � ��?(�

�������������������������6H������������())D8/������������������������������� �������������� ��� ����

���!���������������� ��������6�������������()))=�&����M�������())D8��������������������������� ��� ����

���!���������������-����������������������������������������������������������������5�&�6A�-����

���� ())@8/� $�����������%� ����� ��� �� ������������ ��������� ��� ������������� ����� ���� ��:����� ��!���

���������������������������������6��������������())E8�-��������%�������%�!�����������������������

�������������� ����������� ��������� ���� ��������� ���� ����������� ���������������� ��� ��������������

���������������/�%����� ���������� ����� �������%� ������������������������������������ � ����

-����� ���.� $�����>� 6������� �8� ����� ����� ��������� �������������� ����������� 62���� ���� "����

())D8/� &��� �!������ ��� $�����>� ������ ������� ���������� ���������� -���� �������� ��� ��-��

������������������������%����������������������������$�����>�-������������������������������������

���������/���

;%%%%%& '����%����� ������������������� ����

&���������������������$�����>������������������-������'�����������������������������%���������%�

����:��������������������������������������/�&���������������������'�������������������������%�

����!������*�/D7���'���������������������������������������6;�M'��M�������>???8/�&���$�����>��������

��� ������������ ��� ��� ��������� ������� ���� ��������� ������� ���������� ������/� 3��������� �� �������

���������� �������� ���� ������� �������� ������ ����������� ���� ������������� ������� ���� ������������

���������6�����������())E8/�&������������-���!����������������������������%�-�������������������!��

���������!�������������������6�����������>???=��������M:&��M���'���������()))8/�3������������������

���������������������:�����������������������������������������������=���-���������������!�����������

���������������� �'����� ��������� ����������� ��������������� ������������ 6&�����������>???=�����������

()))=� ����� �� ���� ())E8/� � %���� ������� $�����>%� ����������� ���� ��:������%� ��� >>).��� ��� ��M�� ����

������� ��� *E.��� �����-���� ����������� ����������� !�� ���� ������� ��� ���� ��� ������� 6�������M:

&��M���'��� �� ���� ()))8/� 3�� ���� ����%� !���� ���� ��:� ���������� ����� ��� $�����>� ��� ��������%�

������ �����>):����%� �����-���� ����7 ������ 6��������������())��8/�&��� ��������%���:$�����>��������

6>>)�.��8�������������������������������������������������������������!�������������������6����������

����())��8/�&����%�����������������������$�����>�6*E�.��8� ��������������� ���������� ��� ������������� ����

��������������6��������������())��8/��

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� �� �

� � ��?��

�������� $�����>� ����������� ����� ���� ������������ ������ ���� ���� �:�������� ������� 6����� ����

&����������>??*8���.����������������������-����������������������������������������5�&�!�������� �

������������-������������������������!������������������$�����>�����������������������6�����������

>??C8/� $�����D� ����������� ��� ��������� !�� �� ���������%� -����� ��� �������� ��� ������� ���������

������������� 6 ��"8� ��� ���� ������� ���!���� 6&���� �� ���� ())*8/� ���� ��� ���� ����� ������ ���

���������������!��-����$�����>����� :D%�$�����>����������!���������� ��� ��"�� ��������������

������������������/�

���-���������������$�����>��������������!����������������!����;�������������������6�����������()))=�

������������())>8/�$�����>���������;��������������"��DD>:$��DD(�-������������'��������5$$5DD>:$DD(�

��"N�������������C).�������������������-������������������������5$$5�6������������())>8/�&���

�����������������������;�������!��$�����>%���������� ��� ������������������ � �� 4-������������

�@@J�5%�����!�������������������������;�������������������������������������/��

$�����>� ���� !���� ���-�� ��� �������� ��������������� ��������=� �� ������ ��� ���� &��:>� �������� ���

$�����>� !������� ��� ;5"%:>@E%� ����� ����!������ !������� ��� ���� ������%� ;5"%�(� 67�'��� �� ���� ())�8/�

$�����>����������������������������������������������-���������=�%"%�����5��:��.���������67�'���������

())�=�7���������())@=������������())@8/��&�������������5��:��.����-�����������������������������������

��'�����������������������������������6��������������!.��())C8���������������!����.�������������!��

-�����$�����>�����������������������������������������������/�

$���������� ������������� $�����>���������� ���� ���������������������%� -����� ��������� �-�������������

���������������������������!���������������������������������������������6������������>??D=�#�����

������>??D8/�&�������������������������'���������>�:>E����������������������������������������"��

���"L�6-����L���������������������������8/�&�������������������!���������!�����������������������������

���������������������������������������������%�����������!�����������������������62����!�������2�����

>??@8/� $�����>� ���.�� ���� ���� �"�<L������%� !��� �� ��������� ��������� ���������� ����������� �����

��������������������-������������/��

&������������ ����������������������$�����>��������� ��������������������%�������������������������:

��������������������-�������������������������/�3�����������%�$�����>��������������������������������

����������������������������������� 6��������������())��8/�&�����!��������������� ���!�����������

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� �� �

� � ��?D�

���������������������������������������������!��������������%�������������!��������!������������%�

!���������������������$�����>���������������������������������������������M������������������������%�

������������� ����� ���������:����� ������/������ ���������� ������������� ��.���� ��� �������������������

���������� ��� ������ ���������� ������ ���������%� ����������� ��� ������ ��������� ��������� ����

������������������������!��-���������������������<�� ����������%��������!�!��� ���.������������ ������

��������� ��������������/� $�� ���� �������� ��� $�����>� ����� !���� ��������� ���� .��-�� �������

���������%� -�� ������� ��� ����������� ����� ����������� ���������� ��� ���� ����!��������%� ��������� ����

����������������������������������/�

6,�, 4�������

;%%%&%% ���� ������� �� ������� �����

&��� ����������� ��������� �����������%� ;������� �������� 6%����� E/�8� ��������� ���� ������ ��������

���!�����������6">8������������������������!����:��.���������������������������.�������:��.���������

�����!���� $�67�A����������>??(8/�&�����!���� �����������!����������� 6"�8����-���������'������

���������� ��� ���� ��������� ��������� �������� ���� ��� ��������� ��� �-�� ��������� ��-��� ������ 65��8�

�������%� �� ��!�������� ����������� ������� ���� �� ����������� !������� ������� 6�A�8� ������

6��������� �� ���� >??�8/� &��� ����� "$":����������� ������� ,������� ">� ���� "�� ��� �������� !�� �-��

������������� �������� ������ 6"$"α� �� "$"β8� ����� ������� ������� ��� ����������� ��������� �����

������������67�A����������>??(8/�����������������������������-����������"$"������������������%������

������� ���� ��������� �������� ��� ;������=� ;)%� ;>%� ;(� ���� ;�� 6��������� �� ���� >??�=� ����:

I��������� ���� I��������� >??D=� 3��� �� ���� >??E=� I�.�� �� ���� >??E8/� &����� ��������� ����� ���

;������� ������ ��� ���� ������� ��� ���� ���� ������� ���� ���� ���!�� ��� "$"� ������������ 6����:

I�������������I���������>??D=�3���������>??E=�I�.��������>??E8�&���;)� ����������;������� ���

������������������������!����"$":����"$":��������63���������>??E=����������������>??E8/�&���

;>� ������������������������"$":�����������;(����������"$":�����������;�� ���.��!����"$"�

�������������������6���������������>??E=�I�.��������>??E8/�$��������������;�������������������">:

���������!��������������������� ���������!��� ��� ���������������M������������-���� ���������

-����%� ��� ����� ������%� ���������� ������� ������� 62����� ���� &������� ())D8/� &��� �����������

���������-��������������������������C)%�(@�%�>*)�����CD.��� ���;)%�;>%�;(�����;�� ������������

6����:I�������������I���������>??D=�3���������>??E=����������������>??E=�I�.��������>??E8/��

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� �� �

� � ��?E�

;%%%&%& 1���� ����������� ��� ��������������������������������������

;������� �������=� ;)%� ;>����� ;����� ������� ���������� ����������������� -���� ;)�����;>� !����� ����

���������������%���������������������������������������������������������-��������7 ������ � ��

6��������������())�!8/�;�������������� ��� �������������� ����!�����������!������� ���������������

���������!����������������������������������������������������������7 ����������������������;�������

��� �'����� ������ ��������� ������������ �������������� 6�������� �� ���� ())�!8/�&���� ����M������ ��� ��

��������� ��� ���� ;������� ����� ���� ��� ����� !�� ��!������ ���� >)/E� ��� �� ������ ��� �� ����� �������

6&,��������������>??*8�����������������!��������������������������������������������/��

;�����������!���� $������������0:�����������.����������������������������-���������� $�����������

��� ������������������ 67�A���������� >??(=� �������������� ())�!8/� &����:������������������ ���� "��

����������� ��������-������������������������ �������������������������������������������� 6&����������

>???8%�5�&�������������%������������������������������ 6#,����������>??D8����� ��������� 62��������

())(8/�;����������� ������������� �����!������ ����������.� ������������ ������������������������

-���������������������������������������������������������������������������������������'������/���

&��� ������� ����������� ������� ����������� ��������� ����� ������� ��� ;������� ������� ���� !���� ��-���

������%�����.��������������.�����6�����.:���M����������>??D8�����������������������-����������

��� ���� 5�&������ �������������������� -���� ��������� !�� ��������� ��� ����� �������� 6��������������

B��������� >??>=� &���.�������� >??�8/� $���-��� ������ ������� -������ ������������� ��������������

�������� ���� ������� ���� ����� ��� �������� ��� ��-��� ������� �'����� ��� �������� ������� ���������/�

���������%� �����!���������;��������������������-��� ������������������� 3;&����������!���� ���

������-���������������� � ������������������/��

;������� ������%� ������� ��� �����������������������%� ����������� !�� $�����>������������ C).��� 0:

�������� �������� ��������������� ��� �����������������5$$5%�6��������������())��8/�&���������������

������������������������������������������:���.����������������;������F��0:������:���������������%�

�������������;�������� ������������-��������������������������������������������������������62��

������())(8/�&��������������������������� ������������%����������������������������������� �������

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� �� �

� � ��?@�

������������!��-����;�����������������������������������������6I�����������������������>?*?8/�

;������������������������������������ ����"�%��:��������������%�-���������!�������-�������������

-����β>:������������������������������������.������6%$�8%�������������������������������������������

���������� 62��������())(=�7������������())C8/� �-���%�;������� ������������������ ���!���������:

��������� ��������� ����!��� ��� ��������� ���� ����������� ��� ��!������ ��!�!������ ��� ��������� ����� 3%�

��!������������ �������� 6B��������������>?*?=�B��������������>??�8/�&��������:�������������������

;������� ��������������������">��������6$���������>???=�B����������>???8/�&����������������������

;������������������������������� � ������������������:�������������������������������������������

����������������������-�������������������/� �-���%���������������!��-�����������������;�������

!��$�����>���������������������������������������������������������������������� ������� ��� !��

�����������/�

�������������������������������������"��;�������������%�-�����������������������������������5��:��.��

������� 6I����� �� ���� >??*8/� &��� 5��:��.�� ������� ��� ;������� ��� ��������� 5��� �������� 65���8� ����

��-�������������� ����������������-���� 6L�����������())@8/�&��� ������������������������������� �

���'�����������������������5�������-�������7 ����������������������������������������������������

5��:��.�� ��������� �����������%� ���������� ���� !���:��������� 6��.� �� ���� ())D8/� &����� �������� ��

�������� ������� ��������� ��������� ������ ��� ���� �������� �����%� -����� ���.� 7 � �������%� ���������

�������� ���������� ���� ���������/� 0���� ��������� ��� ������ ������� ������������� ����� ���� ������ ����

����������6 ���������������())E8����������������������!������������������������������������:����������

���������������/��$������5��:��.������������;��������������!�����������������5����%�3�������������������

;�������-����!������������������������������������������������������������������������������������

���5�������������������������������������!������������!������������������;�������!��$�����>/�

&�� ������������ ���� ����� ���������� ������������ ������ !�� -����� $�����>� ���� ;������%� �� �����

����������������� ����������� ������� ����������������������������<������������������� 3�������������

�����������!������������������������������������������������������������3;&��������/�

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� �� �

� � ��?C�

6, �0 4�%��

6, ,� '���9�����,������,��������

;%&%%%% �������� ��������� ��

6, ,�,�,� #/����-'��&� #/����-7�,�'��&� #/����-7�%��'��� ��� ����������� "����)��

#/����-�08��'����

&-�� ����������������������������� ���������� -�����������=� ���%7$":���>� ����������� ���� ���������

����������������'�������������%7$":������>�������������������������������������'������-����

�� ���������� ��� ���� EF:� ��:�����%� -����� -��� ��������� ��� ������� ��������������� ������� ����!������

��������6%�����E/>8/��

&��������������������������'�����%�������>�6��������� ���%�����E/>8%�-���������������������0$�

����������������03 �&�������������������$�����>6%8��������$�����>6�8�������6&�!���E/>8/��&���

���� �������� ���� ������� -��� ��!������� ����� 0��3� ���� ���333� ������ ��� ���0$��/><���: ��6:8� $�

63���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8/�

&���������>� ��'������ -��� ��!��'������� ��!������� ���� ���0$��/><���: ��6:8� $� ����� ���%7$":

�&;�:>�� ���������� ���������� ������ 6�����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%� $�������8/� &���

���%7$":�&;�:>������������������������������������'���������������������������������!������

������� ����� ������������������������:���������L%7$"�� �������������� ���������������� ����!������

������/� &���������>� �������� -��� �������� ���� ���0$��/><���: ��6:8� $� !�� ������� ���������� -����

$��3/� &��� ��������� EF� ��������� -��� ������� ������ E������� ��� �0$� ���������� 3%� ����� 6�����-8�

%������� 60�-�5�������A����!�� 3��/%� 3��-���%�&$%�#�$8����� ����!��������� ���� ���������� ��� ()�

�������/� &���� �������� -��� ���� �������� ���� ������ ��������� -���� 0��3/� &��� ��������� �������� -���

������ ���� �������� ���� ��!������� ����� 0��3� ���� 5���;� ������ ��� ���%7$":�&;�:>�/� &��� �������

������>� �������� -��� ������ ��L%7$":������>/�������� ��������� -��� ��'������� ��� �������

�����������������������!�����������������'�����/�

&�� �������� ���� ��� ������ ��� ���� �������� ������� ��'�����%� 03 �&�� ��0$� ���� ���� ������

��$�����>6%8�������$�����>6�8�-������������ 6&�!���E/>8/�&��� �����������$�����>������������

98Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Figure 5.1 Schematic representation of Adamts1 domain structure and generated recombinantAdamts1 constructs.Schematic representation of the configuration of Adamts1 domains (a). Pre, signal peptide; Pro,prodomain; MMP, metalloprotease catalytic domain; Dis, disintegrin like; Cys, cysteine rich domain; TS,thrombospondin type I repeat; Spacer, spacer domain. Constructs were generated to assess thefunctional importance of different domains (b). Full length and serially truncated constructs of Adamts1

were amplified by gene specific primer based polymerase chain reaction (PCR) and sub-cloned intomammalian expression vector p3xFLAG-CMV13 (Sigma-Aldrich). Generation of a catalytically inactiveconstruct of Adamts1 was achieved by PCR based mutagenesis of the zinc binding domain asdescribed previously (p3xFLAG-6xHis-E/A Ats1; Kuno et al. 1999). A 6x Histidine tag was alsointroduced at the C-terminus of the Adamts1 constructs, upstream of the FLAG tag present in thep3xFLAG-CMV13 vector. Designated names of each construct are found to the right of each schematic.

p3xFLAG-6xHis-Ats1

3xFLAG C-terminal tag

6xHistidine C-termianl tag

p3xFLAG-6xHis-ΔDisAts1

p3xFLAG-6xHis-ΔProAts1

p3xFLAG-6xHis-E/A Ats1

Pre Pro MMP Dis SpacerCys

MMP SpacerCys

SpacerCys

Dis

Pre Pro MMP SpacerCysDis

Pre Pro MMP TSDis Spacer TSCys TS

a

b

TS TS TS

TS TS TS

TS TS TS

TS TS TS

X

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � � � � � � � ����������??�

9���6,��,�������������������� ���������������'����%����6�� ������#�������#������,���'������� ����������� ��� ������������������ ����$���� � ��'������ ��� ���-�� ��� �������/� 7������ ��� !���� �������� ��������� ��M�.� ��'�����/� #��������� ��'������

��������������������������������������������/�7������������������������������@����������������/��

��������� ��,���#������ ��(������6�7/��

"���������

'���������������

3�����������

��(�����5�

'�)������#������ ��(������6�7/��

"���������

'���������������

3�����������

��(�����5�

,/����-��%� ���������6%8� """���-� $"�� -��-������- ���� 0��3� ���������6�8� """���-� � --� ���-- ����&"� A�� 3�

,/����-ΔΔΔΔ,�'�%� Δ���������6%8� """���-�&'"�� -- �- --� -����- �� 0��3� Δ���������6�8� """���$$"�& -��� - - ��- - -�����- �� ���333�

,/����-ΔΔΔΔ%��'�%� Δ����������6%8� """���"�&�"�� --�-�� -� �� � 0��3� Δ����������6�8� """���$$"�& -��� - - ��- - -�����- �� ���333�

,/����-7-�� $���� �">�6%8� � "�-"��"� ����--��'�-� -- �� #��.� $���� �">�6%8�&$""$&��� -� -� -� -� -� -�-� � -��-�

� --- ��A�� 3�

,/����-7-/� $���� �"��6%8� &$"�"-��-���-�$&-���� � � ��� #��.� $���� �"��6%8� &$""$&��� -� -� -� -� -� --�-�� �-�� ��� A�� 3�

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>))�

-�����!����������������33:&����33�63���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8�������

�����������F������������/�A�����%������@��������������������-����-��������%�(����������������%�>���

�����������������6())�&�0���%�>)�&�&���(8%�>������&��������������(��� (�/�&�����������-���������

����������� ����!�������� ���� ���������� ���E��������/�&��� ��������-��� ����� ����!�������� ��������

���������� ����� ��������� &$�� >&&D&>�� ���������� 5/����� 63��������� $�������� ���/� 7��/%� &��

2������%�;3�%�$�������8/�&����������������������������(����������&���������������������������������

���������5/�����%������������������� ����!���������E������������ ���/�������-�����������������.������

�)��������������D(���-����!�����������������������/�&���������!��(E)����������-�����������������

��!��� ���.��� ���M�������� 6())��8� ��� �C��� ��� >� ���/� &��� ���������� !������� -��� ������� ����

�����������������������������������������E/>/>/>/*/�

���

��$�����>�-�����!��'���������!�����������0��3�����A�� 3������������L%7$":������>������������

������������� ������ ����������� ���� ��������� ���������'��������������� $�����>/� &��������������

������-�����������L%7$":���>��������������������%�����E/>/�

&����������>���������������������$�����>����������'��������-�����������������������������������

$�����>�6%�����E/>�!8%�-�����������������������$�����>6%8���������$�����>6�8�������6&�!���E/>8/��

&��������������������������-�����!������� �����0��3����� ���333�������������0$™�/><���: ��6:8�$�

63��������� $�������� ���/� 7��/%� &�� 2������%� ;3�%� $�������8/� &��� �������>� ��'������ -��� �����

��!������� ���� ���0$™�/><���: ��6:8� $� ����� ���%7$":�&;™:>�� ���������� ���������� ������

6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8� ������ ���������������� ��� ���������� ���������>�

6�����!���8/�&�����������������>���������-�����������L%7$":�������>�������'�����������������

���������-����������!�����������������'�����/�

&����L%7$":���>%���L%7$":������>�������L%7$":�������>�������%����:��������@����������������

-�����������������������,������ ��� �����L%7$"� ������� ���� 6%�����E/>%�!8/�&����-��� ���������� ���

�������������������/�&��������������� ����� ���� ��������� ���� �����-���=������������������������������%�

����������� @� ���������� ������� ���� ����������� L!�3� �����%� -��� ��!������� ��� �� �������� �����������

>))��<��������������������������%�@� ���7��.��6%8�EF�� �-�&�$&�$&�$&�$&�$&�$& ��F�����@� ���

7��.�� 6�8� EF� � �-�$&"$&"$&"$&"$&"$&"$ � �F� � 6������� ��� �������� ��������� L!�3� ����������

��������8%�>)���()L�����6�&�0���%�)/�&��������������%�� �C/)8����� (�����>))�����������!���������

>))�����������!���.����>)��������������-���!������!��������������������������>@�����/�&����

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>)>�

��!�������@L ��� ���%������������L!�3�������������������%�-��� �������� �����L!�3������������L%7$":

���>%� ��L%7$":������>� ���� ��L%7$":�������>� ������� ������� -���� $�.������ ������������ ����

������������6(/(/C/������(/(/C/D������������8/�&�������������������-�����������L%7$":@L ��:���>%�

��L%7$":@L ��:������>�������L%7$":@L ��:�������>�6%�����E/>�!8/�

"���������������������������������������������������������-������������!��������!�����������������

�������M����!����������������������!�������������6�����������>???8/�$�����������������������6"$$���

�$$%�"�����������������%�5���N8���������������>E?@:>E?*�60&D))?@(>8������������������������

D)��60�D)��CE>8�-�����������������������"���&�������������������&������������������63���������

$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8����������������������F������������/�����������������

-��� ��� �����-�%� 6%8� EF� $��$�$"���$��$$&&"""��$&"&"� �F� ���� 6�8� EF�

&""&"&�"""&""&&$$���""&$�$���F� 6����!����������� ���������� ������������������� ����������

��������������>E?@8/�&����������������������L%7$":@L ��:���>�6>))��8�-������������!���������C������

>� ���� ��� �� �������� ����������%� >/@���&����������� !����%� >/@��� >)L �:������������������� 6�$&8%� D�

����������0$��������������� (�� ���>@��/�&���� ������������������� �������������������� ������� ������

-���� ��� ���� ��'������ �$"�&"/� $� ���� -��� �������� ��� �� E)��� ������� ����������� >/)� ����� ���

���������� &�'%� E��� >)L� ���� %�������� ���� A����%� )/��&� ����� �0&�%� >�&�&���D%� )/��&� �����

����%�>(/E���������������������������0$����� (�����E)��/��������������������-�����������-�%�?D���(�

��������6>������8%�?D��%��)��������=�EE����)��������=�@*��%�D���������6()�������8%�@*��%�>)���������

6>� �����8/� ���� �������� -��� ������������� "���� $���� $A3� ?C))� ������� �����/� &���������������

��������-��� ���������� ������ E�™� :&>��5/������ 63���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�

$�������8�����������������F�� ����������/�A�����%�(������ ���������������� ��������-��� ����������

�����E)������5/����������������������/�&�����!���-�������!���������������>)������������������:�������

��� �� D(��� -���� !���� ��� �)� �������� �����-��� !�� ����!������ ��� >� ������� ��� ���/� &��� ������ -���

����������� ��� ())������ D(��� ���� 6()�<7� �������%� E�<7� ������������%� )/E�<7� 0���%� >)�&�&���(%�

()�&��������8/�&��������������������-�������-������������!�� ����!����������C������>�����-����

��������6(�)��8/�&����������������-�������������7A:$����������6>)�<7��������%�E�<7�������������%�

E�<7� 0���%� >E�<7� ���8� ����������� ����������� 6>))��<��%� �����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%�

$�������8���������!���������C������>@�����/���������������-����������������������������������������

����������� 6�������� (/(/C/C8� ���� ��'������� 6�������� (/(/C/?8� ������ �� ����� ������������� (E)!��

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>)(�

��-���������������������������������������6EF�""$$"$&�$"$$"""$"�&&"$��F8������������������

�������������������-��������������������������6%�����E/(8/�

6, ,�,�, #/����-7)#4��7-�����#/����-7)#4��7-/�

&����������������������������������������������������-�����!���������������������$,-,.��#%�">�

���� "�� -��� ���������� !�� ���� ������ �5�5:;>� 6���������� ���� ������� ��'������ ��� ;>� ������� ���

$���� 8���������������6.�����������������H���������%�%�����E/��!8/�$��������������������">��������

�������������������;�������">�6%8�����;�������">�6�8����������������������"�%�������;�������"��

6%8�����;�������"��6�8�6&�!���E/>8/�&���������������������������-���������� �����0��3�����A�� 3�

������������%7$":�&;™:>�/�&���������������������������������������">�����"�%�;�������"��6�8�

����;�������">� 6�8%� ��������������:�������� @L����������� ���� ��� �������������������� 6&�!��� E/>%�

%�����E/��!8/�&����������������������-�����������L%7$":@L ��:">�������L%7$":@L ��:"������

-�����'�������������������������������-����������!���������'�����/�

;%&%%%& �������������

&���������(?�&%�03 �&������� ��>������������-�����������������&CE�����.��6�������7������������%�

��-�� ����������%� &����%� 0�2%� $�������8� ����������� >(��� ��� ���!����F�� &�������� 5����� &������

6�&5&8� �� ������ &������� 5��������� &����� 6�&5&8� ������������� -���� >)7� 6�<�8� ������ ����� �����

6��������� �&5&<�&5&8/������� -��� ����!����� ��� �C��� -���� E7���(� ��� �� ����������� ����!���/� $���

��������������-���������������������������������'��������!����M�������/�&�����-������������-����

��-��./�������-������������!��������������������%�-�������-�����A������ ������������-���� (������

)/(E7� 6-<�8� &������ )/�*��<7���� 5�&$¡D0�� 6"�!��%� 3��������� $�������� ���/� 7��/%�&�� 2������%� ;3�%�

$�������8/� &��� �������������������� -��� -������ ��� >(���� ��� ��������������� ����� ���������� ����

�'���������������������������������������������.����������/�&-���������������������������������������

-��������������������������������������������������?):?E7��������������������������������������/�

103Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Figure 5.2 Mutation of the Adamts1 zinc binding region.

Generation of a catalytically inactive construct of Adamts1 was achieved by PCR based mutagenesis ofthe zinc binding domain as described previously (Kuno et al. 1999). A single point mutation of Guanine(a, red box) to Cytosine (b, red box) at nucleotide 1596-1598 (NM_009621) and corresponding residue403 (NP_033751) was introduced. This missense mutation resulted in a GAA � CAA codon change (aand b respectively, blue boxes) and a Guanine (E) � Cytosine (Q) amino acid substitution.

a

b

Wild Typep3xFLAGAts1 sequence

Mutagenised zinc binding regionp3xFLAG-E/A Ats1 sequence

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

104Dunning

Figure 5.3 Schematic representation of the domain organization of Versican and generatedVersican constructs.Schematic of Versican domain organization (a). SP, signal peptide; Ig, immunoglobulin-like; TR,Tandem repeat, Egf, epidermal growth factor-like; CRD, carbohydrate recognition domain; CBP,complement binding protein. Constructs were generated to assess the functional importance of differentdomains (c). Designated names of each construct are found to the right of each schematic. The pECE-V1 contained the entire coding sequence of the V1 isoform of Versican and was a kind donation fromJohn Sandy (b). The G1 and G3 domains of Versican were amplified by gene specific primer basedpolymerase chain reaction (PCR) and sub-cloned into mammalian expression vector p3xFLAG-CMV13(Sigma-Aldrich) (c). The amplified G1 domain terminated at the DPEAAE amino acid sequence normallygenerated by Adamts1 cleavage. A 6x Histidine tag was also introduced at the C-terminus of the G1 andG3 constructs, upstream of the FLAG tag present in the p3xFLAG-CMV13 vector.

p3xFLAG-6xHis-G1

p3xFLAG-6xHis-G3

pECE-V1

SP Ig CS attachmentTR CRDEgf CBPTR Egf

G1 Domain G3 Domain

SP Ig CS attachmentTR CRDEgf CBPTR Egf

SP Ig TR TR

CBP

3xFLAG C-termianl tag

6xHistidineC-termianl tag

Chondroitin Sulphate

a

b

c

CRDEgf EgfDPEAAE

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>)E�

;%&%%%& ���� ���� �����������1���� ����� ������ ���������� �� �������� ���

�����

5��������������������������� ����������� ��������������������$���� �6%�����E/>�����%�����E/�8�

-��� ����������� ����������� ����� (?�&� ������ ������� ��� @� -���� ������� 6������� 7���� ��������%� ��-��

����������%�&����%� 0�2%� $�������8%� ��� (��������������������/� &�������� ������������� -��� ��������

������ 7������������™� ()))� 63��������� $�������� ���/� 7��/%�&�� 2������%� ;3�%� $�������8� ��� ��� ����

�����������F� �����������/�A�����%�D���������������0$�-������������(E)�������:���������� �������

��!������>)���7������������™�()))�-������������(E)����������:�������������������������!�/�&���

��!���-�������!��������E�������������������������=���������������-�����������!�������������-���

�������!��������������������������������()��������/�&����0$<7������������™�()))����������-���

����� ��������� ����� ������ ��� �� ���� -���������/�&����� -��� �������� E� ����� ����� ������������ -����

����������&5&��������������>��������������3&��6�������%����������������������%������:$���������/�

7��%�������� ���%�0�2%�$�������8/�%������������������������������������������%� ������6E��<��8�-���

��������� ��� ���!��� ����������� ��� ����!������ ������� ���� ���������� 6����� ����&���������� >??*8/�

&�������������� ������ -������������ D*������ ����� �����������/� &��������� -���������������������

��!��� !�� �������������%� >>))��� >)��������� ���� ����������� -��� ��������� ��� �� ��-� ��!�/������

������ -��� -������ -���� ������� �A�� 6)/>�C&� 0���%� )/))(C&� ���%� )/))D�� 0�( ��D%� )/))>DC&�

� (��D8� ���� ��������� !�� ����� �������� �����-��� !�� �������������%� >>))��� E��������/������ ��������

-�����������������>))����3�$�!�����6>E)�&�0���%�>7�6�<�8�0�:D)%�)/E7�6-<�8�������������%�)/>7�

6-<�8� ���%� E)�&� &��: ��� � *8=� ���:����!��� �������� ��!��� -��� ������� !�� �������������� ���

>�%)))������>������������������������-�����M������2������!������������/�

2���!���������� �:�>��������������!��������������-��������������������������;>�$,-,.��#�6�5�5:

;>8� ������ � �:;>� 6%����� E/�� !%� .���� ��������� ���� ���/� �/� 7�A���%� ��������� ��� 7���� �������%�

#������������ &�������� ���� $������8/� ;������������������ �:;>������� -��� �������� ������������

���������� 6��&� &����������� ��� ��������� α&5&8� ��� ���� ��� ��������� ���!��� ���������/� ���!���

������������ ��� ���� ���%7$":@� ��:���>� �������� ����� ���� � �:;>� ����� ����� ��������� �������� ����

��������������� ���������������� 7������������®� ()))� 63���������$�����������/� 7��/%�&��2������%�;3�%�

$�������8� ��� �����!��� �!���� ��� ��������� �����������/� ���!��� ������������� -��� ��������� ������

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>)@�

D))��<���"D>*�6������������α&5&8������������-����������������������������������-����������-�������

����������/� ����$�����>�����������-�������������������������������������%�-�����-���������� �:

;>:���>/�

;%&%%%( '�� ��� ����������� ���������� ��

��������������� @� ��� ������� ����!������ �������� -��� �������������� ��A����� ������ 63���������

$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8/����������������-�����������������@������������� (��

�����-��� !�� �-�� -������������ (� �� @������ -���<�'����!������ !����� 6D)�&� ����� � � C/)%� >&� 0���%�

>)�&� �����M���8/�%����������������������������������� 6��������������������!��������'����!����� �����

����������������������()�&� ������ �C/)%�)/E&�0���8�-���������-������������������������������

����)��������/�&������������������-�������������������������������������6A��:����7�!��������

���/� 7��/%� "����������%� 0�2%� $�������8� ���� ���� ���-������� ���������/� &��� -������� ����������� -���

����������!�����������������������������������������M�����������-����!�����6D)�&� ������ �C/)%�>&�

0���%�>):E))�&� �����M���8�����������������������������������!���������������������!�������������

��� �������/� �����������!��������������������������������� ��� ������������������� ����!������$�����>�

��������-��=�-���<�'����!������!�����6D)�&� ������ �C/)%�>&�0���%�E)�&� �����M���8�������(���D�

���-������ �����-����!����������D����������������������������D���E))��� �����������������������!�����

6D)�&� ����� � � C/)%� >&� 0���%� (E)� �� E))�&� �����M���8/� ���������� !����� ������������� ����

����������� ��� ������������������� ����!������">��������-��=�-���<�'����!������!����� 6D)�&� �����

� �C/)%�>&�0���%��)�&������M���8�������(���D����-�����������-����!����������D������������������������

���� D� �� E))��� ����������������������� !����� 6D)�&� ����� � � C/)%� >&� 0���%� (E)�&� �����M���8/� &��

����������!������"��������%�-����������������������������� ���������������� �����������:��������������

���� �����-���������������-�������=�-���<�'����!������!����� 6D)�&� ������ �C/)%�>&�0���%�>))�&�

�����M���8�������(���D����-�����������-����!����������D����������������������������D���E))������������

��������������!�����6D)�&� ������ �C/)%�>&�0���%�E)�&�5�&$8/�

�������� ����� �������;�������-�����.������������� ������������������������� 6#������������$�������%�

$�������8/������!������;�������-���������������� �:;>���������������������������!�������������

6������������ �� ���� ())C8� ������ �� ���!�������� ��� ������ ��������� ���� ���� ���������� ������������/�

A�����%� ������������ ������ -��� !����:����!��� ��� N:��������� 6>)� ��<����� ��� ������%� $�������

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>)C�

A����������%�"5� ���������A��:������������/�7��/%����������0�2%�$�������8����D¨�� ���(D:D*��� ���

���� �������� ��� �������� ����!���� ��!����� 6������ $������� �������%� ������� ���%� 0�2%� $�������8/�

;�������-����������������(&�0��������A�%�� �C/D�������������!���������������������������������

�D))�6>E�x�@E):���������%�$�������A����������%�"5� ���������A��:������������/�7��/%����������

0�2%� $�������8���������!��� ���������� 6��..�������� ())�8/� &������������ ����������� ;������� -���

�����������������>):():������������������������������� ������� 6$������A������������%�A�����%�&$8�

���� 0������&&� ���������������� 6����� $�������%� ����������%� ;3�%� $�������8� -���� *� E)%)))� ����

�))%)))����:����%������������/�&������������������������������������;���������������-�������������

!�� 2������ !���� ������ ���� α:;�� ����!���� �������� ����!������ ������ ;������� �������� !�� ���/�

7�A����������������������!���6�������������>??E8/�

;%&%%%; '�� ������������� ������ ��������A����������� ���

���� ����!������ �������� -��� ����������� !�� 2������ !���� ��������� ��� ����%���� ���/� � �������� -���

���������!��>(7����:�$"5������������������;�%����!����6��������������(/(/E8/�&��!�����

-��� !���.��� -���� �� ��������� ��� E7� 6-<�8� ���:���� ���.� ��� �A�� 6*)�&� 0�( ��D%� ()�&� 0� (��D%�

>))�&� 0���8� ��� >� ���� ��� ���� ���������/� � &��� ���!���� -��� -������ ����� ������ ��� �A��

����������� )/)E7� &-���� ()� 6�A�&8/� &��� ����������!���%� ��!!��� $0&3:%7$"�� ����������� $���!����

6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8�-����������� ���� ���������������������������

(/Eμ�<��� ��� �A�� ����������� >7� A�$� 6�����:$������ ���/� 7��%�������� ���%� 0�2%� $�������8� ��� ����

�������������(�����/�A�����-��������-����������A�&���������!�����-�����������������������:

���.�������:�!!���3�"����>:E)))�6&�������%�0��������%�0�2%�$�������8/�5��������������������������

���������� -��� ����� ��� �������������F�� ������������ 6$������� A����������%� "5� ��������� A��:

������������/�7��/%����������0�2%�$�������8/�

$���:%���� �������������������� -��� ����������� ��������-������ �������������� ������� ���������/�

3�������������������-�����������(D����������������������/�������-���-������!����������A������

������-����������������������������>)�����>�������6�8����������������:()��/�������-�����!��'�������

-�������-����-�����A�/�������-���!���.��� ���>7�A�$<�A�����>)�������������������������/�&���

��������!!���$0&3:%7$"�������������$���!���� 6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8�

-��� ����!����� -���� ��������� Eμ�<��� ��� �A�� ��� >�������� ���� ���������/������� -��� -����������

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>)*�

����!����� -���� ���� ��������� ����!���%� $����� %����� D**:���.��� ����:�!!��� 3�"� ��� >:E))� 6&��������

��!��%� 3���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8� ����A�������������>7�A�$� ����)�

�������� ��� ���� ���������/������� -��� -������ ���� ������� �������� -���� �))�&� �$�3� 6&��������

��!��%�3���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8/�

;%&%%%� � ������ �������� � ���������''�1�����

���������������������:�$"5������-����������������� ���������������������.���6A��:����7�!��������

���/� 7��/%� "����������%� 0�2%� $�������8� ��� ��� ���� �����������F� �����������/� � A�����%� �����-����

�������������%����:�$"5������-��� ������ ���%��������5���������������� 6E)7���������� 6�<�8%� >)7�

������������6�<�8%�>)7�%��������5������������������6�<�8������)7�&����N� (��6�<�8����()���������-����

���������/�"����-���-�������-�������&����N� (�����>)��������/�������������������������-�����������

!�� ����!������ ���>E:()��������%�-�������������%� �����������������E7������������������������ 6�<�8%�E7�

���������� &������� ��������� 6�<�8%� E7� 3����� ������������ ������� 6�<�8%� E)7� ������������

$������������������ 6�<�8������E7� ()� 6�<�8/�&�������������������-�����������!��-������������ �����

������������E7�������������6�<�8����>E��������������-���!������������&����N� (�����E��������/�"����-���

��������������������������������6��>()�����.8/�

;%&%%%9 "�� )������������������ ��� �� �������������� ������ �����6�� ���� ����

'����%�

��������������������������%������������������������������������������� ���������������������������

�����-���������������������!���6���������/(/>8/�3������������������������������;������������������

���������� � ���%�3;&�������-����������������-����������������!������������������;�������6��������

E/(/>/D%�����������!�����>:()���������8%� E)�3#<��� ����!������������%� � 6�����:$���������/� 7��%�

������� ���%� 0�2%� $�������8� �� ���<��� 5��� 6�����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%� $�������8/�

%����-���� �� ������� ��������� ()� �� ���������� ��� �������� ���������� -������������ ��������!��� ���

�������� (/(/(�!���� ��������!�����-���-��� !����� ��� ���� �������������������%�-�����-��� ��������

���������������������!����������������������/��

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>)?�

&����������� ���� ���������� ����:�������;�����������$�����>:��������;����������������������������

� ���%�������������������-������������������ �:�>�������������%�� �:;>������ �:;>:���>������/�

A�����%� ���� ����� ������ -��� ������� ��� �'���� �������� ����� &CE� ����� ������� ����.� 6������� 7���� ��������%�

��-������������%�&����%�0�2%�$�������8� ���������&�������5���������&�����6�&5&8��������������-����

>)7�6�<�8����������������/�������-�������-�����������������������.����(D�������C���-����E7���(������

����������� ����!���/� &��� ������ -��� -������ ���� ���� ������ �������� ��� ����� ���� �&5&�

�������������-����>�������������� 3&��6�������%� ���������������������%������:$���������/�7��%��������

���%�0�2%�$�������8���������!����������������D*���������������������������������������������/��&���

����������� �:�>%�� �:;>������ �:;>:���>���������������������������������������� � ���� -���

���������!���������������������3;&�������-����E)%��)%�>)����7�6�<�8����������������������E)�3#<���

����!������������%� �������������/�

6,/ '0�1� ��

6,/,� "������������� ��� B������� 9��� ������� �� ����9����� �������

#�������

%����-���� ���� ������������ ��� �������� ���������� ��������%� ��L����:���>%� ���%7$":������>%�

���%7$":�������>������������������� ��������� ���%7$":5<$����>� 6%����� E/>�!������������� E/(/>/>/>8�

����������������������������������!�������������-������������!����������������������������%7$"�

���� ����������������������2������!������������������������������������������������������� �����(?�&�

������6%�����E/D8/��3����������������������-���������%7$"���������������������������������������-����

���%7$"���>%� ���%7$":������>%� ���%7$":�������>� �� ���%7$"� 5<$� ���>� 6%����� E/D� �:�8/��

3������������������ ����������� -���� ���%7$"���>%� ���%7$":�������>��� ���%7$":5<$����>%����-���

���������� ��������� ��� ���������������������� ���������� ������ 6%����� E/D��%� !������%�.�������.�8�

���������������������������!������������������������������� ������5�&/�&�����������������������-�������

��������� ��� ������ ����������� -���� ���%7$":������>� 6%����� E/D� �8� ����������� ��� ��� ���� �������� ��

���������!����5�&/�

2������ !���� ��������� ��� �������� �������� ���� ������ ��� ������ ����������� -���� ���%7$"���>� ����

���%7$"�5<$����>����-���������α:%7$"���������������!���������������������>>).�������*E.����

110Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Figure 5.4 Immunolocalisation and Western blot analysis of recombinant Adamts1 proteins.

p3xFLAG constructs containing Adamts1 were transfected into 293T cells and their expressionanalysed by immunohistochemistry using �-FLAG antibody (Sigma-Aldrich) and DAPI nuclear stain (a-d). Cell lysates and media were analysed by Western blot using �-FLAG antibody (e-h). Successfuldetection of FLAG immunoreactive proteins was seen for full length Adamts1 (p3xFLAGAts1) (a);catalytically inactive Adamts1 (p3xFLAG-E/A-Ats1) (b); �proAdamts1 (p3xFLAG�proAts1) (c) and �DisintegrinAdamts1 (p3xFLAG�DisAts1) (d) transfected cells. A band corresponding to a recombinantpro form of Adamts1, ~110kDa (black arrow heads, Russell et al, 2003), was present in the cell layer ofp3xFLAGAts1 and p3xFLAG-E/A-Ats1 transfected cells (e and f respectively). These transfectants alsoproduced a band corresponding to a mature recombinant Adamts1 (~85kDa, open arrowheads, Russellet al 2003) present in the media. Anti-FLAG immunoreactive protein was detected within cells ofp3xFLAG�proAts1 (c) however, no bands of predicted size were detected in either media or cell layersby Western blot (g). A band corresponding to the predicted size of 56kDa (calculated usingbioinformatics) was present in both cell and media layers of p3xFLAG�DisAts1 transfected cells (arrow,h).

a

b

c

d

e

f

g

h

p3xFLAGAts1

p3xFLAG�DisAts1

p3xFLAG�ProAts1

p3xFLAG E/A Ats1

������

e

f

g

h

75

50

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>>>�

��� ���� ����� ���� ������ ������ ������������ 6%����� E/D� �� ���� �8/� &����� !����� ��������� ��� ��M���

��������������:�����������������$�����>%�������������6��������������())��8���������������������:

$�����>��������������������������-�����������������������������������������/�&������%7$":������>�

���������-��� ���������������������������������������������!������$�����>���������������������!��

��� ������� ��M�� ��� ������ $�����>� ���������� ����� ������������ -���� ���%7$"���>� 6%����� E/>� !8/�

��������� ��������� ��� ������� ����!������ ������� ��� ������ ���� ����� �� ������ ������ ��� ���%7$":

������>������������������!��2������!����-����������������������������������������α:%7$"����������

������� -������ ����������� ������ !�� �������������������� 6%����� E/D� �� ���� �%� �����������8/� � 3�� -���

���������� ������������������ ��� ����������� �������� ������� ��� ���������������� ������ !�� ����������

�������������������������������������������������������/�

&��������������������%����%7$":�������>%�-����������������������������!������$�����>��������

��������������������&��>���������������������-��������������������������������6%�����E/>�!8/� . �

�������������� ��������� ���� ����!������ ���%7$":�������>�������� ��� !�� E@.��� �����M�/�$���:%7$"�

2������!�������������������%7$":�������>���������������������-�����������!����������������������

�����-���������������� ���������������M��6E@.��%�%�����E/D��%�*��8/�$�!����������������M�%�!������

���������������%�-����������������������������������6%�����E/D��%����8/�

&�������������������!������������������$�����>������������������!��α−%7$"�2������!����6%�����E/D�

�8�-������������-�������$�����>�����!�������������������������������������������������$�����>�

6α:$�����>:&&�%� ������� ������ α:$�����>:&�8� 6�������� �� ���� ())��8/� 3�� �������� 2������ !�����

������α:%7$"�����α:$�����>:&&������!����������>>)�����*E.���!�����-����������������������������

������ ������ ������������ 6%�����E/E��<!%� ������>�����(%�)���5������� �����.���8�!������� ���������

�����������-�������%7$":5;��������6%�����E/E��<!%�������������D������������8/��&����������������������

>>)� ���� *E.��� !����� ��� ����������� ��� ���� ��:� ���� ������ ����� ��� $�����>� �����������/� � $��

�����������α:$�����>:&&����������������!���%��������������EE:@).��������M�%�-�����������������

����� �������� ��� !���� ���%7$":���>� ���� ���%7$":5;� ����������� ������ ���� ���� !���� ���������

�������������������������!�������������������!�����:���������6��������������())��8/�$����������������

��:���������$�����>����������������������-���������������(?�&�����������������α:$�����>:&&��

����!���� ��� ���������� ������ ����������������� 6%����� E/E� !%� ������������ D8� ���� EE:@).��� ������� ���

�������������������:��������/�

112Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Figure 5.5 FLAG tagged recombinant Adamts1 protein is immunoreactive with both �-FLAG and�-Adamts1 antibodies.p3xFLAG vector containing the entire coding sequence of Adamts1 (p3xFLAGAts1) or no insert(p3xFLAG EV; empty vector) were transfected into 293T cells and cell lysates (a and b, Lanes 1 & 3)and media (a and b, lanes 2 & 4) were analysed by Western blot using both �-FLAG (Sigma-Aldrich)(a) and �-Adamts1-MMP (b) antibodies. A band corresponding to a FLAG immunoreactive proAdamts1, ~110kDa (black arrow head), was present in the cell layer of p3xFLAGAts1 transfected cells(a, lane 1) and a mature Adamts1 band present in the media (~85kDa, open arrowhead, a, lane 2) .Bands of similar size were detected in the cell layer and media extract using the anti-Adamts1-MMPantibody (formally termed Anti-MP-ADAMTS-1, Russell et al, 2003). Similar sized bands were notdetected using either antibody in either the cell or media layer of empty vector transfected cells (a andb, lanes 3 and 4 respectively). Anti-Adamts1-MMP also detected a non-specific band of ~60kDa in thecell layer of both Adamts1 and empty vector transfected cells as seen previously (b, lanes 1 and 3,black arrow, Russell et al 2003).

a b

250

150

100

75

50

250

150

100

75

50

�-FLAG �-Adamts1-MMP

p3xFLAGAts1 p3xFLAG EV p3xFLAGAts1 p3xFLAG EV

1 1 2 3 42 3 4

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>>��

&���������������-����������!������������������������������������������������������$�����>����-����

��� �����:�������� ������ ��� ������������ �������� ��� ����������� ����������� (?�&� ������ ���� ���� !��

���������!�������%7$"����%�������������������������������������������������������!����������������

����������/��

6,/, �����������������9�����������������������)����

&������������������������� ��������!������������$�����>��������-������������!�����!��� ������������

� �:;>�������-���� �������%7$":@� ��:���>��������/� �&������������������������� ����;>� ����������

;������� 6E/(/>/�8/� %���� ������� ����!������ ;������� ���� ������ ����!������ $�����>� -���

���������������������� ��� ������������� ����� �:;>:���>� ����� ����%������� ���� α:;����������� α:%7$"�

����!������ 6%�����E/@�������!8/�&����������%���5$$5%����������!��$�����>�������������;�������

-��� ����� ��������� ��� ���� ������ ��� ���� � �:;>:���>� ����� ����� 6%����� E/@� �8%� ������������� ����

����������������������������������;�������!������!������$�����>/�

6,/,/ �#���������������9������������#����������

&�����!������������������������������!����������������@�� �������������!����������-��������������

����� �������%7$":��������������� ��������������������������!�����.������������������������� 6%�����E/>�

!%� �������� E/(/>/>/>8/����������������� ���� ������������ �������� ������� ����!������$�����>� ��������

-��� ���������� ������ ���������� ��� ���� ���%7$":@� ��:�������� ��������� 6%����� E/>� !8/� ������

��������� ���� 0�:����� -���� ���������� �������������� ��� �����M���%� ���������� ���� �E@.��� α:%7$"�

��������� !���� ������������ ��� ���� ��M�� ��� ����!������ �������� ������� ��� ���� ������������ ������

6%�����E/C��%����8����������!����-��������������������������������������������������-����0�:����/����

��������������!�����-������������ ���!����(E)�&�����E))�&� �����M������������� 6%�����E/C��%�,*�

�/@�*����6�������,/�/@@�*����6��%������������8/�%�������������-������-�������������������

!����� ������������ ��� ����!������ �������� ������� !�� 2������ !���� 6%����� E/C� �%� ,*� �/@�*�

���6�������,/�/@@�*����6��8����������������������������������������������������������������

!��������������6%�����E/C�!%�,*��/@�*����6�������,/�/@@�*����6��8/� �-�����������!������

������������� �������������� ����������������� ��� 5D����� 5E� -��� ����� >)7� ����� ����� ����� ��� ���� ������

�-FLAG �-JSCDPE

150

100

75250

350�

Med

ia

�-Versicana b c

Ce

ll

Me

dia

100

75

50

Me

dia

114Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Figure 5.6 Recombinant Adamts1 is catalytically active.p3xFLAG vector containing the entire coding sequence of Adamts1 (p3xFLAG-6xHis-Ats1) was stablytransfected into a CHO-K1 cell line already stably expressing the V1 isoform of VERSICAN (Kinddonation by Prof. R. LeBaron. Cell lysates and/or Media were analysed by Western blot for full lengthVersican (a) using �-Versican antibody (Sandy et al. 2001); the pro and mature forms of recombinantAdamts1 using �-FLAG antibody (Sigma-Aldrich) (b); and the ectodomain DPEAAE generated byAdamts1 cleavage of VERSICAN using �-JSCDPE (previously termed anti-DPEAAE, Sandy et al.

2001) (c). A band, approximately 350kDa in size, corresponding to full length Versican was detected inthe media (a, black arrow). The pro (~110kDa, black arrow head) and mature (~85kDa, open

arrowhead) forms of recombinant flag tagged Adamts1 were present in the cell layer and mediarespectively (b). The ectodomain DPEAAE generated by Adamts1 cleavage of Versican was detected inthe media (c, ~70kDa, open arrow).

115Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Figure 5.7 Optimisation of recombinant Adamts1 protein purification.

p3xFLAG-6xHis-�DisAts1 was transfected into 293T cells and the media collected for purification.Purification was carried out by nickel affinity chromatography utilising the introduced C-terminal6xHistidine tag. Optimisation of purification involved binding of the recombinant protein present in theconditioned media, 2 washes of the resin with buffer containing 10mM imidazole (W1 and W2) followedby serial elutions with increasing concentrations of imidazole (E1-E5). Anti-FLAG Western blotting wasused to determine which fraction the recombinant Adamts1 began to elute in (a) and an identical silverstained SDS-PAGE gel to determine the purity of each fraction (b).

a

�-FLAG

Silver Stain

b

Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

�-FLAG

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>>@�

������������������ 6%�����E/C�!%�,*��/@�*� ���6��%�,/�/@@�*� ���6����������� �����������8�

������������������������!�������������-�����������������������������������������������������������/�

$������!���������������������������������-��.������>))�&������M����������������������E)�&�6%�����

E/C��8%�-���������������������������-���������������-������ ���� ����������� ���E)�&� �����M���� �����

-�������� ����� ������������� ���� ������������������� ����'����!��������� ���� ��������� -������� ������

�����������������������������������������������/���

$�� �������� ��� ���� ������������ ��� ����!������ $�����>� ������ ���� ���������� ����������� ��� ���-�� ���

%����� E/*/������������������������������ ��������� �������������������� ���%7$":@� ��:����%� -���

�����������α:%7$"�������!������������������������6%�����E/*�������!%������������%���������!������

���������E/(/>/E�����E/(/>/@8/�$�������!�������������������������$�����>�6�*E.��8�-���������� ���

�������������������� �������� �����������������6%�����E/*��%����8/�$��������!����������������M��-���

�������������������!�������������������������-���%�!������-������������������������������>:��6%�����E/*�

�%� 7�� ���� ,��,J8/� ������� !����� ��������� ��� ��������� >:�� ������ α:%7$"� ������!�������� -��� �����

��������� !�� ������ ������ 6%����� E/*� �� ���� !%�,�:,J8� ������������� ���� ����� ������ ��� ����!������

������$�����>/�

6,/,3 �#��������#����������������9�����4�������#�������

���������������� ���������������� �������� ��� ����!������">�;�������-���������������������!���

�!���� ���$�����>/�&�������������!��������������������������������� ���� ���������� ���$�����>=����

����!������ ">� !����� ��� ������ ��� �� ������������� ��� E)�&� �����M���%� ������ �)�&� -��� ����� ���

-������������'����!������������ 6E/(/>/D8/�$������������� �������������� ���������������;�������">� ���

���-�� ���%�����E/?/� �&��� ����!������">� ��������-������������� ��������� ����;������� ��������

��������� !�� $�����>� ��������� -����� � ������������� ����������� �C).��� 6������������ ())>=�

�������������� ())��8/�2����������� ����� ���� ����!������">��������-����� !����������������/E.���

��������� ��� ���� ��������������� ���� ��!���� �������� @� ���������������%7$"� ����� 6��� �CD.��8/� A��

2������!���%� �-��α:%7$"� ����������������������-������������ ��� ���������������������������-���

������������� CE:*).��� ���� @E:C).��� ��� ��M�� 6%����� E/?� �%� ���8/� &��� ">� ����!������ �������

������������������������������������������������������%�����������������������-���������������������

��� !�� ����!������ ">� -���� ����������� ��������� ������������ ���� ���� ��-�� ��� ���� �-�� !����� 6�@E:

117Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Figure 5.8 Optimised purification of recombinant Adamts1 protein.

p3xFLAG vector containing the entire coding sequence of Adamts1 (p3xFLAG-6xHis-Ats1) wastransfected into 293T cells and the media collected for purification of mature recombinant Adamts1.Purification was carried out by nickel affinity chromatography utilising an introduced C-terminal 6xhistidine tag and optimised washing and elution conditions as determined by Figure 5.7. Anti-FlagWestern blotting was used to verify that a protein of approximate predicted size was eluted (a) and anidentical silver stained SDS-PAGE gel to determine the purity of each elution (b). An �-FLAGimmunoreactive band corresponding to the approximate predicted size of mature Adamts1 protein(~85kDa) was detected in elutions 1, 2 and 3 (a, E1-E3, black arrowhead). A protein of similar size,presumed to be mature Adamts1, was the predominant band detected by silver stain in these sameelutions (b, E1-E3, black arrowhead).

a

b

�-FLAG�-FLAG

Silver Stain

Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturatio

118Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Figure 5.9 Optimised Purification of Recombinant Versican G1 protein.

p3xFLAG vector containing the coding sequence of the G1 domain of Versican (p3xFLAG-6xHis-G1)was transfected into CHO-KI cells and the media collected for purification of the recombinant protein.Purification was carried out by nickel affinity chromatography utilising the introduced C-terminal 6xhistidine tag and optimised washing conditions. Anti-Flag Western blotting was used to verify that aprotein of approximate predicted size was eluted (a) and an identical silver stained SDS-PAGE gel todetermine the purity of each elution (b). A strong band was detected in elutions 1 and 2 (a, E1 and E2).A predominant band of similar size was detected by silver stain in these same elutions (b, E1 and E2).

a

�-FLAG

Silver Stain

b

mts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

�-FLAG

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>>?�

C).��8�-������/� &���������������">�-������������������������� ��� ���� ���-� ������� �������� �����������

��������������������������������������������������������">���-���������������������������������������

�����.��-�� 6%�����E/?��%�(��.� ������8/�&���������� �-��!�����-������������ ������������>�����(%�

��-������������������">��������-������������������������������!�������������6%�����E/?��%�,������

,�8/� � A�� ������ �����%� ��������� >� ���� (� ���������� �� ����������� !���� ��� ������������� CE:*).���

�����������������������!����������������">������������������!��������!��������6%�����E/?�!%�,��

���� ,�8/� $���������� ������� !����� -��� ��������� ��� ������ ��������� !��� ��� ����� ��-�� �����������%�

����������������������!������">�-�������������������������������������������������/�

&�����������������������������������������;�������">��������-������������!�������������������������

����!������;�������"�/�&����������������������������������">��������������� ���������������������α:

%7$"� ���������������������������������������M�����"��6������������-�8/�$�����������������'������

����������������������������������������������������������������!��������������������������������������

���%�-�����-����������!�!������� ��������� ��� ����������������� ���� ��������������������������� ���

�������� ���� "�� ��������/� &��� ��������������������� ���� ������!��� �������� ��� ������� ������ !�������

��������� ��� �������.��� ����� �����-��������������������!�� �����M���/�5�&$� ��������������������!��� ���

��������������!�������������!������������������.���������������������������/�2����������������!�����

����������E)�&�5�&$���������������������������������������M��6D>.��8�-�������������������������-��

���������!��α:%7$"� ������!��������6%�����E/>)��%�,������,��������������������E/(/>/D8/�$�!�������

���������M��-������������!�������������� ��� ����������� �-����������� 6%�����E/>)�!%�,������,�%�)���5�

����.���8/� �-��������!���������������������������!������"���������-����������������������

!�����������������������������-��������������������!���������'��������������������������������������

����������������������������-��������������!���������������!�������������6%�����E/>)�!%�,������,�8/�

;%&%(%% 6�� ���� ������������������� ���

&�������������������3;&��������-��������!������;�������������������� �:;>���������������������

����� ������� ������������ �������� ��� �� ������������ �������� ��� ���� �������� ���������� ������ 6�53� U<:�

�/5/&/8��������� ����������-���� ������������6�A�%�#� 8/� �&���������53�-����������������� ����� �����

����������-���������-����������� ������������������5�����%� �6�P)/)E%�%�����E/>>��8%���-���%�

��������������������!���'����!����/� �2���� �����������������������������������-����������%������

Figure 5.10 Purification of recombinant Versican G3 protein.

p3xFLAG vector containing the coding sequence of the G3 domain of Versican (p3xFLAG-6xHis-G3)was transfected into 293T cells and the media collected for purification of the recombinant protein.Purification was carried out by nickel affinity chromatography. Sequencing revealed the C-terminalhistidine tag coded for 7 and not 6 histidine amino acids due to a nucleotide error in the reverse primer,resulting in strong affinity for and binding to the nickel resin. Elution of recombinant G3 was achievedusing 50mM EDTA. Anti-Flag Western blotting was used to verify that a protein of approximatepredicted size was eluted (a) and an identical silver stained SDS-PAGE gel to determine the purity ofeach elution (b). A band of approximate predicted size (~41kDa, predicted using bioinformatics) wasdetected in elutions 1 and 2 (a, E1 and E2). A band of similar size was detected by silver stain in thesesame elutions (b, black arrowhead, E1 and E2). Other contaminating proteins of similar intensities werealso present in these fractions.

120Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Silver Stain

a

�-FLAG

b

n: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte m

�-FLAG

121Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Figure 5.11 Purified Versican induces cumulus oocyte complex expansion.Degree of cumulus expansion (+/-SEM) scored following 20 h of in vitro maturation. Cumulus oocytecomplexes (COCs) were cultured in the presence of no stimulus (None), a 1:20 dilution of Versican(purified by size exclusion chromatography), Egf (3ng/ml) or FSH (50mIU/ml) (a). In b, individual COCscores were graphed for each of the treatments. Data is expressed as mean +/- S.E.M. (n27 COCs).Significant difference (P<0.05) represented by different characters.

a

b

a

b

cc

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>((�

��������-�����������������������������������)%�����������������������������������������������������

����������%���>%�������������������������������������������������������������-��������������.���

�����������������6%�����E/>>�!%�#� 8/�$�������������������������������������������������������-���

���������������������-����;������=������(����������������)�����%�������������������>%�-�����*�

�����������(���������6%�����E/>>�!8/�&������������������������-����������������������������

-��������!������;�������-����!������������������������������� � ���%�!����������������������������

��������� ����� �53� ������� ���� �� �������� ������ ��� ���� ���������� ��� ����� �������� -���� ����

;������%�-��������������������������������������������������������������/��

�������� ���������� � ���� -��� ����� �������������� ��������� !�� ��������� ����������� ����� ���

������������ ������ 6�&8� ����������� ����� ������� ����!������ ;������� ���� ���� � �:;>� ����� �����

�������� ��� �����53�����������������-��������'���� ���������������������������� ���� ������������

� �:�>����������/��&����������������-�����������������������������������������;�������������������

!����������/� �&��������-����E)%��)���>)7��&� ��������� ����������������� ����������53��������� ���

������� � �:�>� �&� ��������� ���� ���� ����� �53� ��� ����� ������������� ��� ;������� -��� ����

�������������� ��������� ���� ����� ����� ��� %� � ������� ��������� ������� 3;&� �������/� � %�������%�

����!������ ;���������������� ��� ���!�������� -���� $�����>� ����������� �������� ;������� 6%�����

E/@8���������������������������������������������� ����������53�������������������� �:�>��&/��$��

-���� ;������� �����%� �����53� �������� !�� E)%��)� �� >)7� ;������U$�����>� ������������������ -���

�'��������� ��� ����� �������� !�� E)�3#� %� � 6�P)/)E%� %����� E/>(8/� � &��� �53� ����� ��� E)7�

;������U$�����>�������������������-����������������������� ����� ����� ��������!�� ����������������

���;������������/� 3�����������53�������-����������� ���������� ���� �������� ����������������� ���

%� ����� ����E)7��&� ���������/�&��������-����E)�3#�%� � ������������������ ������������-������

!���� �������� ���������-����� ���������-����E)7�� �:�>��&� ���� ���������������� ����� �������� ���

������� ���!������������� ��������� 6%����� E/>(� !8� �������� ��� �������������� ��������� -������� ���������

6%����� E/>>%�#� 8/� � &�������� -���� ;������� �������� ��� ������������53� �������������� -����� ����

�������� ��� $�����>� �������� ;������� 6%����� E/>(� !8� �������� ��� �'������ ����������� �������� �53�

���������D/��

123Dunning

Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation

Figure 5.12 Recombinant Versican and Adamts1 cleaved Versican are able to induce cumulusoocyte expansion.Degree of cumulus expansion scored following 20 h of in vitro maturation. (a) Cumulus oocytecomplexes (COCs) were cultured in the presence of FSH (50mIU/ml) or media supplemented with 50,30, 10 or 3% conditioned media from untransfected CHO-KI (Control), or CHO-KI cells stablytransfected with Versican alone (pECE-V1) or Versican (pECE-V1) and full length Adamts1(p3xFLAGAts1, Versican + Adamts1). In b, individual COC scores were graphed for the FSH treatmentand the Control, Versican and Adamts1 + Versican treatments of 50% conditioned mediasupplementation. Data is expressed as mean +/-S.E.M. (n= 5-11 COCs). Significant difference (P<0.05)represented by different characters.

c,d

a,ba

a

a

cc c

a

d

c,d

b,c

a

Control VersicanVersican +

Adamts1

a

b

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>(D�

6,3 %"��1��"�$��

&����������������������������������������������������������������������������������/�3���������-��

�������������������������������������������6����8�������� � ����63;&8��������������$�����>������

;������%����������!������� ��� � �������������� 6��������������())C�������������8/�$�����>�

����;�������������������������������������%�-�����������������������������������������������������

���������� �� ������� ���������/� 3�� ���� ��� ������ ���� ���� ��� ������ ������������� ��������� ������%� 3�

����������������� ����� ������������������$�����>�����;�����������������������������������������

����������������������������������������������������������������/�

6,3,� 0�#����������#����������������9���������������4�������

&��������� ��� ���� ��:������� ��� $�����>� ��� ��� �������� ��� ������� ��������������� ������� ��������

6���%7$":@� 3�:������5��������� ������ ������������������������6%�����E/D��8/�3�� ������������������

������:�����������$�����>� ��� �'�����.������� ���� �������� ����� ������������������������������� ���

�����������������������������������������������M�����6&�����������>???=�����������()))=��������

����())E8/� 3��������!��'�������!�������-�� ����� ���������������� ����!������$�$&&�?� ������������

�����-������������������ ������:��������6����������())C8/�&�����������������������������������-��

���� ��� ��� ��������� -���� ���� $�$&&�?� �����%� ��-���%� $�$&&�?� ������� -��� ��������� ��� �����

�������%�-������������������-�����������6%�����E/D��8�6����������())C8/�&����-�����$�$&&�?���:�

������� ������� ��������� ��� ��������� ��� ������� �������� ����� ���� ��:� ������� ��� $�����>� ���

���������������M������������������������������������������/��3�����������������3����������������������

��� ���� ��������� ���������� ��������� �������%� -����� ���� ���� �������� ���� ��������������� �������

����������������������������������!����������������6%�����E/D��8/�3��������������$�����>%�����������

����� ���� ��:� ������� ��� ���������� ��� ������ ���������� ���� ������������ ��� ���������� �����������

�������������������!�������������/�

��������������������������� �����������-���� ����� �������$�����>�6���%7$":@� ��:����8����������������

�����<�������$�����>�-���� ������� ��������������� ��� ����������������6%�����E/E8/� �&����������������

������ -��� ����� ��� �� ������ ��� ������� $�����>/� � ������������ ��� �:���������� @�� ���������� �������

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>(E�

����!������������������������������������������������-����������������������������������������������

�������������������������������!�������������6%�����E/*�����%�����E/?8/������������������������-���

������������������������������������-�������������������������;�������"��6���%7$":@� ��:"�8�-�����

������������������������������������������������������������������%�����������������������������������������

����!�����������������������.�������/�5������������������!�����������!�����������������������.��������

���� ���������������� �����-���� ��������������������������%�5�&$�6%�����E/>)8/�&������������������

������� ;������� "�� ��������� ����������� @� ���������� ������� ��� ���� �:�������� ���� ���� ������� ����

�����������%� ��� ������������������ ����!�������������-������������ ��� ���������� �����-���� ������������

��������������!���������������������������������������6������������-�8/�3��-����������������������"��

����������;�������!����������������5�&������������<������������������������������!��������������

�������6$��!���������>??C=������������())>=�2��������())(=�2��������())E8/�&�����������!�������

����������"��������������������!����������������������������!��������5�&����������������������������

62��������())E!8������������������� ��� ���� ��-� ���������� ����!���������������������� ��� ���������/�

%�������������������������������������!������"�������������!����������������������!������������

�����!���������������������������������������������������!���������������������������������������������������

���������/�$�����������%� ���� !����������"�� ��� ���� 5�&����������������������� ������� !�� ���������

������������������������!�����������������������������������������"��-����5�&����������������������/�

$������������������������������������������������!������������������������������!�����������������

����5�&�!���������������������������������!������������������������������������������!����������

!�������������������%�������������-����������������������-����������62��������())(8/��������������

����������������������������3�-������!�����������������������������������������!������"��;������/�

6,3, ����)��������4������������������������������#������

$�� -�� -��� �!��� ��� ������������� �������� ����!������ ;����������� $�����>� ����� -��� ��������������

������%� ���� �������� �������� ;������� ��� ������� 6%����� E/@8%� -�� ��������� ���� ��������� ��� ������

�������� ������ �������� ���������� � ����� �������������� -��� ������� !�� ���������������� -����

����!������$�����>�����;�����������-�����������������3;&������������6��������8/�;��������������

�������������������������� � ����-������������������������������������������������������������/��

%����%�������������;�������!����:���������$�����>����������������������������/�&���������������

��������;�������������� ��� �����������-��� ��������!�� ����������!��������� ������������������� ��������� �����

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>(@�

�����������/��$��������������������������������������������.�����������������������������������������

���������� ��� ���� ��������� � �/� 3�����������%� �������!�������-�� ����� ����!����������;������� ��� $����

������ ��� ������������������ 6��������������())�!8%� ������� ��������������� ������������� �����%�!��� ���

��������� !�� ����������� ������������� ������������ 6�������� �� ���� ())@8/� A������� ��� $� ��� �������

��������� -���� ����������� ���!��� ��� ;������� ���������� ������ ����������� ����������/� 3�� ����

��������-�������� ������������� $� ����������������5��:��.����������������;������%�������������-�����

���������������������������-���������������-��������-������������������ $�������!��!��������������!���

;������� ��� ���� ������������� �������� -��� ���� ����������� ��� �������� ���������� ��� ���� ����� �����

����������� ��������������������� ��� ������ ��-�����/� � &����!�����������!��������� ��������� ��� ����

;������� -��� ����������� -���� ����� ������/� � ����������� !������� ����������� -��� ���� ��� ;�������

������������ ����� ���� ������ ��� �� ��-� ����� ���� ����� ����� ���!���� �������� ���������� ��� �������

������������-���������������������������/�

#���� � �� ����������� �� ��������� ��������������� ���������� !�� �������� �������������� ����������

���������������-����;���������������������������/����!��'�������;�������!�����������������������

�������������������������������������������������/��&����������������������5�����!��;�����������!��

��������� ��� ������ ���������� ��������������������������������������� �����-���� ����������� !�� ���� 7 �

�������������������������������$����������%�5�������������A�����������/�

������������ ;������� !�� $�����>������� ��� �������� 6�������� ())�8��������� 3� ������ ����� ��������

;���������������������������������������������������;������������/��3�����������%�������������

�����������;�������-������������������������������6%���E/>(�8�-�����$�����>���������;�����������

���-������������������������������������������������/� &���� �������������������-�����������������

!�����������������;�������-���!�������������-���� $���������������������;��������������-�����������

���%�-����� ������������;����������-���������������������� ����������� �����������!�� $� ������������

��������������������� $:!�����������5��:��.���������!��������������/�

&����!���������;�������������������������������������������-�.��������������������-��������������:

��������5��:��.������������;����������������5��� �������� 65����8� 6L�����������())@8/�&����;�������

���� ��������� -���� ����� 5��:��.�� ������� ���������� ��� ���� �������� ������ � �� ����������� ��������

������������������������������/� $�����>����� ����������� ��� ���������������� ;������%��������������

!���� �������� ��� !�� ������������������� ����� ���������� ����� 5��:��.�� �������� 6$������ �� ���� ())*8/�

�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������

"� ����� � ��>(C�

;�������� ����������� ��� 5����� ���� ������������� ��� ���� ������������ ������������� �������%� ���� ����

��������������������%�������������������������������������������������������������������/��

%����� ����������� -��� ��������� ���� ��������� ��� ������� ����� ���� "�� ������� ��� ;������� -���

�������!�����������������������������������������!��������������������"������!������������=���-����

���� ��� ������������������������������������� ������������ ���������!������������%� �����-������������!��/��

%������������������� �������������������"��;������������������������� ����������� �����������������

�����������������5������������������������������������������������������������������/�

3��������%� ���� ����������-������ ��������� ����� ���� ���������������;�����������$�����>� ����� ����

��������� ������������������ � �������!���� ��� ��������������������������/� &���� ��� ��� ��.���� �����

$�����>� ���� ;������� �������� �������� ��� �������� ����� ���������� ���� �������� ������

�������<�������������������� ���.��� ������������������������������������������/�$��������������

� �������������������$�����>���;��������������6��������8%������������������!�����������;�������

����$�����>���������������������������6����������!�������������������8%������!���������������

������������������!�� 6��� ������ ������8� �������!��� ��� ���� ��-������������������������������ 3;&�

�������/� 3�� ��������� � ���� ������� ����� ��� ���� �������� ��� ���� ����������� ������� ��� ��������

;������%� -����� ������� ��� ����� �� ���'��� ���� ��������� ���%� ������!��� ���� ����������� ��� ���� 5����

����-��%����������������������������� � �/��

$� ������ ������������� ��� ���� ���� ����� ;������� ���� $�����>� ����� ��� ���� ����������� ��� �������

���������� ������ !�� ���������� ����� �������� 3;&� ����������/� ������������������� ������ 3;&�������

-��������!������;����������������!���$�����>�������������!����������������������������������

�����������������-������������������������������������������������������������������/�

� �

� �

� �

� �

� �

� #����) �

��������������������%���������

�������@�����������������%����������������

"� �� � ��>(?�

),� �"-$"�"��$�0��$%���"$"����'0�04�$�0���

3�� ��� -������ ��.��-������� ��������������� ��������������� � ���� ��� ��� ��-�� '������� ����� ������

������� � �%���-����-���� �����������%� 3;&������������������������� ������� �����������/� � 3��

��������� 3;&����� ������� ��������������������������������������� �������������6$�&8� ������������-����

����������� ����� ������ ������� �������������� !���.�%� ��� ������ -���� ����������� ������� ��������

6����8/� $�����������%� -��������� ������ ����������� ��� ���� ������ ��� ��������%� 3;&� ������� ���� ��.� ���

������������ �������������� ���� ��� �� ����� ���������� ����������/� �-���%� ���� ��� ���� ��-��

�������������� ���������� ��� 3;&� �������� �������� ��� ����� � ��������� ����������%� 3;&� ��� ����

��������� ����� ��� ��������� �������/� �������� �������� ����������� ��� ������� 3;&� ����������� �������

����������������������������%���������������������������������������������-��������������������������

����������� �������������%� ��� ��������������������������������� 6�������������())E=�����������())E=�

������:&���-����������())E=����������%���������())@=��M�-��������())*8/�0������%������������

������� ��� �� ������� ��������� Q�����F� ����������� ����!������� ���� ����������� !�� ���� ���������� ������

��������������������/� �-���%�������������������������������-���������������������������������

��������� ����� ����� ��� �!����� ������ 3;&� -���� ���� ������� �����%� ���������� ��� ���� �!������ ���

�������������������������������������������������/�&����������������!�������������������������-�

����� �������� 3;&� ����������� ������ ��� ������� ����� ���������� �������� ���� ������ ������������ ���

���������������������� ��� � ����������������/�&������������������������������!�������������

��������� ��� ���� ����������������/� &��� �!������ ��� ���� �������������� ��� ���� ����� !���������� !���� ���

�������������������������������������������������������������3;&���������������������������������������

��,���/�&����-�.�������������������������������������������������������������������������������

��������������������������������������������3;&���������/�

), �� '"#� %0�"�"0$�"0�� "$� 40� "$� 4" '�� �1�1�1�� ���/ 0�

���,�0#���

5������������������������$���� ���0$�������������!��������-���������� ������� ��� 3;&%�����

�������� ������� ������������ �������� ��� �������� ������ -��� ��������� !�� �!���� ���������� �������/�

�������@�����������������%����������������

"� �� � ��>�)�

2����� � ��������������������������-������"����-��������������������������������%�������������

$���� ���� @����������"%����� ������������� ������������@� ��� >(��%�����������-��� �������� ��� 3;&�

�������/�3�����������-������������%�����!��'�������������������������������������������3;&�����

� ������������������� �����������������������$���� ������� �����������������������������

����� 3;&�6A��-������������������� ������������8/� 3�������� ���������%��"�* ,������$,-,.��#����

�������� ��������� ��� !���� �������� ���� ����� ��������� �����%� ������������� ����� ����������

�����������������������������������������������������������/�2�������"�* ,������$,-,.��#�

��� �������������������� 3;&� �'����� ������ �������������/� �����������������-������������!��� ���

��� ��!������ ��� 3;&� ��� ���� ������� ��� �� ��������� !�� ��� ��������� �����!�����/� � 3�� -��� ����������

������������������������������������������$���� � � ��-��������������������"���������������

���������!�� �������� 6��!.��������()))=���������������())�!8/� �2������ ����� ����� �����������������

������������ ����������� ����"�%�!�����������������������!����������������$���� � ��������������

��������������������� � �/�&���%�-����������������$�����>�����;������������������������������

���������"���!���������������������������� � �/�&�������������%���������������������������

�!����� �����-���� 3;&�� &���� ������������ ����������������� � ���� ��� ���� ������� �������������

������������������� � �������������������.��������������������������������!����.������������������

���������/�

),/ �� 0'0%� F�''"0'� �1$� "�$�� "$� 40� "$� 4" '�� �� 1'0%�

�1�1�1�����/ 0����,�0#���

%����������'�������������������������������!����������������������������/��%����-�������������������

-����!������ ���������������������������������������� ����� ����������%� ���������������������������� ����

���������������������������/��3����������%������������������������������������������������������������

��������������������������<������������������������������������������/��������������������������%�

����������������������.����������������� ����������� !�� ����������� -��� ��������� ������ -���� ��������

�������/� � �-���%��������������������������� ��������!��������.����� ����������������.��!��

�������������������������������%����������������� �����������������������������!���� ���������������

������������������� ������������������/�$���� 3;&%� �����-�������������������� ��� ����������������

�������������������������!�����������!���������������������������!������������������������ � ��

�������@�����������������%����������������

"� �� � ��>�>�

��������������/�$�����������������������$�����>�����;������%��������������������������������������

3;&�������������������-����������������������������������������������/�

��������������������������������������� ����������������������������������� -���� .��-������������

������%����������������������������.��-�����!������������������������������%���������������������

����� �����������������������!���� ����������������������������������������������� �������������

���������/��&����������$�����>������������������-����������������!����������������������������������

����.�������������������������������������������/��������������������������-�������������$�����:

<:���������������������������������M����������������������������$�����>������!�!��������������������

�����!���� ��� ����� ��������/� �-���%� ����������!���������������� � ����������������� ��� 3;&�

����� ������������ ����� ����� ��������� ��� ���� ������� ���� ��� ��������� ���������� !��� ����� ��� ��� �����

������������� ��������������������������%���������������� ����������/�;������� ��� ��.���� ���!����.��%�

!��� ���� ����������� ���� ����� �����!���� ��� ���� �!������ ��������� ���������� ������� ��� ���� � ��

������������/��&�����������!���������������������!���������������������������������3;&���������

-����;������/�

&��������������������������������������������������������������������������������������������������

�����������!������ ������������������������!������� ��� ����������/� &������!����������� ������������������

�������������������������������������!���������������� �������������������!��������������������������

������������� ����-���� ���������� ����!������ ��� �������� !�� �������� ������ ��� �������� ��!������� ���

�������������� �������������� $�����������-���������!������������������������������ �������������

��������������� ��������������� ���������������������������� ����������/�7�.�-���%�������%������������

�������������������������������!������!������/��7�����������������������������3;&�����%�-�����������

�������������������������%��������������������������������������������������������3;&��������/�

&���� ������������������!������������� ��������� ��� ������������������������-��� ������/� �5�������

������������������� �������� ��������� �������� ����������� ����� �������!������� -���������������� ����

�������� ��������� �����/� � 7����� ���������� ��� 5��:7����� ������� �������� ��-��� ������� ��� ���������

����������������������������������������������������������������������������������/��%�������%����

�������.��-����-������'����������������������������������":������<��$���������������������������

����������!����������<�������������������"5(�������������'��������������������������%� <7 �����������/��

&�����������������������������������������������������������!��������������������������������������

���������������������5(��������������������������������������������������������������!��������������

�������@�����������������%����������������

"� �� � ��>�(�

����������� �������/� � &��� ������������� ��������� ��� ���� ���� ������ ��� �������� ��������� ��� ������

�������������������'������������������������/�

),3 '0� �'"$-� 40� %0�"�"0$ � "$� 4" '�� �� 1'0%� �� '"#� B" 4�

40'�"��$��$%��%�� ����

�����!������;�������-�������!������ ��������������������������� � ����-�����������������������

��������������������� �����������������-�������������!��$�����>/��������� ����������������������������

����������������!��������������:��������5��:��.�������������;�������������������5�����������6L�������

���� ())@8/� &���� ;������� ���� ���� ��� �� ������� ������ ��� ���� 5��:��.�� �������� -����� ������� ����

������������������������������� � �� ������������������5��:�/�������������;�������!��$�����>�

-������ ���� ������������������������ �������� ����������� ��� ���� 5��:��.�� �������� -���� ����� �������

�������/�&����;���������������������������������������������������������������������������������

5��:�����������������������!����������������������������������������������������������'������������

����� ��������� �������� ��� �������� ������ ����� ���� ��������� ��������� ���������� ����������� �����

�����������������/�������������%����������������������������������������������������������������

�������������������3;&���������-����$�����>�����;��������������������������������������������

�������3;&��������/��

),6 �%%" "�$��� ,� 0$ "��� �� "�$�� ��� 40'�"��$� �$%� �%�� ���

%1'"$-����/ 0��� 1'� "�$��

$����������.��-���������������$�����>�����;����������������!��������������������������/�;�������

������������-��������:�������������������62��������())D8%�-�����$�����>���������������������������

��-��������������������;5"%�%�%"%������5��:��.���������67�'���������())�=�7���������())E=��������

����())@8/������������;��������������������� �������������������� ��� ��������������� ���������������

�������� 6���8� ��� ������� 62�� �� ���� ())E8/� &�� ��������� -������ ;������� ��� ����!��� ��� ����������

������������������ ����������� ��������������������������� 3;&%� ����������������������������� ���

������� -������ ����!������ ;������� ���������������� ��� �!��� ��� ������������ ���� ���� ��������

���������/�

�������@�����������������%����������������

"� �� � ��>���

),) �1���'/��$%��1 1'0�%"'0� "�$���

&���������������������� � ������ � ������������������������������������������������������

���� ������������������� ������������������������ ���!���������������/������������-�����������������

�����3;&��������������-������������������������������%������������������%������������������������

����� ����������� ��������� -��������� �������%� ��� ���%� -��� 3;&� �������� ��� ��� ����� '������/� �������

�����������������������%�����������3;&����� � ������������������%�!���������������������%�

�������������������%�-����� ����� �����������������������������-� ��������������� ��������-�3;&�

������!���������/�3�����-���������������������������������������������������������������������������

����������������������%���-������-�����������������������������!�������������/����-�.�������������

���������������������������������������������������������������������������������������������-������

���������������������!�������������������������������������-����3;&/�

� �

� �

� �

� �

� �

� #����8 �

F�9����# ��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>�E�

�$�!�������%%����!�������&%�A��������5%����!������&H�6())>8���������!��������������������������������������������������������/�-�������� �� �%�@DC:E�/��

$��-���� $5%� $�!������ �%� 6>??�8� &������� ���������� ��� �������� !������ �������� ��� ������������ !�������������������������������������.������/�" �B����6=%�>)>:>(/��

$��� 7�%� I����� B%����� 7%� B���� A7%� B����� A%� �������%� 7��� ;%� $����� �%� B���� AA� 6>???8� ;���������������� ����������� ��� ����������� ������ ���� ������� ����� ��������� ������� ���� ">� ������/� G�#����������,���#�����6=%�E?C:@)E/��

$��.���M�� %�����L%�&�������%������.��&%�������&%�&������$� 6())E8�5����������-��� ������ ����������!��:��������������������������������������������/�, ���� �������3)%�CC:*D/��

$��!��� $%� &���� �%� A���������� �%� �������.�� &%� �������� �%� ��������� &%� ���������� 5%�B���������B�6>??C8�&����:��������������������������������%�������������������������������������������������������%�!������������:��!��������:������������������������������������!��������������/������#���������,��0�,���83%�>)>>@:(>/��

$������&%�������3%�$���$%� �����&%�$��������%������������%������&$�6())*8�3���������������������������&�.������������������������5�������� ���A��������������������&������-����%�������:������������ ���������<�����!���&��������$�������3��;���/�B���-����/��

$����$%�%��������%����������;%�&��:$������6())E8�&������������������������,����������������������!��-����������������������!�������������������������������������/�*���-�����" �8�%��E*:@C/��

A�����&%�A�-��$%�������7%���������� �%�7����%�0���.��0%�2��������$��6())�8�&����������:����������������:���������������������������/�,������)=%�>)??:>)E/��

A����"�%�7��!�����&7%�7��M��2%�$���7%�A�������A�%�%����07� 6>?*�8�%��������������������������� ������������������������!�����������������������/�B���-����� =%�C>C:(E/��

A�����%7%���������$%�&�������H%�2�����%�2������7%�&�������$�6>??@8����������������!���������������:��������������������������/�(����,����)6%�>>E>:@/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>�@�

A������ H�%� 2����������� �"%� �������� ��� 6>?@C8� &��� ������� ��� ����������!������ ��� ���������������������M�����/������#���������,��0�,���6=%�E@):C/��

A�������� �$%� ������ �$%� $����� $�� 6())C8� &��� �������������� ���� ��������� ���������� ��� ����������������!���������������/�*���B������/%�@)*:>?/��

A��!�����%����������7%���������H�%�������H�6())�8����������������������������������$�$&&�:>�6������������� ���� ����������������� -���� ����!��������:��.�� ������:>8� ���� ����������� ������� !���������������������������������'�������������������������/�G�*���, ���� ���/�%�DC�:*E/��

A������&%����������7%����-������&%����������7%�I�����.�:2������&A�6())D8������������������������������������%�!����������������%� ������������������� ����������-�������������������������/�B���-�����8�%��@@:C�/��

A����MM�� A%� ;����:������� ;$� �� ���� 6>??C8� &������� ��������� ���� ������� ����������� !�� ���� �������������� �&L�/� ������������ ���� ����������� -���� ���� ����� �����������:�������� ������� ���� ������������������������/�G�B������� 8 %��(*>C:(�/��

A�-�� &%� �������� ��%���!.�� �7%���������&%� �������� �7� 6())@8� ��'�������� ��� $�$&&�:>� ��������������������� ����������������������� ��������������������� �����������������/�" �B���/@@%�@??:C)?/��

A��.��� "%� A���� �$������� 6>??�8� ���������������� ��������� �����������%�����:����������� �����������������������������������������������������������������!���/�-���=%�>*�:())/��

A��.���"%�"������ H%� ������:��!������&%����������%����������&� 6())�8������������ ������:��������� �����!������ ��� ������������ ������ ������������%� ��������� ���� ��������:�� ��� ���� ��������������������������/�G�����#���� ��� )%��C:E)/��

A�������� �%� �������� $�%� 5����� HH� 6>??)8� 3����������� !��-���� �������� ������ ���� ���� �����������������������������������/�B���-�����3/%�ED�:C/��

A�.���.��$%������ &&%� 2���������� H%��������&�� 6>??�8��������� ���������������� �������M����������������������������������������������������������%������������:���������������������������/�B���-�����3=%�>�@C:*(/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>�C�

����H%� ���-��M�&%��������%�A�����2%%�I��.����6()))8�&��������������������������!���������>:������ ����������������� ����� ��� ��� ������������� ��������� -���� ��������� ��� ����� -���� ������������'������������:>������/�G�B������� 86%�(?@D*:E�/��

������� �%� 0������ �;%� ���� $H%� A��.��� $%� 7����� 2H� 6())>8� &�":@� ��� ������������ ��� �������������������������������������������������������� ������� ������������� ����:�����:����!����!������/�B���-�����)6%��)>:*/��

��������� "&%� &��������� �&� 6>??�8� ��!����� �������� ��� !������ 5�%� 6�����������:������ ���!���M���������6�88/� $� ����������� �������� ������������ -���� ��������� ��� ������ 3� ������ �� 6����:�����:�����������!����8/�(,B,�2���/�=%�(?(:@/��

�������� H7%� ����������%� A��.��� $"%� �������� "&� 6())*8� ����� �������� �������� ��-� ����������������3;&/�����-����� /%��C:DE/��

�����7%�&����H%�7�����2H� 6>??(8� 3������������������� ������ ��� ������!����������� ��������!���M��� �����������������������������/�$�������������!�������������:�����:�����������!����������/�G�B������� )8%�>(�*):@/��

�����7%�&����H%�&�7����7�%���-����2%�7�����2H�6>??D8��������������������:�����:�����������!��������������!���M��������������������������������������������������!�������-������������������/�G�B������� )8%�(*(*(:C/��

����� 7%� �������� �&%� 7����� 2H� 6>??�8�%���������� ���������������� ������������������ ��� ���������:����������������������������������������������������-����������������������/�*���-�����" �/3%�*C:?�/��

�����7%�I����� %���-����2%����������&%�7�����2H�6>??@8�������������.����!��-�����������������������:�����:����!���� �������������������������� ������������!���� ��������������!����������������/�G�B������� 8�%�>?D)?:>D/��

���� "0%� B����� $3%� ���M� �%� 6>??)8������M������ ��� ���� ������ �������� 5�����������&����:� $� ���������:"�����������"���-�����&��������������$�������������������/�" �����-��.���9�"�����/ %��E�:�@E/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>�*�

������ %%� A������ &$%� $�������� �%� �������� $%� ������ "%� "�������� %� 6())C8� $����������� !��-���� ���������������������������������������������������� ����������������������������/�-�������� ��/3%�@DE:E)/��

��������$%�������"&%���-����&�6())(8�$������������������������������������������!���������/�B���-�����)8%�(():�>/��

���!�������&%���.�����.�0$%�����-�.���%�$�!�������%�6())(8�$���������������������������������������������������:�������������������������/�����-������8%�>))@:>@/��

���!�������&%�%�������$%�$�!�������%%�����-�.����6())E8�3��������������������������������������������������������������:�����������:�������������������������������/�����-����� @%�>�D?:E*/��

����� $0%� ��!������ $ %�&����� &%�������&7%� 3������ ��%� �M������ A7%� ������ "�� 6())D8� ;�������������� ������� ��������� �0$� ���������� ��� ������ ������ $�������� ������� ���� ��������������/�-�����������4������5�3/%�?@?:C(/��

�����%�������%����������%�&������7%��������$&%�5�-����H7�6())E8�&������������������������������ !������ �������� ������ ���� �:���������� ��� ����������:� �������� ��� ���������%� ������������� ������!��'�������!����������������������/�-�������� �� 8%�>?:(@/��

����� 0$%���������.����� �%� H�.����� 0%�%�-���� $%� �����%�%� A������ �H%� 5������7� 6())E8� &������������������������������$�$&&�:>%�:D%�:E%�:?%�����:>E%�����&3&�:��!��&"%!���>�����������������:���������������������������������;������/���������)/%�(@?:CE/��

��.����� �%� A��M������� 3%�&������ "%� ;���� 5%� �����: �������%� 7���������� A%� 5��������!:������ #�6())C8�3�����������������������������������:������������������������������������������������������������������������������������������/�����-����� %�*>E:(*/��

�������"%�7��������%�������M��$%� 3������&%�A������&%����������6())E8�5��������������:������������������!�����������!������������������������������/�-�����"������ ��3@%�?�:C/��

������AH%�7�������5%�7����$%�&����� %%�&������"%�2������2�%�7�����!������6>???8�$����������������������������:(:�������������������������!���������������5(������������.��:>!���/�, ���� �������3@%�(@*E:?E/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>�?�

��� 7�� %������ �%� �4A���� &H%� 5����� HH� 6>???8� 5�������� ��-��� ������ ��������� ����������������������������������������������������������������/�����-������3%��)@):*/��

��������� $%� ��M��!��� �� 6())(8� 5���������������� ��������������������������������������������6� ��8:�������-/�����-�����0�����=%�EE?:CC/��

����� H%�����.�� 7�%� �������� �H%� 7������!���� �$%�������� �H%� 2����� �� 6>???8�&�������������:��������� ������� ������� ��������� ��������� ���������� ������� ���� ��������� ��-��� ������ ������/������#���������,��0�,���8)%�@(�E:D)/��

����:I��������� &&%� I��������� ��� 6>??D8� $� ������ ������������������ ����������� ����������������������-�������������������������������������;������/�G�B������� )8%��(??(:*/��

��-����&�6>?*?8���������������������������-����������������������������������������������������������������������������/�B���-�����3�%��C>:?/��

������ �&%� �������� �7%� ������� ;%� �������� H�� 6())D!8����������� ��������������� ���� $�$&&�:>������!���������M��������������������������������/�*���, ���� ����=%�(D@�:C*/��

���������$%�������7H%������M��H%�$�����%%�$��������&%�"���������A�6())E8���������������:����������-������������������������?��������������������������������������������/�, ���� �������3)%�(C?*:*)@/��

��������7%�7�A�����"%����������H��6>??E8�$��������������;�������-���������������������� ���������������������������������������������������������/�G�. ���"��������@6%�D(@:�>/��

�������� ��%� 7����&%� A�-�� &%� B����%� ��!.�� �7%� �������� �7� 6())C8� $������ ��������������� �����������:�������������������������������������������������������/�����-����� %�(*D(:E)/��

5����!����&%�&�:������3�6>???8�����������������������������M��«�B������� �%�()�:>)/��

5�����H$%����.�$&%�2�����%�2�������0&%�&��M�.�&&�6>???8����������������������-�����������������������:?����������������������/�*���, ���� ����/%�>)�E:D*/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>D)�

5����� H� 6())E8�&����� �������� �����������!����� ��:����������� !��-���� �������� ���� �������� �����/�-�����(����" ��8%�>:(/��

5����� HH� 6>?C?�8� %� � ����������� ���������� ����� ���������� !�� ������:�������� ����� ���������� ������������������������������/�#����� =�%�D*�:D/��

5����� HH� 6>?C?!8� "����������� ��������������� ����������������� ��������������� ��������� ��������:���������������������������������������/�G�,���H���� @=%�>>>:()/��

5�����HH�6>?*)8�����������������������������������������!��������������� ������������ �������/�B���-����� /%�EDE:E(/��

5����� HH� 6())>8� ������� ������� ��� ������� ���������� ������������ ���� ��������� ��� �������/�-�������� �� %�*(?:�*/��

5�����HH%�%������%�2��:A�������%%�������M��&�6>?*�8�3���!��������������������������������������:������������������$&�%���������������%�������������������������:����!����� �����/�" �B����@@%��?:D?/��

5�����HH%�2������-�����%���������%%� ����B�6>??C8�&�����������������������������������������M����������������������������!��������������!����������������/�B���-�����6)%�?C@:*D/��

5����� 77%� B�����.�� �%� �������� �7%� ��!.�� �7%�%�,��� �%� �������� H�� 6()))8���������������������������������� ���� ����������������� -���� ����!��������� ������� ������ ���������� ��� ���� �����������:����������������/�B���-�����) %�>)?):E/��

5���.����%�$�������H�%�2�����&0�6>???8�%����������� ��������:�����;������:������������������������ �'����� ��� ���������������������������� ���������������������������/����������� ����)�$����B����8%�>))D:>�/��

%����� 3%� ���,��.� %%� 7������.� H%� ����� �%� 0������� %� ����������� �%� �����.��M� �%� ������ �&%�"��������� 6())@8�&�������������%%:&$�������������������:������������������������%� �������������������������������������������/�H������3%�>*?:??/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>D>�

%�������� "%� ;�������� �%� 0������� �$%� ������ &%� &����� "%� $������ �%� I���� 7%� &����� �&� 6>??@8� ������������ �����!������ ��� ��!�������%� ��������:�%� ���� �������� �������������� �������� ��� �����������:����������������������������������������������3;%:5&���������::������������������������������� ��� ��������� ��!�����������:� ��� �������������������� ������ ������ ��������� ��������� ������������������������������/�*���-�����" �3/%��?(:D)(/��

%����H�%�7������&�%�7������#A�6>??C8� ��������:����������%������!�����%���������������������/�G�. �� �*�� 3 %�(C:��/��

%������� �%� A��:$��� 3%� ������� $%� ���:5�� �%� $�������� $� 6())D�8� 5"%:��.�� ������ ���������� ��������������������������������������!��������������<�$&���������������������������������/�B�����B������-������� �/ 3%�*(?:�D/��

%��������%�A��:$��� 3%� ���� 7%��������$%� ������� �%�$��������$� 6())D!8����������������� ��������������:��������������������:������ ��������:� !���.����������������������������� �����������������������������!�����������/�B���������������)=%�?*?:?@/��

%����� �%� ������� �;%� 7�� B%������ H&%� �������� $%������� A�%� "����� &&%� ������� ;�� 6>??C�8� ���������'�����%�����:���������������������������������������������������&0%:����������������@�������������������������������!������������������������:����������������/�- � @ %�?E:>)(/��

%����� �%� �������� $%� ������� ;�� 6>??C!8� ������� ��'������ ��� �� ��������� ��������� �������������������������������������������������������:��������������/������B�����B������//8%�(@>:@/��

%������%��M������$������� 6())�8� 3�������������������������������� ���������������� ��� ������������������:��������������:@���������������/�" ���� ���/@%�((E�:@>/��

"������%%�A��������%�"������&%�&�������%�������M:������H5�6())�8�������������������������#D*@�����������������������������������������������������������������������/�B���-�����)8%�??:>)E/��

"������5%����.��;%�$�����3%�"��������%����M���B%�����:$!���������%�"�����3%�2���������5%���.���0� 6())*8�������:��������������������� ��������D�������� ������:7���� ������� ������ ��� ��!��������� ��������������/�" �B���/�/%�>:>(/��

"���������A%�&��������H"�6())C8�����������������:����������������������������������������������������������������������������/� ���� ������)8%�@:>E/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>D(�

"���� $%� H������,��� &%� ������ ��� 6())D8� $�������� ������� ���������� ���� ���������� ��� �������������� ��������������������������:������������� ����!���������������������������������������/�*���, ���� ����=%�?C:>)D/��

"������ 0A%� 5�������&7%� A���� 2 � 6>?C*8� ����:��:����� �������������� ���� ���������/� $� ������ ��� �����������:��������������/�G�����B���8=%�E*:CE/��

"�������"�6())(8��������������������������������!���������/�*�������, ���� ����=)%�>D?:E�/��

"�����&%�"����$�%�N�����%�7������ %�;������5����H%�����������%�������&�6>??*8�3�:������������������ ������ �������� �������� ������ �������:� ���� ��� �������� ������ ���� ��������� ��-��� ������ ��� �����������������/�����-������/%�>@�*:DD/��

"������"%�A�����%%�A�M��� H%�"����0� 6>???8� 3������������������������ �������M����������� ������%������:����!��%� ���� ��������� ��� �������� ��� ���������� ��-��%� ������� ������ �����%� ���� �������������������������������������������������/�B���-�����)@%�>>():C/��

"�������� B%� "��������%� "����� �%� ����� �%� ������� �%� 7������ "� 6())@8� ��������� �������� ���������������������� �������������� ������� � $&&:��������� �3��:���������� ��������������/������ ����-��8 %���?:D*/��

"����� 3%���.���0�6>??D8�����������������������������������������:D������������� ,���������������������������!���������M����������/�G�B������� )8%��)E)(:?/��

"����&%�L����%���������� %� �������� 6>?*C8� 3���������������������� �������� ����������!������������������������������������������/�G�. �$����(���,�)���� �� ���3%�(*>:E/��

"��������%� ������ & %�&�.�:0������� �%��������� H7%� ������ �� 6()))8� ���������������������� ����������������������!���������:����������������/�����-������6���##��6%��:>)/��

������� �� 6())E8� ¬������� ���� ��!��� '������:� ��� ����� ���������� �� ����� �������«­/� G�-� �����)����B���-�����4����5�/3%�E��*:E�D>/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>D��

�������� ��%� %��� �%$� �� ���� 6())C8� &��� ��������� �������� ��DD� ���� ������ 6��>@*8� ��������������-����5��>%(�������������������!�����������������!����������������/�G�B������� = %�>@@@C:*)/��

�����5%�$������� 3%�7����� H%�"�������"%�������� &� 6())C8���!������������!������!���������������������������������������-���������/�-�������� ��/3%�D>E:(D/��

����� 2%� ��������� $%� 2���� �%� A���� �%� "������ H%�&����&%� �������!���� $%� A��.��� "� 6>???8��������� ������� �������������� ��� ���� ���������� �������� ���/>!� ��!����� ��� ����������������������!�������������������������������!�������������������������/�B�� �-��=3 %�>E:(?/��

����������%�&������0%�B������&%� 3���� �6()))8�5��������������������������������������� ���������������������������������������������������������!���������������������������������������:������������������������������������������������������������������������/�*���-�����" �6)%�E():@/��

������M:"��M���M�3%�"��M���M:��!�����3%���������&%�2������&%���������$%�2�����7%���������H��6())@8�"��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������:������������:��������������������������������������������������«�*���, ���� ��� @%�>�)):(>/��

�����$%������7%�7�����2H�6>??*8�&����������!��������������!�������!���������:�������M�:�����������������/�B���-�����6=%�C)E:>>/��

��.���&5%�&�������7%�$�����%%�������7H%�0������H%�"���������A%�$��������&�6())E8�$�����������������������������������������������:���������������������-������������������������?�������������������������/�B���-�����8/%�*(E:�(/��

��.����7%������!����2%�7���������%���.���5%�����������&%���������25%�7������6())D8���������������� ��� ����� �������� ������ �����:���������� ��M���<$�$&>C� ��� ���� ��������� ��� ���� �����������-��� ������ ������� ������� ������:� ���� ,�������!���� ����.� ���������� ��������� ����������/� G�B������� 88%�(D>C?:**/��

�M�.�� %������5$�������6>???8�$!����������������������������������� ����������������� �������� ���.���������������������5����������!�����5�6(8/������#���������,��0�,���8)%�>)E)>:@/��

�����H%��������%�7����%%�&���H&%� ����%�B�����2��6())D8�5���!����������������������:�������������������������������������������������������������!���������������������/�����-������8%�>E@(:?/�

�������C�A�!����������

"� �� � ��>DD�

���� 5%� "�!������� $%� 7�����!��� �%� �����:H������ �� 6())(8� $��������� ��� ������ �������� ������ ����������� ��� M���� ���������� ����.����� ��������%� ���������� �����%� ���� ��������� ��� ���� �����������������������������������������������,������/�(����,����88%�E>>:E/��

����� &%� ������ &� 6())E8� ":������:�������� ������� ���������� ���� ���� 5"%� ���-�.� ��� ����������������/� � ���, ���� ���*��)��)%��():@/��

�� B�%� 2���� � $� �� ���� 6())D8� ��!��������� ���� ���������� ����������������� ��� ������� ����� ���.������������������/������#���������,��0�,����@�%�>>()?:>D/��

��M���&�%���������2�6>?**8� �������������!�������:���������������������/�� ���-�� @%���C:E@/��

3����:$�����&7%�����M���%�7�'���$�6())�8�$�$&&�>:������������������������-�������������!�������������/�� �#�:������,��886%�>*�:?)/��

3����� 0%� ������� �� 6>??@8�&�������� �������� ��� ������ ��������� ��������/� B�����B������-������� � %�*>@:()/��

3����� 0%� ��-��� &$� �� ���� 6>???8� &���� �������� ��� ���������� ��������� ���������� ����� �����������M���������������/�G�B������� 83%�(E)*E:?(/��

3��� �%� ��������� &%� I�.�� &%� #,���� &%� ������� �� 6>??E8� &�������� ����� ��� ������ �":&%� �� ���������������������������������������������!���������������������/�G�B������� 8@%�?E*:@E/��

H������5%�7�����H�%����������� A%��������H%�������,���%��������� �.��%�2��������H%�&����������%�%�����A��6())D8�$!���������������������������������������������������������������������������������/�*���, ���� ����=%��)E):@�/��

H��������&%�"��'�����$A%�0������H�%� ���������A� 6())@8�%��������������������������������������������������!�����������:�������!������������/�"�)�������38%�(()):?/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>DE�

H��������&%� ���������A�6())�8�"����������M����������������������������������������������������������������������:�����������M����/�G����,���#�������3%�>CE@:@E/��

H������&5%������7�6())�8���������������������������������������������@�6&�":@8������������������������:�����:�����������!������� ���������������������������������/�-�������� �� 6%�(C:�>/��

H�����3&%���������%7%��4A����&%�5�����HH�6())>8���������������������������:���������������������(�����������!���������������������������������������������������������������/�, ���� �������3 %��>*C:?C/��

�������� H�%� �4A���� �%� 2���� H&%� �������� �%� 7��!��� H5%� ����!���� 3�%� ���� $H� 6()))8�7�������������������������������������� ��������:!����������������������.������������������&�":@/�,��������=%�C@�:CD/��

����.��&%������� %�&����&%�������&%�0�.������%� ����&�6()))8� �������������� ����!�������������� ������������������������DD/�G�������-�����- ���8%�>@(:C/������������&%����������B%���������&%������ %�3���&�6())�8�7��.������!�����������������!������ ����������������������������������������-��������������������������/�����-������=%�>>C?:*D/��

��-������� %� �����&%� ����� H%� 0���.�!�� �%� ������ $ %�&�����.��&� 6()))8� A������� ��� �� �����������������������<���������������������������%�;������%����7:��������%��:��������%�������DD/�G�B������� 86%��EDD*:E@/��

�����A%� 0���� �$%� &�������� ��%� $������ 2�%�%����� �5%� ������ 7%� ������� �%�&�.-���� ��%�&,�������� � � 6())C8� ;������� ����������� ��������� ���������� ��������� ������ ������-� ����������������/�" �"� � /)%�@C>:*�/��

����A�%�7�����%������H%� ���� %�����H �6()))8�3����������������%�������������%���������������������������������������������������������������������������������/�(����,����83%�>>E�:*/��

������ 0%� ������� B%� &����.�-�� �%� ����� 5� 6())C8� �������� ���� ��������� ������� ������ ����������������� ��� �������:� ���������� ��� �������:������� �������� ������ ���� ����������� ����-�������������������������������/�,���-�����(����,�����)/%��(C:D(/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>D@�

������0%�������B%�&��������%�&��������� %������5�6())(8�5������������ �������������������������DD�����������0$�� �����������������:����������������������� �����������������/�B���-�����))%�C)C:>C/��

���������A%���������2�6>??�8� ��������:!�����������������������������%�������������������%������������/�(��)�G�8%�>(��:D>/��

��!������� %� ���� "2%� �������� B%� &���� &� 6>???8� 3�������������� ��� ���.� ������� ������ ����������������������������������������������������/�, ���� �������3@%��*�E:D(/��

����A %�7������H&%�������������%�$��������H�%�7������%�$�������6())C8���������������$�$&&�?����������������M����������������!���������������/�G�B������� = %�>@>D@:ED/��

��������6>??E8�3�������������������������������������������-��<�����!��������������������������������-������������������������������������:���������������������������������/�B���-�����6 %�>D(@:�E/��

�������7�6())D8�&��������������������'���������������������/�G�� ��,��= �07��##�%�5>D:(�/��

������%��������0%�0�.�������5%�%�,�.��%%� 3�������%%�&������������ 6>??C8�&���������������������������������������-�������������������������:�������������������������-��������!��������������������������������������������������/�G�B������� 8 %�EE@:@(/��

����� �%� &���������� �� 6>??*8� $�$&&�:>� ������� ������� ��� ���� ������������ ������ ������� ��������!��������������3�����������������������������/�G�B������� 8/%�>�?>(:C/��

������%��.����B%���-������� %�0�.����� %�&�����.��&%������ %�&������������6()))8�$�$&&�:>�������������������������������%��������/�(,B,�2���38=%�(D>:E/��

������%�&��������B%�&������������6>???8�$�$&&�:>������������������������������������������-�������������������������/�G�B������� 83%�>**(>:@/��

7���L%�"����.���%�������&%� &��!����� 6()))8�$��������� ���������������������� ����������� !��-����������� 6&�����������������8�������:���������������������� ������������������������/�B���-�����) %�EC?:**/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>DC�

7������ ��%� 7��� �B%� 7�� �I%� L��� BI%� I����� 7%� ������ 2%� ����� I%� B���� AA� 6())C8� &��� �!������ ���;������������������������������������������������������������������/��� ���-��)8%�DCD(:E)/��

7�����2H%�2����5%�A�����"��6>?*@8�$����������������������������������,���������������������-��������������������!��.��-���������������/�" �B�����/%�E>C:(>/��

7������&��6>??E8�$����������.�������������������-����/�B����������68%�C:>D/��

7������&�%�%����H��6>??(8� ��������/�(��)�G�)%�(�?C:D)D/��

7�����$%��������3H$�������6())E8�3�����������������������������������������������������������������-�����������������������������:�����%��������������/�����-����� @%�D():D/��

7�A�����"%�I�����������%�����������5�6>??(8� ����������!�������������������;������/�G�B������� )8%�>)))�:>)/��

7����%�����������%������%�������%�"������;7%�&����������2�6())D8�5��������� ����������������� �����������������������������������!�������'���������������������������������������/�*�������B��� 3%�*?)C:>@/��

7�����%�H���A�%�0��BH%�B����&�%������� %�����22�6())>8������������������������������������������������������'�������������������������������������3;%:5&/�G�������-�����- ���=%�D?):*/��

7����� H%�A�����$&�6>?*E8����������������������!������������������������������/�G�,���H���� /3%�(�>:@/��

7������ H%�5�������0&%�"��� 3%�&�.��M��%�����$H%� ������� 6())(8� ��������� !������� ����������������DD��������������������������.�����������&�":@/�G�B������� 88%�(@@)):*/��

7��� %������A�%�������%�������.�H5%�7�����!�����%�&M��.��� H&%�������� 6>??C8�&�������� ��������������������������������������������(:��������������/�����8�%�>?C:()*/��

7��� BH%� L�� B%� B�� N� 6())E8� %���:������� $�$&&�:>� ���� ���� $�$&&�:>� ��������� �������� ��:� ���������������������������%������������/�� ��� /�

�������C�A�!����������

"� �� � ��>D*�

7��� BH%� L�� B%� B�� N� 6())@8� %���:������� $�$&&�:>� ���� ���� $�$&&�:>� ��������� �������� ��:� ���������������������������%������������/�� ��� � 6%�(DE(:@C/��

7���.��H%������������&��6())>8�$����������� �������������������������������������:�����'������������������������(6:�������������6&88�&�����/�*������ 6%�D)(:*/��

7�����.��0�%�N���& %�%�������5%�&�����7%���������%%�������$%�7������6>???8�&���������������������������5"%�����������������������������������������������5"%�������������������������������������������������/�" ���� ��� )%�(C�?:E)/��

7�'���$%�����M����%� 3����:$�����&7�6())�8�$�$&&�><&5& >� ����!���������������������������������!��������!�������������'�������������;5"%>@E/�G�B������� 8=%�(�@E@:@E/��

7������ "�%� ���.������� 7%� A��.���� A"� 6>??@8� 3���������� ��� !������ ��!��� ���������� ��� ����� !�������������:�����������������������/�*���-�����" �3/%�D�C:D�/��

7�����H�%���&����%H%�%��.���%�&������%� ������$�%�&����������$%�H/%����������"%�����������&%� �4&������ A2� 6>??E8� &���� ���.���� ����������� ������� ����!��� ����������� ������������!����������/�- ��" �8%�((@@:C*/��

&������%�A�������H%�������&%�A��������$"%���,�����������%�%������H5%�&������������6())�8�5��������� ������������ �0$� ��� $�$&&�� ��!������ �������� ��� ���� ������������ ��������� ����� ������������������������������������������������������������������������/�B���-�����)8%�>E)@:>D/��

&���� A�������7%� "��������%�&���� $%� A����� &%� ��� BN%� 5����� HH� 6())D8�&������:���������������������������������������3��������������33���������������������������������������������������������������������������������������/�B���-�����8@%�>DE*:@D/��

&��������� �%� ��������&%� "��&%� �����M�� �%� ��������� &%� ������� �%� 2�����!�� � 6())�8� �����������������������;������<�":&�-���� ����������������.�������/�G�B������� 8=%�D>()E:>(/��

&����"%� ������� H%�$�������&�%����'�����$%�&����.��-��M�5%�&����&%� &�!�!M������%��������0"�6())*8� &��� ��������� ����� ������� M��������������������� ���� ��������� ���������� ��E$�������� �������������������������������!������/�G�B������� =/%�(�C�:*D/�

�������C�A�!����������

"� �� � ��>D?�

&���!��&� 6>?C(8�&������������������������������������� �������������������������������������������:��������������/�$���������������������������������������!���������������������������/�B�����G�� 8%�(D?:E�/��

&����M���7H%���������$%��������$%���������5%����������%�A�����H5%�$������%�&��M�.�&&�6())D8� ����� �������� ��������� ����� ����� ���������:� �� �������� ��� ������������� ���� ��!��� ���������� ���-���������������3;%/�����-������8%�(*@?:CD/��

&�����%�������H2�6>?�D8�&������������������������������������/�G�B��������@8%�@(?:@�D/��

&�����&5%�7������M��&$$������� 6>???8������������'������������������ �'����� ��� ����������������������������������������������:�����:������������M����6&$�58/�G�B������� 83%��)E@�:C)/��

&����M� 7%� �������� �7%� 2������ &%� A������&%� &.�������� H%� ����������� 7$%� ��M��� �H%� ��������&$�6())D8�$�����:>���������������������������������������������������������������������/�B���-�����8@%�>)?@:>)E/��

&���� �%� $��!��� $%� 5������ 3&%� ������� �%� ������� �7%� ���������� 5%� B��������� B� 6>???8� &��������������� �������������� !������������������������������������������ ���������������������/� G�B������� 83%�>>D�>:*/��

&,��������� %�B������� %���������$$%�&�����%�&�.-�������6>??*8�&�������(�����%���������������������������%�����'������������������������!���������������������������������/�" �B��� @ %�E@:@@/��

&��-�.�� &%� A��.��� &�%� ������� �%� A��.��� "%� $����� &� 6())D8� ����������� ����� ������������������������������������������/�,���#������==%��)?:>E/��

&���.���&�6>??D8�%�����������������������������/�,���G�B����� �8%�C>�:(E/��

&�.�����������%�$����$%������&�%�����$H%�%�������6())D8��������������������������������������:�������� ������� @:��������� ������ ������ ������� ���� ����:�����:������� ����!���� ��� ��������:��������������������������!�����������������������������������/�G�B������� 88%�>>>>?:(*/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>E)�

&�.�����������%� �������;�%�����$H%���������$%�%������� 6())>8�&-�������������������������� ������������� �����:���������������:@�������� ��� ����������������������������������������������������:����������������/������B�����B������/83%�>C�:*>/��

0������� 5%���������� $%� �����M.�� �%� �������� $� 6())D8���������� ���������������� ���������� ����:�����:������� ����!���� ������� �������� ��� ��������� ��� ��� ��������� ��� �������������� �������������:�����������������/�B���-�����8�%�>*�*:D�/��

������� �$%� �������� �7%� ���� $H%� A���� �&%� �������� H�� 6())�8� ��������� ���������� ��� ������������� �����:�����:����������������@� �������������������� ������������������:(�����5�(����������/�, ���� �������33%�>))*:>?/��

���� �7%� A������� �H� 6>?C�8� 5""� �������� ���� ���� ���!���� ������� ��� ���� �!!��� �������� ���������������������������/�(����,���� 3%�(?(:�))/��

�������$"%��������&%�6>?@>8�5����������������������������������������������������������-�����������/�G���������6)%�@C:CD/��

�����0%������� %���M���.��&%�&�.�������&%�3���&&%�������&%�0�.������%� ����&�6>???8�5��������������DD� ��� ������ �������� ���� ����� ��������� ������ ��� ����������� ��������� ��� ��:����� ���������������������/�*�������-�����6%�((:*/��

�����$3%�&�������&%�����.��&%�&������%� ���������%�$��!���$� 6())>8�&����������������������������;��������������-�.��-���� ��!����:(� ������� ����� ��������������!������/�G�B������� 8)%�>(E�:@>/��

�M�-��&%�0�����&$�������6())*8�����������!��-����������������:���!����:>:�������������������%� �������� ,�����������������������%� 7 :����������������%���������������������������������:������������������������/�*���-�����" �86%�*EC:@@/��

������.������5"%���MM�!����%�����!����.���5&%�������&%�&������� %�%������ &%�;��������������$%� ������� �� 6())@8� 3��������� ���� ���������� ��� ������� ���������������� �������� ��� -��������������������������:��������������������������� ���������������������������/�(����,����=6%�>>(:()/��

��.�HB%����BN%�$����&%�7�-�5%�H����7%�������&� 6())D8�5"%:��.����-��� ����������������������7 ��������������������������������/�,� ��/@/%�@*(:D/�

�������C�A�!����������

"� �� � ��>E>�

�������� �%� ������� A%� ������%� ����������� 6>?E>8� A����������� ���� �������������� ��������������� ����������������������������������������/�333/�&�����������������������������!�����������������!������0���������������/�B�����B�����������8%�()C:>�/��

��������� "� 6()))8�7����������������������������������� �������� ��� ������� ������� �������/�������������������6%�>(@>:C)/��

�����L�%� �����$H%�7��������%�A,������7%�0��&� 6>??>8�7��������������� �������M����������� ���������������� �!������������������������ ��������������� ������������ ����������������������������������/�, ���� ������� 8%��()):C/��

������&%�&�7����&$%�A��������7%�0��-���-�.���%�&�������6>??D8��������������������������-�����������������������������"���������������!���������������������������������33!�!�����%�������;�!����������������E�!����>��������������������������!�����/��������������� � %�D?>:E)>/��

���������� 7 %� ���-��M� 0A� 6>?*D8� ��!�������� ������������� ��� ����������� ����������� �������������������������/�G�B������� 68%�E)>C:(�/��

������%����.�3&%�����.����7%�5�-�������6())E8�&���$�$&&�������������������/�B�����G�/=)%�>E:(C/��

��-����2%������7%����������&%�7�����2H�6>??E8�"����������:������������������������!����:���������!����������������!�������������/����G�������� )8%�5(?):*/��

������ #%� ���-��������� &%� H������ 2%� ��!��� %� 6>???8���DD:��������������� �������� �������� -�����������������!��������������������������������������������!����/�G�.��� ����)/%�D?>C:(�/��

���.����� $�%� 2����� �%� &�������� 7%� ��������� �H� 6())>8� ������������ ���������� ���� ���������� ��� �����������������������������������������������%�������������������������������������/�B�����G�/63%�>C:(D/��

����!������7%�A��.����2�6())*8� 3����������������� ������������-���������������������������/�,� �-�����*�� )%�>(>:@/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>E(�

���������%��������2%�;��.� %�����I��������&$%������5�!��.�&"�6())C8�&�������������������������:������������%����������%������������M�����/��������������363%��DE:E?/��

����������&%� �����%������%�%��������"�6())E8������������������������������������������������������:��������������������������/�.����G�� ���,�)�������@%�(>?:(D/��

�������������%����������7%�2����&�%�&������%���-�-����%�A�����%�&�������;�%�&������2�%� ��������H� 6())C8� %�������� ��� ��������:� ���� ;������:���� ����������� ������ !�� �������� ������ ���������������������������/�G�B������� = %�>)*>D:(E/��

��������H�%� ������M:"��M���M�3$�������6())E8������������������������$�$&&������������!��������������������������������������������:����������������������������������������������������������/�B���-�����8 %�>(D>:EE/��

��������H�%����������7%���������%�5�����77�6())(8����������:���-������������������-����������������������������:��.���������/�� ��- ��������)3%�@?:?(/��

����M�� 7%� #!����� %&$� �� ���� 6())*8� ������������� ������������� 33� ������ ����������������� ��� 3��3��������/�(����,���/��

��M����%�2���%%��������%�A������&�%�7���������6())(8������'����������!����������������������%�����������������������!��������������� ��� ����� ������ ��� ����:� ������������� ��� !���������� ����������!����������'������/�*���-�����" �)�%�(�D:D*/��

��!����%�"������%�7������ H"%�A���'�����%�A�����%7%������&$� 6())�8������������7 � ���������0$� ��� ��������� ������ ��� �� ���������� ��.�� ��� ������� �������������� ����������� ��������������������������!����������������������/�-�������� �� 6%�D�C:D@/��

��!.���7%����������7%�5�����77%�7�����H�%��4&������A2%���������H��6()))8�����������:��������������� ��� ��������������������:�$�$&&�:>���������������7���������/������#���������,��0�,���88%�D@*?:?D/��

�������M:&��M���'��� H�%� &�������-�.�� $A%� ������ 5�%� 7����� �%� 3����:$����� &7� 6()))8�������������������&5& :><$�$&&�>������������������ �-������������������ ����/�G�B������� 86%���DC>:?/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>E��

������%�%��������� �6())@8�3�����������������������������������������������������������D*�����������������������%��������!���������D���(<�������A�.�����/�� ��-�����,��8 %��(>:��/��

����� &�%� 2������ $�%� &�.���������� �%� ������� ;�%� %���� 5%� %����� �%� &����� �&%� ���� $H� 6())E8�����������������������������������!��-����&�":@���������:�����:����!������������������������������������������������������������������������� ��������/�G�B������� =@%�(E@CD:*@/��

����������5%�B���������B�6>??>8��������������������������������-�������������������/�����)3%�*@C:?/��

�������� �7%� ������ �&%�������� �$%� ������ H�%� �������� H�� 6())��8� ���������� ���� ����������������$�$&&�:>����������������������������;��������������������������������������������������/�G�B������� 8=%�D(��):?/��

���������7%���������$%� �����&%�&�������%���������H��6())�!8� �����:���������������������������������������;������������������������/�, ���� �������33%�>)():�>/������������7%���������&%�A�-�� �6())E8�������������������������������� �������:�&��� ������������������������%�����������������������������������������������������/��B���-����%��#,�"��,��"%�>>):>>)/���

���������7%���!.���7�6())C8�&�������������������������������:���:���������� ������� �������������������/�����-�����0������/%�(*?:�>(/��

���������7%���������$�6())@8�5�������������������� �����������:��������������/�,� �-�����*�� 3%�(>C:(C/��

������ �5%� H���!�� 0�� 6())D8� ������������ ��� L������� ������� ������� ���������� !�� ������:!���:�����������/�B���-�����8@%�>@*E:?(/��

������ %�����.��&%�&�.�������&%���-��������%�������&%� ����&�6()))8� ��������������������������������������������������������/�(����,����83%�>>D*:E(/��

������ &%� ���� &%� ����� &� 6>??D8� ������������ ��� �������� �����M������ �������� ��� ������� �������� ���������������������!������������/�B���-�����6@%�(@@:C)/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>ED�

��..��$H%��������������%�&������%���-�-����%�7�A�����"%�&�������;�%�&������2�%� ��������H�6())�8�&����������������������������������������������������!��;������/��� ���-��)/%�DC*@:?>/��

������ H�%��������%��������M�"%��������&� 6>??@8�&��� ����:�����:����!���� ������:� ������������ ������������/�B�����G�/�6�3�,���5%�>:?/��

��������$%�"��������$�������6())D8��&L����������.�������������������M��������������������������������������������������������������������������/�" ���� ���/�%�>ECC:*@/��

�������� $%� B����������� &%� ������� ;�� 6>?*?8� ���������� ���� ������������� ��� ���������� ����� ����������������� ��� ���������� �������� ����:������� �������� ������ ��������:������������������:��������������������/�G�B������� )3%�>�*D):C/��

��������$%�B�����������&%�#���������A%�7������&�%� �������;�� 6>??(8�7�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������/�" �B����6�%�ED>:E>/��

������H�%�2��������H$�������6())>8�;�������;>�����������������������������������������������"��DD>:$��DD(� !���%� �� ����� ����� ��� �������� !�� ����!������ $�$&&�:>� ���� $�$&&�:D/� G�B������� 8)%�>��C(:*/��

��������� �2%������� %� ;�����.���� I%� &�������� 3A%� 5������� HH� 6())E8� &��� &�":@����� 3������� 3���������������������� ��������������������������� ����������:�����������������:������� 6�"�8�����:���./�G�B������� =@%�>>?�@:D(/��

����� %� ��,�.�-�� �$� �� ���� 6())>8� 3������� ��������� ��� ������� ����� ���.���� ������ ������� ����!���/�B�����B������-������� � =�%�>>ED:@)/��

����������7%����������$$������� 6())C8��&L�� ���������-���� ����:�����:������� ����!���:� ������������� ��� ��������������M�����������������������������������/�G�B������� = %��)>@>:C)/��

�������� �%� %������ H$� �� ���� 6>??C8���DD� ��������� �������������� ��������� �����!�����%� �����������������%������������������/�B�����8@%�((>C:��/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>EE�

������������ &%� 5��������� �� 6())�8� 5��������� ��� ��������� ���������� ���� ������������ ���������������������������������������������������������������������������/�B���-�����)8%�(@?:CC/��

��.�������&%�&�M������&%�B�������%���,������&%�B�M�-��&%�B�������&%�&����������6())D8�5����������������������������������������������������/�G�*���, ���� ���//%�(*>:?>/��

����:$!�������� �%������� 5%� "������� �%� ��.��� 0� 6())E8�&������:���������� ������� .����������������������M����������:��������!��.��-��������������������������������������������������������������/�, ���� �������3)%�>(�@:DD/��

��������0&%�����$H%�$������$�6())@8�5�������������������� ������:�:���������������� ������������!��-��������">:����������;����������������������� ������������������������/�*�����B��� 6%�>D:?/��

������ 2%� 2���� "$������� 6())E8� &��� �������� ;������� ;>����� ;(� �������� �������� �������������������������/�*���B��������)%�>��):D)/��

�������� &%� B����� B%� �.�M�.�� &%� 0���� 0%� ��-������� 3%� &��� &%� �������� H�� 6())*8� ���������������������������!������:�����������������������������������.���<�����.����������������������&7�(� ���� &7�D� ����-��� ��� �������� ������ ��� ��������� ����%� -����� ���� �������� ������������/�" ���� �/��

������� &%� ������� $� �� ���� 6()))8� $�$&&�:>:� ������������������:����������� ���������� ��� ��������-��%���������%��������������������������������/�G��� �. ����@6%�>�DE:E(/��

��������� &%� 0������� B%� 3��� �%� ������� �� 6>??�8� ��0$� ����������� �":&%� �� ����� ����������� ��������������������������������������������������������.����!�!���/�$��������������������������������":&��������������������������;������/�G�B������� )=%�>DD@>:?/��

���������&%�I�.��&%� 3����%�#,����&%����������6>??E8�&�������������������������M����������������":&%��������������������������������������/�"�������!��.������������������������������������":&����������/�G�B������� 8@%�>)�(*:��/��

���,���$&%� �������%�A������5�%�B�������&%�A��.���&H�6>??@8�%��������������������� ������0$� ����������� �����������������/�G�B������� 8�%�(��?E:?/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>E@�

����� &$%� ������� %%� A������� �%� ��!��� �� 6())@8� �����!������ ��� ���� ������� ��� ��!��� '������/� ���� ������)6%�>(@:�@/��

������ H%� �������� H�� 6>??(8� ������������ ���� ��������������� ��� �� �����%� ��������� ������� ���������������������������������������������!�������������������������������������������������������������������������/�G�B������� )8%�@�*(:*/��

�������&%�&�������B�6>?*)8�5�������������������������������������������� �������/�G�-�����(����)@%���>:*/��

�������&%���.������%��������$%�3-������&%�%����������%������$A%������5%�0�����&�6())D8��������������!��-���� ���� ������������� �������� ��� �������� ����������� ���� ���� .�������� ��� ������� ������������������������������������������� ��� ������������������������� �����������������/�*���-�����" �)=%�D*D:?>/��

������$�%�&�������� H$� 6>??*8�������������������������������������������� ����!���� �����������������������������/�G�B������� 8/%�>?(�:�(/��

������ $�%� �������&%$������� 6>??C8������������ ���������������� �������������������� �����������������������/�- �����3�%�D?�:C/��

�����.:���M���� &%� 7������&$$������� 6>??D8� �����:����������������M���������%"%����������� ����������!������%"%�������������M�����%�����������%���������������������/�����88%�>)>E:(D/��

���BN%���������%�2������-�����%��4A����&H%�$��������H�%���������$%�&��M�.�&&%�5�����HH�6())*8�������� �����������������!������������������ !��-�����������������������������������:�A&�>E�����"�%?�������������������!����������������������������/�" ���� ���/6%�>>>:(>/��

���BN%�2��L%��4A����&H%���������%7%��������H0%�&��M�.�&&%�5�����HH�6())D8��������������������A&�>E�����"�%?����������������������������������������������:����������������������������:������������������������������:���������������������������/�" �B��� 8)%�@D:C�/��

����� $%� �.���� %� &���� &� 6())@8� L������� $�$&&�>� ����������� ���������� %"%� ����������������������������������������������������/�" �B��� 86%�(@:�?/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>EC�

��������%���������%7%�5�����HH�6())E8����������������������!������������������!��-����������������������������������������:�����������!�����/�" �B��� 88%�():�)/��

����"2%���!������� %���M�.��&%����������0%�&����&�6())(8�7��.�������������������������������������:������������������������/�*���-�����" �)/%�((�:�>/��

���� "2%� ��!������� %� ��M�.�� &%� ��������� 0%� &���� &� 6())�8� %�������:������������ ������� �����������:��.�� ��-��� ������ 3� ��������������� ������� ��:���������� ��� ��������� ���.� ������� 6���>8� ��������������������������������������:����������.�����<$.�� ��� �����������������/�, ���� �������33%�C?�:*)>/��

������� &7%� "�������� �A%� &�������� H"� 6())�8� 5������� ��� ��:����� ���� ��:����� ������������ ��� ��������!��������� �����������:������������������� ���� ������������������������������������������/�����-�����0�����8%��E:D*/��

������:&���-����&7%�"���������A%�&��������H"�6())D8�������������������������������������������!��!�������������:����������������������� �����������������:����� �������������������������������������:������������������/�-�������� �� =%��>�:?/��

������:&���-���� &7%� "�������� �A%� &�������� H"� 6())E8� 5������ ��� �������� ���� �������������������������������� !������������������������������������ ��� ��������������� ��������������� ���������������������/�-�����(����" ��8%�D)C:>E/��

������:&���-����&7%�&��������&%���������%��������"%�����������&%�7����&%�"���������A%�&��������H"�6())@8� "����������� ���������������� ������ ��� ����� ���������� ����!���� ��!��'����� ��!��������������:������!��� ������� �������������������-�������� �����������������������������������/�B���-�����83%�**>:*/��

�M������ &%� �����M���.�� &%� &�!��-�.�� I� 6())�8� 3������������������� ������������� ��� ����������������������������/�(����������������)���3�%�E?:@D/��

�M��������� �%� "���� H%� ��:�M�!�� "%� ���� �7%� I����� B%� &��� H�%� ��������� �H� 6())(8� &������������������ ��� ;������� ���� ���� �������� ��� ������ �������� ��������� ���� ��������!��� ����/� G��������-�� @%�(EC:@@/��

&���.��B%�$������ %� �!������%� ����� %����!�������#%����-���6>??�8�&:����������������������!�������������:����!���M�������.����&3�:>�!���/�#�����/)�%�C?:*(/�

�������C�A�!����������

"� �� � ��>E*�

&��������H"%�"�������%�������$%�&�&������2 %�&����� ��6>??E8�7��!�!����-������������������!���������������������M��������� ��� ����� ��:����������������������������������!���/�B���-�����6/%�>�*E:?>/��

&�������� H"%� 7����&%� "�������� �A� 6())C8�&���!������ ��� ���� !������ �������:������� �������� �������������������!��'�����������������������������/�,���-�����(����,�����)3%�>C?:?)/��

&�����5%��4$�����������%� �������;�%���������"%���������$�6>??C8� �������������������!���������������� ������ ��� ��������� !�� ������������ !��-���� ��������:������������ ������� 6�� ��������� ��-��������8�����������!����������������6���������������-���������!���>8/�G�B������� 8 %�DC*C:?D/��

&�����%� ����������%�0�.��.���$%����������%%�2�������%�&�������HA%�A�������&H%�&�����5$�6())@8������:<:���!�!������������������������DD:���������5��>%(��������������������%�����������������������.���-���������/�G�����B����86%�>)>C:(*/��

&�������$%�$������M��%�H�����"�6())>8�&�������������������������������������������������������������������/�-�������� �� �%�E>:CE/��

&������H&%������.�;%�������H %�2������%�&���������%���.��&"�6())E8�&����������������������������������!����������3�>D)�������!����������������������������������������/�, ���� �������3)%�D>(C:�C/��

#,���� &%� ��������� &%� 3��� �%� ������-�� B%� ������� �� 6>??D8� 5��������� ���� !������� ��������� ��� ������!����:������������������ �������������������":&%��� �����������������������������������/�G�B������� )8%�(C@)�:?/��

#�����B%�%�,�����B%�&�����%������� %�B�������5%�B�����.��$%� ������%���M�.��&%�&��������6>??D8�$�(*� .��:������� -���� ����������:��.�� �������� 6,�������:�8� �������� ���� A������� ,������ ����������!������������:�����$��:���������������������������/�B�����B������-������� � @�%���>:?/��

;��� ����� $%� &������ �%� ��� ���-� 3%�&���� �%���� ����� $� 6())(8�%����������� ���� ����������������!�������������������������������������/�-�����"������ ��/8%�>DD:E>/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>E?�

;����������A�%�������H%�A���������%�5����� HH� 6>??)8��������������� ���������� ���������������������������������:���!����� ������!�������������������� ���� ��������������� ����������������������������������������/�" �B����3@%��)C:>C/��

;������%�5�����H$%�B����%���&����H%���&����%H%� ����� %%�A����&�%�&��M�.�&&�6())(8�����.������� ����������%�����-������� �����������-������������������ �����:?%� ������� ������� ��!��������/�*���, ���� ����)%�>>ED:@C/��

;�M'��M�%%� ��������"%�������&$%�7����&%%���.������%�7��!����&%�3����:$�����&7�6>???8�&5& :>%��������������������$�$&&�:>%�����&5& :(�������!����������-�������������������-���������:����!�������������/�G�B������� 83%�(��D?:EC/��

2����N%�����NB�6())C8�5��������������������'������:�������������%������������������������������/�-�����(����" ��8%�>:>(/��

2����2 %�"����H�6())D8�3����������������������������������������������������������/�*������*���B��� 6/%�(�E:E�/��

2������� %� �������;�%�&�����&�6>??C8� ������������������/�G�B������� 8 %�>�??C:D)))/��

2��������A%�&������6>?ED8�&�������������������!����������������������������������������!����������/�G��������,���8)%�>CE�:>CEC/��

2������%�7����������"%�����-����3%�$���H���!��&%�&���������%���.��&�6()))8�&�������������������:����������>�6�3�>D)8��������������������������������/�#���*��)%�>�@*:CD/��

2�����&0%�&�������&H�6())D8��������������������������������������������:�.�����������;������/�����-��83%�>>E*:@C/��

2����!���&"%�2�����H&�6>??@8�$�$&���������������������������������/�" �B����=@%��*?:D)>/��

2���� 2B%� �������� H�� 6>??(8� 3������������ ������������� � ��������� ��� ��� ����������� ���������� !�������������:���������������/�, ���� �������/@%��E>(:(>/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>@)�

2�� B%������ 7%����� 7%� ������ 2%� B���� AA� 6())D8����������������� �����:�������� �":&<;�����������������������-�����������������!�������������������������������!��-���������������-��������������������!���>:�������/�G�����,����8%�(((C:�C/��

2�� B%������ 7%� I����� ��%� B���� AA� 6())(8� !���� >:3������:��������� ������� ����� ��������� ���� ����������:��������������������� ��������� !�� !������� ��� ���:������������������ �":&<;������/� G�B������� 88%�>((?D:�)>/��

2��B%�2��H%�7����B%�B���$%�����7%�I�����B%��������%�B����AA�6())E�8�;����������������������������������������:�����������������/�*�����B��� 3%��:>�/��

2��B%�I�����B$������� 6())>8� 3����������������� ���������� ���;�������"��������� ���������������������:����������������������������������������������������������!������;��������������������!������/�G�B������� 8)%�>D>C*:*@/��

2�� BH%� 7�� ����� ��%� 2�� H%� B��� $H%� B���� AA� 6())E!8� &��� �������������� ;������� -���� ���� !�������������/�����-���6%�D*�:?D/��

L�����BB%������ %�2���B%�7��H%�B���$%�B����AA%�7��2B�6())@8�;�������"���������������������������-��� ���� ��������� ������������ ��� ������������ ������� !�� ����������� ��� ��������� ��-��� ������������/�G�B������� =�%�>?�E*:@*/��

B��������&%�������%������&%�A��������&%���������� 6>??�8����������������!��������������������������� ����� �������� ��� ����������� ������ ��� �������� ��!�!�����/� 3������������ ��� ����� ����� ��� ����:��!���������������/�G�����,���@)�3�,���5%�EE:@E/��

B�������� &%� ��M�.�� �%� $.������ ��%� B������ �&%� ������� �� 6>?*?8� ����������� ��� ����:��!���������������!�������������������!���M��������������������!������/�G�B������� )3%�*)>(:*/��

B���������B�6()))8�7��������:������M����������!���������������������/�����*���2��,��68%�(C@:*?/��

B����A7%�I�����B%�����7%�B����AA�6>???8���������������������������������������� ������� ����">�����������;������/�G�����B�����8 %�(>):()/��

�������C�A�!����������

"� �� � ��>@>�

B�.���&%�&�����������B%�0��������&%�������0%�������� %������5�6())(8�3�������������������������������:!������� �������� ���� ����� ����������� ��� ������� �������:������� ���������� ������ ��� ��������������/�B���-�����)8%�>>@E:C>/��

B�����.�� �%�������� �%� �������� �7%� #,��.�� &%�%�,��� �%� �������� H�%� 5����� 77� 6()))8� 5����������������� �������� �����:����������� ����:@� ��� ���� ��� ����� ��� �������� ��� ��� ��������� ����� ��������������/�, ���� �������3�%�D>>D:?/��

B����BN%�;��������$%�7����H7%���-����H%�;���I������$%���������$%���������7H�6())E8�$�������������������� �����%� !��� ���� ��� �������%� ���� ���������� !������ ��!������ �������������� ����������/� ���� ������)/%�(>DC:@�/��

B�����$3%�����"0%����M��%�6>?**8����������������������������������M�������������� ��� �����������������:�����-����-��������������������-����������:������������������������������/����� ����-�� 6�%�EEE:@D/��

I�.��&%����������&%�#,����&%�3����%����������6>??E8�5�������������":&6;�8%���������������������������������":&�-��������������������������������������� ��� ������ ������������������� �������/�G�B������� 8@%��?>D:*/��

I����� L%� H����� 0%� A����� �A%��������� 5%�&�����&%���M�� ��� 6())E8��������������������������� �����������������������������������������������������!�����.������������'������/�(����,����=/���##���%�>>@?:C?/��

I�����B%�����7%�B����A7%�B����AA�6>??*8�&���"������������;�������������������������������������������������-��������:��.��������/�G�B������� 8/%�(>�D(:E>/��

I����&%�B������&%��������B%��������%�3-���� %�����.��B%����������6>??E8�5������������������������!����������� $�%���������������������:�����:�����������!���%���� ��������/�G�B������� 8@%�(@@EC:@�/��

I����7%�B������&%�I����&%�B��������2%�B�������0%�������-��B%���-������%���M�.��&%����������6())>8�������� ���� $�: ������������������������������������� ����������/�$�������!�� ��������������������!�.�����������������/�G�B������� 8)%�C@?�:@/��

I�����������%�����������5� 6>?*?8�&������������������� ���� ����� ��!�!����������������%�;������/�,�)��G�=%�(?CE:*>/�

� �

� �

� �

� �

� �

� #����= �

,�9������������������� ���� �����

Dunning, K.R., Lane, M., Brown, H.M., Yeo, C., Robker, R.L. and Russell, D.L. (2007) Altered composition of the cumulus-oocyte complex matrix during in vitro maturation of oocytes. Human Reproduction, v.22 (11) pp. 2842-2850, November 2007

NOTE: This publication is included in the print copy of the thesis

held in the University of Adelaide Library.

It is also available online to authorised users at:

http://dx.doi.org/10.1093/humrep/dem277