Guillou NoëllineTP de culture cellulaireChateigner Aurélien

TP de culture cellulaireIntroduction

Aujourd’hui, l’embryologie est une science qui s’est tournée vers la compréhension des mécanismes qui permettent le développement des organismes. Pour la plupart des oiseaux, et notamment pour notre poule, le développement de l’embryon se fait en dehors de l’organisme maternel, à l’abri d’une protection, vulgairement appelée œuf.

Cet œuf contient toutes les ressources nécessaires au développement de l’embryon, que ce soit au niveau de l’énergie, de l’eau et de la protection. L’enveloppe externe de cet embryon permet donc la protection de l’embryon, de par sa composition en 3 parties principales : Vitellus, Amnios et Allantoïde. Nous verrons les rôles de ces enveloppes dans la première partie.

En ce qui concerne le développement de l’embryon en lui-même, un certain nombre de processus se mettent en place, que ce soit pour la division cellulaire en elle-même, ou pour la reconnaissance, la migration et la différenciation cellulaire. Ces mécanismes ont pour finalité de former les tissus et les organes de la future poule.

Composant ces tissus et organes, un grand nombre de molécules sont aujourd’hui connues, aussi bien au niveau de la matrice extracellulaire qu’au niveau des membranes. Nous pouvons de plus, à ce jour, mettre en culture des cellules, et ainsi mieux comprendre les mécanismes biologiques et cellulaires. Pour notre TP, nous voulons mettre 2 types de cellules en culture, des cellules cérébrales et des fibroblastes. Pour les mettre en culture, nous utilisons la technique de culture de cellules adhérentes à un support. Nos observations se font au microscope inversé, sous hotte à flux laminaire, et donc en conditions stériles.

1ère partie : mécanisme d’adhésion et de migration cellulaireL’embryon et les annexes embryonnaires

Vésicule Vitelline

Vitellus

Allantoïde

Chorion

Cœlome extra-embryonnaire

Embryon

Cavité amniotique

(Figure 1 : Schéma de l'embryon de poulet à 7 jours de développement)Amnios

Coquille

Embryon

(Figure 2 : Position relative de l'Embryon dans l'œuf, en vue du dessus, en ayant coupé du côté du "gros bout")Annexes embryonnaires

Vitellus

Allantoïde

Embryon

Amnios

Veine vitelline

(Figure 3 : Photo de la position de l'œuf par rapport aux annexes embryonnaires une fois l’embryon extrait de l’œuf.)

Bec

Œil

Hémisphères cérébraux

Lobes optiques

Tête

Cervelet

Moelle épinière

(Figure 4 : Zone cérébrale d'un embryon d'œuf de poule)

Rôle des annexesVitellus

Réserves nutritives de l’embryon, rôle nourricier.

Vésicule vitelline

Entoure la masse de Vitellus, sert d’organe digestif. Elle est parsemée de vaisseaux sanguins, ainsi les produits sont absorbés par ceux-ci et transportés vers l’embryon.

Allantoïde :

Fonction dans la respiration : la splanchnopleure amène une vascularisation ce qui permet des échanges gazeux entre l’allanto-chorion et la coquille de l’œuf.

Fonction nutritive sur plusieurs aspects : prend le relais du raphé séro-amniotique pour l’assimilation du reste de l’albumen et permet de récupérer le calcium de la coquille pour former les os de l’embryon ce qui fragilise la coquille et ainsi facilite la sortie du poussin.

Fonction excrétrice : la cavité allantoïde est une poubelle de l’embryon, en effet les déchets produits par les reins seront lâchés dans l’allantoïde. Au moment de l’éclosion l’allanto-chorion reste collée à la coquille.

Chorion

Couche extra-embryonnaire externe constituée de mésoderme et d’ectoderme.

Cœlome extra-embryonnaire

Cavité générale de l’œuf.

Amnios

Permet le développement de l’embryon en milieu liquide. Permet l’assimilation de l’albumen par le raphé séro-amniotique jusqu'à 16 jours d’incubation. Assure à l’embryon une protection contre une possible dessiccation et d’éventuels chocs mécaniques.

Mise en culture des cellules cérébrales embryonnaires de pouletMatériel et méthodes :Milieu DMEMDMEM base

Le milieu DMEM base est acheté tel quel.

DMEM 5%

Le milieu DMEM 20% se prépare en suivant la composition suivante :

· Milieu de base : DMEM500 mL

· Sérum de veau fœtal (SVF)25 mL (5%)

· Antibiotique6 mL

· L-glutamine6 mL

DMEM 20%

Le milieu DMEM 5% se prépare en suivant la composition suivante :

· Milieu de base : DMEM500 mL

· Sérum de beau fœtal (SVF)110 mL (20%)

· Antibiotique6 mL

· L-glutamine6 mL

Poly Lysine

Pour 10 boites :

1- Peser l’acide borique dans un bécher de 50 mL et ajouter 40 mL environ d’H2O

2- Ensuite, peser la poly lysine dans un micro bécher à l’aide de 2 pinces et l’ajouter avec attention à l’acide borique. Agiter le tout.

3- Peser le NaOH 1N dans un bécher de 25 mL et ajouter de l’H2O puis mélanger avec une tige de verre dans un bain-marie. Ensuite, le transvaser dans une fiole et ajuster à 50 mL. Agiter et mettre dans un flacon.

4- Le PH étant de 4,75 environ, il faut (0,5 mL environ d’NaOH 1N) pour remonter le pH à 8,4

5- Ensuite ajuster la solution à 50 mL avec H2O

6- Prévoir un bécher de 25 ou 50 mL et une seringue de 10 mL avec un filtre de 0,22 µm et verser 2,5 mL par boite de Pétri (sous la hotte). Ne plus bouger les boites jusqu’à la mise en culture.

Tampon borate

Pour les boites « borate », la procédure est la même sauf que l’on n’ajoute pas la poly lysine au tampon borate.

Fibronectine

On veut préparer 10 boites de 60 mm de diamètre, ayant donc chacune 28 cm² de surface. On veut 2 µg.cm-2, on a donc besoin de 560 µg de fibronectine.

Pour cela on suit le protocole suivant :

1- Reconstituer avec 1 mL d’eau stérile par mg de protéine. Laisser dissoudre pendant au moins 30 minutes.

2- Diluer la fibronectine dans une solution saline tamponnée (la dilution n’est pas indiquée) et recouvrir la surface de culture avec un volume minimum.

3- Laisser sécher à l’air pendant au moins 45 minutes à température ambiante. L’excès de fibronectine sera éliminé par aspiration.

Lors de notre manipulation, nous avons donc mis en culture des cellules cérébrales embryonnaires de poulet dans des boites de Pétri présentant différents revêtements afin de savoir lequel semblait être le plus adapté à ce type de culture cellulaire.

Protocole :

(Prélèvement de l’embryon)Incision

Œuf de poule à stériliser à l’alcool

(Préparation de la culture des fibroblastes )

(Prélèvement des hémisphères cérébraux )

(Homogénéiser à l’aide d’une seringue et d’un trocart) (Dans du DMEM 20% ) (Polylysine) (Tampon Borate) (Fibronectine) (Répartir 1,5 mL de la solution cellulaire + 3,5 mL de DMEM 20% dans chaque boite) (Préparer les revêtements des différentes boites)

Analyse et interprétation des résultatsTampon borate

Après 1 heure d’incubation à 37°C en incubateur à CO2, on observe une absence d’adhérence des cellules sur le fond de la boite. On observe la présence d’amas cellulaires, sans doute dus à une mauvaise séparation des cellules lors de la manipulation.

(Figure 5 : Culture de neurones en tampon borate après 1 heure d'incubation)

Après 4 jours d’incubation, les cellules n’ont toujours pas adhéré, on constate l’absence de croissance cellulaire, et la présence de quelques corps apoptotiques (cellules mortes).

(Figure 6 : Culture de neurones en tampon borate après 4 jours d'incubation)

Après 7 jours d’incubation, les cellules n’ont ni adhéré, ni poussé, et seuls les corps apoptotiques sont visibles.

(Figure 7 : Culture de neurones en tampon borate après 7 jours d'incubation)

Donc, le tampon borate n’est pas un milieu approprié pour la croissance des cellules cérébrales embryonnaires, en effet, dans les conditions expérimentales, nous n’avons observé aucune adhérence, migration ou croissance de celles-ci.

Polylysine

(Figure 8: Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur polylysine après 1h d'incubation.)

Après 1 heure d’incubation à 37°C en incubateur à CO2, on observe l’apparition de petits prolongements cellulaires sur certaines cellules, ceci montre que les cellules sont entrain d’adhérer à la paroi de la boite. Par ailleurs, on peut observer l’apparition de longs prolongements qui pourraient traduire un début de croissance cellulaire.

Après 4 jours d’incubation, on constate la présence de corps apoptotiques. Les cellules vivantes adhèrent à la paroi. De plus, les cellules ont poussé, de nombreux prolongements (axones et dendrites) sont apparus. On remarque aussi les synapses entre différents neurones.

(Figure 9 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur polylysine après 4 jours d'incubation.)

Après 7 jours d’incubation, les corps apoptotiques sont toujours présents. Les neurones ont davantage poussé, ils adhèrent toujours à la paroi de la boite et des nombreux prolongements supplémentaires sont apparus.

(Figure 10 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur polylysine après 7 jours d'incubation.)Les neurones font tous des synapses les uns avec les autres.

La polylysine est un polymère de L-lysine, acide aminé présentant sur sa chaine latérale un groupement amine. Le pH de notre solution étant à 8.4, la polylysine est chargée positivement ce qui lui permet de se lier à des groupements chargés négativement par des interactions électrostatiques.

Notre culture a bien adhéré à la paroi de la boite de Pétri, sans doute grâce à des liaisons électrostatiques, les cellules ont bien poussé et migré. Il semblerait donc que dans ces conditions d’expérimentations ce type de support soit approprié à la culture de neurones.

Fibronectine

Après 1h d’incubation à 37°C en incubateur à CO2, on remarque l’apparition de petits prolongements sur quelques cellules, celles-ci sont sans doute entrain d’adhérer à la paroi de la boite de Pétri.

(Figure 11 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur fibronectine après 1h d'incubation.)

Après 4 jours d’incubation, les cellules ont bien adhéré à la paroi, elles ont émit des prolongements (axones et dendrites), quelques synapses sont apparues. On ne voit pas de corps apoptotiques.

(Figure 12 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur fibronectine après 4 jours d'incubation.)

(Figure 13 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur fibronectine après 7 jours d'incubation.)Après 7 jours d’incubation, les cellules ont très fortement adhéré à la paroi, elles ont émit une multitude de prolongements et de nombreuses synapses sont visibles. De plus, les grossissements sont les même sur toutes les photos présentées et on constate que sur celle-ci, les cellules sont beaucoup plus grosses. On n’observe que peu de corps apoptotiques.

La fibronectine est une glycoprotéine dimérique de 440 kDa présentant de nombreux sites de liaisons pour les récepteurs membranaires de certaines cellules, le collagène... In vivo, elle joue un rôle important dans la migration et la différenciation cellulaire.

Notre culture a bien adhéré à la paroi de la boite de Pétri, en se fixant à la fibronectine. Les cellules ont bien poussé et migré. De plus, la croissance cellulaire est plus importante que sur la polylysine. Peu de corps apoptotiques sont présents.

Conclusion

Dans nos conditions expérimentales, il apparait que le meilleur revêtement à utiliser pour la mise en culture de cellules cérébrales embryonnaires de poulet soit la fibronectine. En effet, les cellules poussent et migrent mieux que sur polylysine et peu de corps apoptotiques y sont observés.

Par ailleurs, le soma des neurones ne présente pas de structure particulière.

2ème partie : marquages subcellulaires de cultures primaires de fibroblastes1ère séance : Mise en culture des fibroblastes de poulet

Afin de mettre en culture des fibroblastes, nous avons travaillé sur le corps de l’embryon de poulet. Nous avons éliminé les membres, les viscères et la colonne vertébrale. Nous avons ensuite broyé et dispersé le reste des tissus dans du milieu DMEM 5% puis mis en culture à 2 concentrations différentes : une boite contenant 1 mL de suspension cellulaire et 4 mL de DMEM 5%, et l’autre contenant 0,2 mL de suspension cellulaire et 4,8 mL de DMEM 5%.

(Figure 14 : Observation d'une culture de fibroblastes (1 mL de culture + 4 mL de DMEM) à 7 jours) (Figure 15 : Observation d'une culture de fibroblastes (0,2 mL de culture + 4,8 mL de DMEM) à 7 jours)Nous avons observé les cellules le jour même, à 7 jours et à 14 jours, en ayant réalisé un passage à 7 jours.

On observe sur chacune des photos plusieurs types cellulaires morphologiquement différents. Après 7 jours, on observe que dans la boite à 0,2 mL, les cellules qui ont le plus poussé sont les fibroblastes. Nous avons mis en culture un mélange de cellules contenant entre autre des fibroblastes. Les fibroblastes sont des cellules qui ont besoin d’un support d’adhérence pour croitre, et il se trouve que dans la boite à 1 mL, la présence d’autres types cellulaires à gêné leur adhérence, les empêchant ainsi de se multiplier et de croitre. Dans la boite à 0,2 mL, moins de cellules ont été ensemencées, les fibroblastes ayant une croissance plus rapide que la moyenne, ils ont surpassé les autres cellules en fixation et en croissance. Ceci nous a permis de réaliser un enrichissement en fibroblastes.

Contrairement au premier jour d’observation, à 7 jours, les fibroblastes présentent une organisation spécifique, les cellules sont allongées et disposées parallèlement les unes par rapport aux autres.

2ème séance : Entretien de cultures cellulaires

Protocole corrigé :

· Prendre boite 0,2, éliminer le milieu avec une P1000

· Faire délicatement un rinçage avec 2 mL de milieu PBS pour éliminer le sérum, piège pour l’action de la trypsine (attention à ne pas tout décoller)

· Décoller les cellules en faisant agir 1,5 mL de trypsine : la trypsine dégrade les protéines extracellulaires qui interagissent avec la matrice. Il ne faut pas la laisser agir trop longtemps, sinon elle s’attaque aux protéines cellulaires, et dégrade alors la cellule en elle-même.

· Surveiller les cellules à l’œil et au microscope (transparence, peut prendre entre 2 et 5 minutes)

· Quand les cellules sont décollées, ajouter 0,2 mL de SFV (la trypsine se fixe alors aux protéines de la SFV)

· Homogénéiser et prendre 1 mL, à mettre dans un tube Eppendorf

· Mettre 50µL + 450 µL de DMEM base

· Placer 50 µL sur une cellule de Malassez

· Comptage

On observe en moyenne 4,5 cellules pour 1/100 µL, soit 450 cellule/µL. Notre solution a été diluée au 10ème, on a donc 10 fois plus de cellules par µL, ce nous donne 4500 cellules par µL. On veut ensuite ensemencer les cellules sur les lamelles de verre de la façon suivante :

Lamelle

1- 2500 cellules/cm²

2- (Dans un volume final de 500 µL de CEF)10000 cellules/cm²

3- 15000 cellules/cm²

4- 40000 cellules/cm²

Le diamètre de chaque puits fait 1,5 cm, la surface S = π x r² = π x 0,75² = 1,77 cm². On veut donc :

1- 2500 cellules par cm², donc pour 1,77 cm², on voudra 4425 cellules.

2- 17700 cellules dans le puits

3- 26550 cellules dans le puits

4- 70800 cellules dans le puits

Sachant qu’on a 4500 cellules par µL, on devra prendre :

1- 2,95 µL de la suspension cellulaire q.s.p. 1,5 mL de CEF (on prépare 1,5 mL car la quantité de suspension à prélever pour un volume de 500 µL serait trop petite)

2- 11,8 µL q.s.p. 1,5 mL de CEF

3- 17,7 µL q.s.p. 1,5 mL de CEF

4- 47,2 µL q.s.p. 1,5 mL de CEF

On prélève ensuite 500 µL de chaque préparation que l’on dispose dans les puits 1 à 4. On laisse ensuite pousser pendant 1 semaine à 37°C en incubateur à CO2.

Séance 3 : marquage subcellulaire de l’ADN à l’acridine orange

L’acridine orange est une fluorescéine. Elle se fixe préférentiellement à l’ADN et permet ainsi de mettre en évidence les noyaux et les mitochondries. On observe donc une fluorescence dans le vert. Pour cela, on utilise un microscope à fluorescence, qui dispose d’une lampe à arc et de filtres permettant la sélection de longueurs d’ondes précises.

(Figure 16 : Molécule d'acridine orange)

(Objet) (Oculaire) (Filtre d’émission) (Miroir Dichroïque) (Filtre d’excitation) (Lampe à arc)Principe du microscope à fluorescence :

(Emission) (Excitation)Absorbance

Longueur d’onde (nm)

450520

On excite notre molécule dans le bleu, dont l’absorbance est maximale à 450 nm, et on utilise un filtre d’émission qui permet de mettre en évidence les émissions à partir de 520 nm dans le vert.

Après avoir marqué nos cellules à l’acridine orange, nous les avons observé au microscope et avons obtenu les photographies suivantes :

Figure 17 : Photographie de fibroblastes colorés à l'acridine orange et observés au microscope à fluorescence

Conclusion

La coloration à l’acridine orange permet de mettre en évidence la structure du noyau des fibroblastes, en effet, ils sont constitués de plusieurs nucléoles.

Cette manipulation nous a permis de mettre en évidence la morphologie et l’organisation des fibroblastes, effectivement, ce sont des cellules adhérentes, qui s’organisent parallèlement les unes aux autres, ne supportent pas la confluence, et ont des noyaux constitués de plusieurs nucléoles.

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