Master 2 Professionnel "Chimie Analytique et Instrumentation" Promotion 2006

Larrahondo Maria, Rieb Estelle

Analyse par Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) de filtres solaires

La chromatographie est une technique analytique dont les premières expériences, celles de Tswett, datent de 1903. Elle permet la séparation d’un ou plusieurs composés d’un mélange pour leur identification et leur quantification. La chromatographie en phase liquide est une méthode physico-chimique basée sur des différences d’interactions. Les molécules des produits à séparer (solutés) sont mises en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire contenue dans la colonne chromatographique. Ces interactions provoquent des échanges qui aboutissent à la séparation désirée. La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt en permanence le système chromatographique, dont fait partie la colonne. Les composés en solution se répartissent suivant leur affinité, entre la phase mobile et la phase stationnaire.

Un peu de théorie…Temps de rétention : caractéristique duconstituant et des conditions d’analyseSurface du pic: fonction de la quantité deconstituant.

rt

BA

rArB

ddtt

R+−

= 18,1

« Phase stationnaire polaire et phase mobile apolaire »

chromatographie à polarité de phase normale.

« Phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire »

chromatographie à polarité de phase inverse.

Phase stationnaire polaire affinité pour les solutés polaires.Phase stationnaire apolaire affinité pour les solutés apolaires.Phase mobile polaire entraîne les solutés polaires.Phase mobile apolaire entraîne les solutés apolaires.

Mode isocratique: le mélange de différents solvants ne varie pas au cours de la séparationMode gradient d’élution: variation des pourcentages des solvant au cours de la séparation

AppareillageSystème de pompage : permet d’obtenir un débit stable, et non pulsé.

Les deux solvants : sont pompés séparément puis mélangés dans la chambre de mélange.

Le système de dégazage : élimine les bulles qui perturbent la fonctionnement du détecteur (élargissement de pics).

Chambre de mélange : le mélange est mis sous pression puis envoyé vers l’injecteur

Dispositif d’injection de l’échantillon : permet d’introduire l’échantillon en tête de colonne tout en conservant la pression élevée sur la colonne. Le volume est maîtrisé par une boucle d’injection (20, 50µL...). Une vanne Rhéodyne est alors basculée manuellement pour lancer l’analyse.

Le four : maintient la température de la colonne constante.

La colonne : est un tube rempli de phase stationnaire.

Détecteur à barettes de diodes : permet l'acquisition du spectre de l'échantillon en temps réel, une représentation en 3 dimensions (temps, absorbance, longueur d'onde) et une caractérisation des composés par leur spectre.

Application

Une exposition au soleil peut générer des lésions cutanées. La concentration des filtres UV doit être connue pour ne pas dépasser un taux limite autorisé, fixé par différentes législations.Uneprocédure de dosage de deux filtres solaires, octocrylène et parsol, a été mise au point par HPLC.

O

O

N

2-ethylhexyl 2-cyano-3,3-diphenylacrylate

Octocrylène

O

O O

octan-3-yl 3-(4-methoxyphenyl)acrylate

Parsol

Conditions de séparation de l’octocrylène et du parsolSystème HPLC Agilent 1100

Mode isocratique Phase mobile eau/acétonitrile (15/85, v/v)

Colonne Waters Nova-Pak C18 3,9 mm id x 75 mm0,8 ml.min-1

λ = 310 nm détecteur DADÉchantillon solubilisé dans 60% d’acétonitrile + 40%

d’eau

Chromatogramme d’une crème solaire

Fig.4 Chromatogramme d’une crème contenant 13% d’octocrylène et 9%de parsol.

PARSOLOCTOCRYLENE

Chromatogramme 3D d’une crème solaire

Fig.5 Chromatogramme 3D (temps, absorbance, longueur d’onde)

LOD (ng/mL) LOQ (ng/mL)Octocrylène 9 29

Parsol 5 16

Tab.1 Limites de détection (3*Signal/bruit) et de quantification (10*Signal/bruit)

Fig.1 Illustration des paramètres en chromatographie

Temps de rétention

Largeur à mi-hauteur

Prix d'un appareil AGILENT 1100

35 126 € TTC

Dégazeur

Chambre de mélange

Pompes

Injecteur automatique

Détecteur

(DAD : barrettes de diode)

+ colonne thermostatée dans four (de préférence)

Fig.2 Photo d’une chaîne HPLC Agilent 1100

La Chromatographie Haute Performance est une méthode particulièrement sélective, linéaire et sensible. Pouvant être couplée avec la plupart des détecteurs (UV, MASSE, FLUORESCENCE, RMN…), elle s’adapte à une très large gamme de matrices et analytes. L’optimisation est relativement simple. Cependant, plusieurs paramètres (pH, Phase mobile, Colonne, Température…) peuvent influencer la séparation.

Courbe d'étalonnage

yp = 161.24x + 22.184R2 = 0.9999

yo = 69.688x + 12.043R2 = 0.99990

5001000150020002500300035004000

0 5 10 15 20 25

Concentrations µg/ml

Aire

octocrylèneparsolLinéaire (parsol)Linéaire (octocrylène)

Fig.3 Courbe d’étalonnage: témoigne de la linéarité. Intervalle: Octocrylène 0,625-15 µg/ml

Parsol 0,825-19,8 µg/ml

Aire

Concentration

trB

trA

Si R < 1 la résolution est mauvaiseSi 1 < R < 1,5 la résolution est acceptableSi R > 1,5 la résolution est bonne