2006 Fluo
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Master 2 Professionnel "Chimie Analytique et Instrumentation" Promotion 2006 Laurenti Pauline, Dedreuil-Monet Thibaut 200.0 300 400 500 600 700 800 900.5 0.0 100 200 300 400 514.2 nm 200.0 300 400 500 600 700 800 900.5 -0.3 200 400 600 800 1015.6 nm Droite d' étalonnage de la Quinine (zone de linéarité) y = 359,64x R 2 = 0,9992 0 100 200 300 400 500 600 700 0 0,5 1 1,5 2 [quinine] ppm I fluo à 511nm Effet de quenching y = 164,55x + 1,0014 R2 = 0,9996 0 0,5 1 1,5 2 0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 [NaCl] mmol/L I fluo0 /I fluo 200.0 400 600 800 900.5 -80.8 -60 -40 -20 0 20 40 60 83.8 nm D1 244.70 420.10 478.52 682.84 716.01 781.67 805.19 823.56 877.44 S 1 hv Absorption (excitation) Hν fluo (émission) Schéma de Jablonski (1) L’excitation de certains composés par une source lumineuse, provoque un rayonnement de la molécule excitée. Dans le cas de la fluorescence, ce rayonnement correspond à la réémission partielle ou totale de l’énergie absorbée: passage d’un état singulet S 1 à un état fondamental S 0 , (λ fluorescence est toujours supérieur à λ absorption ). La phosphorescence diffère par le fait que l’émission est plus lente, et que le retour à l’état fondamental se fait à partir d’un état triplet. Lorsque les longueurs d’ondes d’excitation et d’émission sont proches il ne faut pas confondre la fluorescence de l’échantillon avec deux émissions parasites : • Diffusion Rayleigh: réémission d’une petite fraction de la lumière excitatrice dans toutes les directions, par les molécules du solvant avec la même longueur d’onde. • Diffusion Raman: de 100 à 1000 fois plus faible que la diffusion Rayleigh, provient du transfert d’une partie de l’énergie de la radiation excitatrice aux molécules de solvant sous forme d’énergie de vibration. Les molécules de solvant réémettent des photons de moindre énergie que ceux ayant servi à les exciter. Shampoing Klorane® Boisson « tonic » Médicament Quinimax® (en ampoule 250mg/2mL) Autres…. Cuves en quartz Manipulez moi avec précaution 300€ !!! environ 30 000 € !!! 1,82850601 87,35 0,4 5,00E-03 1,48562924 107,51 0,4 3,00E-03 1,17234292 136,24 0,4 1,00E-03 1 159,72 0,4 0 Ifluo(0) / Ifluo Ifluo [quinine] ppm Quencher [NaCl] mmol/L Phénomène de quenching La quinine Résultats Autres spectres Relation Ifluo = f([Quinine]) Appareillage Spectrofluorimétre Perkin Elmer LS 55 Schéma d’un spectrofluorimétre Extraite de l’écorce du quinquina, un arbre d’Amérique du sud, la quinine est aujourd’hui utilisée dans de nombreux médicaments contre le paludisme (Quinimax®) et dans diverses boissons pour son principe amer (Schweppes®). Cet alcaloïde est un composé hautement fluorescent (rendement quantique φ f = 54 % ). Excité à sa λ max(Absorption) = 347 nm, il émet une intensité de fluorescence à λ max(Emission) = 454 nm. Formule chimique : C 20 H 24 N 2 O 2 (324, 41 g/ mol) λ Em = 454 nm Spectre d’absorption UV visible de la quinine dans H 2 SO 4 0.05 M, [quinine] = 8 ppm Schéma de Jablonski (2) Spectre d’émission à 345 nm de la quinine dans H 2 SO 4 0.05 M, [quinine] = 0.04 ppm Rayleigh (345 nm) Harmoniques Raman Réglage de certains paramètres: Fenêtrages (Ex / Em) Longueur d’onde d’excitation Filtres Remarques avant utilisation Pour le dosage de la quinine: Fenêtrages (Ex: 5 / Em : 5) Longueur d’onde d’excitation: 345 nm Filtres:pas de filtres L’environnement peut entraîner un phénomène de quenching ou extinction de fluorescence d’un fluorophore. Ci-contre, mise en évidence du phénomène par les ions chlorures. La loi de Stern-Volmer régit ce phénomène : F(o)/ F = 1 + Ksv [Q] Remarque: l’oxygène dissout est aussi un quencher (dégazage). 122.92 221.04 1/200 000 4 121.88 219.18 1/200 000 3 132.74 95.48 1/500 000 2 129.46 93,12 1/500 000 1 Quantité dans l’injectable en mg/ mL Intensité de fluorescence u.a (551nm) Dilution Dans H2SO4 (0.05 M) Échantillons Quinimax® (en ampoule) 71 128.30 2 4 66 119.43 2 3 72 129.6 1 2 68 122.40 1 1 Quantité dans la boisson (ppm) Intensité de fluorescence u.a (551nm) Opérateurs Échantillons (Schweppes®) Dilution au 1/200éme dans H2SO4 (0.05 M) Avantages/inconvénients La spectrofluorimétrie présente de nombreux avantages: sensibilité (100 à 1000 fois supérieure qu’en UV visible), prix, acquisitions rapides des spectres, simplicité d’utilisation, possibilité de travailler avec microplaque.... Mais l’étude de matrices complexes est difficile à cause des effets de quenching. Ifluo = 2,3.I 0 .ε.l.φ f .[C] = K.[C] (si Abs < 0.04) Limitation Pour les solutions concentrées absence de relation linéaire: phénomène d’auto-quenching (diminution de l’intensité de fluorescence). Spectres d’émissions de fluorescence de 17 solutions de quinine dans H 2 SO 4 (0,05M) les quantités de quinine obtenues expérimentalement peuvent être considérées comme justes et répétables. En ce qui concerne le shampoing Klorane®, l’effet de matrice semble trop important (détergents), pour une étude en spectrofluorimétrie. • Le spectre d’émission de la dérivée première est généralement utilisé pour doser un composé présent dans un mélange. • le spectre d’excitation obtenu avec un spectrofluorimétre permet de confirmer le choix de la longueur d’onde d’excitation. Quinine: zone de linéarité 0,004-1,5ppm Bande d’excitation Rayleigh Limite de linéarité de la courbe étalon 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 20 40 60 80 100 120 [quinine] ppm I fluo λ à 600.28nm Limite à la linéarité Auto-quenching Ifluo = φ f .I 0 .( 1-10 -ε.l.[C] ) Principe:
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Master 2 Professionnel "Chimie Analytique et Instrumentation" Promotion 2006
Laurenti Pauline, Dedreuil-Monet Thibaut
200.0 300 400 500 600 700 800 900.50.0
100
200
300
400
514.2
nm
200.0 300 400 500 600 700 800 900.5-0.3
200
400
600
800
1015.6
nm
Droite d' talonnage de la Quinine (zone de linarit)
y = 359,64xR2 = 0,9992
0100200300400500600700
0 0,5 1 1,5 2[quinine] ppm
I flu
o
511nm
Effet de quenching
y = 164,55x + 1,0014R2 = 0,9996
0
0,5
1
1,5
2
0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006
[NaCl] mmol/L
I fluo
0/I fl
uo
200.0 400 600 800 900.5
-80.8
-60
-40
-20
0
20
40
60
83.8
nm
D1 244.70
420.10
478.52
682.84
716.01
781.67
805.19
823.56
877.44
S1
hvAbsorption(excitation)
Hfluo (mission)
Schma de Jablonski (1)
Lexcitation de certains composs par une source lumineuse, provoque un rayonnement de la molcule excite. Dans le cas de la fluorescence, ce rayonnement correspond la rmission partielle ou totale de lnergie absorbe: passage dun tat singulet S1 un tat fondamental S0, (fluorescence est toujours suprieur absorption). La phosphorescence diffre par le fait que lmission est plus lente, et que le retour ltat fondamental se fait partir dun tat triplet.
Lorsque les longueurs dondes dexcitation et dmission sont proches il ne faut pas confondre la fluorescence de lchantillon avec deux missions parasites : Diffusion Rayleigh: rmission dune petite fraction de la lumire excitatrice dans toutes les directions, par les molcules du solvant avec la mme longueur donde. Diffusion Raman: de 100 1000 fois plus faible que la diffusion Rayleigh, provient du transfert dune partie de lnergie de la radiation excitatrice aux molcules de solvant sous forme dnergie de vibration. Les molcules de solvant rmettent des photons de moindre nergie que ceux ayant servi les exciter.
Shampoing Klorane Boisson tonic
Mdicament Quinimax(en ampoule 250mg/2mL)
Autres.
Cuves en quartzManipulez moi
avec prcaution 300 !!!
environ30 000
!!!
1,8285060187,350,45,00E-03
1,48562924107,510,43,00E-03
1,17234292136,240,41,00E-03
1159,720,40
Ifluo(0) / IfluoIfluo[quinine] ppmQuencher
[NaCl] mmol/L
Phnomne de quenching
La quinine
Rsultats
Autres spectres
Relation Ifluo = f([Quinine])
Appareillage
Spectrofluorimtre Perkin Elmer LS 55
Schma dun spectrofluorimtre
Extraite de lcorce du quinquina, un arbre dAmrique du sud, la quinine est aujourdhui utilise dans de nombreux mdicaments contre le paludisme (Quinimax) et dans diverses boissons pour son principe amer (Schweppes).
Cet alcalode est un compos hautement fluorescent (rendement quantique f = 54 % ).Excit sa max(Absorption) = 347 nm, il met une intensit de fluorescence max(Emission) = 454 nm.
Formule chimique : C20H24N2O2(324, 41 g/ mol)
Em = 454 nm
Spectre dabsorption UV visible de la quinine dans H2SO4 0.05 M, [quinine] = 8 ppm Schma de Jablonski (2)Spectre dmission 345 nm de la quinine
dans H2SO4 0.05 M, [quinine] = 0.04 ppm
Rayleigh (345 nm)
Harmoniques
Raman
Rglage de certains paramtres:
9 Fentrages (Ex / Em) 9 Longueur donde dexcitation9 Filtres
Remarques avant utilisation
Pour le dosage de la quinine:
9 Fentrages (Ex: 5 / Em : 5) 9 Longueur donde dexcitation: 345 nm9Filtres:pas de filtres
Lenvironnement peut entraner un phnomne de quenching ou extinction de fluorescence dun fluorophore.
Ci-contre, mise en vidence du phnomne par les ions chlorures.
La loi de Stern-Volmer rgit ce phnomne : F(o)/ F = 1 + Ksv [Q]
Remarque: loxygne dissout est aussi un quencher (dgazage).
122.92221.041/200 0004
121.88219.181/200 0003
132.7495.481/500 0002
129.4693,121/500 0001
Quantitdans
linjectable en mg/ mL
Intensit de fluorescence
u.a(551nm)
DilutionDans H2SO4
(0.05 M)
chantillonsQuinimax
(en ampoule)
71128.3024
66119.4323
72129.612
68122.4011
Quantit dans la boisson (ppm)
Intensit de fluorescence u.a
(551nm)
Oprateurschantillons (Schweppes)Dilution au 1/200me dans H2SO4
(0.05 M)
Avantages/inconvnientsLa spectrofluorimtrie prsente de nombreux avantages: sensibilit (100 1000 fois suprieure quen UV visible), prix, acquisitions rapides des spectres, simplicit dutilisation, possibilit de travailler avec microplaque....
Mais ltude de matrices complexes est difficile cause des effets de quenching.
Ifluo = 2,3.I0 ..l.f.[C]= K.[C] (si Abs < 0.04)
Limitation
Pour les solutions concentres absence de relation linaire: phnomne
dauto-quenching (diminution de lintensit de fluorescence).
Spectres dmissions de fluorescence de 17 solutions de quinine dans H2SO4 (0,05M)
les quantits de quinine obtenues
exprimentalement peuvent tre considres comme justes et rptables.
En ce qui concerne le shampoing Klorane, leffet dematrice semble trop important (dtergents), pour une tude enspectrofluorimtrie.
Le spectre dmission de la drive premire est gnralement utilis pour doser un compos prsent dans un mlange.
le spectre dexcitation obtenu avec un spectrofluorimtre permet de confirmer le choix de la longueur donde dexcitation.
Quinine: zone de linarit 0,004-1,5ppm
Bande dexcitation
Rayleigh
Limite de linarit de la courbe talon
0100200300400500600700800900
0 20 40 60 80 100 120
[quinine] ppm
I flu
o
600.28nmLimite la linarit
Auto-quenching
Ifluo = f.I0.( 1-10-.l.[C] )
Principe:
