1er et 2_me cours de G_n_tique appliqu_e

8/7/2019 1er et 2_me cours de G_n_tique appliqu_e

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Cours deCours deGénétique AppliquéeGénétique Appliquée



I.I. Introduction auIntroduction augénie génétiquegénie génétique



Le Génie GénétiqueLe Génie Génétique

Définition :

Ensemble des méthodes permettant de modifier le matériel

génétique d¶une cellule par la manipulation de gènes in vitro

BUT:

Connaître la structure et le fonctionnement de l¶informationgénétique (ADN) d¶un animal ou d¶un végétal

Isoler des gènes afin de les transférer dans une autremolécule d¶ADN appartenant à une autre espèce animale ouvégétale



Br ef histor ique du génie génétiqueBr ef histor ique du génie génétique

1868 : découverte de l¶ADN par Miescher

1953 : découverte de la structure de l¶ADN & du modèle de la

double hélice par Watson & Crick

1961 : découverte du code génétique qui permet de comprendre

que le « langage » de l¶ADN correspond au « plan de

construction des êtres vivants »




1971 : découverte des endonucléases (= enzyme servant auxbactéries pour dégrader l¶ADN d¶organismes parasites)par Arber= « ciseaux biologiques » qui permettent de couper

l¶ADN de façon très précise

1972 : premier ADN recombinant (ou produit de manipulationgénétique in vitro)

1977 : premier clonage (ou reproduction in vitro)première localisation sur un chromosome de gène humain




1982 : mise sur le marché du 1er agent thérapeutique génétique(Insuline)

1983 : transfert de gène chez un végétal

1999 : décryptage du premier chromosome humain(chromosome 22)




Universalité du code génétique := code identique de la bactérie à l¶être humain

Clonage de gène :

= isoler un gène permet de permet de récupérer un fragment

d¶ADN, par exemple un gène, à partir d¶un échantillond¶ADN complexe et de grande taille

le multiplier

l¶étudier

fabriquer la protéine pour laquelle il code

Mais attention : le clonage d'animaux, voire d'êtres humains,

n'a rien à voir avec le génie génétique !



La manipulation génétiqueLa manipulation génétique

Population de bactér ies

tr ansgéniques pr oduisant

la pr otéine r ecombinée

ADN r ecombinant

Enzyme de r estr iction

ADN à cloner bactér ieADN

plasmideADN




Les techniques de bases du génie génétique sont :

Identifier un gène

Cloner le gène du donneur dans une bactérie

Caractériser le gène du donneur dans un système bactérien

Modifier le gène du donneur

Réintroduire le gène du donneur dans des cellules donneuses



Applications du génie génétiqueApplications du génie génétique

R echerche biomédicale :

cancer, résulte du dysfonctionnement de certains gènes

Médecine prédictive :

dépistage génétique (diagnostic pré-natal)

Thérapie génique :

remplacement d¶un gène anormal par un gène sain

Ex : essai de traitement de la mucoviscidose




Mises au point de nouveaux médicaments :

médicament de nature protéinique tels que l¶insuline(diabète)

insuline fabriquée par le pancréas

assure la pénétration du sucre dans la cellule manque d¶insuline = diabète héréditaire

injections d¶insuline de porc ou d¶insuline synthétique

risque d¶allergie et/ou d¶intolérance

Solutions =

fabrication d¶insuline humaine pure par des bactéries, des

levures et/ou des animaux

fiable, rapide, coût modique, quantité suffisante




Médecine préventive :

fabrication de vaccins, dont l¶efficacité et l¶innocuité sont testés

sur animaux transgéniques

Agronomie :

amélioration des espèces végétales et des espèces animales

(rendements, qualité gustative )

conférer à des plantes une résistance à certains produits

phytosanitaires (herbicides) ou a certains types d¶agressions

(froid, insectes, sécheresse, sols acides, sols salé )



Les OGMLes OGM

OGM : organisme vivant génétiquement modifié

Un organisme dont le matériel génétique a été modifié d¶une

manière qui ne s¶effectue pas naturellement par multiplication et/ou

par recombinaison naturelle (Loi N°92.654 du 13 juillet 1992)

Application directe du génie génétique

Le génie génétique permet ainsi de modifier, supprimer ouintroduire certains caractères.

Apporter une fonction nouvelle Inactiver ou augmenter une fonction déjà existant



Les OGMLes OGM

Organismes vivants :

Plantes et animaux y compris les champignons, les

bactéries, les virus

Les OGM correspondent à :

des organismes ou parties d'organismes vivants qui sont

capables de transférer ou de répliquer leur matériel génétique

et peuvent ainsi se disséminer dans l'environnement

par exemple dans le cas d'une plante, il s'agit aussi bien de

la plante entière que des fruits, graines, pollens...



Les plantes tr ansgéniquesLes plantes tr ansgéniques

Étude de l¶expression des gènes et de leur fonctionnementau cours du développement de la plante

Impact au niveau environnemental et agricole :

La protection des cultures

La résistance des plantes aux insectes

La tolérance des plantes aux herbicides

La résistance aux maladies

La résistance aux conditions climatiques extrêmes

Voir chapitre « Ingénierie des plantes »



Les animaux tr ansgéniquesLes animaux tr ansgéniques

Essentiellement des souris (99%)

Étude de souris transgéniques capables de développer

� cancers

� maladies neuro-dégénératives graves (Alzheimer,

Parkinson )

� maladies génétiques (diabète, mucoviscidose )

�maladies infectieuses (SIDA, hépatite )

BUT : reproduire les maladies humaines et les étudier

afin de trouver des traitements



Cr itèr es d¶application du génie génétiqueCr itèr es d¶application du génie génétique

La sécurité des personnes

La sécurité de l¶environnement

La nécessité de soigner

L¶absence de discrimination entre les individus

Le traitement éthique des animaux de laboratoire

Le droit de l¶être humain à la recherche et à la connaissance



II.Comment récupérer de

II.Comment récupérer del¶ADN ?l¶ADN ?



L¶ADNL¶ADN

ADN (Acide désoxyribonucléique)

Molécule présente dans toutes les cellules des êtres vivants

Formée de deux doubles brins (double hélice)

Deux extrémités différentes (3¶-OH et 5¶-P)

Action des enzymes relatives à l¶ADN ne se fait que dans un sens



Chr omosomes & ADNChr omosomes & ADN

Pendant division cellulaire :

ADN concentré en structures bien visibles au microscope

= chromosomes : vecteurs du patrimoine génétique

46 chromosomes dans le noyau des cellules humaines

ADN non condensé = longs filaments ou doubles brins formant

une échelle dont les barreaux sont des couples de molécules

A-T : Adénine ± Thymine

C-G : Cytosine ± GuanineC

A

T

G



Pr écautions à pr endr ePr écautions à pr endr e

Éviter l¶hydrolyse de l¶ADN par les endonucléases(DNAses):

DNAses endogènes (= libérées lors de la lyse des cellules)

DNAses exogènes (= en général, bactérie présentes sur la

peau)

Travailler avec des produits complexants (ex : EDTA) de

certains ions comme le Ca2+

et le Mg2+

nécessaires àl¶activité des DNAse

Travailler de manière « propre » (matériel et tampons

stérilisés, avec des gants« )



Pr écautions à pr endr ePr écautions à pr endr e

Limiter les cassures mécaniques

Eviter l¶agitation trop violente des solutions d¶ADN

Limiter la dénaturation thermique

Éviter l¶exposition de l¶ADN à des températures

supérieures à 80°C

Éviter les séjours prolongés à température ambiante

Travailler à 4°C, si possible



Extr action de l¶ADNExtr action de l¶ADN

1. Lyse cellulaire :

Utilisation de détergents (SDS, Triton X100) qui désorganisent

les membranes cellulaires (plasmiques, nucléaires )

Bactéries : ajout de lysozyme qui détruit leur paroi

Végétaux : congélation dans l¶azote liquide & broyage

(mortier)

2. Dissociation des protéines

Utilisation d¶un détergent dénaturant comme le SDS (sodiumdodécylsulfate)

Action d¶une protéase : la protéinase K




3. L¶élimination des protéines

Utilisation de solvants (phénol/chloroforme,

phénol/alcool)

Dénaturation des protéines

ADN et ARN

pr otéines

pr otéines et lipides

Phase aqueuse

Phase or ganique

(phénol-chlor ofor me)




4.

Élimination des AR N

Utilisation d¶une enzyme, la RNAse, dépourvue d¶activité

DNAse

5. Précipitation de l¶ADN :

Solution éthanol 70% et acétate de sodium Na2+ 0,1M

Obtention d¶ADN sous forme solide Laver le précipité pour éliminer les sels

Dissolution dans un tampon stérile à pH 7-8 contenant del¶EDTA

Eviter les congélations-décongélations successives de l¶ADN



Pur eté de l¶extr ait de l¶ADNPur eté de l¶extr ait de l¶ADN

R apport A260nm/A280nm : dosage au spectromètre

Spectre UV d¶absorption de l¶ADN : min 230 nm et max à

260 nm

Dosage des protéines à 280 nm

Rapport Abs260/Abs280 = qualité de l¶extrait

1,8 < Abs260/Abs280 < 2 = extrait d¶ADN pur

Abs260/Abs280 < 1,7 = présence de protéines

Abs260/Abs280 > 2 = présence d¶ARN



Pur eté de l¶extr ait de l¶ADNPur eté de l¶extr ait de l¶ADN

Spectre d¶absorption de l¶ADN dans l¶UV

absor banceContaminations

protéiques : 280 nm

phénol : 270 nm

glucides : 230 nm



Dosage de l¶extr ait d¶ADNDosage de l¶extr ait d¶ADN

Dosage par absorptiométrie UV de la concentration en ADN

mesure effectuée à 260 nm

ADN pur double brin : 1 unité d¶absorbance correspond à 50µg/mL

Concentration en ADN :

[ADN] en µg/mL = A260nm x 50 x facteur de dilution



Dosage de l¶extr ait d¶ADNDosage de l¶extr ait d¶ADN

Estimation de la concentration en ADN par fluorescence en

présence de BET

BET (bromure d¶éthidium) : s¶intercale entre les bases de l¶ADN

et fluoresce sousU

V.Intensité de la fluorescence est proportionnelle à la concentration en

ADN

Dosage fluorimétrique :

Technique sensible mais nécessite l¶utilisation d¶un fluorimètre.

Dosage de l¶ADN en présence de BET et comparaison avec solution

standards



Extr action de l¶ADN plasmidiqueExtr action de l¶ADN plasmidique

Plasmide bactérien

Petite molécule d¶ADN

Bicaténaire

Circulaire

Extra-chromosomique

Réplication indépendante du génome de l¶hôte Vecteurs les plus fréquents de l¶ADN cloné en génie

génétique

plasmide

ADN

bactérie




En résumé, 3 grandes étapes :

1. Croissance des bactéries

Amplification des plasmides :

Chloramphénicol : antibiotique ajouté en fin de phase

exponentielle

Il arrête la synthèse protéique, tandis que les plasmides

continuent de se répliquer




2. Lyse des bactéries = libération des plasmides

Idem extraction ADN génomique mais séparation de l¶ADNplasmidique de l¶ADN génomique

Obtention d¶une solution avec ADN pré-purifié = lysat clair

3. Purification de l¶ADN plasmidique

élimination des protéines résiduelles (phénol /

chloroforme)

hydrolyse de l¶ARN (RNAse)



III. Comment IsolerIII. Comment Isolerun gène ?un gène ?

I. Introduction au génie génétique

II. Comment récupérer l¶ADN ?



ADN : ressemble à une pelote

visqueuse.

Comment isoler un gène de

cet enchevêtrement de fils ?

ADN de méduse

Comment isoler un gène ???Comment isoler un gène ???



Technologie de l¶ADN r ecombinantTechnologie de l¶ADN r ecombinant

Population de bactér ies

tr ansgéniques pr oduisant

la pr otéine r ecombinée

ADN r ecombinant

Enzyme de r estr iction

ADN à cloner bactér ie

ADN

plasmideADN



1.

Les enzymes1

.

Les enzymesutilisées en génétiqueutilisées en génétique



Les enzymes utilisées en génétiqueLes enzymes utilisées en génétique

Couper l¶ADN = nucléases

Coller l¶ADN = ligases

Recopier l¶ADN = ADN polymérase

Modifier l¶ADN = phosphatase, kinases «



1.1. Les enzymes de coupur es : les nucléases1.1. Les enzymes de coupur es : les nucléases

Exonucléases

Endonucléases

Coupe l¶ADN = simple ou double brin

Nombre de brins coupés = 1 ou 2 brins

Extraites de diverses souches bactériennes



phage

Endonucléases

ADN bactérienbactérie



Exonucléases nonExonucléases non--spécifiquesspécifiques

Exo III : exonucléase double brin, coupe à l¶extrémité 3¶ 5¶

Exo L : exonucléase double brin, coupe à l¶extrémité 5¶ 3¶



Endonucléases nonEndonucléases non--spécifiquesspécifiques

La DNAse : endonucléase qui peut couper l¶ADN double brinou simple brin au hasard.

Si Mn2+, attaque les deux brins de l¶ADN

Si Mg2+, attaque chaque brin d¶ADN indépendamment



Endonucléases spécifiques : les enzymes deEndonucléases spécifiques : les enzymes de

r estr ictionr estr iction

Enzyme de type I : l¶enzyme reconnaît la séquence, se

déplace sur l¶ADN et coupe de manière aléatoire

1000 à 4000 paires de base plus loin.

Seules les enzymes de type II sont utilisées en géniegénétique

Enzyme de type II : coupe au niveau de la séquencereconnue

Enzyme de type III : l¶enzyme reconnaît la séquence et

coupe l¶ADN 20 à 25 paires de base plus loin



Nucléases spécifiques : les enzymes de r estr ictionNucléases spécifiques : les enzymes de r estr iction

fragment de restriction

palindrome (RADAR, KAYAK )

SmaIBouts francs =

EcoRI

Bouts collants » avec des extrémités cohésives =




5¶-GAATTC-3¶

3¶-CTTAAG-5¶

5¶-G AATTC-3¶

3¶-CTTAA

G-5

Exemple de l¶enzyme EcoR IExemple de l¶enzyme EcoR I




1ère lettre : majuscule, initiale du genre de la bactérie

E : genre escheri chia

2ème et 3ème lettres : minuscules, désigne l¶espèce de la bactérie co : espèce c oli

4ème lettre : pas toujours présente, désigne la souche bactérienne R : souche RY13

Un chiffre romain : ordre de découverte

I : première enzyme isolée

Exemple EcoR I :

Nomenclature des enzymes de restrictionNomenclature des enzymes de restriction




Visualisation des fragments de restriction en gel d¶agarose

Gel d¶agarose

Cuve d¶électrophorèse



Électr ophor èse des f r agments de r estr ictionÉlectr ophor èse des f r agments de r estr iction

MT321

1: enzyme de restriction 1

2: enzyme de restriction 2

3: ADN non digéré

MT: marqueur de taille



Car te de r estr ictionCar te de r estr iction



Applications : la technique RFLPApplications : la technique RFLP

Technique RFLP: polymorphisme de restriction de l¶ADN.

(restriction fragment length polymorphism):

Technique d¶analyse de la séquence d¶ADN:

des substitutions

des délétions

des insertions

des modifications entre deux séquences proches



Applications : la technique RFLPApplications : la technique RFLP



1.2. Les enzymes qui lient : les ligases1.2. Les enzymes qui lient : les ligases

Ligase



1.2. Les enzymes qui lient : les ligases1.2. Les enzymes qui lient : les ligases

liaison phosphodiester entre extrémités 5¶ et 3¶

effectuent des ligatures sur des fragments d¶ADN

avec

bouts francs des bouts collants (ou extrémités cohésives)

ligases plus efficaces en face d¶extrémités cohésives



1.3. Les enzymes de synthèse1.3. Les enzymes de synthèse

Enzymes qui recopie une chaîne d¶ADN

a. Les ADN polymérasesa. Les ADN polymérases classiquesclassiques »»

Synthèse du nouveau brin dans le sens 5¶ J 3¶

Synthèse complémentaire et antiparallèle

Nécessite la présence de dNTPs : dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Possède les deux activités exonucléasiques :5¶ 3¶ 3¶ 5¶




Fragment de KLENOW :Fragment de KLENOW :

enzyme préparée à partir de l¶ADN polymérase I

propriétés polymérasiques

propriétés exonucléasiques 3¶ 5¶

ne possède plus d¶activité exonucléasique 5¶ 3¶ = évite de dégrader l¶ADN synthètisé




Permet l¶obtention d¶un ADNc à partir d¶un ARN messager

b. La reverse transcriptase (R T)b. La reverse transcriptase (R T)

ARN dépendante

Pas d¶activité exonucléase 3¶ 5¶

Possède une activité RNAse




c. La Taq polymérasec. La Taq polymérase

ADN polymérase isolée de bactéries vivant dans des sources

d¶eau chaudes = thermostables (75-80 °C)

Pas d¶activité d¶édition :

= mésappariements (1/100 bases)

Utilisation principale = PCR (polymerase chain reaction)



1.4. Les enzymes qui modifient l¶ADN1.4. Les enzymes qui modifient l¶ADN

a. Terminal désoxya. Terminal désoxy--nucléotidylnucléotidyl--transférasestransférases

+ dGTP + dCTPterminaltransferase

ADN




a. Terminal désoxya. Terminal désoxy--nucléotidylnucléotidyl--transférasetransférase

Enzyme qui permet d¶ajouter des nucléotides à l¶extrémité 3¶

de l¶ADN

Ajout d¶au moins 3 nucléotides identiques

Ne nécessite pas de modèle

Technique de « queuttage » pour obtention d¶extrémités cohésives




b. Les kinasesb. Les kinases

utilisé pour marquer l¶ADN :Incorporation de phosphore radioactif (P32) sur l¶extrémité 5¶ d¶un

acide nucléique.

enzymes qui phosphorylent

transfert d¶un groupement phosphate à partir d¶une molécule d¶ATP

transfert à l¶extrémité 5¶




c. Les phosphatasesc. Les phosphatases




hydrolyse le groupement phosphate situé en 5¶

c. Les phosphatasesc. Les phosphatases

large spécificité de ces enzymes

réaction irréversible

utilisées pour préparer de l¶ADN recombinant




topoisomérases II : coupent deux brins d¶ADN

d. Les topoisomérasesd. Les topoisomérases

enzyme qui modifient le nombre d¶enlacements de l¶ADN

capable d¶introduire ou d¶éliminer des supertours dans

la double hélice

couper 1 ou 2 brins d¶ADN pour modifier le nombre de

supertours puis le reconstitue

topoisomérases I : coupent un seul brin d¶ADN



Enzymes : conclusionsEnzymes : conclusions

4 grandes familles d¶enzymes + quelques autres

origine biologique (virus, bactéries, plantes )

activité précise ADN = cible des ces enzymes

molécules qui aident à isoler les gènes

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