1

LE CYCLE CELLULAIRE

2

III - Contrôle intra-cellulaire des événements du cycle

cellulaire

3

Objectif

• Complexe Cdk - cycline = facteur de déclenchement des événements du cycle– Comment ? – Dans le bon ordre– Une seule fois par cycle

• Quatre événements– Réplication de l’ADN en phase S et blocage de la re-

réplication– Entrée en phase M– Séparation des chromatides– Sortie de la mitose

4

Les trois grands acteurs

1. Complexe S-Cdk = – Cycline A + Cdk2 chez les vertébrés– Clb 5, 6 + Cdk 1 chez la levure

2. Complexe M-Cdk =– Cycline B + Cdk 1 (ex Cdc 2 !) chez les

vertébrés– Clb 1, 2, 3, 4 +Cdk 1 chez la levure

3. Anaphase Promoting Complexe (APC)

5

Quatre événements, quatre acteurs, quatre paragraphes

A Complexe S-Cdk Réplication de l’ADN en phase S et blocage de la re-réplication

B Complexe M-Cdk Entrée en mitose

CAnaphase Promoting Complexe (APC)

Séparation des chromatides sœur à la transition métaphase anaphase

D Complexe M-Cdk Sortie de la mitose

E

F

Sic1 et Hct1

Comment initialiser la phase S

Phase G1 : inactivité stable de Cdk

6

Table 17-1

Composition de S-Cdk et M-Cdk des vertébrés et des levures bourgeonnantes

7

A - Complexe S-Cdk

Réplication de l’ADN en phase S et blocage de la re-réplication

8

Expériences de fusion cellulaire

• G1 + S G1 se réplique S contient S-Cdk• G2 + S Pas de synthèse d’ADN en G2• G2 + G1 Pas de synthèse d’ADN en G1

9

Fig 17-21

• Expériences (1970) de fusion cellulaire

10

Origin Recognition Complex (ORC)

• Gros complexe multiprotéique qui se fixe sur l’origine de réplication (chez la levure)

• Puis addition de nombreuses protéines régulatrices supplémentaires dont Cdc 6

11

• Taux bas pendant le cycle cellulaire

• Augmentation transitoire en début de G1

• Se fixe à ORC

• Nécessaire à la liaison de protéines proches, les Mcm

Cdc 6

12

Protéines Mcm(Minichromosome Maintenance)

• Maintien des minichromosomes circulaires dans la levure (en fait des plasmides)

• Se fixent à ORC grâce à Cdc 6• ORC + Cdc 6 + Mcm = pre-replicative

complexe

13

Lei,M2001p1447: Initiating DNA synthesis: from recruiting to activating the MCM complex.

J Cell Sci 2001,114

Fig. 1. Initiating DNA synthesis, from recruitment to activation of the MCM complex. (A) Assembly of the pre-RC begins during the G1 phase, when Cdc6 and Cdt1 are recruited to replication origins to which ORC and Mcm10 bind. (B) Cdc6 and Cdt1 facilitate the loading of the MCM complex. Anchoring of the MCM complex is mediated through interaction between individual subunits of the MCM complex and multimers of the Mcm10 protein. Cdc6 is removed from origins once the MCM complex is recruited. The Cdc7-Dbf4 kinase is also recruited to the origin during G1 phase. (C) Phosphorylation of the MCM complex by Cdc7-Dbf4 occurs during S phase and is controlled locally at individual origins. Phosphorylation of the MCM complex is coupled to a conformational change in the complex that results in the melting of origin DNA. ORC and Mcm10 are hidden from view. (D) This conformational change is believed to convert the inactive MCM complex into the enzymatically active helicase, whose ring-shaped structure becomes topologically linked to DNA (Tye and Sawyer, 2000). Recruitment of Cdc45 requires both the phosphorylation of the MCM complex and the activity of CDKs. Disassociation of the MCM helicase by Cdc45 from the Mcm10 anchor initiates the melting of DNA and recruits RPA, DNA polymerase a, and primase to the origins for the initiation of DNA synthesis. (E) The melting of the dsDNA induces a conformational change in ORC before replication origins assume a post-replication chromatin state. Like the ORC, Mcm10 is believed to remain bound to origins throughout the cell cycle.

Initialisation de la synthèse d'ADN, depuis le recrutement jusqu'à l'activation du complexe MCM

14

Mol Cell Volume 21, Issue 2 , 20 January 2006, Pages 143-144 Christin A. Cvetic and Johannes C. Walter Getting a Grip on Licensing: Mechanism of Stable Mcm2-7 Loading onto Replication Origins

• A Model for Mcm2-7 Loading by the ORC and Cdc6 ATPases • ATP bound ORC first binds origin DNA. Cdc6 then binds ORC and ATP. Cdt1 and Mcm2-7 (possibly as a complex) associate

with ORC and Cdc6 at the origin. ATP hydrolysis by Cdc6 leads to the loading of Mcm2-7 complexes on DNA and the release of Cdt1 from the origin. Cdc6 association is destabilized by Cdc6 ATP hydrolysis. ATP hydrolysis by ORC completes the Mcm2-7 loading reaction allowing further rounds of Mcm2-7 loading.

15

Fig 17-22

• Constitution du pre-replicative complexe (pre-RC)

L’origine de réplication est prête à déclencher la réplication

16

Arrive l’activation de S-Cdk

Deux actions "contraires"

1 - Déclenchement de la réplication

2 - Blocage de la re-réplication

17

1 - Déclenchement de la réplication

• Déclenchement par S-Cdk en fin de G1

• Phosphorylation de ORC par S-Cdk et une autre protéine kinase

18

2 - Blocage de la re-réplication par S-Cdk

• Par la dissociation de Cdc 6 du ORC (donc plus de pre-RC plus de réplication)

• Phosphorylation de Cdc 6 ubiquitinylation par le complexe SCF dégradation de Cdc 6 dans un protéasome

• Phosphorylation de protéines Mcm exportation hors du noyau (intervention de G1/S-Cdk)

19

Fig 17-22• Arrive l’activation de

S-Cdk :1 - Déclenchement de

la réplication

2 - Blocage de la re-réplication par S-Cdk

20

Inhibition de la re-réplication de l'ADN : intervention des autres Cdk pendant les

autres phases du cycle cellulaire• S-Cdk

– Activité élevée pendant G2 et mitose précoce– Empêche la re-réplication quand S est terminée

• Pendant la mitose– M-Cdk

• phosphoryle Cdc 6 et les protéines Mcm• donc empêche la re-réplication

• En fin de G1– Aide à l'exportation des Mcm hors du noyau par

G1/S-Cdk

21

• Réponse :

• A la fin de la mitose, toutes les activités Cdk sont ramenées à zéro

• Déphosphorylation de Cdc 6 et Mcm • Réassemblage de pre-RC (pre-replicative

complexe)

Comment se fait la réplication au cycle suivant ?

22

B - Complexe M-Cdk

Entrée en mitose

23

M-Cdk

• Accumulation de M-cycline (= cycline B des vertébrés)– Par diminution de sa dégradation– Par augmentation de la synthèse

• Accumulation de M-Cdk (= M-cycline + Cdk 1)• Cdk est soumis à deux régulations (c'est l'inhibition

qui l'emporte)– CAK qui phosphoryle et active– Wee 1, protéine kinase qui exerce une phosphorylation

inhibitrice à deux sites voisins

24

• Accumulation de M-Cdk prêt à agir mais inhibé par la double phosphorylation inhibitrice maintenue par Wee 1

• En fin de G2 activation de Cdc 25 (protéine phosphatase)

• Qui retire les deux phosphates inhibiteur de M-Cdk

• En même temps l'activité de la kinase inhibitrice Wee1 est supprimée

M-Cdk

25

Qu'est ce qui active Cdc 25 ?

• Deux protéine kinases– Kinase Polo– M-Cdk elle-même et M-Cdk phosphoryle et inhibe

Wee 1

• M-Cdk– Active son activateur (Cdc 25)– Inhibe son inhibiteur

• Feed back positif activation de tous les complexes M-Cdk de la cellule explosion d'activité M-Cdk

26

Fig 17-23

• Activation de M-Cdk

(Dont la concentration augmente progressivement)

•Il y a phosphorylation de M-Cdk en plusieurs endroits :

•Sur un site d’activation par CAK•Sur une paire de sites inhibiteur par Wee 1 kinase

•L’inhibition l’emporte ( M-Cdk est inactive)

polo

27

• Permet d'éviter de faire entrer en mitose des cellules qui n'ont pas répliqué tout l'ADN

• Comment ?– Soit détection de l'ADN non répliqué– Soit détection d'une fourche de réplication en

activité

• Bloque l'activation de M-Cdk (signal négatif)

Point de contrôle de la réplication de l'ADN

28

• Hydroxyurée : bloque la synthèse de l'ADN activation d'un point de contrôle pas d'entrée en mitose (signal négatif)

• Caféine à fortes doses : bloque le point de contrôle (signal négatif)

• Hydroxyurée + caféine entrée en mitose malgré un ADN incomplètement répliqué ("mitose suicide")

Expériences

29

Fig 17-24

• Point de contrôle de la réplication de l'ADN

30

• A elle seule, elle déclenche tous les processus d'entrée en mitose– Assemblage du fuseau– Attachement des chromosomes au fuseau– Condensation des chromosomes (condensines) (…)– Fragmentation de l'enveloppe nucléaire (lamina nucléaire)– Réarrangement des filaments d'actine– Réorganisation du Golgi– Réorganisation de reticulum endoplasmique– Réorganisation des microtubules

• Tout se fait par des phosphorylations de protéines spécifiques de l'événement

Rôles de M-CdkC’est M-Cdk qui fait tout ça !

31

Fig 4-56

• (…) Condensines : complexe de 5 protéines qui condensent le chromosome

• Phosphorylation par M-Cdk

32

C - Anaphase Promoting Complexe (APC)

Séparation des chromatides sœur à la transition métaphase anaphase

33

Séparation des chromatides sœur

• A la transition métaphase – anaphase• Déclenchement par M-Cdk puis• complexe Anaphase Promoting Complex

(APC)• Perte soudaine de la cohésion entre les

chromatides par activation de APC

Rappel : les deux plus importantes ubiquitine ligases :1. Complexe SCF

(Skp1–Cul1–FBP [F box protein])2. APC

(anaphase promoting complex)

34

Anaphase Promoting Complex (APC)

• Ubiquitine ligase

• Complexe très différent de M-Cdk

35

Fig 17-20 B

• Anaphase Promoting Complex (APC)

36

Fig 18-3

• Cohésines (liaison des chromatides sœur)

• Condensines (condensation des chromosomes)

37

Fig 17-25

• Nécessité de la dégradation des protéines– A Inhibiteur d'APC– B Ajout de M-cycline non dégradable la destruction de M-cycline est

• non indispensable à la séparation des chromatides• Indispensable à la sortie de mitose

38

Sécurine

• Cible de APC

• Avant l'anaphase se lie et inhibe la séparase

39

Séparase

• Protéase

• Inhibée par la sécurine

40

Réaction

• Activation de APC par Cdc 20 (cf infra)• Destruction de la sécurine • Libération de la séparase • Phosphorylation du complexe cohésine

(médiée par polo kinase) • Clivage du complexe cohésine • Les chromatides perdent leur cohésine

et se séparent

41

Déclenchement de l'activation de l'Anaphase Promoting Complex

(APC)• Nécessité de Cdc 20

42

Fig 17-26

Déclenchement de la séparation des chromatides par APC

43

Régulation de Cdc 20

1. Synthèse qui augmente à l'approche de la mitose (par augmentation de la transcription)

2. Phosphorylation de APC

44

Quelles kinases phosphorylent et activent le complexe Cdc 20 – APC ?

• Quelles kinases phosphorylent et activent le complexe Cdc 20 – APC ?– M-Cdk ? Oui mais phase de latence– Autre ?– Inconnu et pourtant étape clé dans le déclenchement de

l'anaphase pendant la phase M

45

Point de contrôle de l'attachement du fuseau

• Vérifie que tous les chromosomes sont attachés correctement au fuseau

• Se fait sur le kinétochore

• Un kinétochore mal attaché envoie un "signal négatif" qui bloque l'activation de Cdc 20 – APC

• Quel "signal négatif" ?

46

Nature du signal négatif

• Mad2– Se fixe sur un kinétochore libre– Nécessaire au fonctionnement du point de contrôle

• Un seul kinétochore libre entraîne– la liaison de Mad2 et l'inhibition de Cdc 20 – APC– donc l’inhibition de la destruction de sécurine, – donc l’inhibition de l’activation de séparase– donc l’inhibition de la séparation des chromatides

etc…

47

Fig 17-27

• Prométaphase de cellule de mammifère– Fuseau mitotique

(vert)– Chromatides sœur

(bleu)

• AC anti Mad2 (rouge) sur le kinétochore de la seule chromatide non attachée

48

J. Cell Biol., Volume 141, Number 5, June 1, 1998 1181-1191.Localization of Mad2 to Kinetochores Depends on Microtubule Attachment, Not Tension Jennifer C. Waters, Rey-Huei Chen, Andrew W. Murray, and E.D. Salmon

Mad2 quitte les kinétochores au fur et à mesure que les MT s'y accumulent. On a marqué des cellules mitotiques PtK1

avec des AC dirigés contre Mad2 (orange/rose), contre la tubuline (vert),

et l'ADN a été coloré au Hoechst 33342 (bleu).)

(A) Juste après la rupture de l’enveloppe nucléaire. Flèches blanches, accumulation de Mad2 sur les

kinetochores; pointes de flèches blanches, Mad2 sur des résidus

d’enveloppes nucléaires.(B) Prométaphase précoce.

Green arrowhead, kinetochore fibers are visible as bright dense bundles of green microtubules that end abruptly on a chromosome;

white arrowhead, spindle pole.(C) Milieu de prometaphase.

White arrowhead, Mad2 on kinetochore microtubules.

(D) Prometaphase tardive.(E) Métaphase.(F) Anaphase.

Yellow arrows, newly attached leading kinetochores on congressing chromosomes label brightly for Mad2;

purple arrows, trailing kinetochores on attached kinetochores label less brightly;

green arrows, attached kinetochores that lack Mad2; and

red arrows, attached kinetochores on which some Mad2 is still visible.

49

Point de contrôle de la chronologie de l'anaphase

• Il n'y en a pas

• Si mutation du point de contrôle de l'attachement du fuseau, la chronologie de l'anaphase est normale (ou légèrement retardée chez les mammifères)

50

D - M-Cdk

Sortie de la mitoseMitosis Exit Network (MEN)

51

Sortie de la mitose

• Après la ségrégation de l'anaphase,

• Il faut tout refaire en sens inverse :–Désassemblage du fuseau

–Décondensation des chromosomes

–Reconstruction de l'enveloppe nucléaire

52

Sortie de la mitose

• Entrée en mitose phosphorylation • Sortie de mitose déphosphorylation

des mêmes protéines • Hypothèses :

– Inactivation de M-Cdk (le plus important) …

– Activation de phosphatases

– Les deux

53

Inactivation de M-Cdk

• Ubiquitinylation des cyclines M…

• … activées par le même complexe Cdc20-APC que celui qui détruit la sécurine à la transition métaphase – anaphase

54

Fig 17-20• Ubiquitinylation de la

cycline M par APC (anaphase promoting complex)

55

Résumé sur Cdc20-APC

• Conduit à l'anaphase

• Conduit à l'inactivation de M-Cdk donc la sortie de mitose

56

• L'inactivation de M-Cdk est due presque uniquement à l'action de Cdc20-APC

• M-Cdk stimule l'activité de Cdc20-APC• "M-Cdk active sa propre destruction"

Le "paradoxe" de M-Cdk en fin de mitose

Inactiv

atio

n d

e

M-C

dk

12

3

4

57

E - Phase G1 : Hct1 et Sic1

Inactivité stable de Cdk

58

(a) Embryon précoce sans phase G1

• Les deux données de base– (Cdc20-APC inactive M-Cdk)– (M-Cdk stimule Cdc20-APC)

• M-Cdk est haut • Cdc20-APC augmente • M-cycline (de M-Cdk) diminue • inactivation de APC • La cellule peut à nouveau accumuler

de la M-cycline rapidement

59

Fig 17-28A

• Création d’une phase G1 stable : cellules d’embryon précoces sans phase G1

étaphase

(a) Embryon précoce sans phase G1

60

(b) Cellules dont le cycle comporte une phase G1

• L’accumulation rapide de cycline n’est pas nécessaire

• Il faut laisser le temps à la cellule de croître

• Il faut éviter la réactivation de M-Cdk à la fin de la mitose plusieurs mécanismes

1. Protéine Hct1

2. Protéines CKI (cdk inhibitor protein)

3. Baisse de la transcription des gènes de cycline M

61

Les trois mécanismes pour supprimer l’activité de M-Cdk en G1

1. Protéine Hct1 ( Cdc 20)

2. Augmentation de la production de protéines CKI (Cdk inhibitor protein eg Sic 1)

3. Baisse de la transcription des gènes de cycline M

62

1 - Protéine Hct1

• Proche de Cdc 20• Active APC comme Cdc 20• Toutefois

– Cdc 20-APC est activé par M-Cdk (accélérant la destruction de M-Cdk)

– Hct1 est inhibé par M-Cdk qui la phosphoryle directement

• Hct1-APC augmente en mitose tardive après la destruction de M-cycline par Cdc 20-APC la destruction de la cycline M continue après la mitose :

• Bien que l’activité de Cdc 20-APC ait baissé l’activité de Hct1-APC reste élevée

63

• Création d’une phase G1 stable dans des cellules avec phase G1

Fig 17-28B

64

Cellules avec phase G1

• La chute d’activité de M-Cdk en fin de mitose (à cause de Cdc20-APC)

• conduit à l’absence de baisse de Hct1-APC (parce que M-Cdk inhibe Hct1-APC [levée d’inhibition])

• Garantissant une suppression continue de l’activité de M-Cdk après la mitose (parce que Hct1 active APC qui détruit la cycline M)

65

2 - Augmentation de la production de protéines CKI (Cdk inhibitor protein)

• Rappel : régulation fine de Cdk :

• 2 - protéines inhibitrices– Protéines

inhibitrices de Cdk "Cdk inhibitor proteins" (CKIs)

– Agissent sur le site actif de Cdk

• Exemple de CKI : Sic1

• Rappel : inhibition du complexe cycline A - Cdk2 humain par une CKI (p27)

66

Sic1

• C’est une Cdk Inhibitor protein (CKI)• Étudiée chez la levure bourgeonnante • Inactive M-Cdk en fin de mitose• Inactivée par M-Cdk (comme Hct1)• M-Cdk

– inhibe Sic1– Inhibe un gène de synthèse de Sic1 diminution de la production

• Inhibition mutuelle de M-Cdk et Sic1– Sic1 inhibe M-Cdk– M-Cdk inhibe Sic1

• Comme pour M-Cdk et Htc1 (inhibition mutuelle)

67

3 - Baisse de la transcription des gènes de cycline M

• Normalement M-Cdk active les gènes de cycline feed back positif

• Mais en fin de mitose– Hct1 et Sic1 inactivent M-Cdk – Diminution de la transcription des gènes de

cycline

68

Résumé des trois mécanismes

• L’activité de M-Cdk est supprimée par– L’activation de Hct1-APC– L’accumulation de CKI

• Sic1 chez la levure

• p27 chez les mammifères

– La diminution de production de cycline

mécanisme robuste…

• Comment en sortir ??– Il faut la synthèse de cycline G1 (cf. infra)

69

F - Comment initialiser la phase S

• Accumulation de cycline G1–Non détruites par Hct1-APC

–Non inhibée par Sic1 • Accumulation de G1-Cdk

71

Conséquences de l’augmentation du complexe G1-Cdk

• Déclenche la transcription des gènes de la cycline G1/S • G1/S augmente • Formation de complexes G1/S-Cdk (qui sont résistants à

Hct1-APC et Sic1) qui– Font entrer la cellule en phase S– Stimulent la transcription des gènes de cyclines S et la formation

de complexes S-Cdk

• Ces complexes S-Cdk sont inhibés par Sic1• Mais G1/S-Cdk phosphoryle et inactive Sic1 (et Hct1-APC)

• Activation de S-Cdk

72

Conclusion sur le passage d’un G1 stable à S

• C’est la même boucle qui – déclenche l’inactivation de M-Cdk en

mitose tardive

– et qui active rapidement et complètement S-Cdk en fin de G1

• mais en sens inverse

73

Cardozo,T2004p739 Nat Rev Mol Cell Biol

• Cyclin-dependent kinases (CDKs) represent both the engine and the pacemaker of the cell cycle. It is now clear that proteolysis is a significant force that imposes the required checks and balances on this engine. During G1, Cdk1 and Cdk2 need to be idle to avoid premature DNA synthesis and mitosis (see figure, panel a). Starting at the G1–S checkpoint — the point at which DNA replication and centrosome duplication begins — Cdk2 markedly increases its activity (see figure, panel b). The activity of Cdk2, and therefore the phosphorylation of its substrates, builds to a peak through the DNA-synthesis and centrosome-duplication phase into G2, at which point the activity of Cdk2 is attenuated again. The coincidence of peaking Cdk2 activity and peaking activity of the DNA-replication and centrosome-duplication machinery indicates that Cdk2 somehow releases and maintains the nuclear environment that is necessary for the synthetic machinery to function. Although Cdk2 seems to be the optimal agent for this purpose, it is not absolutely required. Low Cdk1 activity and/or the action of other CDKs contribute to these processes, and can accomplish them in the absence of Cdk2, at least under normal cellular conditions3.

CDK activity profilesCardozo,T2004p739 Nat Rev Mol Cell Biol

75

Protéine Rb

• Rappel : suppression de l'activité de M-Cdk en G1 par– Activation de Hct1– Accumulation de CKI

• Sic1 chez la levure• p27 chez les mammifères

– Inhibition de la transcription des gènes de cycline

• Activation du complexe G1-Cdk en fin de G1– Inversion des 3 mécanismes

76

G1-Cdk

• Les effets les mieux connus de G1-Cdk sont médiés par E2F

77

E2F

• Protéine régulatrice de gène

• Sert de médiateur à l'activité de G1-Cdk

• Se fixe sur des promoteurs d'ADN codant pour des protéines nécessaires à l'entrée en phase S dont les cyclines G1/S et S

• E2F est contrôlé par la protéine du rétinoblastome Rb

79

Fig 17-30

• Contrôle de l'initiation de la phase S dans les cellules animales– Phosphorylation de Rb par G1-Cdk inactivation de Rb – Libération de E2Fqui active la transcription des gènes de la phase S

dont G1/S-cycline et S-cycline qui augmentent donc et augmentent la phosphorylation de Rb

– Feed back positif. (Autre feed back positif de E2F sur lui-même)

G1-Cdk = cycline D - Cdk4G1/S-cycline = cycline ES-cycline = cycline A

80

Les boucles de feed back

• E2F augmente sa propre synthèse (positif)

• E2F transcription de G1/S cycline et S-cycline activité de G1/S-Cdk et S-Cdk phosphorylation de Rb libération de E2F transcription de G1/S cycline et S-cycline activité de G1/S-Cdk et S-Cdk phosphorylation de Rb libération de E2F etc… (positif)

• Activation de G1/S-Cdk et S-Cdk phosphorylation de Hct1 et p27 destruction de G1/S-Cdk et S-Cdk (négatif)

81

Résultat final

• Activation rapide et complète du complexe S-Cdk nécessaire à l'initiation de la phase S

82

Rétinoblastome• Cancer de la rétine chez l'enfant

• La perte des deux copies du gène Rb1 conduit à une prolifération excessive de la rétine immature

• La perte complète du gène est compensée au début – par Hct1 et p27 dans les autres types de cellules– Et des protéines proches de Rb

83

DeGregori,J2004p3411

DeGregori, J. J Cell Sci 2004;117:3411-3413

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84

DeGregori,J2004p3411

85

Coordination croissance prolifération

• Nécessité d’une phase suffisamment longue pour multiplier le nombre de molécules par deux– Cycle trop court cellule trop petite– Cycle trop long cellule trop grosse

rôle de l’environnement sur le cycle• Grâce à cycline 3 (Cln3 chez la levure

cycline D des vertébrés)

86

Fig 17-31

• Contrôle de la taille de la cellule (levure) via le cycle cellulaire en cas de nutrition insuffisante– A Si taux de

division cellulaire constant diminution de la taille de la cellule

– B La cellule ralentit le cycle pour maintenir sa taille

87

Cycline Cln3 chez la levure ( cycline D des vertébrés)

• C’est une cycline G1• Taux de synthèse parallèle à la croissance de la

cellule (la quantité augmente mais la concentration reste constante)– Si on augmente artificiellement Cln3 la cellule se divise en

deux cellules plus petites– Si on diminue artificiellement Cln3 la cellule se divise en

deux cellules plus grosses

la cellule entre en division à partir d’un certain seuil de Cln3

88

Comment gérer la quantité de Cln3 plutôt que sa concentration ?

• Hypothèse : la cellule aurait hérité d’une quantité fixe d’un inhibiteur qui se lierait et bloquerait l’activité de Cln3

• Quand Cln3 dépasse l’inhibiteur, elle déclenche l’activation de G1-Cdk nouveau cycle

• Nature de cet inhibiteur en quantité constante ?– ADN lui-même ?– Ou protéine liée à l’ADN ?

89

Fig 17-32

• Coordination croissance cycle cellulaire (prolifération) : hypothèse– Nombre fixe de protéines liées à l’ADN et qui inhibent Cln3– Quand la cellule croît le nombre de molécules de Cln3

augmente seuil activation de Cdk

• Expliquerait pourquoi les cellules polyploïdes sont plus grosses

90

Exceptions à la coordination croissance prolifération

• Levure : la croissance se fait en fonction des nutriments extérieurs

• Cellule animale : présence de signaux qui stimulent croissance et prolifération

• Croissance et prolifération peuvent évoluer de façon indépendante – Croissance sans division ou– Division sans croissance

• Œuf de xénope– Au début (avant fécondation) croissance sans division – Puis (après fécondation) division sans croissance

91

Les points de contrôle des dommages de l’ADN

• Il existe des points de contrôle de l’intégrité de l’ADN

– Si l’ADN est altéré il faut attendre qu’il soit réparé avant de le répliquer

– au moins deux points de contrôle pour stopper le cycle 1. Un en fin de G1 (bloque l'entrée en phase S)

2. Un en fin de G2 (bloque l'entrée en mitose)

92

1 - Point de contrôle en fin de G1 pour bloquer l'entrée en phase S

• Au point G1 tardif : inhibition de l'activation des complexes G1/S-Cdk et S-Cdk

• eg : Altération de l'ADN * activation de la protéine régulatrice de gène p53 qui stimule la transcription de gènes dont la CKI p21 qui se lie à G1/S-Cdk et S-Cdk et inhibe leur action blocage de l'entrée en phase S

• Comment ?? Par un mécanisme indirect

93

Comment une altération de l'ADN active-t-elle p53 ?

• Dans une cellule normale :– p53 est instable et à faible concentration car interagit avec

Mdm2 qui se comporte comme une ubiquitine ligase

• Si lésion de l'ADN– Activation de protéines kinases qui phosphorylent p53 – Affaiblissement de sa liaison avec Mdm2 – Diminution de la dégradation de p53 – Augmentation de la p53 dans la cellule – Activation de CKI (p21) etc… cf. supra

94

Proto-Oncogene Proteins c-mdm2

• An e3 ubiquitin ligase that– interacts with and– inhibits tumor suppressor protein p53.

• Its ability to ubiquitinate p53 is regulated by tumor suppressor protein p14arf.

95

Int J Biochem Cell Biol. 2007;39(7-8):1476-82.MDM2 and MDM4: p53 regulators as targets in anticancer therapy.Toledo F, Wahl GM.

• A dynamic model of the p53 response integrating the distinct and complementary roles of MDM2 and MDM4.• (a) In unstressed cells p53 is kept at low levels (due to MDM2-mediated degradation) and inactive (primarily due to

MDM4-mediated occlusion of the p53 TAD). In this diagram, p53 stability is represented by a blue circle and p53 activity by a green star, and MDM2 (2) and MDM4 (4) levels are represented by red and orange ovals, respectively.

• (b) After stress, MDM2 degrades itself and MDM4: a transcriptional stress response (diagrammed below) is mounting.• (c) Increased MDM2 levels, resulting from p53 activation, lead to a more efficient MDM4 degradation, enabling full p53

activation: the transcriptional response is maximal.• (d) Following stress relief, accumulated MDM2 targets p53 again, and as MDM4 levels also increase, p53 activity

decreases, so that the stress response is fading. This may allow cell cycle re-entry (grey arrow). As discussed in the text, the switch that makes MDM2 preferentially target p53 for degradation in unstressed cells (a), then target itself and MDM4 after stress (b and c) then target p53 again after stress relief (d) is proposed to result from the regulated deubiquitination of p53, MDM2 and MDM4 by HAUSP, a process also involving the adaptor protein Daxx.

A dynamic model of the p53 response integrating the distinct and complementary roles of MDM2 and MDM4

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Fig 17-33

• Blocage en G1 par une lésion de l'ADN

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Moll,UM2003p1001(fig1)

• Molecular Cancer Research Vol. 1, 1001–1008, December 2003• Ute M. Moll and Oleksi Petrenko• The MDM2-p53 Interaction• FIGURE 1. Regulation of p53 by MDM2. p53 and MDM2 form an

autoregulatory feedback loop. p53 stimulates the expression of MDM2; MDM2, in turn, inhibits p53 activity because it stimulates its degradation in the nucleus and the cytoplasm, blocks its transcriptional activity, and promotes its nuclear export. A broad range of DNA damaging agents or deregulated oncogenes induces p53 activation. DNA damage promotes phosphorylation of p53 and MDM2, thereby preventing their interaction and stabilizing p53. Likewise, activated oncogenes induce ARF protein, which sequesters MDM2 into the nucleolus, thus preventing the degradation of p53. Conversely, survival signals mediate nuclear import of MDM2 via Akt activation, which destabilizes p53.

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Chene,P2003p102 Nat

Rev Cancer

• Figure 1 | The p53-mediated response. p53 exists in nonstressed cells at a very low concentration. Under stress conditions, the p53 protein accumulates in the cell, binds in its tetrameric form to p53-response elements and induces the transcription of various genes that are involved in cell-cycle control, apoptosis, DNA repair, differentiation and senescence. The loss of p53 tumour-suppressor activity by mutation/deletion of TP53 or inhibition of p53 allows the proliferation of the cells that are damaged under the stress conditions. This uncontrolled proliferation can lead to tumour development.

The p53-mediated response

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Chene,P2003p102 Nat

Rev Cancer

• Figure 2 I Regulation of p53 by M DM2. p53 and MDM2 form an auto-regulatory feedback loop. p53 stimulates the expression of MDM2; MDM2 inhibits p53 activity because it blocks its transcriptional activity, favours its nuclear export and stimulates its degradation. Different cellular signais, such as DNA-damage or oncogene activation, induce p53 activation. DNA damage favours p53 phosphorylation, preventing its association with MDM2. Activated oncogenes activate the ARF protein, which prevents the MDM2-mediated degradation of p53. Similarly, inhibitors of the p53-MDM2 interaction should activate p53 tumour-suppressor activity in tumour cells that express wild-type p53. These compounds, because they bind to MDM2, could also affect the p53 independent activities of MDM2.

Regulation of p53 by Mdm2

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Chene,P2003p102 Nat

Rev Cancer

• Figure 3 | Structure of the p53–MDM2 complex. a | The surface of MDM225–109 is in white and the backbone of p5317–29 is in green. Two different views of the complex are presented, and the amino (N) and carboxyl (C) termini of the p53 peptide are indicated. b | The p5317–29 backbone is in grey and the side chains of Phe19, Trp23 and Leu26 are represented. The surface of MDM225–109 is in yellow.

Structure of the p53–MDM2 complex

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2 - Point de contrôle en fin de G2 pour bloquer l'entrée en mitose

• Mécanisme semblable à celui qui bloque l'entrée en mitose en réponse à une réplication incomplète de l'ADN

• Si ADN altéré par radiation eg, l'ADN lésé envoie un signal qui aboutit à la phosphorylation et l'inactivation de la phosphatase Cdc 25

• Blocage de la déphosphorylation et de l'activation de M-Cdk (cf. Activation de M-Cdk)

• Blocage de l'entrée en mitose

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"Application au cancer"

• Cellule normale + conditions normales les points de contrôle n'ont pas besoin de fonctionner

• Si petit dommage à l'ADN + point de contrôle non fonctionnel accumulation de petits dommages

• gros dommages augmentation de la fréquence des mutations génératrices de cancer

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Exemple

• Des mutations du gène de p53 surviennent dans au moins la moitié des cancers

• Accumulation plus facile de mutations dans les cellules cancéreuses par perte de la fonction de la p53

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Ataxie télangiectasie

• Maladie génétique rare

• Altération d'une des protéines kinases qui phosphoryle et active p53 en réponse à une lésion d'ADN radio-induite

• Perte des points de contrôle d'altération de l'ADN

• Fréquence accrue de cancer chez ces patients très sensibles aux RI

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Réparation de l'ADN

• Organismes unicellulaires– Arrêt du cycle pour réparer la lésion– Si réparation impossible le cycle se poursuit quand

même– "La vie vaut mieux que pas de vie du tout"

• Organismes multicellulaires– "L'organisme prévaut sur la cellule"– Une cellule atteinte menace l'individu (cancer)– On suicide la cellule en exécutant un programme de mort

cellulaire (apoptose)

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Importance de p53

• Rôle dans la décision d'exécuter l'apoptose

• Rôle de protection contre le cancer

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Tableau résumant les principales protéines régulatrices du cycle

cellulaire

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• Tableau résumant les principales protéines régulatrices du cycle

cellulaireTable17-2

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Fig 17-34

• Survol du système de contrôle du cycle cellulaire– "Core" : suite de complexes cycline-Cdk– Toutes les cellules n'ont pas tout !

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Résumé du cycle cellulaire

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Virchows Arch (2004) 444:313–323 Mathewos Tessema · Ulrich

Lehmann · Hans Kreipe. Cell cycle and no end

Fig. 1 Negative and positive regulators of the normal cell cycle. Signals promoting and inhibiting the different phases of the cell cycle as well as checkpoints monitoring the proper completion of every phase of the cell cycle are indicated. In the centre of the cycle, the CDK/cyclin complexes driving the respective phase are shown. For details, see the text

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Understanding the cell cyclePaul Nurse et al.Nature Medicine 4, 1103 - 1106 (1998)

• The pattern of the progress in understanding cell division.

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Understanding the cell cyclePaul Nurse et alNature Medicine 4, 1103 - 1106 (1998)

• Changes in maturation-promoting factor (MPF) and cytostatic factor (CSF) activities during meiotic divisions of oocytes and mitotic divisions of early zygotes.