Metodický postup vyhodnocení obsahů aminokyselin ve standardech a vzorcích programem CHROMuLAN v 0.56 a vý še

S. Kráčmar, P. Píša, P. Porazil

2002

2

Vydalo: Pikron s.r.o., Kaň kovského 1235, 182 00 Praha 8, tel. +420 2 96781 671; +420 2 96781 693; fax +420 2 6884676; e-mail pikron@volny.cz Ingos s.r.o. – Pikron s.r.o., K Nouzovu 2090, 143 16 Praha 4, tel. +420 2 96781 683

Pikron s.r.o., 2002

3

OBSAH

strana Obsah 3

Tvorba metody standardu 4

Tvorba metody vzorku 8

Zadání a vyhodnocení vzorku 10

Další možnosti programu 16

4

Pro hodnocení vzorků na obsah jednotlivý ch aminokyselin je třeba si vytvořit metody,

který mi vý počet provedeme (Metoda standardu a vzorku). Stanovíme velikost píků Area pro

danou molaritu a aminokyselinu (Amount) standardu, dále velikost Area (plocha píku), User

Peak Coef (molekulová hmotnost) a Response (odezva) pro obsah jednotlivé aminokyseliny

ve vzorku.

Metody se tvoří zpravidla při instalaci programu CHROMuLAN a přístroje AAA 400

nebo při zavedení nové metody stanovení aminokyselin a vý poč tu jejich obsahu.

Sestavujeme dvě metody:

- METODA STANDARDU

- METODA VZORKU

Metody můžeme vytvořit dvojím způsobem:

a) využitím již definovaný ch metod

b) samostatně nadefinovanou

Ad a)

Č lenění jednotlivý ch adresářů a jejich umístění uvádí schéma č .1.

Schéma č .1. V rámci podadresářů (DAPA, Hydrolyzát, Sirne, TRP… ) jsou uvedeny soubory s označením:

xy_mol.ulm - které jsou podkladem pro sestavení METODA STANDARDU a xy_mw.ulm - které slouží pro sestavení METODY VZORKU

Po zadání Method v technologickém okně ⇒ Open, vybereme z podadresáře

příslušnou metodu, otevřeme soubor xy_mol.ulm, popř. xy_mw.ulm, po který ch se otevře

(schéma č . 2.) dialogové okno:

5

Metod template – je zadána metoda, údaj se v tabulce nedá změnit Calibration file – kalibrační soubor, načítá se z podadresáře Sequence Metod File Name – metoda pro vzorek Dilution – nezadává se, Base min.interval [min] – parametr ukazuje, jak dlouhý musí bý t rovný úsek, aby se považoval za nulovou linii Base Max Diff – parametr udává maximální šum, který může bý t na úseku, který se považuje za nulovou linii Min. peak height – minimální vý ška píku. Píky, které jsou menší se ignorují Min. peak width – minimální šířka píku. Píky, které jsou užší se ignorují Use Negative Peaks – toto políčko se zatrhuje, pokud chceme vyhodnocovat negativní píky Calc Amounts - toto políčko se zatrhuje, pokud chceme automaticky počítat množství Use Internal Standard – políčko označíme, pokud používáme externí standard Factor – přepoč tový faktor při ředění vzorku Calibration File Age – datum a čas nač tení kalibračního souboru No Unknown Peaks – při označení políčka se vyhodnocují pouze píky definované v metodě Results Value – používáme Amount, dále je možno vybrat Area, Ratio, Response … . Def Data Name -

Schéma 2.

Po zadání dat ⇒ Parameters se vytvoří okno se třemi řádky (Filter, Peaks a Baseline) schéma č . 3. Poklepem na LTM zamodříme řádek Peaks

Peaks je modrá. Poklepáním LTM (levého tlačítka myši) ⇒ Peaks ⇒ dialogové okno ⇒ Peaks ⇒ Browse se vytvoří schéma: METODA STANDARDU schéma č . 4. nebo METODA VZORKU schéma č . 5.

Schéma č . 3.

6

METODA STANDARDU

Schéma č . 4.

Pro obě sché ma jsou shodná: X[min] – retenční čas píku dané aminokyseliny Name – název aminokyseliny (pro obě metody musí bý t stejné názvy) Amount – množství aminokyseliny ve standardu – nmol/ml Response – odezva je vypoč tena podle vzorce uvedeného v manuálu, nezadává se Window[min] – velikost okna Data Name – u Pro se udává B (blue – modrá) stanovení při vlnové délce 440 nm Pro sché ma č. 4. METODA STANDARDU je:

Area – nezajímavá User Peak Coef – udává se 1 Internal Standard – udává se FALSE

Pro sché ma 5. METODA VZORKU je: Area – plocha stanovené aminokyseliny Usr Peak Coef – udává se molekulová hmotnost aminokyseliny – vý počet v g/kg nebo mg/g,

může bý t také 1 a v tomto případě počítáme obsah v mol. Internal Standard – udává se TRUE

7

METODA VZORKU

Schéma 5.

Metody ukládáme Metod ⇒ Save As – schéma č . 3.

Ad b)

Zadáním Method ⇒ New na hlavním panelu se vytvoří schéma č . 2. a vyplní se

uvedená kriteria ⇒ OK a do adresáře Method zapíšeme název nové Metody a vše uložíme.

Dále Method ⇒ Open a vybereme nový soubor, opětovně se otevře schéma č . 2 a po zadání

Parameters na panelu se vytvoří prázdné okno, v něm stiskneme PTM a vybereme Add ⇒

Peaks a vznikne kolonka Peaks. Dále PTM ⇒ Peaks ⇒ Browse při vzniku schéma č . 4

s jedním řádkem, do kterého zadáme příslušné hodnoty. Po uzavření příslušný ch oken a

zadání OK se doplněný soubor uloží.

8

ZADÁ NÍ A VYHODNOCENÍ STANDARDU Otevřeme analý zu standardu. Graph v technologickém okně a v Sequences vybereme standard.

Schéma č . 6.

ruční vytváření nulové linie porovnání analý z ruční vytváření píků zobrazení nulové linie nastavení vý řezu zobrazení os vrácení předchozího vý řezu zobrazení popisu píků režim zobrazení pozice kurzoru zobrazení reportu

Pokud nebyl standard v sekvenci označen (viz. schéma č . 2 – Use Calibration File) ,

označíme jej dodatečně a to PTM ⇒ Setup a v záložce Header zatrhneme Cal Standard (schéma č . 7.).

Schéma č . 7.

9

Zadáme PTM ⇒ Metod ⇒ Load From v dialogovém okně otevřeme soubor xy_mol.ulm (pro náš příklad DAPA_mol.ulm). O tom, že metoda je správně nač tena se přesvědčíme zadáním PTM ⇒ Metod ⇒ Peaks ⇒ Browse (schéma č . 8.).

Schéma č . 8. Zadáme PTM ⇒ Peaks ⇒ Autodetect, při kterém se hledaný pík označí, včetně retenčního času (schéma č . 9.).

Schéma č . 9. Zadáním PTM ⇒ Peaks ⇒ Browse se dopoč te Response a Area standardu (schéma č . 10.), toto okno uzavřeme a VYHODNOCENÍ STANDARDU uložíme File ⇒ Save As ⇒ xy_mol.ulm ⇒ Uložit.

Schéma č . 10. Při zadání PTM ⇒ Peaks ⇒ Autodetect se však nemusí příslušný pík načíst a to z důvodu jiného retenčního času uvedeného v METODĚ STANDARDU. Potom postupujeme následovně:

10

Pomocí (režim zobrazení pozice kurzoru) ve schématu č . 6. najedeme na pozici píku a zjistíme retenční čas příslušného píku (pro náš příklad 54,39 min.), otevřeme schéma č . 8. a do kolonky X[min] vepíšeme tuto hodnotu a File ⇒ Save As ⇒ xy_mol.ulm ⇒ Uložit.

Upozornění: Při použití standardních metod, pufrů, HND, laboratorní teploty, stále stejné práce obsluhy AAA 400 se takto nastavené hodnoty (retenční čas) jednotlivý ch aminokyselin mění jen velmi nepatrně a velikost oken (Windows [min] tuto skutečnost eliminuje. ZADÁ NÍ A VYHODNOCENÍ VZORKU Otevřeme analý zu standardu. Graph v technologickém okně a v Sequences vybereme analý zu vzorku (schéma č . 11.).

Schéma č . 11. PTM ⇒ Metod ⇒ Load From nač teme metodu vyhodnocení obsahu aminokyselin (podle propozice řešitele, č i zvyklostí pracoviště – v molech nebo mg resp. g vzorku) xy_??.ulm, pro náš příklad DAPA_mw.ULM a zadáme Otevřít. O tom, že máme nač tenu správnou metodu se přesvědčíme PTM ⇒ Metod ⇒ Peaks ⇒ Browse (schéma č . 12.), v tomto případě je v kolonce Usr Peak Coef uvedena molekulová hmotnost aminokyseliny DAPA .

Schéma č . 12. Dále zadáme PTM ⇒ Setup s vytvořením okna se třemi záložkami Header, Method a Instrument (schéma č . 13., 14. a 15.).

11

Schéma č . 13. Kde Sample Name – označení vzorku, které jsme zadaly při tvorbě Sequences před analý zou, je možné je změnit Sample Desc. – doplň ující údaje, možno zadat Analys – jméno pracovníka provádějícího analý zy Amount – koncentrace mol vzorku ISTD Amount – nezadává se Inj. Volume – nezadává se Cal. Standard – u vzorku se nezatrhuje Multi factor – faktor ředění, zadává se také při tvorbě Sequences Divide factor – navážka vzorku k analý ze, zadává se také při tvorbě Sequences

Schéma č . 14. Kde: Load From - je uvedena metoda nač tená PTM ⇒ Metod ⇒ Load From (schéma č . 12.) Save To - Calibration File - nač te se příslušný standard pro sérii vzorků, Tento standard je možno také

načíst PTM ⇒ Metod ⇒ Select Calibration File

12

Schéma č . 15.

Pomocné údaje, které si může obsluha zaznamenat pro další potřebu PTM ⇒ Peaks ⇒ Autodetect se detekují příslušné píky a probíhá vypočet obsahu aminokyselin (schéma č . 16.). Správně detekované píky se označí názvem příslušné aminokyseliny a retenčním časem.

Schéma č . 16.

13

PTM ⇒ Peaks ⇒ Browse vytvoříme tabulku vý sledků (schéma č . 17.).

Schéma č . 17. Kde Amount 2,160 je vý sledek stanovení aminokyseliny DAPA v g/kg vzorku.

Téhož dosáhneme při zadání PTM ⇒ Peaks ⇒ Calculate amounts - vý počet obsahu aminokyselin ve vzorku. Upozornění: Vý počet obsahu aminokyselin probíhá podle názvu aminokyseliny, proto pozor označení aminokyselin musí bý t shodné pro obě metody (standard a vzorek). Po zadání PTM ⇒ Peaks ⇒ Autodetect však nemusí dojít k nač tení všech píků (viz.

schéma č . 16.) a potom postupujeme následovně:

Pomocí (ruční vytváření píků) označíme příslušný pík (schéma č . 18.).

Schéma č . 18. Po povolení PTM se pík označí retenčním časem (schéma č . 19.) a po opětovném zadání PTM do retenčního času se vytvoří nabídka (schéma č . 20.) z níž vybereme Assign method peak (schéma č . 21.) s názvy aminokyselin a jejich retenčních časů – vychází z METODY VZORKU. Po těchto krocích opětovně zadáme PTM ⇒ Peaks ⇒ Autodetect (schéma č . 16.) a PTM ⇒ Peaks ⇒ Browse (schéma č . 17.).

14

Schéma č . 19.

Schéma č . 20.

15

Schéma č . 21. Porovnávání analý z umožň uje vložit několik analý z do jednoho grafu. Nač teme Graph ⇒ Soubor ⇒ (porovnání analý z) ⇒ File ⇒ Open otevřeme další analý zu a grafy se vzájemně proloží (schéma č . 22.).

Schéma č . 22.

16

Pomocí Overlay manager si můžeme upravovat grafy a to tím, že zatržením aktivujeme č i potlačujeme barevné chromatogramy (horní – zelená barva – vlnová dálka 570 nm – všechny aminokyseliny, vyjma Pro; modrá barva - Pro [B] vlnová délka 440 nm.). DALŠÍ MOŽNOSTI PROGRAMU PTM ⇒ Peaks ⇒ Math zadáváme kriteria pro píky a chromatogram PTM ⇒ Peaks ⇒ Truncate – zadáním času v minutách vymezíme chromatogram od 0 do

xyz minut PTM ⇒ Peaks ⇒ View – zatržením políček vymezíme data na chromatogramu PTM ⇒ Peaks ⇒ Scale – vymezíme hodnoty velikosti okna chromatogramu PTM ⇒ Peaks ⇒ Copy to clipboard – uložíme chromatogram do paměti PC a můžeme

přenést do jiný ch programů (Word, Excel apod.). PTM ⇒ Peaks ⇒ Print ⇒ Report – viz. schéma č . 23.

Schéma č . 23.

17

PTM ⇒ Peaks ⇒ Print ⇒ Window – tisk do okna bez dat

Poklepen na Peak ve schéma č . 17. LTM se řádek zamodří – schéma č . 24. a PTM vyvoláme submenu kde:

Schéma č . 24. Copy selected – data se uloží do paměti PC Delete selected – modře označené řádky se odstraní Delete all – všechna data se odstraní Add – přidání další řádky Grid option – schéma č . 25. kde:

Schéma č . 25

Edit Enabled – editace povolena Internal values – mezinárodní hodnoty All details – podrobné informace Automize Columns – stejná velikost kolonek Alweys Show Editor - ???? Print options – volba tisku Print – náhled na tisk dat – přizpůsobení potřebám obsluhy je podle Print options POZOR při ukončení práce s každý m vzorkem jste dotázáni zdali chcete data uložit, nebo ne. Při zadání Yes – Ano se data uloží, proces již nelze zvrátit. V případě, že chceme vzorek vyhodnotit jinou metodou, musíme opětovně zadat všechna požadovaná data.