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Travaux dirigés de Biologie Moléculaire

L3-BH01

S. Bourgerie

Bases puriques-pyrimidiques (1)

Cytosine : 2-oxy-4-amino-pyrimidineThymine : 2,4-dioxy-5-méthyl-pyrimidine ou 5-méthyl-uracileUracile : 2,4-dioxy-pyrimidine 2

Bases puriques-pyrimidiques (2)

Adénine : 6-amino-purineGuanine : 2-amino-6-oxy-purine

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Équilibres tautomériques, 2 formules pour une même espèce

« un proton peut occuper des positions différentes sur un squelette donné sans que les propriétés des espèces soient modifiées »=> deux structures différentes sont en équilibre chimique.

soit pour l'hybride

Cétone/ alcool Imine/ amine

Amino-cétone :Lactame

Imino-alcool :Lactime

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Tautomères de la thymine (et U) et de la guanine

5

Tautomères de la cytosine et de l’adénine

6

Tautomères de la cytosine et de l’adénine

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Cas de l’uracile et de la thymine

lactame-lactimeDi-lactame Di-lactime

Les 3 formes tautomériques de l’uracile (et T)à pH 7,0 la forme lactame prédomine; les autres formes deviennent prééminentes lorsque le pH diminue

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Équilibres tautomériques : pour RESUMER

R CH2 C R'

NH

R CH C R'

NH2

C NH2

O

R C NH

OH

R

amino-cétone(ou lactame)

imino-alcool(ou lactime)

forme céto forme énol

thymine, uracile & guanine

cytosine & adénineimino amino

R N C

NH2

R'

R NH

C

NH

R'

amino imino

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Bases puriques et pyrimidiques : liaisons hydrogène

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NN

O

O

CH3

N

N N

N

NH H

H

Ose

Ose

NN

N

O N

N N

N

O

N

H

H

H

H

HOse

Ose

T

A

C

G

Appariement des paires de basesselon Watson et Crick

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Paires de bases

12

Appariement : cas des formes tautomères

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TAUTOMERES

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tautomères 2

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Nomenclature des nucléosides et des désoxynucléosides

bases nucléosides désoxynucléosides

Adénine adénosine désoxyadénosine

Guanine guanosine désoxyguanosine

Cytosine cytidine désoxycytidine

Uracile Uridine -

Thymine - désoxythymidine

base Base + sucre

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17

18

N

NNH

N

NH2N

NN

N

NH2

O

OHOH

HO

N

NN

N

NH2

O

OHOH

OP-O

O-

O

base

ribonucléoside

ribonucléotide

N

NN

N

NH2

O

OHOH

OPO

O-

O

PO

O

PO-

O-

O

O-

N

NN

N

NH2

O

OHOH

OPO

O-

O

PO-

O

O-

ADENOSINE

ADENINE

ADENOSINE-5’-MONOPHOSPHATE (ou AMP)

ADENOSINE-5’-diPHOSPHATE (ou ADP)

ADENOSINE-5’-triPHOSPHATE (ou ATP)

ATP

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Spectres

Spectres d’absorption des bases puriques et pyrimidiques

Coefficient d’absorption molaire des nucléotides (ε260nm M-1.cm-1)

-AMP 15400

-GMP 11700

-CMP 7500

-UMP 9900

-dTMP 9200

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Structure

Structure d’une unité nucléotidique de l’ADN et de l’ARN

base

POH

3’

5’

base

POH

3’

5’

OH

2’

La base purique ou pyrimidique est schématisée en bleu, le désoxyribose ou le ribose par la barre verticale verte,la liaison phospho-diester par la barre en diagonale etle groupement phosphate par la lettre P inscrite dans un cercle

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base

P3’

5’

P

base

3’

5’

3’

P

base

3’

5’

3’

P

base

3’

5’OH

3’

PP

Structure d’une chaîne nucléotidique d’ADN

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dACG

23

P

3’

5’

3’

P

3’

5’

3’

P

3’

5’OH

3’

PP

5’ 3’

A

T

C

G

G

C

5’

P

3’

5’

3’

P

3’ 3’

P

3’

5’OH

3’

P P

3’ 5’

Schématisation de la disposition antiparallèle des brins de l’ADN24

25

Pentoses

O

OHOH

HH

HH

HOOH

β-D-ribose

1'

5'

4'2'3'

O

HOH

HH

HH

HOOH

β-2-désoxy-D-ribose

1'

5'

4'2'3'

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28

Centrifugation en CsCl

L’ARN est sensible au traitement alcalin

Mécanisme de l’hydrolyse alcaline des ARNLa solution alcaline provoque la déprotonationdu groupe 2’-OH et facilite l’attaque nucléophile du noyau phosphore proche, ce qui entraîne le clivage de la chaîne de l’ARN. Il se forme un cycle phosphate lié aux C2’ et C3’ qui va être hydrolysé soit en 2’ soit en 3’ phosphate.

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ARN (d=2) plus dense que l’ADN (d=1,7) qui est lui-même plus dense que les protéines (d=1,4)

A pH 7,0 on obtient 2 bandes : la bande supérieure correspond à l’ADN du phage T4, l’autre bande à l’ARN

A pH 12,0 on obtient 1 bande :uniquement celle correspondant à l’ADN : la bande d’ARN a disparu par suite de l’hydrolyse de ce dernier en milieu alcalin.

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Electrophorèse en gel d’agarose

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Matériel nécessaire :Tampon d’échantillonCuveSupport + scotchPeigneErlen (chauffage de l’agarose)

Dissolution de l’agarose à chaudLaisser refroidirAjouter BETPas de bulles !Cuve et agarose : mise en place du peigne.Prise en masse de l’agarose

Mise sous tensionCathode (-) et anode (+) Migration des molécules chargées positivement (cation) et négativement (anion).

ADN polyphosphatedonc polyanion donc du – au +

MigrationBleu clair : Xylène Cyanol, ADN grande tailleBleu foncé : Bleu de Bromophénol, ADN petite taille, front de migrationVariable selon % agar

Lecture sous UV : BET

Effet pH & action DNase sur ADN double brin

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Espèces moléculaires en présence

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pH 7,0 pH 12,0

(-)

(+)

(-)

(+)

Continuum/ Smear

incubation Brève Ménagée Brève Ménagée

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