PHYSIQUE CELLULAIRE- 4 -

TRANSLOCATION DES PROTÉINES

Jean-Pierre HENRY21 Mars 2008

Hypothèse de travail:

Au niveau : reticulum endoplasmique,mitochondries, bactéries, chloroplastes

la translocation est linéaire• La spécificité est donnée par une

préséquence (souvent clivée aprèstranslocation)

• La protéine (précurseur) passe linéairement• Le passage s’effectue au niveau d’un pore

aqueux

Description biochimique rapide:Mitochondrie

H+ADP ATP

H+

ATP synthase

Respiratorychain

Presequence

Importation mitochondriale:description biochimique (2)

• Importation post-traductionnelle: synthèsecytoplasmique sur polysomes

• Préséquence :– En N-terminal– Environ 20 résidus, avec résidus basiques et jamais acides

• La préséquence greffée en N-ter d’une protéinepassagère (DHFR) la dirige vers la mitochondrie

• Il existe des compartiments multiples : rôle de lapréséquence

Importation mitochondriale:description biochimique (3)

PrécurseurProtéineclivée

Mitochondries 0 + +

Protéinase K 0 0 +

• L’importation est signée par: i) la protection contre la protéinase K; ii) laperte de la préséquence

• L’importation requiert: i) de l’ATP mitochondrial et cytosolique; ii) un ΔΨ

Importation dans le reticulum endoplasmique:description biochimique rapide

•L’importation est co-traductionnelle•Elle nécessite une préséquence en N-ter (séquence leader), àcaractère essentiellement hydrophobe•La préséquence est généralement clivée après l’importation

LA TRANSLOCATION A LIEU ÀTRAVERS UN CANAL AQUEUX

Mise en évidence sur le reticulumendoplasmique

La translocation a lieu à travers un canalaqueux : cas du reticulum (1)

Principe: mettre une sondefluorescente à des endroitsdéfinis pour sonderl’environnement

• mARN de longueur définiepour avoir une protéineconnue (1)

• tARN lysine modifié sur NH2par NBD pour avoir unmarqueur à des positionsdéfinies (2)

• Analyse par temps de vie defluorescence (3)

Crawley et al, Cell(1994) 78, 461; Hamman

et al, Cell (1997) 89, 535

• la terminaison de lasynthèse requiert descodons spécifiques

• en leur absence, lachaîne reste attachée ausite P du ribosome

• l’élongation se fait parun tARN chargé par unacide aminé

• on peut modifier le NH2en position ε d’un tARNchargé par le NBD

Données biologiques

La translocation a lieu à travers un canalaqueux : cas du reticulum (2)

Résultats:• Ribosomes sans membrane:

– NBD dans l’eau– Accessible à KI (quencher)

• Ribosomes + Membrane– NBD dans l’eau– Accessible à KI après perméabilisation

(SLO), seulement si > 70 résidus– D’après la taille des quenchers, le

canal aurait 40 Å de diamètre

La translocation a lieu à travers un canalaqueux : cas du reticulum (3)

Conclusions;• La préséquence et la chaîne sont dans un

environnement aqueux, inaccessible à partir ducytoplasme

• Le ribosome et la membrane forment un canalcontinu

• Une longueur minimale est nécessaire pour émergerdu canal

Durant la translocation dans le reticulum, laprotéine est dans une conformation allongée (1)

• On utilise le même protocole:protéine de longueur variablefixée au ribosome (pas determinaison)

• On ajoute un site de N-glycosylation et on cherche lalongueur minimale permettant laglycosylation

• Comme témoin, on ajoute de lapuromycine: libération duribosome et glycosylation

RM: membrane de reticulum

Durant la translocation dans le reticulum, laprotéine est dans une conformation allongée (2)

Résultats:• La glycosylation nécessite 65

résidus entre le ribosome (siteP) et l’enzyme OST

• La microscopie électroniqueindique que cette distance estde 200 Å (ribosome 150 Å +membrane 50Å)

• Soit 200 Å/65 = 3,1 Å/résiduHélice α: 1,5 Å/résiduConformation étendue: 3,5 Å

MISE EN ÉVIDENCEÉLECTROPHYSIOLOGIQUE DU PORE

• Cas du reticulum• Cas de la mitochondrie

– Membrane externe : le PSC– (Membrane interne : TIM23)

Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (1)

• On utilise l’approche bicouches planes: mesure du courant entre 2compartiments à potentiel imposé

• On fusionne des microsomes (vésicules de reticulum rugueux) avec labicouche préformée

Simon and Blobel, Cell (1991) 65, 371

Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (2)

• A V = 0, après la fusion, aucun courant: le pore serait obstruépar les chaînes en croissance bloquées au site P

• La puromycine est une drogue qui force la terminaison: elleinduit le relargage des chaînes et libère le pore.

Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (3)

• Conductances mesurées après addition de 100 ou 0,3 µM depuromycine

• A 0,3 µM, on distingue des évènements quantiques, d’unevaleur unitaire d’environ 200 pS dans les conditions ioniquesutilisées (canal de grande taille)

Mise en évidence électrophysiologique dupore: cas du reticulum (4)

• L’addition de KCl à 300mM de concentration finaledécroche les ribosomes dela membrane microsomiale

• On observe alors unefermeture du canal

LE SYSTÈME D’IMPORTATION DE LAMEMBRANE EXTERNE DE LA

MITOCHONDRIE (TOM)

Le « Peptide Sensitive Channel »PSC

La méthode d’observation initiale

Une autre méthode d’observation:le « dip-tip »

• Le bain contient des fragmentsmembranaires (vésicules) avecdes canaux; une monocouche seforme en surface

• Une pipette de patch-clamp estsortie du bain: formation d’unemonocouche à la pointe

• La pipette est rentrée dans lebain : apposition desmonocouches

Thieffry et al (1988) EMBO J ,7, 1449

• Activité rapide

• Canal de grande taille;220 pS

• Structure dimérique

• Faible sélectivitécationique

• Dépendance vis-à-visdu potentiel

Le PSC de mitochondries de corticosurrénales

Dépendance (/potentiel) de la probabilitéd’observation des 3 états

Etat 3 (dimère)

Etat 2 (monomère)

Etat 1 (fermé)

Caractéristiques du PSC

• Le PSC est présent sur toutes les mitochondriestestées

• Il peut prendre des formes différentes: chez la levure,il n’y a pas les fermetures longues

• Il est présent uniquement sur la membrane externedes mitochondries

• Il est observable par d’autres techniques comme lesbicouches planes ou le patch-clamp de vésiculesgéantes

Le PSC est inhibé par des peptides basiquescomme les préséquences mitochondriales

NOTRTGAECKQTMLTQRpRIHBYESNKGCIKRCIHPKIVHRKCNCKIReduced MCDYESYGGFLRRGFKVVTDynorphin B

PEPTIDES

YESMLSKLASLQTVAALRRGLRTSVASATSVATKKTE

(1-34) p-Ornithineaminotransferase

YESMLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRpL4(1-22)YESMLSLRQSIRFFKPATRpL4(1-16)

YESMLSLRQSIRFFKYpL4(1-12)YCyt c oxidase subunit4PRESEQUENCES

PSCINHIBITION

SEQUENCEPEPTIDES

Effet de préséquences sur le PSC de levure

• Le canal est observé parDip-tip, puis transféré dansun bain contenant le peptide

• (haut) Fermetures induitespar une préséquence de 16résidus; l’effet est maximal à+ 10 mV

• A - 50 mV, les fermeturessont plus nombreuses, maisleur durée est plus courte

• (bas) Durée des fermeturespour le peptide de 16 résiduset pour un peptide de 13résidus

Interprétation du blocage

• A V > 0, le peptide cationique estfaiblement attiré dans le canal :blocages peu nombreux

• Quand V diminue, le nombre maisaussi la durée des blocage augmentent

• A V = 10 mV, l’attraction est suffisantepour que le peptide franchisse le canal :la durée des blocages diminue

• A V < 0, le nombre des blocagescontinue à augmenter et leur durée àdiminuer

• Les peptides d’adressage passent àtravers le PSC

Les fermetures proviennent d’interactions avecdes peptides

• Le transfert d’un PSC de levure maintenu à - 30 mV dans un bain contenantune préséquence de 22 résidus montre des fermetures rapides (passage dupeptide) et après lavage, des fermetures longues, mimant le PSC demammifère

• L’opération peut être répétée : les « portes » ne sont pas covalentes

Schéma d’interprétation des fermetures du PSC

Trypsin

Cytosol

Intermembrane spacePSC

Presequence Modèle:

• le système detranslocation comportedes sites de liaison surles 2 faces

• Chez les mammifères,on isole le PSC avec despeptides-signal liés

• Ces peptides donnentdes fermetures

Energétique et vectorialité du transportmitochondrial

• Pour une protéine de la matrice, transport à travers 2 membranes; lessystèmes d’importation sont couplés de manière dynamique

• Des chaperons cytosoliques maintiennent la protéine déroulée à l’extérieur• Le potentiel facilite le passage de la préséquence• Des chaperons mitochondriaux capturent la protéine importée, biaisent le

mouvement brownien et facilitent la renaturation

Principe du cliquet brownien

• La chaîne déroulée est soumise aumouvement brownien au cours deson passage à travers le pore

• Dés leur translocation, lesséquences sont prises en chargepar des chaperons ou des enzymes

• Ces liaisons ou modificationsempêchent le retour de la chaîne etdonnent la directionalité

• Dans le reticulum, le ribosomepousse la chaîne synthétisée et elleest prise en charge en trans

Remarque: au niveau du reticulum, il existe aussi des protéines transportéespost-traductionnellement. Chez les bactéries, le mode post-traductionnel estdominant

Biochimie simplifiée des systèmesd’importation mitochondriaux

• Les 2 systèmes TOM et TIM ontété purifiés et reconstitués enmembrane

• Les activités « canal » de TOM etTIM sont portées par,respectivement, TOM40 et TIM23

• TOM purifié et reconstitué al’activité PSC (Kunkele et al(1998) J Biol Chem 273, 31032)

Vision biochimique plus complète

• TOM: le canal (TOM40, PSC)s’associe avec des récepteursdifférents selon la protéine etsa destination

• TIM: il existe un secondsystème, responsable del’insertion dans la membraneinterne

• TIM23: il existe tout unsystème ATP-dépendant pour« tirer » sur la protéine

Morphologie du système TOM purifié

• TOM purifié à partir de mitochondries de Neurospora• Présence de 2 dépressions avec des diamètres de 20 Â ,

compatibles avec la conductance du PSC• Le PSC, comme TOM, a une structure dimérique

Kunkele et al (1998) Cell, 93, 1009

UN SYSTÈME DE LA MEMBRANEINTERNE (TIM)

Activité canal de TIM23

Activité canal de TIM23

TIM23 (levure), purifié et reconstituéen bicouche, est un canal

• Grande taille (> 150 pS)• Cationique (sélectivité PK+/PCl- = 16)• Ouverture induite symétriquement

par le potentiel• Fermeture à temps longs

Truscott et al (2001) Nature Struc Biol, 8, 1074

Le canal de TIM23 est bloqué par despréséquences

• Activité testée par une rampede potentiel, milieuasymétrique en KCl (gradient x10, bicouches planes)

• L’addition de préséquence ducôté espace intermembranaire(KCl faible) entraîne unefermeture (a)

• Addition du côté matriciel, peud’effet (b)

Effet d’une préséquence et de TIM50

Activité de TIM23, bicouche plane, V =0, gradient de KCl

• TIM23 seul, courant dû au gradientde K+

• La partie soluble du partenaire TIM50présent dans l’espaceintermembranaire ferme le canal

• La présequence mise du même côtéavec TIM50 donne des ouverturesrapides

• L’activité canal est régulée par unpartenaire: ouvertures brèvespermettant le maintien du Δµ H+

Meinecke et al (2006) Science, 312, 1523

TRANSLOCATION DANS LERETICULUM ENDOPLASMIQUE

Rôle central de Sec61:• Trouvé dans les microsomes de chien et de levure• Homologue de SecY permettant la sécrétion des

protéines chez E coli• Possède des résidus hydrophiles dans des segments

transmembranaires

Rôle de Sec61: Biochimie

• Purification à partir des microsomes de chien– Solubilisation(digitonine) de membranes avec des

ribosomes– Détachement des ribosomes par la puromycine– Purification

• Membranes déplétées en Sec61: perte du transport;la reconstitution restaure le transport

• Purification des autres activités pour avoir le systèmeminimal

• Activité minimale : Sec61, Récepteur de SRP(SRPr),et , pour certaines protéines TRAM

Gorlich and Rapoport (1993) Cell, 615-630

DONNÉES STRUCTURALES

Structure atomique d’un analogue de Sec 61:Le canal de translocation des protéines d’une

Archeubactérie

Organisation générale

• Le complexe est équivalent à Sec61 ; 3 sous-unités: α avec 10 TM, β et γchacun 1 TM

• (à gauche) vue depuis le cytosol; (à droite) vue en coupe• (à gauche) forme générale d’un carré, limité sur 3 côtés par βγ• (à droite) partie importante dans la membrane; dans le cytosol, on trouve les

extrèmités et 2 boucles d’ancrage du ribosomeVan den berg et al (2004)Nature,427, 36

Pseudo-axe de symétrie

• Il y a un pseudo axe de symétrie dans le plan de la membrane• Les TM 1-5 et 6-10 occupent des positions symétriques• On distingue une face avant (à gauche) susceptible de s’ouvrir

Eléments importants de la structure

• En coupe, structure en sablier hydrophile au milieu de la membrane• Le TM2 a une structure originale: 2 demi-hélices avec TM2a fermant la

structure (plug)• TM2a pourrait se coller contre γ dans la forme ouverte• Au milieu de la membrane, rétrécissement (pore ring) de 20-25 Å à 5-8 Å;

anneau hydrophobe (presse-étoupe)

Vue synthétique

Le schéma met en évidenceles points importants:

• La structure en sablier• L’existence d’un anneau

central au niveau durétrécissement

• La présence d’unbouchon obstruant lepore central

• Le canal au repos estfermé

Le canal au repos est fermé (1)

• La protéine purifiée est inséréedans un dispositif debicouches planes (sanssolvant)

• Pas d’ouverture de canaux (onestime qu’il y a plus de 106

protéines dans la membrane)• Le contrôle est la membrane

seule• Le canal fermé est

imperméant aux ions et à H20

Saparov et al (2007) Mol Cell 26, 501

Le canal au repos est fermé (2)

• Des cystéines sont introduites en position 67 et 120• En présence de l’oxydant, un pont disulfure se

forme, qui bloque le canal dans la position ouverte• Avec le réducteur, re-fermeture.

Ouverture latérale du canal (1)

• La structure est capable de s’ouvrir sur sa face avant, entre TM2b et TM7: ily aurait une « respiration » du complexe

• La préséquence hydrophobe se collerait sur l’interface TM2b/TM7; pendantune ouverture; elle passerait dans la phase membranaire

Ouverture latérale du canal (2)

• Modélisation moléculaire(10-20 ns)

• L’ouverture nécessite uneforce de 2-3 nN

• Cette force estprincipalement due àl’interaction avec les lipides

• Durant l’ouverture, il n’y apas d’influx de lipides

• La relaxation est spontanée

Gumbart and Schulten(2007)Biochemistry 46, 11147

Schéma de translocation des protéinessolubles (1)

• La préséquence (hydrophobe) selie à l’interface TM2/7, à l’avant

• La structure s’ouvre mettant lapréséquence dans les lipides

• Ce mécanisme déclenche lemouvement de TM2a et l’ouverturedu pore

• La préséquence est clivée et lachaîne rentre dans la lumière

• Le pore se referme

Schéma de translocation des protéinessolubles (2); dynamique moléculaire

Le peptide (bleu) est (Ala)10

Gumbart and Schulten (2006) Biophys J, 90, 2356

INSERTION DES PROTÉINESMEMBRANAIRES

Rôle de Sec61

Insertion des protéines membranaires

• Le système Sec61 joue un rôle important dansl’insertion des protéines membranaires en hélice α

• Le segment transmembranaire joue le rôle deséquence-signal nonclivée

• Dans le cas des protéines polytopiques (plusieurssegments transmembranaires), l’insertion se faitsegment transmembranaire après segmenttransmembranaire

Sec61 et l’insertion des protéines membranaires

• La séquence-signal pourrait se fixer sur le site hydrophobe dans les 2orientations (selon la séquence)

• Si la séquence n’est pas clivée, on aura une insertion selon les 2orientations

• Dans les 2 cas, la chaîne doit sortir du canal ribosomial

Sec61 et l’insertion des protéines membranairesprotéines polytopiques

• Les séquences TM àinsérer servent deséquence-signalinternes non clivées

• A chaque fois, on doitavoir l’ouverture ducomplexe Sec61 etl’ouverture du canalribosomial