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Université de Sherbrooke
Propriétés structurales et fonctionnelles du récepteur AT1 de
l’angiotensine II
Par
Ivana Domazet
Département de pharmacologie
Thèse présenté(e) à la Faculté de médecine et des sciences de la santé
en vue de l‟obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.)
en pharmacologie
Sherbrooke, Québec, Canada
mars, 2015
Membres du jury d‟évaluation
Dr.Gaétan Guillemette, département de pharmacologie
Dr.Emanuel Escher, département de pharmacologie
Dr. Michel Grandbois, département de pharmacologie
Dr. Marek Rola-Pleszczynski , département de pédiatrie
Dr. François Marceau, département de médecine, Université de Laval
© Domazet Ivana, 2015
À ma famille
La vie est authentique lorsqu’elle change.
Léon Tolstoї
iv
iv
RÉSUMÉ
Propriétés structurales et fonctionnelles du récepteur AT1 de l’angiotensine II
Par
Ivana Domazet
Programmes de pharmacologie
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l‟obtention
du diplôme de philosophiae doctor (Ph.D.) en pharmacologie, Faculté de médecine et des
sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4
L‟angiotensine II (Ang II), une hormone jouant un rôle important dans l‟homéostasie
cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT1 appartenant à
la grande famille des GPCRs. Les sept domaines transmembranaires (TM) des GPCRs
contribuent à former la pochette de liaison du ligand. Afin d‟identifier les acides aminés du
TM2 et du TM5 impliqués dans la formation de la pochette de liaison du récepteur AT1,
nous avons utilisé l‟approche SCAM qui consiste à évaluer les propriétés de liaison du
récepteur suite à sa réaction avec le MTSEA. Le MTSEA alkyle les cystéines endogènes ou
introduites par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement stérique qui interfère
avec la liaison du ligand. Une série de mutants ont été produits en remplaçant
successivement par une cystéine les résidus 70 à 94 du TM2 ainsi que les résidus 190 à 217
du TM5 du récepteur AT1 et de son mutant constitutivement actif N111G-AT1. Après le
prétraitement avec le MTSEA, les mutants D74C, L81C, L83C, A85C, A89C ont montré
une diminution significative d‟affinité pour le ligand 125
I-Sar1,Ile
8Ang II, suggérant que
ces résidus sont orientés dans la pochette de liaison du récepteur AT1. Le mutant D74C-
N111G est devenu insensible au MTSEA, alors que la sensibilité de L81C-N111G fut
diminuée. Par contre, le mutant V86C-N111G s‟est avéré sensible au MTSEA. Ces
résultats suggèrent que l‟activation constitutive du récepteur AT1 implique un mouvement
de pivot du TM2, favorisant le rapprochement du haut du TM2 vers la pochette de liaison.
Pour le TM5, après le prétraitement avec le MTSEA, les mutants L197, N200, I201, G203
et F204 ont montré une diminution significative d‟affinité pour le ligand 125
I-Sar1,Ile
8Ang
II, suggérant que ces résidus sont orientés dans la pochette de liaison du récepteur AT1. Le
mutant I201C-N111G est devenu plus sensible au MTSEA, alors que la sensibilité de
G203C-N111G fut diminuée. Ces résultats suggèrent que l‟activation constitutive du
récepteur AT1 implique un mouvement de rotation du TM5 dans le sens anti-horaire. Le
récepteur AT1 est connu pour coupler préférentiellement à la protéine Gq et les propriétés
fonctionnelles de ce récepteur ont surtout été évaluées en fonction de sa capacité à induire
la production des inositol phosphates et à mobiliser le Ca2+
intracellulaire. Par contre, le
récepteur AT1 interagit avec d‟autres protéines G (Gi et G12/13) et active également des voies
de signalisation indépendantes des protéines G (MAPK). Nous avons évalué une série
d‟analogues de l‟Ang II pour leur capacité à inhiber ou activer plus ou moins sélectivement
les diverses voies de signalisation en aval du récepteur. C‟est la notion de sélectivité
fonctionnelle. Nos résultats démontrent que les substitutions à la position 1 ne confèrent
pas de séléctivité fonctionnelle, alors que les substitutions à la position 4 montrent un biais
vers la signalisation la MAPK et que les substitutions à la position 8 montrent un biais pour
le recrutement des β-arrestines.
v
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Mots clés : récepteur AT1, angiotensine II, pochette de liaison, SCAM, sélectivité
fonctionnelle.
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Table des matières
Résumé ............................................................................................................................................ iv
Liste des figures ........................................................................................................................... ix
Liste des tableaux ........................................................................................................................ xi
Liste des abréviations .............................................................................................................. xii
Introduction ................................................................................................................................... 1 Les récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs) ..................................................................... 1
Système rénine-angiotensine (RAS) ............................................................................................... 2
Effets physiologiques de l’Ang II:................................................................................................................. 3
Récepteurs de l’Ang II : ................................................................................................................................... 4
Structure générale du récepteur AT1 de l’Ang II ................................................................................... 4
Nomenclature des résidus situés dans TM .............................................................................................. 5
Ang II ....................................................................................................................................................................... 6
Structure du récepteur AT1 de l’Ang II ........................................................................................... 6
Pochette de liaison du récepteur AT1 ........................................................................................................ 6
Méthode SCAM : identification de la pochette de liaison du récepteur AT1 .............................. 8
Utilisation du SCAM afin de délimiter la pochette de liaison des GPCRs .................................... 9
État basal versus état actif du récepteur ............................................................................................... 10
Activation constitutive du récepteur AT1 .............................................................................................. 11
Activation des récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs) ............................................. 12
Mécanisme moléculaires impliqués dans l’activation des GPCRs ............................................... 12
Mécanisme d’activation du récepteur AT1 de l’Ang II ...................................................................... 12
Sélectivité fonctionnelle .................................................................................................................... 14
Concept de sélectivité fonctionnelle ....................................................................................................... 14
Pourquoi faire des études de sélectivité fonctionnelle? ................................................................. 15
La signalisation du récepteur AT1 .................................................................................................. 15
Voies de signalisation impliquées dans l’activité du récepteur AT1 .......................................... 15
Activation de la voie de MAPK/ERK par le récepteur AT1 ............................................................. 17
Méthodes utilisés pour mesurer l’activation de différentes voies de signalisation .... 19
Production des inositols phosphates ...................................................................................................... 19
Activation de la voie des ERKs ................................................................................................................... 19
Recrutement de l’arrestine et l’activation de la voie G12 ................................................................ 20
Calcul du biais de signalisation ................................................................................................................. 20
Importance de la sélectivité fonctionnelle du récepteur AT1 .............................................. 21
vii
vii
Problématique ...................................................................................................................................... 22
Objectifs .............................................................................................................................................................. 23
Article 1 ......................................................................................................................................... 24 The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor
participates in the formation of the ligand binding pocket and undergoes integral
pivoting movement during the process of receptor activation ........................................... 24
Résumé ................................................................................................................................................................ 25
Introduction ...................................................................................................................................................... 27
EXPERIMENTAL PROCEDURES ................................................................................................................ 29
RESULTS ............................................................................................................................................................. 34
DISCUSSION ....................................................................................................................................................... 38
FOOTNOTES ...................................................................................................................................................... 46
REFERENCES .................................................................................................................................................... 46
Article 2 ......................................................................................................................................... 48 The fifth transmembrane domain of angiotensin II Type 1 receptor participates in
the formation of the ligand-binding pocket and undergoes a counterclockwise
rotation upon receptor activation ................................................................................................. 48
Résumé ................................................................................................................................................................ 48
INTRODUCTION ............................................................................................................................................... 50
EXPERIMENTAL PROCEDURES ................................................................................................................ 52
RESULTS ............................................................................................................................................................. 54
DISCUSSION ....................................................................................................................................................... 64
REFERENCES .................................................................................................................................................... 70
Article 3 ......................................................................................................................................... 73 Characterization of Angiotensin II molecular determinants involved in AT1 receptor
functional selectivity .......................................................................................................................... 73
Résumé ................................................................................................................................................................ 73
INTRODUCTION ............................................................................................................................................... 75
MATERIALS AND METHODS ...................................................................................................................... 76
RESULTS ............................................................................................................................................................. 80
DISCUSSION ....................................................................................................................................................... 98
REFERENCES .................................................................................................................................................. 102
TABLES .............................................................................................................................................................. 106
viii
viii
Discussion .................................................................................................................................. 114
CONCLUSIONS ........................................................................................................................... 133
Liste des références ................................................................................................................ 136
ix
ix
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION
Figure 1 Le système rénine-angiotensine……………………………………………………3
Figure 2 Représentation schématique du récepteur AT1 ........................................................ 5
Figure 3 Arrangement des domaines transmembranaires autour de la pochette de liaison du
récepteur AT1 .................................................................................................................. 8
Figure 4 Substituted Cysteine Accessibility Method (SCAM) ............................................. 10
Figure 5 Sélectivité fonctionnelle ......................................................................................... 15
Figure 6 Les différentes voies de signalisation du récepteur AT1 ....................................... 17
ARTICLE 1
Figure 1 Schematic representation of the human AT1 receptor ............................................ 30
Figure 2 MTSEA treatment of the wild-type AT1 receptor and sensitive reporter cysteine-
bearing mutant receptors ............................................................................................... 32
Figure 3 Effects of MTSEA on different mutant AT1 receptors bearing a reporter cysteine
in TMD2 ....................................................................................................................... 33
Figure 4 MTSEA treatment of the N111G-AT1 receptor and sensitive reporter cysteine-
bearing mutant N111G-AT1 receptors .......................................................................... 36
Figure 5 Effect of MTSEA on different mutant N111G-AT1 receptors bearing a reporter
cysteine in TMD2 ........................................................................................................ 39
Figure 6 [Sar1,Ile
8]Ang II protection of MTSEA-sensitive mutant receptors ...................... 40
Figure 7 Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild type and mutant
AT1 receptors ................................................................................................................ 42
Figure 8 Helical wheel representation of TMD2 reporter cysteines and their pattern of
reactivity to MTSEA ..................................................................................................... 43
ARTICLE 2
Figure 1 Schematic representation of the human AT1 receptor ............................................ 57
x
x
Figure 2 MTSEA treatment of the wild-type AT1 receptor and sensitive reporter cysteine-
bearing mutant receptors ............................................................................................... 58
Figure 3 Effects of MTSEA on mutant AT1 receptors bearing a reporter cysteine in TMD5
...................................................................................................................................... 59
Figure 4 MTSEA treatment of the N111G-AT1 receptor and sensitive reporter cysteine-
bearing mutant N111G-AT1 receptors .......................................................................... 62
Figure 5 Effect of MTSEA on N111G-AT1 mutant receptors bearing a reporter cysteine in
TMD5 ............................................................................................................................ 63
Figure 6 [Sar1,Ile
8]Ang II protection of MTSEA-sensitive mutant receptors ...................... 65
Figure 7 Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild-type (WT) and
mutant AT1 receptors .................................................................................................... 66
Figure 8 Helical wheel representation of TMD5 reporter cysteines and their pattern of
reactivity to MTSEA ..................................................................................................... 68
ARTICLE 3
Figure 1 Inositol1-phosphate production induced by Ang II analogs……………………81
Figure 2 βarrestin1 recrutement to the AT1 receptor by Ang II analogs .............................. 84
Figure 3 βarrestin2 recrutement to the AT1 receptor by Ang II analogs .............................. 85
Figure 4 G12 activation by Ang II analogs……………………………………………….87
Figure 5 Ang II induced ERK activation .............................................................................. 88
Figure 6 EGFR-dependent ERK activation by Ang II analogs ........................................... 90
Figure 7 PKC-dependent ERK activation by Ang II analogs .............................................. 92
Figure 8 Atypical PKC-dependent ERK activation ............................................................. 94
Figure 9 Effects of AngII analogs on AT1 signalling pathways .......................................... 97
xi
xi
LISTE DES TABLEAUX
ARTICLE 1
Tableau 1 Binding Properties of [Sar1,Ile
8]Ang II to cysteine-substitued hAT1 mutant
receptors……………………………………………………………………………....29
Tableau 2 Binding Properties of [Sar1,Ile
8]Ang II to cysteine-substitued hAT1 mutant
receptors bearing the N111G mutation……………………………………………….35
ARTICLE 2
Tableau 1 Binding Properties of [Sar1,Ile
8] Ang II to Cysteine-Substitued hAT1 Mutant
Receptors………………………………………………………………………….55-56
Tableau 2 Binding Properties of [Sar1,Ile
8] Ang II to Cysteine-Substitued hAT1 Mutant
Receptors Bearing the Asn111
Gly Mutation……………………………………….60-61
ARTICLE 3
Tableau 1 Binding Properties of AT1 receptor ligands ………………………………......107
Tableau 2 Activation of Gq, βarrestin1, βarrestin2 and G12 by AT1 receptor
ligands……………………………………………………………………………….108
Tableau 3 Activation of Gq, PKC-ERK and EGFR-ERK by AT1 receptor ligands
……………………………….....................................................................................109
Tableau 4 Transduction ratios of AT1 receptor ligands………………………..…………110
Tableau 5 Biais factor of AT1 receptor ligands modified at position 1………………….112
Tableau 6 Biais factor of AT1 receptor ligands modified at position 4………………….113
Tableau 7 Biais factor of AT1 receptor ligands modified at position 8…………………..114
xii
xii
LISTE DES ABRÉVIATIONS
AT1
AT2
Ang II
Récepteur à l‟angiotensine II type 1
Récepteur à l‟angiotensine II type 2
angiotensine II
Ang III
Ang IV
angiotensine III
angiotensine IV
AMPc adénosine monophosphate 3', 5'-cyclique
ACE enzyme de conversion de l‟angiotensine II
Bpa para-benzoyl-L-phenylalanine
Ca2+
calcium
CAM mutant constitutivement actif
Cys cystéine
DAG
EGF
EGFR
ERK1/2
GDP
GPCR
GRK
Diacylglycérol
Facteur de croissance épidermique
Récepteur du facteur de croissance épidermique
Extracellular signal-regulated kinases
Guanosine diphosphate
Récepteur couplé à une protéine G
Kinase des récepteurs couplés à une protéine G
GTP
JAK
JNK3
Guanosine triphosphate
Janus kinase
c-Jun N-terminal kinase
IP3 inositol 1,4, 5-trisphosphate
IP3R Récepteur à inositol 1,4, 5-trisphosphate
PDGF platelet-derived growth factor
PIP2 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
PKC protéine kinase C
RAF RAF kinase
IGFR insulin-like growth factor 1 receptor
PIP2 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
xiii
xiii
PKC protéine kinase C
PLC phospholipase C
MAPK mitogen-activated kinase
MEK MAP kinase kinase
MMP métalloprotéinase
MPA methionine proximity assay
MTS méthanethiosulfonate
MTSEA méthanethiosulfonate-ethylammonium
MTSES méthanethiosulfonate-éthylsulfonate
TM domaine transmembranaire
SCAM substituted cysteine accessibility method
Src proto-oncogene tyrosine-protein kinase
1
1
INTRODUCTION
Les récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs)
Les récepteurs situés à la surface cellulaire permettent de capter un stimulus venant de
l‟extérieur afin de le traduire en une réponse appropriée à l‟intérieur de la cellule. Il existe
quatre grandes catégories de récepteurs : les récepteurs nucléaires, les récepteurs canaux, les
récepteurs à activité enzymatique et les récepteurs couplés à une protéine G. Les récepteurs
couplés à une protéine G sont les protéines transmembranaires les plus nombreuses et les
plus diversifiées impliquées dans la transduction du signal intracellulaire. Plus de 2% des
gènes de notre organisme codent pour des récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs).
Les GPCRs sont impliqués dans l‟homéostasie de divers systèmes. Ces récepteurs sont
impliqués dans le contrôle d‟une multitude de processus biologiques (vision, métabolisme,
neurotransmission, olfaction, réponse immunitaire, réponse inflammatoire) et
pathophysiologiques (maladies cardiovasculaires, cancer, diabète). Ils représentent donc des
cibles très intéressantes pour le traitement de différentes maladies telles que les maladies
cardiaques, certains désordres inflammatoires et autres (Lebon and Tate, 2012). Aujourd‟hui,
les GPCRs représentent la cible la plus importante de tous les médicaments sur le marché.
Environ 40% des médicaments actuellement disponibles sur le marché ont leurs effets
thérapeutiques via un ou des GPCRs (Ma and Zemmel, 2002), d‟où l‟importance de bien
comprendre leur structure et leur activation.
Des stimuli de nature très variée peuvent activer les GPCR (photons, ions, amines,
acides aminés, peptides, protéines, lipides, nucléotides, glycoprotéines et phospholipides)
(Kroeze, et al., 2003).
L‟unité de signalisation de base d‟un GPCR comprend un récepteur, une protéine G
hétérotrimérique et un effecteur. Suite à la liaison du ligand, le GPCR subit un changement
conformationnel qui permet l‟activation de la protéine G. Les GPCRs doivent leur nom à leur
mécanisme de transduction le mieux connu, soit l‟activation de protéines G hétérotrimériques.
Les protéines G hétérotrimériques servent d‟intermédiaires dans l‟activation d‟effecteurs à
l‟intérieur de la cellule tels que les enzymes, les canaux ioniques et autres. Les protéines G
sont composés de trois sous-unités, soit la sous-unité Gα, Gβ et Gγ. Les sous-unités Gβ et Gγ
forment un dimère stable. Suite à l‟activation, les GPCRs catalysent l‟échange d‟une molécule
de GDP pour une molécule de GTP à l‟intérieur de la sous-unité Gα de la protéine G. Cet
2
2
échange cause l‟activation et la dissociation de la sous-unité Gα du dimère Gβγ. Après
dissociation, Gα et Gβγ peuvent chacune activer leurs effecteurs respectifs (Pierce, et al.,
2002).
On peut classer la protéine Gα en fonction de sa capacité à activer certaines voies de
signalisation. Par exemple, la protéine Gαs active l‟adenylate cyclase, et favorise
l‟augmentation de l‟AMP cyclique. À l‟inverse, la protéine Gαi inhibe l‟adénylate cyclase et
cause une baisse de l‟AMP cyclique. La protéine Gαq active la phospholipase C (PLCβ) qui
clive le phosphatidyl inositol 4,5-biphosphate (PIP2) en diacylglycérol et en inositol 1,4,5-
triphosphate (IP3). La protéine Gα12∕13, quant à elle, active la Rho kinase impliquée dans la
réorganisation du cytosquelette (Pierce, et al., 2002).
Même si les protéines G sont responsables de la majorité des effets suite à l‟activation
des GPCRs, il est bien connu que les GPCRs sont capables d‟activer d‟autres voies de
signalisation indépendantes de la protéine G (Kenakin, 2011) telles que le recrutement
d‟arrestine, la transactivation du récepteur de l‟EGF, ainsi que l‟activation de certaines
kinases (Src).
Système rénine-angiotensine (RAS)
Le récepteur de l‟Ang II (récepteur AT1) est un GPCR et il constitue l‟élément central
du système rénine-angiotensine. Le système rénine-angiotensine joue un rôle clé dans la
régulation de la pression artérielle. Suite à une baisse de la concentration de sodium, ou à une
baisse du volume sanguin ou encore à une baisse de la pression artérielle, les reins sécrètent la
rénine. La rénine est une enzyme qui clive son unique substrat, l‟angiotensinogène, une
protéine plasmatique produite par le foie. Le clivage de l‟angiotensinogène produit
l‟angiotensine I (Ang I), un décapeptide qui ne possède aucune fonction biologique connue
mais qui est converti en Ang II) par l‟enzyme de conversion de l‟angiotensine (ACE). L‟Ang
II est la molécule active du système rénine-angiotensine; c‟est l‟agoniste du récepteur AT1
(figure 1). L‟Ang II a une demi-vie très courte et elle est rapidement métabolisée en
angiotensine III (Ang III) par l‟aminopeptidase A et cette dernière en angiotensine IV (Ang
IV) par l‟aminopeptidase N (Hunyady and Catt, 2006) .
3
3
FIGURE 1. Le système rénine-angiotensine. Représentation schématique de la production de
l‟angiotensine II et ses effets physiologiques.
Effets physiologiques de l‟Ang II:
L‟Ang II favorise une élévation de la pression artérielle par une variété d‟actions. Elle
stimule la sécrétion d‟aldostérone par le cortex de la glande surrénale qui favorise la
réabsorption de sodium (Na+) et de l‟eau par le tubule rénal. L‟Ang II est aussi un puissant
vasoconstricteur qui augmente la résistance vasculaire périphérique. De plus, l‟Ang II stimule
la croissance et la prolifération cellulaire. Également, l‟Ang II favorise la sécrétion de la
vasopressine afin d‟augmenter la réabsorption d‟eau. L‟Ang II agit aussi dans le cerveau,
pour augmenter la soif pour favoriser l‟absorption d‟eau, ce qui augmente le volume sanguin
et par conséquent augmente la pression artérielle (de Gasparo, et al., 2000; Bader, 2010).
Afin de réduire les effets physiologiques de l‟Ang II, il existe plusieurs classes de
médicaments sur le marché. Les inhibiteurs d‟ACE bloquent l‟enzyme de conversion et
empêchent la production d‟Ang II, abolissant ses principales fonctions : la vasoconstriction et
la libération d‟aldostérone. Ce type de médicament est utilisé pour traiter l‟hypertension
artérielle et l‟insuffisance cardiaque et le premier inhibiteur de cette classe a été le captopril.
Il existe aussi des antagonistes du récepteur AT1 qui bloquent son activation par l‟Ang II. Les
4
4
antagonistes du récepteur AT1 tel que le losartan agissent en diminuant l‟effet
vasoconstricteur et l‟effet mitogènique de l‟Ang II. Enfin, les inhibiteurs de la rénine
empêchent la formation de l‟Ang I à partir de l‟angiotensinogène. L‟aliskiren est un exemple
de la nouvelle génération d‟inhibiteurs de la rénine qui sont utilisés en clinique et qui peuvent
être administrés par la voie orale (Burnier, 2001; Paulis and Unger, 2010).
Récepteurs de l‟Ang II :
Deux types de récepteurs ont été identifiés pour l‟Ang II : le récepteur AT1 et le
récepteur AT2 (de Gasparo, et al., 2000). Le récepteur AT2 est composé de 363 acides aminés
et possède une homologie de séquence de 34 % avec le récepteur AT1. Il s‟exprime surtout
durant la vie fœtale. Le rôle physiologique du récepteur AT2 est encore relativement obscur
bien que certaines études suggèrent que ce récepteur aurait des actions d‟antagoniste
physiologique du récepteur AT1, ayant des effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques
(Steckelings, et al., 2005). La majorité des effets physiologiques connus de l‟Ang II passent
par le récepteur AT1 (Burnier, 2001; Miura, et al., 2003a).
Structure générale du récepteur AT1 de l‟Ang II
Le récepteur AT1 est présent dans plusieurs organes tels que le foie, la glande surrénale,
le cerveau, les poumons, le rein, le cœur et les vaisseaux sanguins. Composé de 359 acides
aminés, le récepteur AT1 fait partie de la classe A des GPCRs, ayant une forte homologie avec
le récepteur de la rhodopsine. Ce récepteur comme tous les autres GPCRs est composé de sept
domaines transmembranaires α-hélicaux (TM) ainsi que d‟un domaine N-terminal
extracellulaire et un domaine C-terminal intracellulaire. Le domaine extracellulaire de l‟AT1
se caractérise par la présence de trois sites consensus de glycosylation (Asn4, Asn176,
Asn188) ainsi que quatre résidus cystéine impliqués dans la formation de deux ponts
disulfures essentiels pour la liaison de l‟Ang II (figure 2) (Yamano, et al., 1992; Lanctot, et
al., 1999; Lanctot, et al., 2005).
Le domaine intracellulaire quant à lui est composé de 3 boucles intracellulaires et d‟une
queue C-terminale. Il contient plusieurs résidus sérine/thréonine pouvant être phosphorylés
par les kinases de récepteurs couplés à une protéine G (GRK) afin de recruter l‟arrestine et
initier le processus de désensibilisation et d‟internalisation du récepteur (Mehta and
Griendling, 2007).
5
5
Nomenclature des résidus situés dans TM
Pour faciliter la comparaison des résidus situés dans les domaines transmembranaires
(TM) de différentes GPCR de la classe A, plusieurs nomenclatures ont été proposées. Dans
cette thèse, j‟ai retenu la nomenclature de Ballesteros et Weinstein (Ballesteros, J.A. 1995).
La nomenclature est basée sur le fait que dans chaque TM le résidu le plus hautement
conservé est désigné le résidu X.50 où X représente le numéro du TM. Les autres résidus sont
numérotés relativement à leur position par rapport au résidu le plus conservés. Par exemple, le
résidu le plus hautement conservé dans le 2e TM est un aspartate qu‟on va désigner Asp-
74(2.50)
. Le résidu situé avant l‟aspartate est une alanine qui sera donc identifié comme Ala-
73(2.49)
. Par contre, le résidu situé après l‟aspartate 74 est une leucine et sera désigné en tant
que Leu-75(2.51)
.
FIGURE 2 : Représentation schématique du récepteur AT1. Les numéros indiquent les
positions des résidus dans le récepteur. Les cercles gris représentent les cystéines qui forment
les ponts disulfures et les cercles noirs représentent les cystéines qui ne sont pas impliquées
dans la formation de ponts disulfures. Les sites de glycosylation potentiels (Asn-4, Asn-176 et
Asn-188) sont aussi identifiés. L‟Asn-111 dans le TM3 est aussi indiquée en gris.
6
6
Ang II
L‟octapeptide Ang II (Asp1-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
8) est le médiateur principal du
système rénine-angiotensine (de Gasparo, et al., 2000). Les différentes études effectuées in
vivo et in vitro avec les analogues de l‟Ang II ont permis de déterminer les résidus impliqués
dans la liaison et dans l‟activation du récepteur AT1 (Khosla, et al., 1974; Regoli, et al., 1974).
L‟activité biologique de l‟Ang II dépend en grande partie du résidu aromatique Phe8 et
de son carboxylate dans la partie C-terminale du peptide (de Gasparo, et al., 2000). Les
chaines latérales aromatiques en position 4 et 6 (Tyr4 et His
6) semblent également impliquées
dans l‟activation du récepteur (Khosla, et al., 1974). Par exemple, en remplaçant les résidus
aromatiques Tyr4 et Phe
8 par des résidus aliphatiques, on génère des antagonistes du
récepteur AT1. Il faut cependant mentionner que le résidu Tyr-4 cause principalement une
importante baisse d‟affinité pour le récepteur, ce qui le rend moins intéressant du point de vue
structure-fonction (Guillemette, et al., 84). Les résidus situés dans la partie N-terminale sont
importants pour la liaison au récepteur ainsi que pour la durée d‟action du ligand. L‟Ang III
(Ang-2-8) formée par la délétion de l‟aspartate en position 1 est aussi puissante que l‟Ang II.
L‟Ang IV (Ang-3-8) garde une faible activité biologique et se comporte comme un agoniste
partiel ayant une faible affinité pour le récepteur AT1 (de Gasparo, et al., 2000).
Structure du récepteur AT1 de l‟Ang II
Pochette de liaison du récepteur AT1
Les GPCRs de la classe A possèdent une cavité hydrophile au centre de la protéine
appelée la pochette de liaison. La pochette de liaison est délimitée par les sept domaines
transmembranaires et sert à accommoder le ligand au sein du récepteur (voir figure 3). Il est
connu que dans le cas des GPCRs ayant des ligands plus volumineux comme les peptides
(Ang II), le site de liaison se situe en partie dans les domaines transmembranaires et en partie
dans les régions extracellulaires (Schwartz, et al., 2006).
Différentes études utilisant des analogues de l‟Ang II en combinaison avec de la
mutagénèse dirigée ont permis l‟identification des déterminants moléculaires importants pour
la liaison de l‟Ang II. Les acides aminés essentiels à la liaison de l‟Ang II incluent les résidus
cystéines qui forment les ponts disulfures ainsi que plusieurs autres résidus situés dans la
partie supérieure du récepteur. Par exemple, les résidus chargés situés dans les domaines
transmembranaires, tels que la Lys-102(3.26)
dans le haut du TM3 ainsi que la Lys-199(5.42)
7
7
dans le haut du TM5, participent à la liaison du peptide (Yamano, et al., 1995; de Gasparo, et
al., 2000).
Initialement, on a formulé l‟hypothèse selon laquelle le groupement carboxyle en C-
terminal de l‟Ang II, de même que les chaines latérales Arg2, Tyr
4 et His
6 sont importants
pour la liaison et l‟activité du peptide (Khosla, et al., 1974; Hsieh and Marshall, 1986). Il a été
également démontré que le groupement C-terminal de la Phe8
forme une liaison ionique avec
la chaine latérale du résidu Lys-199(5.42)
du récepteur AT1 (Monnot, et al., 1996), alors que la
chaine latérale de la Tyr4 du peptide lierait le résidu N111 du récepteur AT1 (Feng, et al.,
1998). De plus, les chaines latérales des résidus His6
et Phe8 de l‟Ang II se retrouvent à
proximité des résidus His-256(6.51)
et Phe-259(6.54)
du récepteur AT1 (Noda, et al., 1995).
Des études de marquage par photoaffinité ont permis d‟identifier de façon plus directe
les points de contact entre l‟Ang II et son récepteur. Notamment, l‟Asp1 du ligand entre en
contact avec la 2ième
boucle extracellulaire du récepteur AT1 (Laporte, et al., 1999), alors que
la Val3
de l‟Ang II est à proximité du résidu Ile-172 dans la 2ième
boucle extracellulaire
(Boucard, et al., 2000), et que la Phe8
de l‟AngII est à proximité des résidus Phe-293(7.44)
et
Asn-294(7.45)
situé dans le 7ième
domaine transmembranaire (Perodin, et al., 2002).
Avec une autre approche de photomarquage par affinité qui exploite la préférence
marquée du groupement photosensible para-benzoyl-L-phenylalanine (Bpa) pour le résidu
méthionine (Methionine Proximity Assay (MPA)), tous les résidus qui sont à une proximité
de 8Å de la position 8 de l‟Ang II et qui sont donc situés dans la pochette de liaison du
récepteur AT1 ont été identifiés (Clement, et al., 2005; Clement, et al., 2009; Fillion, et al.,
2009; Fillion, et al., 2010; Fillion, et al., 2013). Parmi ces résidus, on retrouve Phe77(2.53)
situé
dans 2e domaine transmembranaire, Leu112
(3.36), Tyr113
(3.37) situés dans 3
e domaine
transmembranaire, Asn200(5.43)
dans 5e domaine transmembranaire, Phe249
(6.44), Trp253
(6.48),
His256(6.51)
,Thr260(6.55)
situés dans 6e domaine transmembranaire, Phe293
(7.44), Asn294
(7.45),
Asn295(7.46)
, Cys296(7.47)
et Leu297(7.48)
situés dans 7e domaine transmembranaire (Fillion, et
al., 2010).
En ce qui concerne le récepteur AT1, on peut déduire que l‟Ang II est capable de
pénétrer profondément dans la pochette de liaison constituée à la fois des domaines
transmembranaires et des domaines extracellulaires.
8
8
FIGURE 3 : Pochette de liaison du récepteur AT1 : Arrangement des domaines
transmembranaires autour de la pochette de liaison du récepteur AT1.
Méthode SCAM : identification de la pochette de liaison du récepteur AT1
L‟acide aminé cystéine qui possède un souffre dans sa chaîne latérale est souvent utilisé
pour étudier les relations entre la structure et la fonction d‟une protéine. En effet, la cystéine
est capable de former un lien disulfure avec toute autre molécule possédant un groupement
thiol libre. Cette propriété peut être exploitée pour modifier les cibles de façon covalente, ce
qui a mené au développement des agents capables de réagir spécifiquement avec les cystéines.
La cystéine demeure un bon choix pour substituer un résidu natif dans une protéine puisque sa
taille est intermédiaire et elle n‟a pas tendance à former des structures secondaires et donc ne
change pas la structure globale de la protéine.
Ainsi, Roberts et collaborateurs (Roberts, et al., 1986) ont développé des composés
méthanthiosulfonates (MTS), hautement séléctifs au groupement thiol permettant de modifier
de façon spécifique les cystéines. Il existe des MTS contenant un groupement
éthylammonium (MTSEA) ou éthylsulfonate chargé négativement (MTSES). Ces composés
peuvent modifier des protéines (cibles) contenant des cystéines pour y introduire une charge,
ainsi qu‟un certain encombrement stérique. L‟approche SCAM (Substituted Cysteine
Accessibility Method) consiste à remplacer tous les acides aminés, un à la fois, par une
cystéine et ensuite d‟évaluer l‟effet d‟un MTS sur les propriétés de liaison du récepteur
mutant.
Dans un premier temps, le SCAM a été utilisé pour caractériser les canaux ioniques
(Akabas, et al., 1992). Les résidus constituant le pore du canal forment une pochette
9
9
hydrophile par laquelle passent les ions et ainsi la modification de ces résidus par un
composé MTS bloque l‟accès aux ions, modifiant ainsi la fonctionnalité du canal. En absence
de modification des propriétés fonctionnelles, il y a deux explications possibles : soit la
cystéine introduite n‟a pas pu réagir avec le réactif MTS, soit la modification de la cystéine ne
cause pas de changement détectable de la fonctionnalité de la protéine.
Utilisation du SCAM afin de délimiter la pochette de liaison des GPCRs
Afin de mieux comprendre les propriétés moléculaires du récepteur AT1, nous avons
utilisé l‟approche SCAM (Akabas, et al., 1992; Javitch, et al., 1994; Javitch, et al., 1995) qui
permet d‟identifier les acides aminés faisant partie de la pochette de liaison du récepteur en
plus de déterminer l‟orientation des domaines transmembranaires lors de l‟activation du
récepteur. Cette approche est basée sur la réactivité de dérivés des méthanethiosulfonates
(MTS) ayant une spécificité pour les groupements sulfhydryls des cystéines (Cys). Parmi les
différents MTS disponibles sur le marché, le MTSEA (2-aminoethyl méthanethiosulfonates)
est un réactif chargé et hydrophile. Il réagit un milliard de fois plus rapidement avec les
thiols ionisés (RS¯) qu‟avec les thiols non-ionisés (RSH). Ainsi, seulement les cystéines
présentes dans le compartiment aqueux sont ionisées et peuvent réagir avec le MTSEA. La
méthode de SCAM consiste à vérifier l‟accessibilité du ligand dans la pochette de liaison suite
à la réaction entre le réactif MTS et les cystéines introduites de façon systématique par
mutagénèse dirigée dans les domaines transmembranaires.
La première étape consiste donc à remplacer de façon successive un par un chacun des
résidus dans un domaine transmembranaire par une cystéine. Ces récepteurs mutants sont par
la suite traités avec le réactif MTSEA et leur propriété de liaison est évaluée. La cystéine
située dans la pochette de liaison sera alkylée par le MTSEA, causant ainsi l‟encombrement
stérique qui interférera avec la liaison du ligand (figure 4). Par contre, si l‟alkylation n‟affecte
pas les propriétés de liaison du récepteur mutant, on déduit que la cystéine substituante n‟est
pas située dans la pochette de liaison.
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FIGURE 4 : Substituted Cysteine Accessibility Method (SCAM). Le MTSEA réagit
spécifiquement avec les cystéines libres. Il réagit un milliard de fois plus rapidement avec les
thiols ionisés (RS-) qu‟avec les thiols non-ionisés (RSH). Ainsi, seulement les cystéines dans
le compartiment aqueux sont ionisées et réagiront avec le MTSEA. La cystéine située dans la
pochette de liaison sera alkylée par le MTSEA, causant ainsi un encombrement stérique qui
interférera avec la liaison du ligand.
État basal versus état actif du récepteur
Les GPCRs sont des protéines dynamiques capables de transition entre de multiples
conformations (Lefkowitz, 2007). Ces diverses conformations sont en équilibre dynamique
avec les effecteurs intracellulaires et les ligands extracellulaires. Le modèle ternaire cubique a
été formulé pour décrire l‟interaction dynamique entre le récepteur, son ligand et sa protéine
G effectrice (Schwartz, et al., 2006).
De façon générale, la forme basale d‟un GPCR est la plus énergétiquement favorable en
absence de ligand. La liaison d‟un agoniste complet stabilise une conformation active du
récepteur, (augmente la population des récepteurs de conformation active aux dépens de la
population étant dans la conformation inactive) ce qui augmente l‟affinité du récepteur pour
11
11
une protéine effectrice intracellulaire et mène à une signalisation maximale. Pour leur part, les
agonistes partiels stabilisent une conformation active du récepteur de façon moins efficace
que les agonistes complets, sans toutefois produire une réponse maximale. Les antagonistes
neutres occupent le site de liaison du récepteur, mais n‟ont aucune influence sur l‟adoption
des diverses conformations du récepteur. En fait, les antagonistes ne font que bloquer l‟accès
de l‟agoniste au récepteur. Les agonistes inverses stabilisent la conformation inactive du
récepteur. La notion de l‟agoniste inverse a été proposée récemment, suite à la découverte de
l‟activité constitutive de certains récepteurs, qui peuvent donc adopter une conformation
active en absence d‟agoniste (Seifert and Wenzel-Seifert, 2002).
En absence du ligand, la majorité des GPCRs possèdent un faible niveau d‟activité
constitutive (Seifert and Wenzel-Seifert, 2002) (une sous-population des récepteurs ayant
assez d‟énergie pour être dans leur conformation active). Certaines mutations peuvent
déstabiliser la forme inactive d‟un GPCR et favoriser les conformations plus actives : ce sont
des mutants constitutivement actifs (CAM). Les CAM favorisent le déplacement de l‟état
inactif vers l‟état actif des GPCRs et par ce fait, offrent un précieux outil dans l‟identification
des résidus impliqués dans l‟activation des GPCRs. En plus des résidus identifiés à l‟aide des
mutants constitutivement actifs (CAM), on croit que les résidus hautement conservés dans les
GPCRs jouent un rôle essentiel dans le mécanisme d‟activation (Gether and Kobilka, 1998).
Dans les études visant à identifier et caractériser les mouvements des domaines
transmembranaires qui accompagnent l‟activation d‟un GPCR, il est nécessaire de discriminer
entre les conformations basales et actives du récepteur. Dans le cas du récepteur AT1,
l‟utilisation du mutant constitutivement actif s‟avère donc très appropriée pour représenter la
conformation active du récepteur, alors que l‟utilisation du récepteur de type sauvage est un
bon modèle de la conformation basale.
Activation constitutive du récepteur AT1
La découverte d‟une activité constitutive chez certains GPCRs qui peuvent activer leur
protéine G en absence d‟agoniste fut une avancée importante. Il est connu que certaines
mutations favorisent l‟augmentation de l‟activité constitutive.
Le récepteur AT1 fait partie d‟un large groupe de GPCRs démontrant une certaine
activité constitutive. Une légère activité constitutive du récepteur AT1 a été observée lors de
sa surexpression dans les cellules COS-1, causant ainsi une augmentation de l‟activité basale
de la PLCβ (Noda, et al., 1996). Ensuite, d‟autres études indépendantes ont elles aussi
démontré une importante augmentation de l‟activité constitutive du récepteur AT1 lorsque le
12
12
résidu Asn111(3.35)
situé dans le 3e domaine transmembranaire est remplacé par des résidus
moins encombrants tels que l‟alanine ou la glycine (Noda, et al., 1996; Balmforth, et al.,
1997; Groblewski, et al., 1997).
Il a été suggéré que les GPCRs dans leur état basal sont contraints dans une
conformation inactive favorisé par certaines interactions intramoléculaires. Suite à la liaison
d‟un agoniste ou sous la présence d‟une mutation spécifique, cette contrainte est libérée ce qui
favorise la conformation active d‟un récepteur. Il est bien connu que le résidu Asn-111 est
hautement mais non strictement conservé dans la classe A des GPCRs.
Activation des récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs)
Mécanisme moléculaires impliqués dans l‟activation des GPCRs
Afin de propager un signal vers l‟intérieur de la cellule, un GPCR doit adopter une
conformation active. Dans le modèle le plus simple de l‟activation des GPCRs, un ligand
agoniste complet stabilise une conformation active du récepteur, ce qui augmente l‟affinité de
ce dernier pour un ou des effecteurs intracellulaires et mène à une signalisation maximale.
Les GPCRs possèdent tous une structure commune dictée par l‟arrangement des sept
domaines transmembranaires dans la membrane plasmique (Palczewski, et al., 2000; Park, et
al., 2008; Rasmussen, et al., 2007; Rasmussen, et al., 2011). Plusieurs résidus et motifs
(D/ERY, NPxxY) conservés pour les GPCRs de la classe A ont été impliqués dans leur
processus d‟activation (Katritch, et al., 2013; Rosenbaum, et al., 2009).
L‟ensemble des informations disponibles suggère que tous les GPCRs pourraient
partager un mécanisme d‟activation commun (Rosenbaum, et al., 2009). En dépit de toutes les
informations disponibles, il reste encore beaucoup de travail à effectuer afin de déterminer les
différentes conformations qu‟adoptent les GPCRs au cours de leur transition de l‟état inactivé
à l‟état activé.
Mécanisme d‟activation du récepteur AT1 de l‟Ang II
Chez plusieurs GPCRs, une étape clé de l‟activation est un éloignement entre le TM3 et
le TM6 du côté cytoplasmique du récepteur (Gether, et al., 1997; Ballesteros, et al., 2001). Si
on bloque ce mouvement, on empêche l‟activation de la protéine G. Dans le cas du récepteur
AT1, il y a des évidences qui montrent qu‟une interaction forte entre le résidu Tyr-113(3.37)
situé dans le 3e domaine transmembranaire et His-256
(6.51) situé dans le 6
e domaine
transmembranaire favorise l‟état inactif du récepteur et empêche l‟activation de la protéine Gq
13
13
(production des inositols phosphates) (Miura, et al., 2006). Il a été démontré qu‟un
mouvement vers l‟extérieur du côté cytoplasmique du 6e domaine transmembranaire favorise
la flexibilité de la 3e boucle intracellulaire, ce qui favorise l‟adoption d‟une conformation
active, présentant un lieu d‟ancrage pour la protéine G (Martin, et al., 2007; Conchon, et al.,
1997).
Il existe différents motifs impliqués dans l‟activation des GPCRs. Un de ces motifs, le
motif D/ERY est celui qui a été le plus étudié. Les trois résidus composant ce motif sont une
Asp ou un Glu en position 3.49, une arginine en position 3.50 et une tyrosine en position 3.51.
Ce motif est situé sur le côté cytoplasmique du 3e domaine transmembranaire, à l‟interface de
la 2e boucle intracellulaire. Plusieurs études montrent que ce motif joue un rôle central dans la
régulation de l‟état conformationnel des GPCRs. L‟arginine(3.50)
est impliquée dans une
interaction ionique avec l‟aspartate (3.49)
adjacente ainsi qu‟avec un résidu chargé situé en
position 6.30 dans le TM6 afin de former ce qu‟on appelle la serrure ionique (« ionic lock »).
L‟interaction intramoléculaire entre ces 3 résidus serait importante pour le maintien du
récepteur dans sa forme inactive et cette interaction doit être brisée lors de l‟activation. Les
structures cristallines de la rhodopsine (Palczewski, et al., 2000) ainsi que du récepteur β2-
adrénergique (Yao, et al., 2006) semblent appuyer cette hypothèse. Dans le cas du récepteur
AT1, il n‟y a pas de résidu chargé négativement à la position 6.30 mais le motif DRY semble
jouer un rôle dans l‟activation de la protéine G et dans le recrutement de l‟arrestine. Par
exemple, en substituant l‟aspartate (3.49)
par des résidus plus petits (alanine ou glycine), on
empêche l‟activation de la protéine G mais on permet encore une signalisation indépendante
de la protéine G (Wei, et al., 2003; Seta, et al., 2002; Gaborik, et al., 2003).
Des études suggèrent que lors de l‟activation du récepteur de l‟urotensine, les résidus
du motif DRY sont impliqués dans une interaction directe avec la protéine G. En effet, une
mutation à l‟intérieur du motif DRY conduit souvent à une forme inactivable du récepteur par
rapport à la protéine G (Proulx, et al., 2008).
Un autre motif impliqué dans l‟activation des GPCRs est le motif NPxxY situé dans le 7e
domaine transmembranaire. Il a été suggéré que ce motif joue le rôle d‟un interrupteur
moléculaire qui serait important dans la transition du récepteur de la conformation basale vers
la conformation active. Selon cette hypothèse, le résidu Asn(7.49)
est orienté vers le 6e domaine
transmembranaire dans la conformation inactive du récepteur et suite à l‟activation, ce résidu
se réoriente de façon à interagir avec l‟Asp-74(2.50)
du 2e domaine transmembranaire.
Plusieurs études montrent l‟importance de l‟Asp-74 (2.50)
(Bihoreau, et al., 1993) ainsi que de
plusieurs autres résidus situés dans le 7e domaine transmembranaire (Tyr-292
(7.43), Asn-
14
14
294(7.45)
, Asn-298(7.49)
, Tyr-302(7.52)
) (Perodin, et al., 2002; Clement, et al., 2005; Balmforth, et
al., 1997; Miura, et al., 2003b; Laporte, et al., 1996) pour l‟activation du récepteur AT1.
L‟activation du récepteur AT1 dans cette section fait référence à l‟activation du
récepteur via la protéine G mais récemment il a été mis en évidence que le récepteur AT1 est
également capable d‟activer des voies de signalisation indépendantes de la protéine G, d‟où
l‟importance du concept de sélectivité fonctionnelle.
Sélectivité fonctionnelle
Concept de sélectivité fonctionnelle
L‟interaction d‟un ligand avec un récepteur est l‟un des fondements de la
pharmacologie. Cette interaction (ligand-récepteur) est à l‟origine des principaux paramètres
pharmacologiques que sont la capacité du ligand à lier le récepteur (affinité) et la capacité à
produire la réponse biologique (efficacité). Jusqu‟à tout récemment, on évaluait l‟efficacité
d‟un récepteur par sa capacité à activer une seule voie de signalisation. Il est maintenant bien
connu que le récepteur AT1 active plusieurs voies de signalisation en interagissant avec
différents effecteurs responsables de la variété d‟actions de l‟Ang II. Il est donc logique de
penser que divers ligands peuvent induire une variété de conformations d‟un GPCR et ainsi
inhiber ou activer plus ou moins sélectivement les diverses voies de signalisation en aval du
récepteur. C‟est le concept de sélectivité fonctionnelle (Galandrin, et al., 2007)(Kenakin,
2011; Violin and Lefkowitz, 2007; Rajagopal, et al., 2010) (Figure 5). Par exemple, une
certaine conformation du récepteur peut coupler plus efficacement à une voie de signalisation
X et moins bien à la voie Y. À l‟inverse, une autre conformation adoptée par le récepteur
activera plus efficacement la voie Y et moins bien la voie X.
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FIGURE 5 : Sélectivité fonctionnelle. Représentation schématique de divers ligands pouvant
induire diverses conformations d‟un même récepteur et pouvant activer ainsi diverses voies de
signalisation engendrant différentes conséquences fonctionnelles.
Pourquoi faire des études de sélectivité fonctionnelle?
L‟importance de la sélectivité fonctionnelle est qu‟elle permet de concevoir des ligands
plus sélectifs qui favoriseront un effet voulu au détriment des effets indésirables. La
sélectivité fonctionnelle trouve son importance dans le développement des nouveaux
médicaments que l‟on veut plus sélectifs. Comment y parvenir? En testant plusieurs ligands
ayant une structure chimique différente, il sera possible de déterminer les voies d‟activation
privilégiées par ces derniers. Dans un premier temps, à partir de ces données, il sera possible
de tirer les conclusions sur l‟influence de la structure chimique des ligands sur la voie
d‟activation privilégiée par le récepteur AT1. Par la suite, en faisant du modelage moléculaire,
il sera possible de déduire la conformation du récepteur efficace à activer l‟une ou l‟autre voie
de signalisation. Finalement, l‟étape ultime sera de designer des super ligands agonistes ou
antagonistes pour chacune des voies de signalisation.
La signalisation du récepteur AT1
Voies de signalisation impliquées dans l‟activité du récepteur AT1
La voie de signalisation classique du récepteur AT1 passe par la protéine Gq qui active
la phospholipase Cβ (PLCβ). La PLCβ hydrolyse le phosphatidyl inositol 4,5-bisphosphate
(PIP2) menant à la production de deux seconds messagers : l‟inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3)
et le diacylglycérol (DAG) (Kojima, et al., 1984; Balla, et al., 1986). Ces seconds messagers
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amplifient d‟autres cascades de signalisation. L‟IP3 active un récepteur/canal, l‟IP3R, dans le
réticulum endoplasmique et provoque une relâche du Ca2+
intracellulaire (Ferris, et al., 1992).
Le DAG active la protéine kinase C (PKC), une sérine/thréonine kinase qui phosphoryle des
substrats dans la cellule et ainsi module leur activité (Kanashiro and Khalil, 1998). Les
connaissances actuelles suggèrent que le récepteur AT1 interagit aussi avec d‟autres protéines
G hétérotrimériques telles que la protéine Gi responsable de l‟inhibition de l‟adenylyl cyclase
et la protéine G12/13 impliquée dans le remodelage du cytosquelette (Hunyady and Catt,
2006b; Mehta and Griendling, 2007).
L‟effet hypertrophique de l‟Ang II met en jeu l‟activation de plusieurs protéines
kinases. L‟Ang II régule l‟activité des kinases de la famille JAK (Ali, et al., 1997; Ali, et al.,
1998; Mascareno and Siddiqui, 2000) et de la famille Src (Seta, et al., 2002; Sayeski, et al.,
1998; Sayeski and Ali, 2003). Les kinases de la famille JAK stimulent la phosphorylation et
l‟activité de facteurs de transcription tels que les STATs (Signal Transducers and Activators
of Transcription) (Liang, et al., 1999; McWhinney, et al., 1998). Les kinases de la famille Src
(cSrc) peuvent phosphoryler de nombreuses protéines et mener à l‟activation de MAP kinases
(mitogen activated protein) telles que les ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases)
(Seta, et al., 2002; Kim, et al., 2009). L‟Ang II est aussi capable de réguler l‟activité de
certains récepteurs de facteurs de croissance (PDGF, EGFR, IGFR) (Mehta and Griendling,
2007; Heeneman, et al., 2000; Shah and Catt, 2003; Folli, et al., 1997).
Le récepteur AT1 serait également capable d‟activer des voies n‟impliquant pas les
protéines G (figure 6). Par exemple, le récepteur AT1 peut lier l‟arrestine, une protéine
d‟échafaudage qui favorise la désensibilisation et l‟internalisation du récepteur via les puits
tapissés de clathrine (Gaborik, et al., 2001; Hunyady, et al., 2000). En inhibant une voie de
signalisation, l‟arrestine peut également en activer d‟autres. Par exemple, l‟arrestine permet la
formation des complexes pouvant activer la voie des MAP kinases (JNK3 et ERK1/2) (Wei,
et al., 2003; McDonald, et al., 2000; Wei, et al., 2004). En plus d‟activer les MAP kinases via
les arrestines (Wei, et al., 2003), il est aussi connu que le récepteur AT1 peut activer les MAP
kinases via la protéine kinase C (Tian, et al., 1998) et via la transactivation du récepteur à
l‟EGF (epidermal growth factor) (Shah, et al., 2004).
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FIGURE 6 : Les différentes voies de signalisation du récepteur AT1 : Récepteur AT1 de l‟Ang
II peut activer plus d‟une voie de signalisation en interagissant avec différents effecteurs.
Récepteur AT1 peut activer les voies de signalisation dépendante ou indépendante de la
protéine G.
Activation de la voie de MAPK/ERK par le récepteur AT1
Les voies de signalisation impliquant les MAP kinases contrôlent des processus
cellulaires importants tels que la croissance, la différenciation et la prolifération cellulaire. Ce
sont des protéines kinases qui catalysent la phosphorylation d‟autres protéines (enzymes,
facteurs de transcription) afin de les activer. L‟activation des MAP kinases se fait en cascade :
la protéine sérine/thréonine MAPK kinase kinase (Raf) phosphoryle MAPK kinase
(MEK1/2) et cette cascade de phosphorylation se poursuit par l‟activation des MAPK
(ERK1/2) (Rozengurt, 2007).
Comme déjà mentionné, le récepteur AT1 peut activer les ERK1/2, une des voies des
MAP kinases, de trois façons différentes : par une voie dépendante de la protéine Gq et
impliquant la protéine kinase C, par la transactivation du récepteur tyrosine kinase (EGFR) ou
par une voie indépendante de la protéine Gq et impliquant les arrestines.
18
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L‟activation des ERK1/2 passant par la voie de la protéine Gq met en jeu la PKC. Cette
dernière est responsable de la phosphorylation de cibles en amont de la cascade de
signalisation des ERK1/2. La PKC active une petite protéine G, la protéine Ras, qui interagit
avec la kinase Raf initiant l‟activation de la cascade de signalisation impliquant Raf, Mek1/2
et ERK1/2 (Tian, et al., 1998).
L‟activation de la voie des ERK1/2 n‟impliquant pas la protéine G passe par les
arrestines. Les arrestines favorisent le recrutement des complexes protéiques menant vers
l‟activation de MAP kinases (Wei, et al., 2003; Wei, et al., 2004).
L‟Ang II peut aussi activer les ERK1/2 via la transactivation du récepteur de l‟EGFR.
La transactivation de l‟EGFR est initiée par une augmentation du Ca2+
intracellulaire,
l‟activation de la PKC et de la kinase Src. Src active une métalloprotéinase (MMP) relâchant
le ligand EGF (epidermal growth factor) lié à l‟héparine (HB-EGF). La liaison du ligand EGF
entraîne un changement conformationnel de l‟EGFR et sa dimérisation. La dimérisation
favorise une autophosphorylation au niveau des résidus tyrosine dans la queue cytoplasmique
du récepteur. Cette phosphorylation crée des sites d‟ancrage pour d‟autres protéines
adaptatrices possédant les domaines SH2, et recrute ensuite le complexe Shc-Grb2-Sos. Ceci
permet l‟activation de la petite protéine G Ras menant à l‟activation des MAP kinases
impliquant Raf, Mek1/2 et ERK1/2 (Hunyady and Catt, 2006b; Mehta and Griendling, 2007).
La transactivation de l‟EGFR par le récepteur AT1 a été démontrée dans plusieurs tissus tels
que le foie, le rein, la prostate, le cœur et les cellules musculaires lisses vasculaires (Thomas,
et al., 2004).
Des études récentes montrent que l‟activation de ERK1/2 par la voie dépendante de la
protéine G (PKC) possède un profil cinétique très différent de l‟activation de ERK1/2 par la
voie indépendante de la protéine G (les arrestines) (Ahn, et al., 2004). L‟activation d‟ERK1/2
par la PKC est un phénomène rapide et transitoire favorisant la translocation des ERKs dans
le noyau et la transcription du gène c-Fos. Par contre l‟activation des ERKs par les arrestines
est un phénomène beaucoup plus lent et plus soutenu dans le temps et ERK activé reste dans
les compartiments cytosoliques (Wei, et al., 2003; Wei, et al., 2003; Ahn, et al., 2004; Ahn,
et al., 2004; Aplin, et al., 2007; Tohgo, et al., 2002).
Les conséquences moléculaires semblent aussi différer en fonction de la voie
d‟activation de ERK1/2. L‟activation des ERKs par les arrestines est associée aux phénotypes
cardioprotecteurs tels que la survie cellulaire (Ahn, et al., 2009b), la régulation de la
contraction cellulaire (Rajagopal, et al., 2006) et la migration (Hunton, et al., 2005). Dans les
études faites au niveau du cœur et de cardiomyocytes isolés, l‟activation de la voie des
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arrestines favorise la croissance et l‟hypertrophie (Zhai, et al., 2005), la prolifération des
cardiomyocytes (Aplin, et al., 2007; Hansen, et al., 2008), et une augmentation au niveau de
leur contractilité (Rajagopal, et al., 2006; Violin, et al., 2010). Dans les cellules musculaires
lisses vasculaires, la signalisation via les arrestines augmente la synthèse protéique en
interagissant avec la MAP kinase interacting kinase 1 (Mnk-1) (DeWire, et al., 2008) et
protège contre l‟apoptose par la phosphorylation de BAD (Ahn, et al., 2009)
Méthodes utilisés pour mesurer l‟activation de différentes voies de signalisation
Production des inositols phosphates
Nous avons mesuré l‟activation de la voie Gq/PLC/IP3/Ca2
par un immunoessai
compétitif IPone HTRF (homogeneous time resolved fluorescence) développé par la
compagnie Cisbio.Cet immunoessai mesure l‟accumulation de l‟IP1 en présence de LiCl qui
bloque la conversion de l‟IP1 en myoinositol. Le signal spécifique est généré entre l‟anticorps
dirigé contre l‟IP1 et l‟IP1 synthétique couplé à l‟accepteur fluorophore. Suite à la stimulation
du récepteur, l‟IP1 provenant de la dégradation de l‟IP3 rentre en compétition avec l‟IP1
synthétique pour la liaison à l‟anticorps ce qui produit une baisse du signal de fluorescence.
Donc, le transfert de l‟énergie est inversement proportionnel à la concentration de l‟IP1
produit suite à la stimulation du récepteur dans le lysat cellulaire.
Activation de la voie des ERKs
Afin de vérifier l‟état de l‟activation des ERK1/ 2, nous avons utilisé l‟essai Alpha
Screen Sure Fire (Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay). Dans cet essai, un
premier anticorps, reconnaissant la forme phosphorylée de ERK, est capturé par une bille
enrobée de protéine A (bille accepteuse). Un deuxième anticorps, reconnaissant ERK, est
biotinylé et capturé par une bille enrobée de streptavidine (bille donneuse). Les deux billes
sont à proximité seulement s‟il y a présence de ERK phosphorylé. Lorsque les deux billes
sont à proximité, l‟excitation de la bille donneuse par AlphaScreen libère le radical libre O2
qui excite la bille accepteuse, et cette dernière émet alors de la lumière. L‟activation de
ERK1/2 est proportionnelle à la quantité de la lumière émise par la bille accepteuse.
20
20
Recrutement de l‟arrestine et l‟activation de la voie G12
Afin de vérifier l‟activation de la voie G12 et le recrutement de l‟arrestine (β1-arrestine
et β2-arrestine), nous avons utilisé l‟essai BRET. L‟essai BRET est fondé sur le transfert
d‟énergie entre un donneur bioluminescent et un accepteur fluorescent. Pour qu‟il y ait un
transfert d‟énergie, le donneur et l‟accepteur doivent être situé à la proximité (10-100Å). La
méthode BRET utilise une luciférase RLuc dont le substrat est la coelenterazine. En présence
de l‟oxygène, la luciférase favorise la transformation du substrat coelenterazine en
coelenteramide en émettant une légère lumière visible dans le bleu (395nm). Lorsqu‟un
possible accepteur est situé à proximité de cette source lumineuse, la lumière bleu est captée
par l‟accepteur, dans ce cas la protéine GFP10. L‟excitation de cette dernière (GFP10)
entraîne l‟émission d‟une lumière verte à 510nm. L‟efficacité du transfert d‟énergie du
complexe Rluc à la GFP10 est déterminée par le rapport entre l‟intensité d‟émission de
l‟accepteur (lumière verte) sur l‟intensité d‟émission du donneur (lumière bleu). Pour le
recrutement des arrestines, nous avons utilisé la construction RLuc fusionné avec les
arrestines (β1 ou β2 arrestine) et la protéine GFP10 fusionnée avec le récepteur AT1. Pour
l‟activation de la voie G12, nous avons utilisé la construction de RLuc fusionnée avec la
protéine G12 et la protéine GFP10 fusionnée avec la sous-unité gamma de la protéine G
(Ggamma).
Calcul du biais de signalisation
Dans l‟objectif d‟identifier efficacement la signalisation biaisée de différents analogues
de l‟Ang II et de faciliter la compréhension des données, nous avons utilisé la méthode
proposée par le groupe de Kenakin nous permettant de calculer le biais de signalisation
(Kenakin, et al., 2012). Les ratios de transduction log(τ/Ka) ont été calculé en utilisant le
logiciel GraphPad Prism. Le ratio de transduction représente une estimation de l‟effet
(puissance et efficacité) d‟un analogue sur la conformation du récepteur et par la suite sur
l‟interaction du complexe ligand-récepteur avec les effecteurs intracellulaires. Afin d‟évaluer
le biais à l‟intérieur d‟une voie de signalisation donnée, il faut comparer le comportement
d‟un ligand avec le ligand de référence. L‟Ang II a été capable de produire une réponse
maximale ayant des puissances semblables pour toutes les voies de signalisation que nous
avons testées, et nous l‟avons choisi pour être notre ligand de référence. En comparant le
log(τ/Ka) du ligand de référence (Ang II) à la valeur du log(τ/Ka) de chaque analogue testé
pour une voie de signalisation, nous avons pu établir le biais à l‟intérieur d‟une voie de
21
21
signalisation donnée, soit le Δlog(τ/Ka). Afin d‟évaluer le biais entre les différentes voies de
signalisation pour chaque analogue, nous avons calculé le ΔΔlog(τ/Ka) et le facteur biaisé.
ΔΔ(τ/Ka) a été calculé en comparant la valeur du Δlog(τ/Ka) pour une voie de signalisation
versus la valeur du Δlog(τ/Ka) d‟une autre voie de signalisation. Le facteur biaisé représente
la base de 10 de la valeur calculée du ΔΔlog(τ/Ka).
Importance de la sélectivité fonctionnelle du récepteur AT1
Le récepteur AT1 fut un des premiers récepteurs pour lequel l‟importance de la
signalisation biaisée a été démontrée. Le récepteur AT1 joue un rôle important dans la
régulation de la pression sanguine et une suractivité peut mener à plusieurs pathologies telles
que l‟hypertension, la dysfonction rénale ainsi que l‟insuffisance cardiaque.
Les études de mutagénèse sur le récepteur AT1 montrent qu‟en bloquant sa capacité à
activer la protéine Gq, on n‟affecte pas sa phosphorylation, son internalisation, son
recrutement ainsi que sa signalisation via l‟arrestine (Wei, et al., 2003; Gaborik, et al., 2003).
Il a été démontré que l‟activation de la signalisation β-arrestine via le récepteur AT1 favorise
les effets cardioprotecteur et anti-apoptotique (Ahn, et al., 2009b; Rakesh, et al., 2010). Suite
à une délétion du récepteur AT1 ou des arrestines, le stress mécanique au niveau du cœur
induit l‟apoptose, suggérant que la signalisation via les β-arrestines par le récepteur AT1 est
cardioprotectrice (Rakesh, et al., 2010).
Les propriétés de l‟analogue [Sar1,Ile
4,Ile
8]Ang II (SII) qui active la voie des ERKs en
absence de production d‟inositol phosphate l‟ont fait reconnaître comme l‟un des premiers
ligands biaisés (Holloway, et al., 2002). D‟autres travaux montrent que SII améliore la
contractilité des cardiomyocytes chez la souris via la signalisation dépendante de la β-
arrestine et ceci en absence de la signalisation dépendante de la protéine Gq (Rajagopal, et al.,
2006). D‟autres expériences faites avec le SII montrent qu‟il cause une diminution de
l‟apoptose, qu‟il stimule la chimiotaxie, qu‟il augmente la contractilité cardiaque, la
croissance et la prolifération cellulaire (Aplin, et al., 2007; Ahn, et al., 2009b; Rajagopal, et
al., 2006; Hunton, et al., 2005; DeWire, et al., 2008). Il a également été suggéré que le ligand
biaisé SII et l‟Ang II stabilisent différentes conformations actives du récepteur AT1 (Sauliere,
et al., 2012).
Sadoshiwa et al ont généré des souris transgéniques qui surexpriment le récepteur AT1
de type sauvage et un mutant du récepteur AT1 incapable de coupler à la protéine Gq. Bien
que les deux groupes de souris aient développé une hypertrophie cardiaque suite à une
22
22
stimulation chronique par l‟Ang II, il y a eu moins d‟apoptose et de fibrose au niveau du
myocarde des souris exprimant le récepteur AT1 incapable de coupler à la protéine Gq (Zhai,
et al., 2005). Ceci porte à croire que ces deux aspects (fibrose et apoptose) impliqués dans la
progression de la maladie sont potentiellement reliés à l‟activité de la voie de signalisation
dépendante de la protéine Gq.
Les antagonistes du récepteur AT1 tel le losartan, utilisé couramment en clinique pour
traiter l‟hypertension, bloquent toutes les voies de signalisation en aval du récepteur. Par
contre, il serait intéressant de développer une nouvelle génération d‟antagonistes capables de
bloquer sélectivement une voie de signalisation et n‟influençant pas l‟activation des autres
voies de signalisation. Par ce fait même, on pourrait espérer développer des médicaments
pouvant contrôler sélectivement certains aspects de la fonction du récepteur où le contrôle de
la pression artérielle serait influencé indépendamment de la croissance pathologique des
cardiomyocytes ou des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC).
Problématique
Une connaissance approfondie de la structure moléculaire du récepteur, en particulier de
la topologie de la pochette de liaison ainsi que des changements structuraux associés à
l‟activation du récepteur est requise pour le développement de nouveaux outils
thérapeutiques. L‟élucidation de la pochette de liaison d‟un GPCR fournit des informations
importantes sur les mécanismes de reconnaissance moléculaire entre une hormone et son
récepteur. L‟interaction spécifique entre l‟hormone et son récepteur se fait au niveau de la
pochette de liaison. Les sept TM des GPCRs contribuent à former la pochette de liaison du
ligand. Il existe différentes approches biochimiques pour étudier la structure moléculaire d‟un
GPCR. Nous proposons d‟utiliser l‟approche SCAM (Substituted Cysteine Accessibility
Method) qui nous permettra de caractériser la pochette de liaison en identifiant les résidus de
chaque domaine transmembranaire impliqués dans sa formation. De plus, en utilisant le
mutant constitutivement actif N111G-AT1, l‟approche SCAM nous aidera à déterminer la
position relative de chaque domaine transmembranaire suite à l‟activation du récepteur. Ces
résultats seront utiles pour élaborer un modèle moléculaire de la pochette de liaison du
récepteur AT1 de l‟Ang II. Afin d‟améliorer ce modèle, nous allons étudier les différents
changements conformationels se produisant lors de l‟activation du récepteur. Au cours des
dernières années, il est devenu de plus en plus évident que le récepteur AT1 peut activer plus
23
23
d‟une voie de signalisation en interagissant avec différents effecteurs intracellulaires. Le
concept de sélectivité fonctionnelle suggère que différents ligands peuvent induire différentes
conformations du récepteur et ainsi favoriser l‟activation ou l‟inhibition de certaines voies de
signalisation. Nous proposons donc de tester les propriétés fonctionnelles d‟une série
d‟analogues de l‟Ang II possédant des structures chimiques différentes et possiblement des
propriétés pharmacologiques distinctes. Ces ligands nous donneront l‟information par rapport
à la sélectivité fonctionnelle en identifiant les voies de signalisation préférentiellement
activées ou inhibées par ces derniers. Les données obtenues serviront à améliorer notre
modèle moléculaire du récepteur AT1.
Objectifs
1ère
et 2ième
publication
1. Déterminer la pochette de liaison du récepteur AT1 avec l‟approche de SCAM
2. Identifier les résidus du TM2 et du TM5 qui participent dans la formation de la pochette de
liaison du récepteur AT1 et de son mutant constitutivement actif AT1-N111G
3. Déterminer le type de mouvement qui se produit lorsque le récepteur passe de la forme
inactive vers la forme active
3ième
publication
1.Étudier la sélectivité fonctionnelle de différents ligands analogues de l‟Ang II
2. Évaluer la puissance (EC50) et l‟efficacité (Emax) des différents analogues de l‟Ang II à
activer sélectivement une voie de signalisation.
1. Gq/PLC
2. G12
3. Le recrutement des arrestines
4. La voie de MAP kinases (PKC-ERK et EGFR-ERK)
24
24
ARTICLE 1
The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor participates in
the formation of the ligand binding pocket and undergoes integral pivoting movement during
the process of receptor activation
Ivana Domazet, Brian J. Holleran, Stéphane S. Martin, Pierre Lavigne, Richard Leduc,
Emanuel Escher and Gaétan Guillemette.
J. Biol. Chem, 284: 11922-11929 (2009).
Statut de l’article: publié dans Journal of Biological Chemistry .
Référence : Domazet I., Holleran B.J., Martin S.S, Lavigne P., Leduc R., Escher E. &
Guillemette G. (2009). The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II
receptor participates in the formation of the ligand binding pocket and undergoes integral
pivoting movement during the process of receptor activation. J. Biol. Chem. 284 (18): 11922-
9.
Avant-propos: J‟ai dirigé cette étude et produit toutes les manipulations de ce manuscrit. J‟ai
rédigé la première version de ce manuscrit.
25
25
Résumé : L‟angiotensine II, une hormone jouant un rôle important dans l‟homéostasie
cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT1 qui appartient à
la grande famille des GPCRs. Comme tous les autres GPCRs, le récepteur AT1 possède sept
domaines transmembranaires (TM) qui contribuent à former la pochette de liaison du ligand.
Afin d‟identifier les acides aminés du TM2 impliqués dans la formation de la pochette de
liaison du récepteur AT1, nous avons utilisé l‟approche SCAM (Substituted Cysteine
Accessibility Method) qui consiste à évaluer les propriétés de liaison du récepteur suite à sa
réaction avec le methanethiosulfonate (MTSEA). Le MTSEA alkyle les cystéines endogènes
ou introduites par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement stérique qui interfèrera
avec la liaison du ligand. Une série de mutants ont été produits en remplaçant successivement
par une cystéine les résidus 70 à 94 du TM2 du récepteur AT1 et de son mutant
constitutivement actif AT1-N111G. Après le prétraitement avec le MTSEA, les mutants
D74C, L81C, L83C, A85C, A89C ont montré une diminution significative d‟affinité pour le
ligand 125
ISar1, Ile
8AngII, suggérant que ces résidus sont orientés dans la pochette de liaison
du récepteur AT1. Des résultats différents ont été obtenus dans le cas du récepteur N111G-
AT1. Le mutant D74C-N111G est devenu insensible au MTSEA, alors que la sensibilité de
L81C-N111G fut grandement diminuée. Par contre, le mutant V86C-N111G s‟est avéré
sensible au MTSEA. Ces résultats suggèrent que l‟activation constitutive du récepteur AT1
implique un mouvement de pivot du TM2, favorisant le rapprochement du haut du TM2 vers
la pochette de liaison.
26
26
The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor participates in
the formation of the ligand binding-pocket and undergoes integral pivoting movement during
the process of receptor activation
Ivana Domazet, Brian J. Holleran, Stéphane S. Martin, Pierre Lavigne, Richard Leduc,
Emanuel Escher, and Gaétan Guillemette
Department of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de
Sherbrooke, Sherbrooke,
Quebec, Canada, J1H 5N4
Running title: SCAM method to study the ligand-binding pocket of the hAT1 receptor
Corresponding author: Gaétan Guillemette, Ph.D., Department of Pharmacology, Faculty of
Medicine, Université de Sherbrooke, 3001 12th Avenue North, Sherbrooke, Quebec, Canada,
J1H 5N4, Tel.: (819) 564-5347, Fax: (819) 564-5400, E-mail:
Gaetan.Guillemette@USherbrooke.ca
27
27
The octapeptide hormone angiotensin II (AngII) exerts a wide variety of cardiovascular
effects through the activation of the angiotensin II type-1 (AT1) receptor, which belongs to the
G protein-coupled receptor superfamily. Like other G protein-coupled receptors, the AT1
receptor possesses seven transmembrane domains that provide structural support for the
formation of the ligand-binding pocket. In order to identify those residues in the second
transmembrane domain (TMD2) that contribute to the formation of the binding pocket of the
AT1 receptor, we used the substituted cysteine accessibility method. All the residues within
the Leu-70 to Trp-94 region were mutated one at a time to a cysteine, and, after expression in
COS-7 cells, the mutant receptors were treated with the sulfhydryl-specific alkylating agent
methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA). MTSEA reacts selectively with water-
accessible, free sulfhydryl groups of endogenous or introduced point mutation cysteines. If a
cysteine is found in the binding pocket, the covalent modification will affect the binding
kinetics of the ligand. MTSEA substantially decreased the binding affinity of D74C-AT1,
L81C-AT1, A85C-AT1, T88C-AT1, and A89C-AT1 mutant receptors, which suggests that
these residues orient themselves within the water-accessible binding pocket of the AT1
receptor. Interestingly, this pattern of acquired MTSEA sensitivity was altered for TMD2
reporter cysteines engineered in a constitutively active N111G-AT1 receptor background.
Indeed, mutant D74C-N111G-AT1 became insensitive to MTSEA, whereas mutant L81C-
N111G-AT1 lost some sensitivity and mutant V86C-N111G-AT1 became sensitive to
MTSEA. Our results suggest that constitutive activation of the AT1 receptor causes TMD2 to
pivot, bringing the top of TMD2 closer to the binding pocket and pushing the bottom of
TMD2 away from the binding pocket.
Introduction
The octapeptide hormone angiotensin II (AngII)6 is the active component of the renin-
angiotensin system. It exerts a wide variety of physiological effects, including vascular
contraction, aldosterone secretion, neuronal activation, and cardiovascular cell growth and
proliferation (1). Virtually all the known physiological effects of AngII are produced through
the activation of the AT1 receptor, which belongs to the G protein-coupled receptor (GPCR)
superfamily (2, 3). GPCRs possess seven transmembrane domains (TMDs), which provide
structural support for signal transduction. The AT1 receptor interacts with the G protein Gq/11,
which activates a phospholipase C, which in turn generates inositol 1,4,5-trisphosphate and
diacylglycerol from the cleavage of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (4, 5). Inositol
28
28
1,4,5-trisphosphate causes the release of Ca2+
from an intracellular store whereas
diacylglycerol activates protein kinase C.
Like other GPCRs, the AT1 receptor undergoes spontaneous isomerization between its
inactive state (favored in the absence of agonist) and its active state (induced or stabilized by
the agonist) (6). Movement of TMD helices through translational or rotational displacement is
believed to be essential to achieve the active state (7, 8). It has been proposed that TMD3,
TMD5, TMD6, and TMD7 may participate in the activation process of the AT1 receptor by
providing a network of interactions through the AngII-binding pocket (9). The dynamics of
this network are thought to be modified following agonist binding, thereby forcing the
receptor to form new interactions between the TMDs.
Based on homology with the high resolution structure of rhodopsin, the archetypal
GPCR (10), it was expected that the binding site of the AT1 receptor would involve the seven
mostly hydrophobic TMDs and would be accessible to charged water-soluble ligands, like
AngII. For this receptor, the binding site would thus be contained within a water-accessible
crevice, the binding pocket, extending from the extracellular surface of the receptor to the
transmembrane portion. Using a photoaffinity labeling approach, we directly identified
ligand-contact points within the second extracellular loop and the seventh TMD of the AT1
receptor (11-13). Interestingly, numerous mutagenesis studies have provided the basis for a
model in which an interaction between Asn-111 in TMD3 and Tyr-292 in TMD7 maintains
the AT1 receptor in the inactive conformation. The agonist AngII would disrupt this
interaction and promote the active conformational state (14). In support of this model, it was
further shown that substitution of Asn-111 for a residue of smaller size (Ala or Gly) confers
constitutive activity on the AT1 receptor (15-17).
The substituted cysteine accessibility method (SCAM) (18-20) is an ingenious approach
for systematically identifying the residues in a TMD that contribute to the binding site pocket
of a GPCR. Consecutive residues within TMDs are mutated to cysteine, one at a time, and the
mutant receptors are expressed in heterologous cells. If ligand binding to a cysteine-
substituted mutant is unchanged compared with wild-type receptor, it is assumed that the
structure of the mutant receptor, especially around the binding site, is similar to that of the
wild-type and therefore that the substituted cysteine lies in a similar orientation to that of the
wild-type residue. In TMDs, the sulfhydryl of a cysteine oriented toward the binding site
pocket should react faster with a positively charged sulfhydryl reagent like
methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA) than sulfhydryls facing the interior of the
protein or the lipid bilayer. Two criteria are used for identifying engineered cysteines on the
29
29
surface of the binding-site pocket: (i) the reaction with MTSEA alters binding irreversibly and
(ii) the reaction is retarded by the presence of ligand. We previously used this approach to
identify the residues in TMD3, TMD6, and TMD7 that form the surface of the binding site
pocket in the wild-type AT1 receptor and in the constitutively active N111G-AT1 receptor
(21-23). Here we report the application of SCAM to probe TMD2 in the wild-type and
constitutively active receptors.
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Materials –Bovine serum albumin, bacitracin, and soybean trypsin inhibitor were from
Sigma. The sulfhydryl-specific alkylating reagent MTSEA (CH3SO2-SCH2CH2NH3+) was
purchased from Toronto Research Chemicals, Inc. (Toronto, Canada). The cDNA clone for
the human AT1 receptor subcloned in the mammalian expression vector pcDNA3 was kindly
provided by Dr. Sylvain Meloche (Université de Montréal). LipofectAmine2000
and culture
media were obtained from Invitrogen. 125
I-[Sar1, Ile
8]AngII (specific radioactivity ~1500
Ci/mmol) was prepared with Iodo-GEN
(Perbio Science, Erembodegem, Belgium)
according to the method of Fraker and Speck (24)and as previously reported (25).
Numbering of Residues in TMD2 -Residues in TMD2 of the human AT1 receptor were
given two numbering schemes. First, residues were numbered according to their positions in
the human AT1 receptor sequence. Second, residues were also indexed according to their
position relative to the most conserved residue in the TMD in which it is located (26). By
definition, the most conserved residue was assigned the position index ″50″ (e.g. in TMD2,
Asp74 is the most conserved residue and was designated Asp-74(2.50)
, whereas the upstream
residue was designated Leu-75(2.51)
and the downstream residue, Ala-73(2.49)
. This indexing
simplified the identification of aligned residues in different GPCRs.
Oligodeoxynucleotide Site-directed Mutagenesis -Site-directed mutagenesis was
performed on the wild-type AT1 receptor with the overlap PCR method (Expand High
Fidelity PCR System; Roche Applied Science). Briefly, forward and reverse oligonucleotides
were constructed to introduce cysteine mutations between Leu-70(2.46)
and Trp-94(2.70)
. PCR
products were subcloned into the HindIII-XbaI sites of the mammalian expression vector
pcDNA3.1. Site-directed mutations were then confirmed by automated DNA sequencing by
aligning the AT1 sequence with multiAlin (26).
Cell Culture and Transfection -COS-7 cells were grown in Dulbecco‟s modified
Eagle‟s medium (DMEM) containing 2 mM L-glutamine and 10% (v/v) fetal bovine serum.
30
30
The cells were seeded into 100-mm culture dishes at a density of 2 x 106 cells/dish. When the
cells reached ~90% confluence, they were transfected with 4 g of plasmid DNA and 15 l of
lipofectAmine2000
. After 24 h, transfected cells were trypsinized, distributed into 12-well
plates, and grown for an additional 24 h in complete DMEM containing 100 IU/ml penicillin
and 100 g/ml streptomycin before the MTSEA treatment and binding assay.
Binding Experiments -COS-7 cells were grown for 36 h post-transfection in 100-mm
culture dishes, washed once with phosphate-buffered saline (PBS), and subjected to one
freeze-thaw cycle. Broken cells were then gently scraped into washing buffer (25 mM Tris-
HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2), centrifuged at 2500 X g for 15 min at 4 oC, and
resuspended in binding buffer (25 mм Tris-HCl, pH 7.4, 100 mм NaCl, 5 mм MgCl2, 0.1%
bovine serum albumin, 0.01% bacitracin, 0.01% soybean trypsin inhibitor). Saturation
binding experiments were done by incubating broken cells (20-40 g of protein) for 1 h at
room temperature with increasing concentrations of 125
I-[Sar1,Ile
8]AngII in a final volume of
500 µl. Nonspecific binding was determined in the presence of 1 µм unlabeled
[Sar1,Ile
8]AngII. Bound radioactivity was separated from free ligand by filtration through
GF/C filters presoaked for at least 3 h in binding buffer. Receptor-bound radioactivity was
evaluated by -counting.
Treatment with MTSEA -MTSEA treatment was performed according to the procedure
of Javitch et al. (18), with minor modifications. Two days after transfection, the cells, which
were grown in 12-well plates, were washed with PBS and incubated for 3 min at room
temperature with freshly prepared MTSEA at the desired concentrations (typically from 0.5 to
6 mм) in a final volume of 0.2 ml. The reaction was stopped by washing the cells with ice-
cold PBS. Intact cells were then incubated in binding medium (DMEM, 25 mм HEPES, 0.1%
bovine serum albumin, pH 7.4) containing 0.05 nм 125
I-[Sar1,Ile
8]AngII for 90 min at room
temperature. After washing with ice-cold PBS, the cells were lysed with 0.1 ɴ NaOH, and the
radioactivity was evaluated by -counting. The percentage of fractional binding inhibition was
calculated as (1- (specific binding after the MTSEA treatment/specific binding without the
treatment)) × 100.
TABLE1
Binding Properties of [Sar1, Ile
8]AngII to cysteine-substitued hAT1 mutant receptors
Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described under the
″Experimental Procedure". Binding affinities (Kd) and maximal binding capacities (Bmax) are
expressed as the means ± S.D. of values obtained in n independent experiments performed in
31
31
duplicate. Mutants P82C, W84C, Y87C, Y92C, and W94C did not demonstrate any
detectable binding.
Kd (nM) Bmax (fmol/mg) n
WT (Cys76
) 0.6 ± 0.3 4282 ± 903 11
L70C 0.7 ± 0.2 1428 ± 796 4
A71C 0.9 ± 0.3 2729 ± 523 3
L72C 0.4 ± 0.2 1923 ± 549 4
A73C 0.4 ± 0.1 1814 ± 309 3
D74C 1.2 ± 0.7 1141 ± 320 4
L75C 0.9 ± 0.4 1405 ± 232 3
F77C 3.1 ± 0.6 2256 ± 478 3
L78C 0.4 ± 0.1 1412 ± 300 3
L79C 0.5 ± 0.2 1833 ± 1020 3
T80C 0.3 ± 0.0 1918 ± 711 3
L81C 4.0 ± 1.3 2415 ± 872 3
L83C 1.8 ± 0.2 1288 ± 691 3
A85C 0.9 ± 0.3 1074 ± 405 4
V86C 0.6 ± 0.3 1709 ± 140 3
T88C 3.2 ± 1.9 5633 ± 72 3
A89C 0.5 ± 0.1 1061 ± 451 3
M90C 1.6 ± 1.0 490 ± 20 3
E91C 2.1 ± 0.6 1622 ± 950 3
R93C 0.8 ± 0.3 1152 ± 67 3
32
32
FIGURE 1. Schematic representation of the human AT1 receptor. The numbers indicate
the positions of cysteines and other residues in the receptor. The gray closed circles represent
cysteine residues that are thought to be linked via disulfide bridges, and the black closed
circles represent cysteine residues whose side chains do not form a disulfide bridge. Mutated
TMD2 residues are located between Leu70
and Trp94
inclusively. Potential N-glycosylation
sites (Asn4, Asn
176, and Asn
18) are indicated. Asn
111 in TMD3 is also shown in gray.
Protection against MTSEA reaction by [Sar1,Ile
8]AngII –Transfected cells grown in
12-well plates were washed once with PBS and incubated in the presence or absence of 100
nм [Sar1,Ile
8]AngII for 1 h at 16
oC (to avoid internalization of receptors). The cells were
washed to remove excess ligand and then treated with MTSEA. The cells were washed three
times with ice-cold PBS and once with an acidic buffer (150 mм NaCl, 50 mм acetic acid, pH
3.0) to dissociate bound ligand. They were then incubated for 3 h at 16oC in binding medium
(DMEM, 25 mм HEPES, 0.1% bovine serum albumin, pH 7.4) containing 0.05 nм 125
I-[Sar1,
Ile8]AngII. The percentage of protection was calculated as ((inhibition in the absence of [Sar
1,
Ile8]AngII) - (inhibition in the presence of [Sar
1,Ile
8]AngII)/(inhibition in the absence of [Sar
1,
Ile8]AngII)) ×100.
Phospholipase C assay- Inositol phosphates accumulation was determined as
described previously (27). In brief, COS-7 cells were seeded in 6-well plates, transfected, and
33
33
labeled for 16 h in serum-free M199 containing 10 Ci/ml [myo-3H]inositol (MP
Biomedicals, Solon, OH). Cells were washed twice with PBS plus 0.1% (w/v) dextrose and
then incubated in stimulation buffer (DMEM containing 25mм HEPES, 10mм LiCl, and 0.1%
bovine serum albumin, pH 7.4) for 30 min at 37°C. Incubations were terminated by the
addition of ice-cold perchloric acid (final concentration, 5% (v/v)). Water-soluble inositol
phosphates were then extracted with an equal volume of a 1:1 (v/v) mixture of 1,1,2-
trichlorotrifluoroethane and tri-N-octylamine. The samples were mixed vigorously and
centrifuged at 2500 × g for 30 min. The upper phase containing inositol phosphates was
applied to an AG1-X8 resin column (Bio-Rad). Inositol phosphates were eluted sequentially
by the addition of an ammonium formate/formic acid solution of increasing ionic strength.
Fractions containing inositol phosphates were collected and measured in a liquid scintillation
counter.
Data analysis -Results are presented as means ± SD. Specific binding data (Bmax and
Kd) were analyzed with Prism version 4.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego CA),
using a one-site binding hyperbola nonlinear regression analysis.
FIGURE 2. MTSEA treatment of the wild-type AT1 receptor and sensitive reporter
cysteine-bearing mutant receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type,
D74C, L81C, A85C, T88C, or A89C AT1 receptors were incubated for 3 min at room
temperature with increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mм). The
intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nм 125
I-[Sar1,Ile
8]
AngII, and their binding properties were evaluated as indicated in "Experimental Procedures."
Each curve represents the means ± S.D. of data obtained from at least three independent
experiments.
34
34
FIGURE 3. Effects of MTSEA on different mutant AT1 receptors bearing a reporter
cysteine in TMD2. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type or mutant AT1
receptors were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mм
MTSEA (A) or 2 mм MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room
temperature with 0.05 nм 125
I-[Sar1,Ile
8]AngII. The percentage of binding inhibition was
calculated as indicated in ″Experimental Procedures.″ The vertical line represents an arbitrary
threshold used to identify cysteine-sensitive mutants and was set at a value corresponding to
binding inhibition 20% greater than the value for the wild-type AT1 receptor. The white bars
indicate mutant receptors for which binding activities were not appreciably reduced compared
to the wild-type receptor after treatment with MTSEA. The gray and black bars indicate
mutant receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or strongly reduced
(black) after treatment with MTSEA. Each bar represents the means ± SD of data from at
least three independent experiments.
RESULTS
Binding Properties of Mutant Receptors Bearing Cysteines in TMD2 -To identify the
residues in TMD2 that face the binding site pocket of the AT1 receptor, we mutated 24
35
35
consecutive residues between Leu-70(2.47)
and Trp-94(2.70)
to cysteine, one at a time. Each
mutant receptor was transiently expressed in COS-7 cells. To assess the conservation of the
global conformation of these receptors after the substitution, pharmacological parameters
describing the equilibrium binding of the radiolabeled competitive ligand 125
I-[Sar1,Ile
8]
AngII such as Kd and Bmax were determined (Table 1). All mutant AT1 receptors exhibited
high binding affinity for 125
I-[Sar1,Ile
8]AngII (similar to that of the wild-type AT1 receptor)
except for mutants P82C(2.58)
, W84C(2.60)
, Y87C(2.63)
, Y92C(2.68)
, and W94C(2.70)
, which did not
demonstrate any detectable binding activity and were not used for the SCAM analysis. Bmax
values for all detectable receptors ranged from 490 to 4282 fmol/mg of protein.
Effect of Extracellularly Added MTSEA on the Binding Properties of Mutant
Receptors -To verify whether the reporter cysteines introduced into the TMD2 of the AT1
receptor were oriented toward the binding pocket, mutant receptors were treated with
concentrations of MTSEA varying between 0.5 and 6 mм. We also verified whether the wild-
type AT1 receptor, which contains 10 endogenous cysteines (Fig. 1) was sensitive to MTSEA
treatment. Fig. 2 shows that various concentrations of MTSEA had very little effect (no more
than a 25% reduction) on the binding properties of the wild-type AT1 receptor, indicating that
the endogenous cysteines made a relatively small contribution to the binding site pocket. A 3-
min treatment with 0.5 mм MTSEA (Fig. 3A) strongly inhibited the binding properties of
mutants L81C(2.57)
-AT1 (binding inhibition of 65%), A85C(2.61)
-AT1 (binding inhibition of
71%), and T88C(2.64)
-AT1 (binding inhibition of 75%), whereas it had only a minor effect on
the binding properties of the other mutant receptors. At higher MTSEA concentrations (2 mм
and above), the binding properties of mutant receptors D74C(2.50)
-AT1 and A89C(2.65)
-AT1
were also slightly affected (Fig. 3B). Overall, the most reactive cysteines were those
substituted for L81C(2.57)
, A85C(2.61)
and T88C(2.64)
, whereas the cysteine substituted for
D74C(2.50)
and A89C (2.65)
were less reactive.
Altered Accessibility to TMD2 Reporter Cysteines in the Constitutively Active N111G-
AT1 Receptor -We made use of the constitutively active N111G-AT1 receptor to assess and
map the potentially altered accessibility of MTSEA to the engineered cysteines. We first
determined the pharmacological properties of the 24 cysteine-substituted mutant receptors.
Within the N111G-AT1 receptor background, 18 cysteine-substituted mutants conserved a
high binding affinity for the competitive ligand 125
I-[Sar1,Ile
8]AngII (Table 2). The mutant
receptors P82C(2.58)
-N111G-AT1, L83C(2.59)
-N111G-AT1, W84C(2.60)
-N111G-AT1, Y87C(2.63)
-
N111G-AT1, Y92C(2.68))
-N111G-AT1, and W94C(2.70)
-N111G-AT1 did not have any
36
36
detectable binding activity and were not used for the SCAM analysis. Bmax values for all
detectable receptors ranged from 570 to 3967 fmol/mg of protein (Table 2).
TABLE 2
Binding Properties of [Sar1,Ile
8]AngII to cysteine-substitued hAT1 mutant receptors
bearing the N111G mutation
Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described under
″Experimental Procedure.″ Binding affinities (Kd) and maximal binding capacities (Bmax) are
expressed as the means ± SD of values obtained in n independent experiments performed in
duplicate. Mutants P82C-N111G, L83C-N111G, W84C-N111G, Y87C-N111G, Y92C-
N111G and W94C-N111G did not demonstrate any detectable binding.
Kd (nM) Bmax (Fmol/mg) n
N111G 0.8 ± 0.2 3003 ± 885 10
L70C 3.6 ± 1.6 3087 ± 235 3
A71C 1.3 ± 0.2 2787 ± 777 3
L72C 0.9 ± 0.6 2688 ± 877 3
A73C 0.6 ± 0.1 3967 ± 1516 4
D74C 1.8 ± 0.1 1781 ± 775 3
L75C 0.6 ± 0.0 2336 ± 689 3
F77C 0.7 ± 0.0 3004 ± 213 3
L78C 0.6 ± 0.1 1645 ± 704 3
L79C 0.5 ± 0.0 1868 ± 280 3
T80C 0.4 ± 0.0 3395 ± 456 3
L81C 1.7 ± 0.2 1780 ± 252 3
A85C 0.9 ± 0.1 622 ± 429 3
V86C 2.6 ± 0.6 570 ± 202 3
T88C 0.7 ± 0.1 819 ± 608 3
A89C 1.0 ± 0.4 1019 ± 854 3
M90C 2.9 ± 1.0 980 ± 492 3
E91C 2.1 ± 0.6 1622 ± 950 3
R93C 1.2 ± 0.5 1175 ± 75 3
37
37
FIGURE 4. MTSEA treatment of the N111G-AT1 receptor and sensitive reporter
cysteine-bearing mutant N111G-AT1 receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing
the N111G-AT1, L81C-N111G-AT1, A85C-N111G-AT1, V86C-N111G-AT1, T88C-N111G-
AT1, or A89C-N111G-AT1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with
increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mм). The intact cells were
then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nм125
I-[Sar1,Ile
8]AngII, and their
binding properties were evaluated as indicated under ″Experimental Procedures.″ Each curve
represents the means ± S.D. of data from at least three independent experiments.
Figure 4 (see also Fig. 2) shows that, like the wild-type receptor, the N111G-AT1 receptor
was relatively insensitive to a 3-min treatment with MTSEA concentrations ranging from 0.5
to 2 mм, again indicating the relatively low contribution of the endogenous cysteines to the
binding site pocket. Cysteine-substituted N111G-AT1 receptor mutants were also treated with
increasing concentrations of MTSEA, and their binding properties were assessed with 125
I-
[Sar1,Ile
8]AngII. Fig. 5 summarizes the effect of the MTSEA treatment on the different
cysteine-substituted N111G-AT1 receptor mutants. As observed in the wild-type background,
0.5 mм MTSEA decreased the binding activity of the A85C(2.61)
–N111G –AT1 and
T88C(2.64)
–N111G–AT1 by 78 and 82 % respectively. It is noteworthy that the V86C(2.62)
–
N111G–AT1 mutant, which was insensitive to MTSEA in the wild-type background, had
reduced binding activity by 47% in the N111G-AT1 background after a treatment with 0.5
mM MTSEA. On the other hand, L81C(2.57)
–N111G–AT1 which exhibited a significant
reduction in binding activity in the wild-type background, became less sensitive to MTSEA in
the N111G-AT1 background (reduction of 39% in binding activity after a treatment with 2
38
38
mM MTSEA) and that D74C(2.50)
–N111G–AT1 became completely insensitive to treatment
with MTSEA.
Protection against MTSEA Reaction by a Pretreatment with [Sar1,Ile
8]AngII –To
confirm that reporter cysteines accessible to MTSEA are located within the binding pocket,
receptor mutants were saturated with the competitive ligand [Sar1,Ile
8]AngII prior to the
MTSEA treatment. The cells were then washed with an acid buffer to dissociate the bound
ligand. The receptors were then assayed for binding with the radiolabeled competitive ligand.
Fig. 6 shows how a preincubation with the competitive ligand [Sar1,Ile
8]AngII protected
mutant receptors D74C(2.50)
-AT1, L81C(2.57)
-AT1, A85C(2.61)
-AT1, T88C(2.64)
-AT1, A89C(2.65)
-
AT1, L81C(2.57)
-N111G-AT1, A85C(2.61)
-N111G-AT1, V86C(2.62)
-N111G-AT1, T88C(2.64)
-
N111G-AT1, and A89C(2.65)
-N111G-AT1 from the inhibitory effect of MTSEA, with
protection levels ranging from 59 to 91%.
Functional Properties of Wild-type and Mutant AT1 receptors-The functional
properties of wild-type and mutant AT1 receptors were evaluated by measuring phospholipase
C activity in transiently transfected COS-7 cells. Fig. 7 shows the relative amounts of inositol
phosphates accumulated under basal conditions. Cells expressing cysteine mutant receptors in
the wild-type background produced inositol phosphates at levels that were not significantly
different from that produced by cells expressing the wild-type AT1 receptor. The basal level
of inositol phosphates found in cells expressing cysteine mutant receptors in the N111G
background was at least 3-fold higher than that found in cells expressing the wild-type AT1
receptor, thereby confirming the constitutive activity of all receptors bearing both cysteine
and N111G mutations. These results show that cysteine mutations within TMD2 do not
compromise the functional integrity of either the ground state AT1 receptor or the
constitutively active N111G-AT1 receptor.
DISCUSSION
The rationale of this study, which relied on SCAM analysis, was to gain an insight into
the orientation of TMD2 of the AT1 receptor by identifying the residues accessible to MTSEA
within the binding site pocket. Mapping these residues in the ground state receptor and the
constitutively active N111G background allowed us to measure relative changes in the
position of certain residues, thus providing valuable information with which to infer a
structural change underlying AT1 receptor activation. It is important to mention that our
approach of systematically substituting each residue within TMD2 for a cysteine did not alter
39
39
the functional properties of either the ground state AT1 receptor or the constitutively active
N111G-AT1 receptor (Fig.7).
FIGURE 5. Effect of MTSEA on different mutant N111G-AT1 receptors bearing a
reporter cysteine in TMD2. Intact COS-7 cells transiently expressing the mutant N111G-
AT1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mм
MTSEA (A) or 2 mм MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room
temperature with 0.05 nм 125
I-[Sar1,Ile
8]AngII. The percentage of binding inhibition was
calculated as indicated under ″Experimental Procedures.″ The vertical line represents an
arbitrary threshold used to identify cysteine-sensitive mutants. It was set at a value
corresponding to binding inhibition 20% greater than the value for the N111G-AT1 receptor.
The white bars indicate mutant receptors for which binding activities were not appreciably
reduced compared to that of the N111G-AT1 receptor after treatment with MTSEA. The gray
and black bars indicate mutant receptors for which binding activities were slightly reduced
(gray) or strongly reduced (black) after treatment with MTSEA. Each bar represents the
means ± SD of data from at least three independent experiments.
40
40
FIGURE 6. [Sar1,Ile
8]AngII protection of MTSEA-sensitive mutant receptors. Intact
COS-7 cells transiently expressing MTSEA-sensitive mutant AT1 receptors were
preincubated for 1 h at 16oC in the absence or presence of 100 nм [Sar
1,Ile
8]AngII. The cells
were then incubated for 3 min at 16oC in the continued absence or presence of
[Sar1,Ile
8]AngII with optimal MTSEA concentrations to achieve maximal binding inhibition
of each receptor. The MTSEA concentrations were as follows: 0.5 mм for L81C-AT1, A85C-
AT1, T88C-AT1, A85C-N111G-AT1, V86C-N111G-AT1, and T88C-N111G-AT1; 2 mм for
D74C-AT1, A89C-AT1, L81C-N111G-AT1, and A89C-N111G-AT1. The cells were then
washed with ice-cold PBS and incubated for 3 h at 16oC with 0.05 nм
125I-[Sar
1,Ile
8]AngII.
Protection was calculated as described under ″Experimental Procedures.″ Each bar represents
the means ± S.D. of data from at least three independent experiments.
As previously reported, the insensitivity of the wild-type receptor to MTSEA suggests either
that endogenous cysteines are not alkylated by MTSEA or that their alkylation does not affect
the binding of the ligand (23). Our methodological approach of adding the MTSEA reagent to
whole adherent cells expressing the AT1 receptor essentially exposed only the extracellular
ligand-accessible side of the receptor to MTSEA. Interestingly, most of the MTSEA-
accessible residues that we identified with the SCAM approach lie in the middle (D74C(2.50)
,
L81C(2.57)
) to the top portion of TMD2 (A85C(2.61)
, T88C(2.64)
, A89C(2.65)
) (Fig.8). These
results imply that the residues involved in the interaction with the ligand are mostly located
within this interface. Thus, residue Ala-89(2.65)
would delineate the top of the binding pocket,
whereas residue Asp-74(2.50)
would delineate the bottom of the water-accessible binding
pocket of the receptor. Along with these residues, three other residues, Leu-81 (2.57)
, Ala-
41
41
85(2.61)
, and Thr-88(2.64)
, would lie on the same α-helix face in the ground state of the receptor,
with great exposure to a potential hydrophilic pocket (see Fig.8). By a mechanism that could
be steric, electrostatic, or indirect, the alkylation of these residues with MTSEA would
hamper the binding of the ligand. It is very likely that these two subsets of residues do not
interact with the same portion of the ligand. Furthermore, it is assumed that water-accessible
residues are in the binding site pocket if a competitive ligand protects them from the effect of
MTSEA. The competitive ligand [Sar1,Ile
8]AngII protected all the residues tested, thus
supporting the notion that these specific residues within TMD2 are located in the binding
pocket. Although the mutant L83C-AT1 did show sensitivity (Fig. 3B), we did not consider
residue Leu-83(2.59)
to be in the binding pocket, because 1) it is not on the same helical face as
the other MTSEA-sensitive residues 2) in the constitutively active background, the mutant
L83C(2.59)
-N111G-AT1 did not show any binding activity. These results suggest that residue
Leu-83(2.59)
is important to maintain the global conformation of the receptor.
Our finding that residues Asp-74(2.50)
, Leu-81(2.57)
, Ala-85(2.61)
, Val-86(2.62)
, Thr-88(2.64)
,
and Ala-89(2.65)
are located in the binding pocket of the AT1 receptor is in accordance with the
current models proposed for bovine rhodopsin (10), squid rhodopsin (28), the opsin receptor
(29), and dopamine D2 receptor (30). Indeed, residue Thr-94(2.61)
is thought to be one of the
contact points with retinal in the crystal structure of bovine rhodopsin (10) whereas residue
Asn-87(2.57)
is one of the contact points with retinal in the crystal structure of squid rhodopsin
(28). Also, the SCAM approach was used to show that residues Asp-80 (2.50)
, Val-87(2.57)
, Val-
91(2.61)
, Val-92(2.62)
, Leu-94(2.64)
, and Glu-95(2.65)
are located in the binding pocket of dopamine
D2 receptor (30).
42
42
FIGURE 7. Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild type and
mutant AT1 receptors. Transfected COS-7 cells were preloaded for 16-24 h with 10 Ci/ml
[myo-3H]inositol. Inositol phosphates (sum of inositol bisphosphate, inositol trisohosphate,
and inositol tetrakisphosphate) accumulated within a period of 30 min were determined as
described under ″Experimental Procedures.″ These results represent the mean ± S.D. values
from three independent experiments (done in triplicate), where inositol phosphates production
was normalized for incorporation of [myo- 3
H]inositol into phospholipids and for receptor
expression level (determined by saturation binding assays).
43
43
FIGURE 8. Helical wheel representation of TMD2 reporter cysteines and their pattern
of reactivity to MTSEA. A and B, positions in TMD2 of MTSEA-alkylated cysteines
affecting ligand binding are shown in a helical wheel representation viewed from the
extracellular side for receptors with no additional mutation in TMD2 (A) and for receptors in
which Asn-111 has been mutated to Gly in addition to the reporter cysteine in TMD2 (B).
The gray and black circles indicate mutant receptors for which binding activities were slightly
reduced (gray) or significantly reduced (black) after the treatment with MTSEA. White
circles indicate those mutant receptors that were insensitive to MTSEA treatment or positions
that resulted in little or no detectable binding when substituted for cysteine.
To further investigate the mechanism by which the AT1 receptor undergoes structural changes
during the transition from its inactive to its active state, we took advantage of the
constitutively active N111G-AT1 receptor. It is believed that the isomerization of conformers
toward the active state, which involves transmembrane movement, is stabilized by the binding
of an agonist and would be mimicked in part by the constitutively active receptor (6, 31).
Thus, within the structural background of the N111G-AT1 receptor, we verified the
accessibility of TMD2 residues to MTSEA, and we compared the pattern obtained with that
of the wild-type receptor. We found that Cys-substituted mutant A85C(2.61)
-N111G-AT1,
T88C(2.64)
-N111G-AT1, and A89C(2.65)
-N111G-AT1 maintained their sensitivity to MTSEA in
44
44
the constitutively active receptor background (Fig. 5). One more Cys-substituted mutant in the
N111G-AT1 receptor background,V86C(2.62)
-N111G-AT1, was found to be sensitive to
MTSEA (Fig. 5). It is important to mention that in the N111G-AT1 background, the
sensitivity of D74C(2.50)
-N111G-AT1 was completely abolished, and the sensitivity of
L81(2.57)
-N111G-AT1 was greatly diminished when compared with that observed in the basal
state (Fig. 3 versus Fig. 5). Thus, in the active state of the receptor, Asp-74(2.50)
, which is
located more toward the bottom of the TMD, would be displaced away from the binding
pocket (Fig. 8). Interestingly, our finding that residues Leu-81(2.57)
-N111G and Ala-85(2.61)
-
N111G are in the binding pocket in the active state of the AT1 receptor is in accordance to the
current model proposed for the ligand-free G-protein-coupled receptor opsin (29). Indeed,
residues Phe-91(2.57)
and Thr-94(2.61)
confine the retinal pocket in the active form of opsin (29,
32). In the protection assay for the mutants in the N111G- AT1 background, the competitive
ligand [Sar1,Ile
8]AngII offered effective protection to all sensitive mutants (L81C
(2.57)-
N111G-AT1, A85C(2,61)
-N111G-AT1, V86C(2,62)
-N111G-AT1, T88C(2,64)
-N111G-AT1, and
A89C(2,65)
-N111G-AT1) against the alkylating effect of MTSEA, suggesting that these
residues are located in the binding pocket (Fig. 6).
Our study showed that position 2.50, a well conserved aspartic acid residue found in
many class A receptors, appears to be facing the binding pocket in the ground state but not in
the N111G-AT1 background. This position in TMD2 is known to be crucial for G protein
activation (6, 33, 34). Also, this residue is suggested to be a part of an intermolecular
bonding network implicating interhelical interactions between TMD2 and TMD7. Indeed, the
recently elucidated crystal structure of squid rhodopsin shows that the carboxyl group of Asp-
80(2.50)
interacts directly with the side chain of Asn-311(7.61)
, corresponding to a state in which
rhodopsin is able to bind G proteins (28). Our data suggesting that residue Asp-74(2.50)
is
displaced away from the binding pocket in the active state of the receptor is concordant with
the suggestion that this residue forms intramolecular interactions with residues of other TMDs
and particularly of TMD7 upon activation. This would support the idea that the N111G
receptor stabilizes its constitutive activity partly by altering the conformation of this residue.
Since the residues corresponding to Asp-74(2.50)
in TMD2 and the NPXXY motif in TMD7 are
highly conserved in GPCRs, the functional significance of TMD2-TMD7 interaction may be
common to many GPCRs (3).
The divergence in the sensitivity of Cys-substituted mutants in the wild-type
background and in the N111G-AT1 receptor background suggests that the accessibility of
residues in TMD2 and their spatial proximity within the binding pocket were altered due to
45
45
the single substitution of an asparagine for a glycine at position 111 in TMD3. Our results
points to a considerable structural change during the process of activation of the receptor. In
the N111G-AT1 receptor background, Val-86(2.62)
, which is located near the top of TMD2,
became MTSEA-sensitive. This residue is located at the extreme right of the helical face
formed by the MTSEA-sensitive Thr-88(2.64),
Leu-81(2.57)
, Ala-85(2.61)
, and Ala-89(2.65)
residues
identified in the ground state (Fig.8). The simple explanation for such a gain in sensitivity of
mutant V86C-N111G-AT1 is that upon activation, TMD2 slightly rotates clockwise, bringing
Val-86(2.62)
within the binding pocket, where it can be alkylated by MTSEA. If this were the
case, one should expect that the sensitive residue at the extreme left of the helical face
forming the binding pocket would be displaced out of the binding pocket, where it could not
be alkylated by MTSEA. Because T88C(2.64)
-N111G-AT1 is still sensitive to MTSEA, this
explanation is unlikely. A clockwise rotation of TMD2 cannot either explain the reduced
sensitivity of mutant L81C(2.57)
-N111G-AT1 and the complete loss of sensitivity of mutant
D74C(2.50)
-N111G-AT1. The straightforward explanation for the sensitivity changes observed
between the mutant in the ground state and those in the constitutively active state could be
that TMD2 undergoes integral pivoting, bringing the top of TMD2 toward the binding pocket
and pushing the bottom of TMD2 away from the binding pocket. This simple pivoting
movement would then expose Val-86(2.62)
to the binding pocket and extrude Asp-74(2.50)
out of
the binding pocket. This explanation would go along with the four proposed simple but varied
types of movements (pivoting, rotation, translation and piston movements) that TM α-helices
can undergo in a lipid bilayer (35). Previous studies using the SCAM approach have proposed
a rigid body rotation of TMD2 for the constitutively active rat AT1 receptor bearing mutations
at residue Asn-111(3.35)
(36). In that study (36), a decrease in the accessibility of the residues
in the bottom of TMD2 to the binding pocket in the case of constitutively active receptor was
observed. This corresponds partly to our observations and could be interpreted as we suggest
as a pivoting movement, where the bottom of the TMD2 is pushed away from the binding
pocket.
In conclusion, we show that TMD2 participates in the formation of the binding pocket
of the AT1 receptor. Our data comparing the ground state versus an activated state of the AT1
receptor strongly point toward a pivoting movement of TMD2 that exposes Val-86(2.62)
and
alters the exposure of Leu-81(2.57)
to the binding pocket. The movement of the bottom of
TMD2 would shift Asp-74(2.50)
away from the binding pocket. This particular movement
could be a structural feature common to other rhodopsin-like GPCRs.
46
46
FOOTNOTES
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research. This article was
submitted to fulfil the requirements of a Ph.D. thesis for I.D. at the Université de Sherbrooke.
E.E. is recipient of the J.C. Edwards Chair in Cardiovascular Research. R.L. is a Chercheur
National of the Fonds de la recherche en Santé du Québec. P.L. is a Chercheur Senior of the
Fonds de la recherche en Santé du Québec.
The abbreviations used are: AngII, angiotensinII; AT1 receptor, Angiotensin II Type-1
receptor; GPCR, G protein-coupled receptor; TMD, transmembrane domain; SCAM,
substituted-cysteine accessibility method; MTSEA, methanethiosulfonate-ethylammonium;
DMEM, Dulbecco‟s Modified Eagle‟s Medium.
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48
48
ARTICLE 2
The fifth transmembrane domain of angiotensin II Type 1 receptor participates in the
formation of the ligand-binding pocket and undergoes a counterclockwise rotation upon
receptor activation
Auteurs de l’article: Ivana Domazet, Stéphane S. Martin, Brian J. Holleran, Marie-Ève
Morin, Patrick Lacasse, Pierre Lavigne, Emanuel Escher, Richard Leduc et Gaétan
Guillemette
Statut de l’article: publié dans Journal of Biological Chemistry (2009) 284 :31953-31961
Avant-propos: j‟ai fait la majorité des expériences et j‟ai redigé la première version du
manuscrit.
Résumé : L‟angiotensine II, une hormone jouant un rôle important dans l‟homéostasie
cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT1 appartenant à la
grande famille des GPCRs. Les sept domaines TM des GPCRs contribuent à former la
pochette de liaison du ligand. Afin d‟identifier les acides aminés du TM5 impliqués dans la
formation de la pochette de liaison du récepteur AT1, nous avons utilisé l‟approche SCAM
(Substituted Cysteine Accessibility Method) qui consiste à évaluer les propriétés de liaison du
récepteur suite à sa réaction avec le methanethiosulfonate (MTSEA). Le MTSEA alkyle les
cystéines endogènes ou introduites par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement
stérique qui interfèrera avec la liaison du ligand. Une série de mutants ont été produits en
remplaçant successivement par une cystéine les résidus 190 à 217 du TM5 du récepteur AT1
et de son mutant constitutivement actif AT1-N111G. Après le prétraitement avec le MTSEA,
les mutants L197, N200, I201, G203 et F204 ont montré une diminution significative
d‟affinité pour le ligand 125
ISar1, Ile
8AngII, suggérant que ces résidus sont orientés dans la
pochette de liaison du récepteur AT1. Des résultats différents ont été obtenus dans le cas du
récepteur AT1-N111G. Le mutant I201C-N111G est devenu plus sensible au MTSEA, alors
que la sensibilité de G203C-N111G fut diminuée. Ces résultats suggèrent que l‟activation
constitutive du récepteur AT1 implique un mouvement de rotation dans le sens antihoraire du
TM5.
49
49
THE FIFTH TRANSMEMBRANE DOMAIN OF ANGIOTENSIN II TYPE 1
RECEPTOR PARTICIPATES IN THE FORMATION OF THE LIGAND BINDING
POCKET AND UNDERGOES A COUNTERCLOCKWISE ROTATION UPON
RECEPTOR ACTIVATION
Ivana Domazet, Stéphane S. Martin, Brian J. Holleran, Marie-Ève Morin, Patrick Lacasse,
Pierre Lavigne, Emanuel Escher, Richard Leduc and Gaétan Guillemette
Department of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de
Sherbrooke, Sherbrooke, Quebec, Canada, J1H 5N4
Running title: Rotation of transmembrane five upon AT1 receptor activation
Corresponding author: Gaétan Guillemette, Ph.D., Department of Pharmacology, Faculty of
Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 3001 12th Avenue North,
Sherbrooke, Quebec, Canada, J1H 5N4, Tel.: (819) 564-5347, Fax: (819) 564-5400, E-mail:
Gaetan.Guillemette@USherbrooke.ca
50
50
The octapeptide hormone angiotensin II exerts a wide variety of cardiovascular effects
through the activation of the angiotensin II Type 1 (AT1) receptor, which belongs to the G
protein-coupled receptor superfamily. Like other G protein-coupled receptors, the AT1
receptor possesses seven transmembrane domains that provide structural support for the
formation of the ligand-binding pocket. The role of the fifth transmembrane domain (TMD5)
was investigated using the substituted cysteine accessibility method. All of the residues within
Thr-190 to Leu-217 region were mutated one at a time to cysteine, and after expression in
COS-7 cells, the mutant receptors were treated with the sulfhydryl-specific alkylating agent
methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA). MTSEA reacts selectively with water-
accessible, free sulfhydryl groups of endogenous or introduced point mutation cysteines. If a
cysteine is found in the binding pocket, the covalent modification will affect the binding
kinetics of the ligand. MTSEA substantially decreased the binding affinity of L197C-AT1,
N200C-AT1, I201C-AT1, G203C-AT1, and F204C-AT1 mutant receptors, which suggests that
these residues orient themselves within the water-accessible binding pocket of the AT1
receptor. Interestingly, this pattern of acquired MTSEA sensitivity was altered for TMD5
reporter cysteines engineered in a constitutively active N111G-AT1 receptor background.
Indeed, mutant I201C-N111G-AT1 became more sensitive to MTSEA, whereas mutant
G203C-N111G-AT1 lost some sensitivity. Our results suggest that constitutive activation of
AT1 receptor causes an apparent counterclockwise rotation of TMD5 as viewed from the
extracellular side.
INTRODUCTION
The octapeptide hormone angiotensin II (AngII)6 is the active component of the renin-
angiotensin system. It exerts a wide variety of physiological effects, including vascular
contraction, aldosterone secretion, neuronal activation, and cardiovascular cell growth and
proliferation (1). Virtually all the known physiological effects of AngII are produced through
the activation of the AT1 receptor, which belongs to the G protein-coupled receptor (GPCR)
superfamily (2, 3). GPCRs possess seven transmembrane domains (TMDs), which provide
structural support for signal transduction. The AT1 receptor interacts with the G protein Gq/11,
which activates a phospholipase C, which in turn generates inositol 1,4,5-trisphosphate and
diacylglycerol from the cleavage of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (4, 5). Inositol
1,4,5-trisphosphate causes the release of Ca2+
from an intracellular store, whereas
diacylglycerol activates protein kinase C.
51
51
Like other GPCRs, the AT1 receptor undergoes spontaneous isomerization between its
inactive state (favored in the absence of agonist) and its active state (induced or stabilized by
the agonist) (6). Movement of TMD helices through translational or rotational displacement is
believed to be essential to achieve the active state (7, 8). For the AT1 receptor, it was
proposed that TMD3, TMD5, TMD6, and TMD7 participate in the activation process by
providing a network of interactions through the AngII-binding pocket (9). The dynamics of
this network are thought to be modified following agonist binding, which forces the receptor
to form new interactions or sever existing interactions between the residues forming the
TMDs.
Based on homology with the high resolution structure of rhodopsin, the archetypal
GPCR (10), it was expected that the binding site of the AT1 receptor would be formed
between its seven mostly hydrophobic transmembrane domains and would be accessible to
charged water-soluble agonists, like AngII. For this receptor, the binding site would thus be
contained within a water-accessible crevice, the binding pocket, extending from the
extracellular surface of the receptor to the transmembrane portion. Using a photoaffinity
labeling approach, we directly identified ligand contact points within the second extracellular
loop and the seventh TMD of the AT1 receptor (11-13). Interestingly, numerous mutagenesis
studies have provided the basis for a model in which an interaction between Asn-111 in
TMD3 and Tyr-292 in TMD7 maintains the AT1 receptor in the inactive conformation. The
agonist AngII would disrupt this interaction and promote the active conformational state (14).
In support of this model, it was further shown that substitution of Asn-111 for a residue of
smaller size (Ala or Gly) confers constitutive activity on the AT1 receptor (15-17).
The substituted cysteine accessibility method (SCAM) (18-20) is an ingenious
approach for systematically identifying the residues in a TMD that contribute to the binding
site pocket of a GPCR. Consecutive residues within TMDs are mutated to cysteine, one at a
time, and the mutant receptors are expressed in heterologous cells. If ligand binding to a
cysteine-substituted mutant is unchanged compared with wild-type receptor, it is assumed that
the structure of the mutant receptor, especially around the binding site, is similar to that of
wild type and therefore that the substituted cysteine lies in a orientation similar to that of the
wild-type residue. In TMDs, the sulfhydryl of a cysteine oriented toward the binding site
pocket should react more quickly with a positively charged sulfhydryl reagent like
methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA) than sulfhydryls facing the interior of the
protein or the lipid bilayer. Hence, two criteria are used for identifying engineered cysteines
on the surface of the binding-site pocket: (i) the reaction with MTSEA alters ligand binding
52
52
irreversibly and (ii) the reaction is retarded by the presence of ligand. We previously used this
approach to identify residues in TMD2, TMD3, TMD6, and TMD7 that form the surface of
the binding site pocket in the wild-type AT1 receptor and in the constitutively active N111G-
AT1 receptor (21-24). Here we report the application of SCAM to probe TMD5 in the wild-
type and constitutively active receptors.
EXPERIMENTAL PROCEDURES
Materials -Bovine serum albumin, bacitracin, and soybean trypsin inhibitor were from
Sigma. The sulfhydryl-specific alkylating reagent MTSEA (CH3SO2-SCH2CH2NH3+) was
purchased from Toronto Research Chemicals, Inc. (Toronto, Canada). The cDNA clone for
the human AT1 receptor subcloned in the mammalian expression vector pcDNA3 was kindly
provided by Dr. Sylvain Meloche (Université de Montréal). LipofectAmine2000
, and culture
media were obtained from Invitrogen. 125
I-[Sar1, Ile
8]AngII (specific radioactivity, ~1500
Ci/mmol) was prepared with Iodo-GEN
(Perbio Science, Erembodegem, Belgium)
according to the method of Fraker and Speck (25) and as previously reported (26).
Numbering of residues in TMD5 -Residues in TMD5 of the human AT1 receptor were
given two numbering schemes. First, residues were numbered according to their positions in
the human AT1 receptor sequence. Second, residues were also indexed according to their
position relative to the most conserved residue in the TMD in which it is located (27). By
definition, the most conserved residue was assigned the position index „50‟, e.g., in TMD5,
Pro-207 is the most conserved residue and was designated Pro-207(5.50)
, whereas the upstream
residue was designated Phe-206(5.49)
and the downstream residue, Phe-208(5.51)
. This indexing
simplified the identification of aligned residues in different GPCRs.
Oligodeoxynucleotides site-directed mutagenesis -Site-directed mutagenesis was
performed on the wild-type AT1 receptor with the overlap PCR method (Expand High
Fidelity PCR System; Roche Applied Science). Briefly, forward and reverse oligonucleotides
were constructed to introduce cysteine mutations between Thr-190(5.33)
and Leu-217(5.60)
. PCR
products were subcloned into the HindIII-XbaI sites of the mammalian expression vector
pcDNA3.1. Site-directed mutations were then confirmed by automated DNA sequencing by
aligning the AT1 sequence using MultAlin (28).
Cell culture and transfection -COS-7 cells were grown in Dulbecco‟s modified Eagle‟s
medium (DMEM) containing 2 mM L-glutamine and 10% (v/v) fetal bovine serum. The cells
were seeded into 100-mm culture dishes at a density of 2 x 106 cells/dish. When the cells
53
53
reached ~90 % confluency, they were transfected with 4 g of plasmid DNA and 15 l of
lipofectAmine2000. After 24 h, transfected cells were trypsinized, distributed into 12-well
plates, and grown for an additional 24 h in complete DMEM containing 100 IU/ml penicillin
and 100 g/ml streptomycin before the MTSEA treatment and binding assay.
Binding experiments -COS-7 cells were grown for 36 h post-transfection in 100-mm
culture dishes, washed once with phosphate-buffered saline (PBS), and subjected to one
freeze-thaw cycle. Broken cells were then gently scraped into washing buffer (25 mM Tris-
HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2), centrifuged at 2500 g for 15 min at 4oC, and
resuspended in binding buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1%
BSA, 0.01% bacitracin, 0.01% soybean trypsin inhibitor). Saturation binding experiments
were done by incubating broken cells (20-40 g of protein) for 1 h at room temperature with
increasing concentrations of 125
I-[Sar1, Ile
8]AngII in a final volume of 500 µl. Non-specific
binding was determined in the presence of 1 µM unlabeled [Sar1,Ile
8]AngII. Bound
radioactivity was separated from free ligand by filtration through GF/C filters pre-soaked for
at least 3 h in binding buffer. Receptor-bound radioactivity was evaluated by counting.
Treatment with MTSEA -MTSEA treatment was performed according to the procedure
of Javitch et al. (29), with minor modifications. Two days after transfection, the cells, which
were grown in 12-well plates, were washed with PBS and incubated for 3 min at room
temperature with freshly prepared MTSEA at the desired concentrations (typically from 0.5
mM to 6 mM) in a final volume of 0.2 ml. The reaction was stopped by washing the cells with
ice-cold PBS. Intact cells were then incubated in binding medium (DMEM, 25 mM HEPES,
0.1% BSA, pH 7.4) containing 0.05 nM 125
I [Sar1, Ile
8]AngII for 90 min at room temperature.
After washing with ice-cold PBS, the cells were lysed with 0.1 N NaOH and the radioactivity
was evaluated by counting. The percentage of fractional binding inhibition was calculated as
[1-(specific binding after the MTSEA treatment/specific binding without the treatment)] x
100.
Protection against MTSEA reaction by [Sar1, Ile
8]AngII -Transfected cells grown in 12-
well plates were washed once with PBS and incubated in the presence or absence of 100 nM
[Sar1, Ile
8]AngII for 1 h at 16
oC (to avoid internalization of receptors). The cells were washed
to remove excess ligand and then treated with MTSEA. The cells were washed three times
with ice-cold PBS and once with an acidic buffer (150 mM NaCl, 50 mM acetic acid, pH 3.0)
to dissociate bound ligand. They were then incubated for 3 h at 16oC in binding medium
(DMEM, 25 mM HEPES, 0.1% BSA, pH 7.4) containing 0.05 nM 125
I-[Sar1, Ile
8]AngII. The
percentage of protection was calculated as [(inhibition in the absence of [Sar1, Ile
8]AngII) -
54
54
(inhibition in the presence of [Sar1, Ile
8]AngII)/(inhibition in the absence of [Sar
1, Ile
8]AngII)]
x 100.
Phospholipase C assay -Inositol phosphates accumulation was determined as described
previously (30). In brief, COS-7 cells were seeded in six-well plates, transfected, and labeled
for 16 h in serum-free M199 containing 10 Ci/ml [myo-3H]inositol (MP Biomedicals, Solon,
OH). Cells were washed twice with PBS/0.1% (w/v) dextrose and then incubated in
stimulation buffer (DMEM containing 25mM HEPES, 10mM LiCl, and 0.1% BSA, pH 7.4)
for 30 min at 37°C. Incubations were terminated by the addition of ice-cold perchloric acid
[final concentration, 5% (v/v)]. Water-soluble inositol phosphates were then extracted with an
equal volume of a 1:1 (v/v) mixture of 1,1,2-trichlorotrifluoroethane and tri-N-octylamine.
The samples were mixed vigorously and centrifuged at 2500g for 30 min. The upper phase
containing inositol phosphates was applied to an AG1-X8 resin column (Bio-Rad). Inositol
phosphates were eluted sequentially by the addition of an ammonium formate/formic acid
solution of increasing ionic strength. Fractions containing inositol phosphates were collected
and measured in a liquid scintillation counter.
Data analysis -Results are presented as means ± SD. Specific binding data (Bmax and
Kd) were analyzed with Prism version 4.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego CA),
using a one-site binding hyperbola nonlinear regression analysis.
RESULTS
Binding properties of mutant receptors bearing cysteines in TMD5 -To establish
whether residues in TMD5 orient themselves towards the binding-site pocket of the AT1
receptor, we mutated 27 consecutive residues between Thr-190(5.33)
and Leu-217(5.60)
to
cysteine, one at a time. Each mutant receptor was transiently expressed in COS-7 cells. To
assess the conservation of the global conformation of these receptors after the substitution,
pharmacological parameters describing the equilibrium binding of the radiolabeled
competitive ligand 125
I-[Sar1, Ile
8] AngII such as Kd and Bmax were determined (Table 1).
Most mutant AT1 receptors exhibited high binding affinity for 125
I-[Sar1, Ile
8] AngII (similar
to that of the wild-type AT1 receptor) except for mutant G203C(5.46)
-AT1 that showed a
moderate 5-fold decrease in binding affinity. The mutant receptors G196C(5.39)
-AT1,
K199C(5.42)
-AT1 and P207C(5.50)
-AT1 did not demonstrate any detectable binding activity and
55
55
were not used for the SCAM analysis. Bmax values for all detectable receptors ranged from
0.2 to 7.9 pmol/mg of protein.
Table 1
Binding Properties of [Sar1, Ile
8] AngII to Cysteine-Substitued hAT1 Mutant Receptors
Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described in the Experimental
Procedure. Binding affinities (Kd) and maximal binding capacities (Bmax) are expressed as the
means ± SD of values obtained in n independent experiments performed in duplicate. Mutants
G196C, K199C and P207C did not demonstrate any detectable binding.
Kd Bmax n
nM pmol/mg
WT 0.9 ± 0.4 1.3 ± 0.9 18
T190C 0.8 ± 0.2 0.6 ± 0.3 3
L191C 2.2 ± 0.4 0.7 ± 0.4 3
P192C 1.0 ± 0.3 0.2 ± 0.02 3
I193C 2.1 ± 0.3 1.0 ± 0.4 4
G194C 0.7 ± 0.3 2.1 ± 0.5 3
L195C 3.5 ± 1.0 0.9 ± 0.1 4
L197C 1.8 ± 0.2 0.9 ± 1.4 3
T198C 0.8 ± 0.2 1.3 ± 1.1 3
N200C 0.9 ± 0.2 0.7 ± 0.4 4
I201C 1.0 ± 0.3 1.2 ± 0.4 3
L202C 1.5 ± 0.3 1.2 ± 0.2 3
G203C 5.0 ± 2.8 0.6 ± 0.5 3
F204C 2.4 ± 0.4 0.8 ± 0.5 3
L205C 0.9 ± 0.4 2.5 ± 1.5 4
F206C 0.9 ± 0.2 4.8 ± 3.2 4
F208C 1.1 ± 0.6 1.4 ± 0.3 3
L209C 0.8 ± 0.3 0.6 ± 0.1 3
I210C 1.2 ± 0.6 1.7 ± 1.0 3
I211C 0.7 ± 0.2 2.9 ± 1.0 4
L212C 0.8 ± 0.3 3.6 ± 0.3 3
56
56
T213C 0.8 ± 0.2 7.9 ± 0.3 3
S214C 1.1 ± 0.2 1.8 ± 1.9 3
Y215C 2.0 ± 0.3 2.4 ± 1.3 3
T216C 0.8 ± 0.1 2.1 ± 0.7 3
L217C 1.3 ± 0.8 2.8 ± 0.3 3
Effect of extracellularly added MTSEA on the binding properties of mutant receptors -To
verify whether the reporter cysteines introduced into TMD5 of the AT1 receptor were oriented
towards the binding pocket, mutant receptors were treated with concentrations of MTSEA
varying between 0.5 mM and 6 mM. We had initially verified whether the wild-type AT1
receptor, which contains 10 endogenous cysteines (Fig. 1) was sensitive to MTSEA. Fig. 2
shows that various concentrations of MTSEA had very little effect (no more than a 15%
reduction at high MTSEA concentrations) on the binding properties of the wild-type AT1
receptor, indicating that the endogenous cysteines made a relatively small contribution to the
binding-site pocket. A 3-min treatment with 0.5 mM MTSEA (Fig. 3A) strongly inhibited the
binding properties of mutants L197C(5.40)
-AT1 (binding inhibition of 35%), N200C(5.43)
-AT1
(binding inhibition of 38%), G203C(5.46)
-AT1 (binding inhibition of 57%) and F204C(5.47)
-AT1
(binding inhibition of 30%), whereas it had only a minor effect on the binding properties of
the other mutant receptors. At higher MTSEA concentrations (2 mM and above), the binding
properties of mutant receptor I201C(5.44)
-AT1 were also slightly affected (Fig. 3B). Overall,
the most reactive cysteines were those substituted for L197C(5.40)
, N200C(5.43)
, G203C(5.46)
and
F204C(5.47)
, whereas the cysteine substituted for I201C(5.44)
was less reactive.
Altered accessibility to TMD5 reporter cysteines in the constitutively active N111G-AT1
receptor -We made use of the constitutively active N111G-AT1 receptor to assess and map
the potentially altered accessibility of MTSEA to the engineered cysteines.
We first determined the pharmacological properties of the 27 cysteine-substituted mutant
receptors.
57
57
FIGURE 1. Schematic representation of the human AT1 receptor. The numbers indicate
the positions of cysteines and other residues in the receptor. The gray closed circles represent
cysteine residues that are thought to be linked via disulfide bridges, and the black closed
circles represent cysteine residues whose side chains do not form a disulfide bridge. Mutated
TMD5 residues are located between Thr-190 and Leu-217 inclusively. Potential N-
glycosylation sites (Asn-4, Asn-176, and Asn-188) are indicated. Asn-111 in TMD3 is also
shown in gray.
58
58
FIGURE 2. MTSEA treatment of the wild-type AT1 receptor and sensitive reporter
cysteine-bearing mutant receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type
(WT), L197C, N200C, I201C, G203C, or F204C AT1 receptors were incubated for 3 min at
room temperature with increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mm).
The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nm 125
I-[Sar1,
Ile8]AngII, and their binding properties were evaluated as indicated under “Experimental
Procedures.” Each curve represents the mean ± S.D. of data obtained from at least three
independent experiments.
Within the N111G-AT1 receptor background, 24 cysteine-substituted mutants conserved a
high binding affinity for the competitive ligand 125
I-[Sar1, Ile
8] AngII, whereas one mutant
G203C(5.46)
-N111G-AT1 displayed a moderate almost 8-fold decrease in binding affinity
(Table 2). It is interesting to note that the mutation K199C(5.42)
which abolished the binding
properties of the wild-type receptor, caused only a minor decrease of binding affinity in the
N111G-AT1 receptor background. The mutant receptors G196C(5.39)
-N111G-AT1, P207C(5.50)
-
N111G-AT1 and L212C(5.55)
-N111G-AT1 did not have any detectable binding activity and
were not used for the SCAM analysis. Bmax values for all detectable receptors ranged from
0.2 to 1.9 pmol/mg of protein (Table 2).
Figure 4 (see also Fig. 2) shows that, like the wild-type receptor, the N111G-AT1
receptor was relatively insensitive to a 3-min treatment with MTSEA concentrations ranging
from 0.5 mM to 2 mM, again indicating the relatively low contribution of the endogenous
cysteines in the binding-site pocket. Cysteine-substituted N111G-AT1 receptor mutants were
also treated with increasing concentrations of MTSEA and their binding properties were
assessed with 125
I-[Sar1, Ile
8] AngII.
59
59
FIGURE 3. Effects of MTSEA on mutant AT1 receptors bearing a reporter cysteine in
TMD5. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type (WT) or mutant AT1 receptors
were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mm MTSEA (A) or 2
mm MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with
0.05 nm 125
I-[Sar1, Ile
8]AngII. The percentage of binding inhibition was calculated as
indicated under “Experimental Procedures.” The vertical line represents an arbitrary threshold
used to identify cysteine-sensitive mutants and was set at a value corresponding to binding
inhibition 20% greater than the value for the wild-type AT1 receptor. The white bars indicate
mutant receptors for which binding activities were not appreciably reduced compared with the
wild-type receptor after treatment with MTSEA. The gray and black bars indicate mutant
receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or strongly reduced (black)
after treatment with MTSEA. Each bar represents the mean ± S.D. of data from at least three
independent experiments.
60
60
Table 2
Binding Properties of [Sar1, Ile
8] AngII to Cysteine-Substitued hAT1 Mutant Receptors
Bearing the Asn111
Gly Mutation
Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described in the Experimental
Procedure. Binding affinities (Kd) and maximal binding capacities (Bmax) are expressed as the
means ± SD of values obtained in n independent experiments performed in duplicate. Mutants
G196C, P207C, and L212C did not demonstrate any detectable binding.
Kd Bmax n
nM pmol/mg
N111G 0.7 ± 0.2 1.0 ± 0.7 8
T190C 1.0 ± 0.2 0.5 ± 0.2 3
L191C 2.4 ± 0.4 0.6 ± 0.1 3
P192C 0.8 ± 0.3 0.5 ± 0. 2 4
I193C 3.2 ± 1.5 0.8 ± 0.3 4
G194C 0.9 ± 0.7 1.3 ± 0.3 3
L195C 2.0 ± 1.0 0.9 ± 0.2 3
L197C 3.1 ± 1.9 0.2 ± 0.1 4
T198C 0.6 ± 0.2 1.2 ± 0.3 3
K199C 3.2 ± 0.7 0.7 ± 0.4 3
N200C 1.8 ± 0.4 1.0 ± 0.3 4
I201C 1.4 ± 0.6 0.8 ± 0.4 4
L202C 1.4 ± 0.4 0.8 ± 0.4 3
G203C 7.7 ± 5.5 0.3 ± 0.2 3
F204C 1.7 ± 0.5 0.4 ± 0.1 4
L205C 0.9 ± 0.3 1.1 ± 0.2 3
F206C 1.8 ± 0.4 0.5 ± 0.3 3
F208C 1.2 ± 0.1 0.3 ± 0.2 3
L209C 0.7 ± 0.3 0.6 ± 0.2 3
I210C 1.6 ± 0.8 1.2 ± 0.7 3
I211C 0.7 ± 0.5 1.6 ± 0.6 4
T213C 1.6 ± 0.6 1.9 ± 0.8 3
S214C 1.3 ± 0.3 1.4 ± 0.7 3
Y215C 3.1 ± 0.5 1.6 ± 0.5 3
61
61
T216C 1.0 ± 0.8 1.3 ± 0.1 3
L217C 1.1 ± 0.4 0.7 ± 0.5 3
Figure 5 summarizes the effect of the MTSEA treatment on the different cysteine-substituted
N111G-AT1 receptor mutants. As observed in the wild-type background, mutants L197C(5.40)
-
N111G-AT1 (binding inhibition of 27%), N200C(5.43)
-N111G-AT1 (binding inhibition of 43%)
and F204C(5.47)
-N111G-AT1 (binding inhibition of 37%) were very sensitive to 0.5 mM
MTSEA. It is noteworthy that mutation I201C(5.44)
which conferred a low sensitivity to
MTSEA in the wild-type background (binding inhibition of 32% after treatment with a high 2
mM concentration of MTSEA), conferred a higher sensitivity to MTSEA in the N111G-AT1
background (binding inhibition of 48% after treatment with a low 0.5 mM concentration of
MTSEA). At the opposite, the mutation G203C(5.46)
conferred a high sensitivity to MTSEA in
the wild-type background whereas it conferred only a low sensitivity to MTSEA in the
N111G-AT1 background. Finally, of interest, MTSEA treatment increased (127%) the
binding activity of mutant K199C(5.42)
-N111G-AT1 (Fig.5)
Protection against MTSEA reaction by a pretreatment with [Sar1, Ile
8]AngII –To confirm
that reporter cysteines accessible to MTSEA are located within the binding pocket, receptor
mutants were saturated with the competitive ligand [Sar1, Ile
8]AngII prior to MTSEA
treatment. Cells were then washed with an acid buffer to dissociate the bound ligand and the
receptors were then assayed for binding with the radiolabeled competitive ligand. Figure 6
shows how a pre-incubation with the competitive ligand [Sar1, Ile
8]AngII protected all mutant
receptors that had exhibited changes in binding properties during MTSEA treatment
(L197C(5.40)
-AT1, N200C(5.43)
-AT1, I201C(5.44)
-AT1, G203C(5.46)
-AT1, F204C(5.47)
-AT1,
L197C(5.40)
-N111G-AT1, N200C(5.43)
-N111G-AT1, I201C(5.44)
-N111G-AT1, G203C(5.46)
-
N111G-AT1 and F204C(5.47)
-N111G-AT1) from the inhibitory effect of MTSEA, with
protection levels ranging from 60% to 95%.
Functional properties of wild-type and mutant AT1 receptors -The functional
properties of wild-type and mutant AT1 receptors were evaluated by measuring the
phospholipase C activity in transiently transfected COS-7 cells. Figure 7 shows the relative
amounts of inositol phosphates accumulated under basal conditions. The basal production of
inositol phosphates in cells expressing the cysteine mutant receptor in the wild-type
62
62
background were not significantly different from that produced by the cells expressing the
wild-type AT1 receptor.
FIGURE 4. MTSEA treatment of the N111G-AT1 receptor and sensitive reporter
cysteine-bearing mutant N111G-AT1 receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing
the N111G-AT1, L197C-N111G-AT1, N200C-N111G-AT1, I201C-N111G-AT1, G203C-
N111G-AT1, or F204C-N111G-AT1 receptors were incubated for 3 min at room temperature
with increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mm). The intact cells
were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nm 125
I-[Sar1, Ile
8]AngII, and
their binding properties were evaluated as indicated under “Experimental Procedures.” Each
curve represents the mean ± S.D. of data from at least three independent experiments.
63
63
FIGURE 5. Effect of MTSEA on N111G-AT1 mutant receptors bearing a reporter
cysteine in TMD5. Intact COS-7 cells transiently expressing the mutant N111G-AT1
receptors were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mm
MTSEA (A) or 2 mm MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room
temperature with 0.05 nm 125
I-[Sar1, Ile
8]AngII. The percentage of binding inhibition was
calculated as indicated under “Experimental Procedures.” The vertical line represents an
arbitrary threshold used to identify cysteine-sensitive mutants. It was set at a value
corresponding to binding inhibition 20% greater than the value for the N111G-AT1 receptor.
The white bars indicate mutant receptors for which binding activities were not appreciably
reduced compared with that of the N111G-AT1 receptor after treatment with MTSEA. The
gray and black bars indicate mutant receptors for which binding activities were slightly
reduced (gray) or strongly reduced (black) after treatment with MTSEA. Each bar represents
the mean ± S.D. of data from at least three independent experiments.
The basal level of inositol phosphates found in cells expressing cysteine mutant receptors in
the N111G background was at least 4-fold higher than that found in cells expressing the wild-
type AT1 receptor, thereby confirming the constitutive activity of all receptors bearing both
64
64
cysteine and N111G mutations. These results show that cysteine mutations within TMD5 do
not compromise the functional integrity of either the ground state AT1 receptor or the
constitutively active N111G-AT1 receptor.
DISCUSSION
The rationale of this study, which relied on SCAM analysis, was to gain an insight into
the orientation of TMD5 of the AT1 receptor by identifying the residues accessible to MTSEA
within the binding site pocket. Mapping these residues in the ground state receptor and the
constitutively active N111G background allowed us to measure relative changes in the
position of certain residues, thus providing valuable information with which to infer a
structural change underlying AT1 receptor activation. It is important to mention that our
systematic approach of substituting each residue within TMD5 for a cysteine did not alter the
functional properties of either the wild-type AT1 receptor or the constitutively active N111G-
AT1 receptor (Fig.7)
As previously reported, the insensitivity of the wild-type receptor to MTSEA suggests
either that endogenous cysteines are not alkylated by MTSEA or that their alkylation does not
affect the binding of the ligand (24). Our approach of adding the MTSEA reagent to whole
adherent cells expressing the AT1 receptor essentially exposed only the extracellular ligand-
accessible side of the receptor to MTSEA. Interestingly, most of the MTSEA-accessible
residues that we identified with the SCAM approach are located from the middle (N200C(5.43)
,
I201C(5.44)
, G203C(5.46)
, F204C(5.47)
) to the top (L197C(5.40)
) portion of TMD5 (Fig.8). These
results suggest that this portion of TMD5 is involved in the interaction with the ligand.
Residue Leu-197(5.40)
would delineate the top whereas residue Phe-204(5.47)
would delineate
the bottom of the water-accessible binding pocket of the AT1 receptor. Along with these two
residues, three other residues, Asn-200 (5.43)
, Ile-201.44)
and Gly-203(5.46)
, would also be part of
the binding pocket in the ground state of the receptor. Indeed, by a mechanism that could be
steric, electrostatic, or indirect, the alkylation of these residues with MTSEA hampered the
binding of the ligand. This is further supported by the fact that the competitive ligand [Sar1,
Ile8]AngII protected them from the effect of MTSEA.
65
65
FIGURE 6. [Sar1, Ile
8]AngII protection of MTSEA-sensitive mutant receptors. Intact COS-7
cells transiently expressing MTSEA-sensitive mutant AT1 receptors were preincubated for 1 h at
16 °C in the absence or presence of 100 nm [Sar1, Ile
8]AngII. The cells were then incubated for 3
min at 16 °C in the continued absence or presence of [Sar1, Ile
8]AngII with optimal MTSEA
concentrations to achieve maximal binding inhibition of each receptor. The MTSEA
concentrations were as follows: 0.5 mm for L197C-AT1, N200C-AT1, G203C-AT1, F204C-AT1,
L197C-N111G-AT1, N200C-N111G-AT1, I201C-N111G-AT1, and F204C-N111G-AT1; and 2
mm for I201C-AT1 and G203C-N111G-AT1. The cells were then washed with ice-cold PBS and
incubated for 3 h at 16 °C with 0.05 nm 125
I-[Sar1, Ile
8]AngII. Protection was calculated as
described under “Experimental Procedures.” Each bar represents the mean ± S.D. of data from at
least three independent experiments.
66
66
FIGURE 7. Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild-type (WT) and
mutant AT1 receptors. Transfected COS-7 cells were preloaded for 16–24 h with 10 μCi/ml
[myo-3H]inositol. Inositol phosphates (sum of inositol bisphosphate, inositol trisphosphate, and
inositol tetrakisphosphate) accumulated within a period of 30 min were determined as described
under “Experimental Procedures.” These results represent the mean ± S.D. values from at least
three independent experiments (done in triplicate) where inositol phosphate production was
normalized for incorporation of [myo-3H]inositol into phospholipids and for receptor expression
level (determined by saturation binding assays).
Our finding that residues Leu-197(5.40)
, Asn-200(5.43)
, Ile-201(5.44)
, Gly-203(5.46)
and Phe-204(5.47)
are located in the binding pocket of the AT1 receptor is in accordance with the structures of
bovine rhodopsin (10), squid rhodopsin (31), opsin (32), β1-adrenergic receptor (33), β2-
adrenergic receptor (34-36) and dopamine D2 receptor (19). Indeed, residues His-211(5.46)
and
67
67
Phe-212(5.47)
are thought to constitute a contact point for retinal in the crystal structure of bovine
rhodopsin (10) whereas residues Phe-205(5.43)
and Phe-209(5.47)
are located in the binding pocket
of the crystal structure of squid rhodopsin (31). The crystal structure of the β1-adrenergic
receptor revealed that residues Ser-212(5.43)
and Ser-215(5.46)
are contact points for the high-
affinity antagonist cyanopindolol (33). Also, the crystal structure of the β2-adrenergic receptor
revealed that residues Ser-204(5.43)
, Ser-207(5.46)
and Phe-208(5.47)
are important for
catecholamines binding (34, 35). Furthermore, using the SCAM approach, it was shown that
residues Val-191(5.40)
, Ser-194(5.43)
, Ile-195(5.44)
, Ser-197(5.46)
and Phe-198(5.47)
are located in the
binding pocket of dopamine D2 receptor (19). Moreover, using the methionine proximity
approach, we recently observed that residue N200(5.43)
reacts with the photosensitive ligand [Sar1,
Bpa8]AngII (37). In light of these results, this orientation of TMD5 in the ligand-binding pocket
appears to be a common feature of many class A GPCRs.
To further investigate the mechanism by which the AT1 receptor undergoes structural
changes during the transition from its inactive to its active state, we took advantage of the
constitutively active N111G-AT1 receptor. It is believed that the isomerization of conformers
toward the active state, which involves transmembrane movement, is stabilized by the binding of
an agonist and would be mimicked at least in part by the constitutively active receptor (6, 38).
Thus, within the structural background of the N111G-AT1 receptor, we verified the accessibility
of TMD5 residues to MTSEA and we compared the pattern obtained with that of the wild-type
receptor. We found that Cys-substituted mutants L197C(5.40)
-N111G-AT1, N200C(5.43)
-N111G-
AT1 and F204C(5.47)
-N111G-AT1 maintained their sensitivity to MTSEA in the constitutively
active receptor background whereas mutant I201C(5.44)
-N111G-AT1 gained sensitivity and mutant
G203C(5.46)
-N111G-AT1 lost some sensitivity to MTSEA (Fig. 5). In the protection assay, the
competitive ligand [Sar1, Ile
8]AngII offered effective protection to all sensitive mutants
(L197C(5.40)
-N111G-AT1, N200C(5.43)
-N111G-AT1, I201C(5.44)
-N111G-AT1, G203C(5.46)
-N111G-
AT1 and F204C(5.47)
-N111G-AT1) against the alkylating effect of MTSEA, confirming that these
residues are located in the binding pocket (Fig. 6).
Our finding that residues Leu-197 (5.40)
, Asn-200 (5.43)
, Ile-201 (5.44)
, Gly-203(5.46)
and Phe-
204(5.47)
face the binding pocket in the active state of the AT1 receptor is in accordance with the
current model proposed for the crystal structure of opsin (32). Indeed, residues Ile-205(5.40)
, Phe-
208(5.43)
and Phe-212(5.47)
confine the binding pocket of the retinal in the active form of opsin (32,
68
68
39). In the crystal structure of activated rhodopsin (40), residues Met-207(5.43)
and His-211(5.46)
were also found in the binding pocket. Furthermore, using NMR spectroscopy measurements, it
was found that residues His-211(5.46)
and Phe-212(5.47)
interact with retinal in the receptor‟s active
intermediate form metarhodopsin II (41).
A peculiar observation made when the N111G-AT1 receptor was tested with the SCAM
approach was the increased binding activity (127%) of mutant K199C(5.42)
-N111G-AT1
following a treatment with 0.5 mM MTSEA. Obviously, the alkylation of this mutant did not
cause any constraint but rather facilitated its interaction with [Sar1, Ile
8]AngII. A likely
explanation is that the positive charge added by MTSEA at this position would promote ligand
binding, possibly by restoring the initial charge lost by substitution of this residue for cysteine.
Interestingly, when tested in the wild-type background, this mutant did not demonstrate any
detectable affinity, whereas in the constitutively active background K199C(5.42)
-N111G-AT1
displayed a 3-fold decrease in binding affinity. These results suggest that alkylation of K199(5.42)
potentiates binding via a mechanism involving an intramolecular ionic interaction within the
receptor. Further studies are needed to clarify this issue.
FIGURE 8. Helical wheel representation of TMD5 reporter cysteines and their pattern of
reactivity to MTSEA. The positions in TMD5 of MTSEA-alkylated cysteines affecting ligand
69
69
binding are shown in a helical wheel representation as viewed from the extracellular side for
receptors with no additional mutation in TMD5 (A) and for receptors in which Asn-111 has been
mutated to Gly in addition to the reporter cysteine in TMD5 (B). The gray and black circles
indicate mutant receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or
significantly reduced (black) after the treatment with MTSEA. The white circles indicate those
mutant receptors that were insensitive to MTSEA treatment or positions that resulted in little or
no detectable binding when substituted for cysteine.
The divergence in the sensitivity of Cys-substituted mutants in the wild-type background and in
the N111G-AT1 receptor background suggests that the accessibility of residues in TMD5 and
their spatial proximity within the binding pocket were altered due to the single substitution of an
Asparagine for a Glycine at position 111 in TMD3. Interestingly, mutant G203(5.46)
-N111G-AT1
was much less sensitive to MTSEA whereas mutant I201(5.44)
-N111G-AT1 was more sensitive to
MTSEA when compared to the analogous mutants in the ground state of the receptor (see Fig.3
versus Fig. 5). These results point to an appreciable structural change during the process of
receptor activation. In fact, residue Ile-201(5.44)
is located at the extreme right whereas residue
Gly-203(5.46)
is located at the extreme left of the helical face formed by the MTSEA-sensitive
residues Leu-197(5.40)
, Asp-200(5.43)
and Phe-204(5.47)
identified in the ground state receptor (Fig.
8). In other words, this structural change brings Ile-201(5.44)
within the binding pocket where it
can be more efficiently alkylated by MTSEA while it pushes Gly-203(5.46)
away from the binding
pocket. A simple and straightforward explanation for such changes in sensitivity is that upon
activation, the surface of TMD5 that is exposed to the binding site slightly rotates
counterclockwise as viewed from the extracellular side. Because the MTSEA- sensitive residues
lie in upper portion of TMD5, our data do not allow us to ascribe this rotation to the entire TMD.
Such a rotation would go along with the four proposed simple but varied types of movements
(pivoting, rotation, translation and piston movements) that TM α-helices can undergo within a
lipid bilayer (42).
It was suggested that an interaction between the highly conserved E/DRY motif on
TMD3 (positions 3.49/3.50 and a glutamate residue on TMD6 (position 6.30)), termed the ionic
lock, stabilizes the inactive conformation on many class A GPCRs (43). Using an NMR
spectroscopy approach, it was recently shown that upon activation of rhodopsin, TMD5
70
70
undergoes an apparent rotation movement (44, 45). In this process His-211(5.46)
moves closer to
Glu-122(3.37)
of TMD3, thus disrupting the ionic lock (44, 45). Therefore the rotation of TMD5 is
believed to play an important role in stabilizing the active state of the receptor.
In conclusion, we identified specific residues in the upper portion of TMD5 that participate
in the formation of the ligand-binding pocket of the AT1 receptor. Our data comparing the
ground state versus an activated state of the AT1 receptor strongly point towards a
counterclockwise rotation as viewed from the extracellular side of TMD5 in which the residue
facing the extreme right of the binding pocket (Ile-201(5.44)
) becomes more sensitive, while the
residue facing the extreme left of the binding pocket (Gly-203(5.46)
) becomes less sensitive to the
alkylating effect of MTSEA. Our results also suggest that the binding pocket of the AT1 receptor
shares some similarities with that of other class A GPCRs.
REFERENCES
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72
72
FOOTNOTES
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research. This article was
submitted to fulfil the requirements of a Ph.D. thesis for I.D. at the Université de Sherbrooke.
E.E. is recipient of the J.C. Edwards Chair in Cardiovascular Research. R.L. is a Chercheur
National of the Fonds de la recherche en Santé du Québec. P.L. is a Chercheur Senior of the
Fonds de la recherche en Santé du Québec.
1 The abbreviations used are: AngII, angiotensinII; AT1 receptor, Angiotensin II Type-1 receptor;
GPCR, G protein-coupled receptor; TMD, transmembrane domain; SCAM, substituted-cysteine
accessibility method; MTSEA, methanethiosulfonate-ethylammonium; DMEM, Dulbecco‟s
Modified Eagle‟s Medium.
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73
ARTICLE 3
Characterization of Angiotensin II molecular determinants involved in AT1 receptor functional
selectivity
Auteurs de l’article: Ivana Domazet, Brian J. Holleran, Alexandra Richard, Camille
Vanderberghe, Pierre Lavigne, Emanuel Escher, Richard Leduc et Gaétan Guillemette
Statut de l’article: soumis à Molecular Pharmacology, décembre 2014
Avant-propos: J‟ai participé à l‟élaboration des expériences, ensuite j‟ai effectué la plupart des
expériences et j‟ai collaboré à l‟écriture du manuscrit.
Résumé : L‟angiotensine II (AngII), une hormone jouant un rôle important dans l‟homéostasie
cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT1 appartenant à la
grande famille des GPCRs. Le récepteur AT1 est connu pour coupler préférentiellement la
protéine Gq. Pour cette raison, les propriétés fonctionnelles de ce récepteur ont surtout été
évaluées en fonction de sa capacité à induire la production d‟inositol phosphates et à mobiliser le
Ca2+
intracellulaire. Le récepteur AT1 interagit avec d‟autres protéines G hétérotrimériques (Gi et
G12/13) et active également des voies de signalisation indépendantes des protéines G telle que la
voie des ERKs, une des familles des MAP kinases. Notre hypothèse est que divers ligands
pourraient induire ou stabiliser une variété de conformations d‟un GPCR et ainsi inhiber ou
activer plus ou moins sélectivement les diverses voies de signalisation en aval du récepteur.
C‟est la notion de sélectivité fonctionnelle. Dans l‟étude présente, nous avons développé
différents essais permettant de mesurer six différentes voies de signalisation. Nous avons
sélectionné une série d‟analogues de l‟AngII modifiés en position 1, 4 et 8 qui diffèrent quant à
leur structure chimique. Dans cette étude, nous avons comme objectif de mieux caractériser les
déterminants moléculaires qui modulent la séléctivité fonctionnelle du récepteur AT1 dans les
cellules HEK 293. Nos résultats démontrent que la position 1 ne confère pas de séléctivité
fonctionnelle, la position 4 montre un biais vers la signalisation de la voie d‟ERK et la position 8
semble importante pour le recrutement des β-arrestines. De façon intéressante, nous avons
également demontré que les analogues modifiés en position 8 sont aussi des agonistes partiels de
la voie PKC-ERK via les isoformes atypiques de PKC (PKCζ et PKCι). Notre approche a donc
permis d‟identifier des ligands sélectifs des voies de signalisation du récepteur AT1. Ces résultats
mèneront éventuellement à la conception de nouveaux ligands sélectifs pour certaines voies de
signalisation, ce qui permettra de réduire ou même d‟éliminer les effets secondaires de plusieurs
médicaments.
74
74
ABSTRACT
The octapeptide angiotensin II (AngII) exerts a variety of cardiovascular effects through
the activation of the AngII type 1 receptor (AT1), a G protein-coupled receptor. The AT1 receptor
engages and activates several signalling pathways, including heterotrimeric G proteins Gq and
G12, as well as the ERK1/2 pathway. Additionally, following stimulation, β-arrestin is recruited
to the AT1 receptor, leading to receptor desensitization. It is increasingly recognized that specific
ligands selectively bind and favour the activation of some signalling pathways over others, a
concept termed ligand bias or functional selectivity. A better understanding of the molecular
basis of functional selectivity may lead to the development of better therapeutics with fewer
adverse effects. In the present study, we developed assays allowing the measurement of 6
different signalling modalities of the AT1 receptor. Using a series of AngII peptide analogs that
were modified in positions 1, 4 and 8, we sought to better characterize the molecular
determinants of AngII that underlie functional selectivity of the AT1 receptor in HEK293 cells.
The results reveal that position 1 of AngII does not confer functional selectivity, while position 4
confers a bias towards ERK signalling over Gq signalling and that position 8 confers a bias
towards βarrestin recruitment over ERK activation and Gq signalling. Interestingly, the analogs
modified in position 8 were also partial agonists of the PKC-dependent ERK pathway via
atypical PKC isoforms PKC and PKC.
75
75
INTRODUCTION
The octapeptide hormone angiotensin II (AngII) is the active component of the renin-
angiotensin system, responsible for controlling blood pressure and water retention via smooth
muscle contraction and ion transport. It exerts a wide variety of physiological effects, including
vascular contraction, aldosterone secretion, neuronal activation, and cardiovascular cell growth
and proliferation. Virtually all the known physiological effects of AngII are produced through
the activation of the AT1 receptor, which belongs to the G protein-coupled receptor (GPCR)
superfamily (de Gasparo, et al., 2000).
The AT1 receptor interacts with the G protein Gq/11, which activates a phospholipase C,
which in turn generates inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) and diacylglycerol (DAG) from the
cleavage of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (Hunyady and Catt, 2006). The second
messenger IP3 binds to the calcium channel receptor IP3R present at the surface of the
endoplasmic reticulum, thus liberating Ca2+
into the cytosol. G protein–coupled receptor kinases
(GRKs) phosphorylate the receptor, leading to β-arrestin recrutement and functional uncoupling
of G protein signaling. The AT1 receptor also activates the G protein G12 (Sagara, et al., 2007;
Suzuki, et al., 2009; Ushio-Fukai, et al., 1998; Gohla, et al., 2000). It is known that G12, through
the regulation of RhoGEF proteins, leads to the activation of RhoA/Rho kinase and cytoskeleton
reorganisation (Siehler, 2009). The AT1 receptor also activates extracellular signal–regulated
kinases 1 and 2 (ERK1/2) (Tian, et al., 1998; Wei, et al., 2003). ERK1/2 activation by the AT1
receptor is complex and can be mediated by PKC (G protein-dependent) or by EGFR
transactivation (G protein-independent) (Luttrell, 2002; Miura, et al., 2004).
Recent evidence has demonstrated that different ligands for a GPCR can stabilize the
receptor under distinct conformations that promote the activation of some signalling pathways
over others (Galandrin, et al., 2007). This phenomenon is referred to as ligand bias or functional
selectivity. Biased ligands have been proposed to stabilize receptor conformations that are
distinct from those induced by unbiased ligands and selectively change the propensity of GPCR
coupling to various effectors, leading to different signalling outcomes. Several biased agonists
have been recently described for numerous GPCRs (van der Westhuizen, et al., 2014; Rominger,
et al., 2014), and such ligands show much therapeutic promise which could translate to
compounds having less off target effects (Rominger, et al., 2014).
76
76
The goal of the present study was to better comprehend the molecular basis underlying
AT1 receptor functional selectivity. Early structure-activity relashionship studies using assays
measuring rabbit aorta strip contraction and rat blood pressure have shown that position 8 of
AngII is essential for ligand activity, while position 4 is critical for ligand affinity, as well as
some activity (Regoli, et al., 1974). Position 1 of AngII analogs is often substituted with
sarcosine (N-methylglycine), which allows the peptides to resist aminopeptidase degradation.
AngIII, also known as AngII (2-8), is an endogenous AngII peptide where the aspartic acid at
position 1 is removed by animopeptidase degradation. The ligand [Sar1Ile
4Ile
8]AngII, which is
unable to signal via the Gq pathway, is able to selectively recruit βarrestin (Wei, et al., 2003).
Based on these observations, the goal of the study was to ascertain the impact of positions 1, 4
and 8 of AngII on the signalling profiles of the AT1 receptor and thus gain some insight into
whether these molecular determinants of AngII are involved in conferring the property of
functional selectivity towards the AT1 receptor. We therefore synthesized and investigated a
series of peptide analogs containing amino acid substitutions at positions 1, 4 and 8 and
determined their signalling profiles towards six different signalling pathways.
MATERIALS AND METHODS
Materials
All reagents were from Sigma-Aldrich Canada Ltd. (Oakville, ON) unless otherwise
indicated. Culture media, trypsin, FBS, penicillin, and streptomycin were from Wisent (St-
Bruno, Qc, Canada). OPTI-MEM and RNAi max were from Invitrogen Canada Inc. (Burlington,
ON). Polyethyleneimine (PEI) was from Polysciences (Warrington, PA). All siRNAs were from
Sigma-Aldrich (St-Louis, MO). 125
I-AngII (specific radioactivity ~1000 Ci/mmol) was prepared
with Iodo-GEN® (Perbio Science, Erembodegem, Belgium) as reported previously.
Constructs
The cDNA clone for the human AT1 receptor was kindly provided by Dr. Sylvain
Meloche (University of Montréal). The AT1-GFP10 construct was built by inserting the GFP10
sequence at the C-terminus of the AT1 construct, joined by the linker GSAGT, using the In-
Fusion® PCR cloning system (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) as recommended by
the manufacturer. The RLuc-βarrestin1, RLuc-βarrestin2, Gα12-RLuc, Gβ1 and Gγ1-GFP10
77
77
constructs were kindly provided by Dr. Michel Bouvier (University of Montréal). All constructs
were confirmed by automated DNA sequencing by alignment with multiAlin (Corpet, 1988).
Cell culture and transfection
Human embryonic kidney (HEK) 293 cells were maintained in DMEM medium
supplemented with 10% FBS, 100 IU/ml penicillin, and 100 µg/ml streptomycin at 37°C in a
humidified 5% CO2 atmosphere. HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor were
maintained in medium containing 0.5 mg/mL G418. For βarrestin recruitment assays, HEK293
cells (3 106 cells) were transiently transfected with 8700 ng of AT1-GFP10 and either 300 ng
of Rluc-βarrestin1 or 300 ng of Rluc-βarrestin2 using linear polyethylenimine (1 mg/ml)
(PEI:DNA ratio 4:1). For G12 activation assays, HEK293 cells (3 106 cells) were transiently
cotransfected with the following constructs: 3000 ng of AT1 receptor, 600 ng Gα12-RLuc, 3000
ng Gγ1-GFP10 and 1800 ng Gβ1, using linear polyethylenimine (PEI:DNA ratio 4:1). For
siRNA transfection, HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor were seeded in a 96-well
plate (50,000 cells/well) and each well was transfected with 1 pmol of the indicated siRNA using
RNAi max (0.3 uL).
Binding Experiments
For binding experiments, broken cells were gently scraped into washing buffer (25
mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2), centrifuged at 2500 × g for 15 min at 4 °C,
and resuspended in binding buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1%
bovine serum albumin, 0.01% bacitracin, 0.01% soybean trypsin inhibitor). Dose displacement
experiments were done by incubating broken cells (20–40 μg of protein) for 1 h at room
temperature with 0.8 nM 125
I-AngII as tracer and increasing concentrations of AngII. Bound
radioactivity was separated from free ligand by filtration through GF/C filters presoaked for at
least 3 h in binding buffer. Receptor-bound radioactivity was evaluated by γ counting. Results
are presented as means ± S.D. The Kd values in the displacement studies were determined from
the IC50 values using the Cheng-Prusoff equation.
78
78
Gq signalling
Gq signalling was evaluated by the measurement of inositol 1-phosphate (IP1) production
using the IP-One assay (Cisbio Bioassays, Bedford, MA). Necessary dilutions of each analog
were prepared in stimulation buffer (10 mM Hepes, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 4.2 mM KCl,
146 mM NaCl, 5.5 mM glucose, 50 mM LiCl, pH 7.4). HEK293 cells stably expressing the AT1
receptor were washed with PBS at room temperature, then trypsinized and distributed at 15 000
cells/well (7 μl) in a white 384-well plate in stimulation buffer. Cells were stimulated at 37 °C
for 30 min with increasing concentrations of AngII or analogues. Cells were then lysed with the
lysis buffer containing 3 μl of IP1 coupled to the dye d2. After addition of 3 μl of anti-
IP1 cryptate terbium conjugate, cells were incubated for 1 h at room temperature under agitation.
FRET signal was measured using a TECAN M1000 fluorescence plate reader (TECAN, Austria).
BRET-based biosensor assays
After 48 h post-transfection, cells were washed with PBS and resuspended in stimulation
buffer. For the βarrestin recruitment assays, the proximity of fusion protein RLuc-βarrestin to the
reporter AT1-GFP10 was evaluated. Upon stimulation, RLuc-βarrestin was recruited to the AT1-
GFP10 fusion protein, whereby the BRET signal was increased. For the G12 activation assay,
the biosensor measures the proximity of the fusion protein RLuc-Gα12 to GFP10-Gγ. Upon
activation, both RLuc-Gα12 and GFP10-Gγ move away from each other, which causes a decrease
in the measured BRET. For both the βarrestin recruitment assays and G12 activation assay, cells
transfected with the appropriate constructs were stimulated with the indicated ligands in 96-well
white plates (50 000 cells/well) for 8 min, and then coelentherazine 400A was added at a final
concentration of 5 uM. All BRET signals were measured using a TECAN M1000 fluorescence
plate reader. The BRET ratio was calculated as the GFP10 emission over luminescence emission.
Net BRET ratio was calculated by subtracting the BRET ratio under basal conditions from the
BRET ratio upon maximal stimulation. All data were expressed as a percentage of maximal
AngII response.
ERK1/2 activation assay
ERK1/2 activation was measured using the ERK1/2 AlphaScreen Surefire kit
(PerkinElmer, Waltham, MA). HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor were seeded
79
79
into 96-well plates at a density of 125 000 cells/well. After 24 h, cells were starved for at least 16
h in phenol red-free media before stimulation. Where specified, protein kinase C inhibitor
Go6983 (1 uM), EGFR tyrosine kinase inhibitor PD168393 (250 nM) or combination of both
inhibitors was added 30 min before stimulation. For time-course experiments, 100 nM AngII was
added for the indicated times. For concentration-response experiments, cells were stimulated
with increasing concentrations of indicated ligand. Cells were incubated at 37°C either for 2 min
(PKC-ERK) or 5 min (EGFR-ERK), as determined by the peak responses obtained in the time-
course assays. Stimulation of cells was terminated by the addition of lysis buffer to each well.
The plate was then agitated at room temperature for 10 min and 4 µl of lysate was transferred to
384-well ProxiPlates (PerkinElmer, Waltham, MA) and 5 ul of the assay reaction mix was added
to each well (reaction buffer : activation buffer : donor beads : acceptor beads = 120 : 40 : 1 : 1).
The plate was then incubated in the dark at room temperature for 24 h under agitation and the
signal was measured with an Enspire alpha reader (PerkinElmer, Waltham, MA) using standard
AlphaScreen settings. All data were expressed as a percentage of maximal AngII-induced
ERK1/2 phosphorylation.
Data analysis
Binding data were analyzed with Prism version 6.0 for Windows (GraphPad Software,
San Diego CA), using a one-site binding hyperbola nonlinear regression analysis. Transduction
ratios and bias factors were calculated based on the method of Kenakin (Kenakin, et al., 2012),
as described in detail by van der Westhuizen et al (van der Westhuizen, et al., 2014).
Transduction ratios [log(/KA)] were first derived using the operational model equation in
GraphPad Prism. The transduction ratio is an assessment of the effect (potency and efficacy) of a
compound on receptor conformation and the subsequent ligand-receptor interaction with
downstream effectors. In order to assess true ligand bias, system and observational bias which
may be present owing to the different sensitivities of the assays used must be eliminated by
comparing ligand activity at a given signalling pathway to that of a reference agonist. AngII,
which yielded similar potencies and maximally activated all the pathways, was the reference
compound. By subtracting log(/KA) of AngII to the log(/KA) value of each analog for a given
pathway, a within-pathway comparison was first established, yielding Δlog(/KA). Finally,
between-pathway comparisons were achieved for a given ligand in the form of ΔΔlog(/KA) and
80
80
the bias factor BF. ΔΔlog(/KA) were calculated by substracting Δlog(/KA) values of one
signalling pathway from the Δlog(/KA) of the signalling pathway to which it is compared. BF
values are the base 10 values of ΔΔlog(/KA) and are the actual bias factors.
RESULTS
Binding properties of AngII peptide analogs
We evaluated the binding properties of 8 selected peptide analogs of AngII (Table 1).
AngII (Kd = 1.1 nM), and its analogs [Sar1Ile
8]AngII (Kd = 1.7 nM), [Sar
1]AngII (Kd = 1.8 nM),
[Ile8]AngII (Kd = 3.2 nM), AngIII (Kd = 5.2 nM), [Sar
1Ile
8]AngIII (Kd = 12 nM) showed high
binding affinity in the low nanomolar range whereas analogs [Sar1Ile
4]AngII (Kd = 78 nM) and
[Ile4]AngII (Kd = 894 nM) showed lower binding affinities. These analogs modified at positions
1, 4 or 8 were appropriate to compare their relative efficacies in the different signalling
pathways.
Gq signalling
To assess AT1 receptor signalling via the heterotrimeric G protein Gq, we measured IP1
production after a 30 min stimulation with each analog, using AngII as a reference. The AngII
dose-response curve shown at Fig. 1A revealed a maximal response of 730.2 nM of IP1 produced
(normalized to 100%) with a half-maximal response (EC50) at a concentration of 3.1 nM. Dose-
response curves with the analogs modified at position 1 provided a maximal response of 98%
and EC50 of 3.3 nM for [Sar1]AngII (Fig. 1B) and a maximal response of 87% and EC50 of 51
nM for AngIII (data not shown). Dose-response curves with the analogs modified at position 4,
provided a maximal response of 43% and EC50 of 686 nM for [Sar1Ile
4]AngII (Fig. 1C) and a
maximal response of 67% and EC50 of 3100 nM for [Ile4]AngII (data not shown). Dose-response
experiments with the analogs modified at position 8 revealed that [Sar1Ile
8]AngII (Fig. 1D),
[Ile8]AngII (Fig. 1E) and [Ile
8]AngIII (Fig. 1F), did not produce any measurable IP1. All these
data are summarized in Table 2. These results indicate that position 8 of AngII is critical for
activating the Gq pathway. These results also indicate that position 4 of AngII affects both the
potency and the efficacy of the peptide in the activation of the Gq pathway whereas
modifications at position 1 did not show any impact.
81
81
Figure 1. Inositol 1-phosphate production induced by AngII analogs. HEK293 cells expressing
the AT1 receptor were stimulated with increasing concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B),
Sar1Ile
4-AngII (C), Sar
1Ile
8-AngII (D), Ile
8-AngII (E) and Ile
8-AngIII (F) for 30 min at 37°C. IP1
accumulation was measured with the IP-One assay, as described in the methods. Data are
expressed as a percentage of AngII maximal response. Data are the mean ± SD of 3-6
independent experiments performed in triplicate.
82
82
βarrestin recruitment
To evaluate the capacity of the receptor to recruit and engage with either βarrestin1 or
βarrestin2 following an 8 min stimulation with each analog, a BRET-based βarrestin recruitment
assay was used. The AngII dose-response curve for βarrestin1 recruitment revealed a maximal
net BRET ratio of 0.085 (normalized to 100%) with an EC50 of 6.1 nM (Fig. 2A), while that for
βarrestin2 recruitment revealed a maximal net BRET ratio of 0.106 (normalized to 100%) with
an EC50 of 4.6 nM (Fig. 3A). Dose-response curves for βarrestin recruitment by [Sar1]AngII
showed a maximal response of 100% with an EC50 of 6.4 nM for βarrestin1 (Fig. 2B) and a
maximal response of 94% with an EC50 of 5.6 nM for βarrestin2 (Fig. 3B).The analog AngIII
had a maximal response of 94% with an EC50 of 54 nM for βarrestin1 recruitment and a maximal
response of 93% with an EC50 of 48 nM for βarrestin2 recruitment (data not shown).
Dose-response curves were performed with two analogs modified at position 4.
[Sar1Ile
4]AngII showed maximal responses of 81% (βarrestin1) and 86% (βarrestin2) with EC50s
of 429 nM (βarrestin1) and 458 nM (βarrestin2) (Figs. 2C, 3C). [Ile4]AngII showed maximal
responses of 72% (βarrestin1) and 84% (βarrestin2) with EC50s of 2800 nM (βarrestin1) and
3829 nM (βarrestin2) (data not shown).
Dose-response curves were performed with three analogs modified at position 8.
[Sar1Ile
8]AngII showed maximal responses of 56% (βarrestin1) and 61% (βarrestin2) with EC50s
of 4.5 nM (βarrestin1) and 5.6 nM (βarrestin2) (Fig. 2D, 3D). [Ile8]AngII showed maximal
responses of 54% (βarrestin1) and 59% (βarrestin2) with EC50s of 7.0 nM (βarrestin1) and 5.7
nM (βarrestin2) (Fig. 2E, 3E). [Ile8]AngIII showed maximal responses of 50% (βarrestin1) and
49% (βarrestin2) with EC50s of 11.3 nM (βarrestin1) and 48 nM (βarrestin2) (Fig. 2F, 3F). All
these results are summarized in Table 2. These results indicate that the analogs modified at
position 8 of AngII are partial agonists for the recruitment of βarrestins with relatively high
potencies but with efficacies lower (~50%) than that of AngII. The analogs modified at position
4 are also partial agonists for the recruitment of βarrestins although with relatively high
efficacies (~80% compared to AngII) and with low potencies. Modifications at position 1 of
AngII did not show any impact on the recruitment of βarrestins.
83
83
Figure 2. βarrestin1 recruitment to the AT1 receptor by AngII analogs. HEK293 cells co-
transfected with fusion protein RLuc-βarrestin and the reporter AT1-GFP10 were stimulated with
increasing concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B), Sar
1Ile
4-AngII (C), Sar
1Ile
8-AngII (D),
Ile8-AngII (E) and Ile
8-AngIII (F) for 8 min at 37°C. βarrestin1 recruitment was measured as
described in the methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data
are the mean ± SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.
Figure 2. βarrestin1 recruitment to the AT1 receptor by AngII analogs. HEK293 cells co-
transfected with fusion protein RLuc-βarrestin and the reporter AT1-GFP10 were stimulated with
increasing concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B), Sar
1Ile
4-AngII (C), Sar
1Ile
8-AngII (D),
Ile8-AngII (E) and Ile
8-AngIII (F) for 8 min at 37°C. βarrestin1 recruitment was measured as
described in the methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data
are the mean ± SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.
84
84
Figure 2. βarrestin1 recruitment to the AT1 receptor by AngII analogs. HEK293 cells co-
transfected with fusion protein RLuc-βarrestin and the reporter AT1-GFP10 were stimulated with
increasing concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B), Sar
1Ile
4-AngII (C), Sar
1Ile
8-AngII (D),
Ile8-AngII (E) and Ile
8-AngIII (F) for 8 min at 37°C. βarrestin1 recruitment was measured as
described in the methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data
are the mean ± SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.
85
85
Figure 3. βarrestin2 recrutment to the AT1 receptor by AngII analogs. HEK293 cells co-
transfected with fusion protein RLuc-βarrestin and the reporter AT1-GFP10 were stimulated with
increasing concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B), Sar
1Ile
4-AngII (C), Sar
1Ile
8-AngII (D),
Ile8-AngII (E) and Ile
8-AngIII (F) for 8 min at 37°C. βarrestin2 recruitment was measured as
described in the methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data
are the mean ± SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.
86
86
G12 activation
The ability of the AT1 receptor to engage with and activate the G12 heterotrimer was
evaluated using a BRET-based biosensor assay. The AngII dose-response curve shown at Fig.
4A revealed a net BRET ratio of 0.096 (normalized to 100%) with an EC50 of 4.7 nM. Dose-
response curves with the analogs modified at position 1 provided a maximal response of 104%
with an EC50 of 5.1 nM for [Sar1]AngII (Fig. 4B) and a maximal response of 98% with an EC50
of 90 nM for AngIII (data not shown). Dose-response curves with the analogs modified at
position 4 showed a maximal response of 65% with an EC50 of 228 nM for [Sar1Ile
4]AngII (Fig.
4C) and a maximal response of 60% with an EC50 of 1056 nM for [Ile4]AngII (data not shown).
Dose-response curves with the analogs modified at position 8 showed a maximal response of
44% with an EC50 of 1.0 nM for [Sar1Ile
8]AngII (Fig. 4D), a maximal response of 42% with an
EC50 of 3.2 nM for [Ile8]AngII (Fig. 4E) and a maximal response of 38% with an EC50 of 12 nM
for [Ile8]AngIII (Fig. 4F). All these results are summarized in Table 2. These results indicate that
the analogs modified at position 8 of AngII are partial agonists for G12 activation with relatively
high potencies but with efficacies lower (~40%) than that of AngII. The analogs modified at
position 4 are also partial agonists for G12 activation with efficacies lower (~60%) than that of
AngII and with low potencies. Modifications at position 1 of AngII did not show any impact on
the activation of G12.
87
87
Figure 4. G12 activation by AngII analogs. HEK293 cells expressing the AT1 receptor and co-
transfected with Gα12-RLuc, Gγ1-GFP10 and Gβ1 were stimulated with increasing
concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B), Sar
1Ile
4-AngII (C), Sar
1Ile
8-AngII (D), Ile
8-AngII
(E) and Ile8-AngIII (F) for 8 min at 37°C. G12 activity was measured as described in the methods.
Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data are the mean ± SD of 3-6
independent experiments performed in triplicate.
88
88
ERK response
We evaluated the capacity of the selected AngII analogs to activate the ERK1/2 pathway
by measuring ERK phosphorylation levels upon stimulation, a hallmark of ERK activity. Figure
5 shows that under control conditions (circles), the addition of AngII increased ERK
phosphorylation which reached a maximal value at 5 min and then slowly declined towards the
basal level. In the presence of the EGFR tyrosine kinase inhibitor PD168393 (triangles), the
addition of AngII increased ERK phosphorylation which reached a maximal value at 2 min and
then slowly declined towards the basal level. In the presence of the PKC inhibitor Go6983
(squares), the addition of AngII increased ERK phosphorylation which reached a maximal value
at 5 min and then slowly declined towards the basal level. In the presence of both PD168393 and
Go6983 (diamonds), the addition of AngII did not produce any measurable ERK
phosphorylation. These results suggest that in our experimental model, within the limits of our
time-course, AngII activates the ERK1/2 pathway via PKC following Gq activation and also via
the transactivation of EGFR. Since the ERK1/2 response is completely abolished in the presence
of both inhibitors, we reasoned that the ERK response in the presence of Go6983 was mediated
by EGFR (pathway EGFR-ERK) while the ERK response in the presence of PD168393 was
mediated by PKC (pathway PKC-ERK).
89
89
Figure 5. AngII-induced ERK activation. HEK293 cells expressing the AT1 receptor were
pretreated as indicated for 30 min and then were stimulated with 100 nM AngII for different
periods of time. ERK activity was measured as described in the methods. Data are expressed as a
percentage of AngII maximal response. Data are the mean ± SD of 3-6 independent experiments
performed in triplicate.
EGFR-mediated ERK response
To evaluate the EGFR-ERK pathway, HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor
were treated with increasing concentrations of each analog for 5 min, in the presence of Go6983
(Fig. 6 and Table 3). The AngII dose-response curve shown at Fig. 6A shows a maximal
response of 49 677 luminescence arbitrary units (normalized to 100%) with an EC50 of 2.8 nM.
Dose-response curves with the analogs modified at position 1 provided a maximal response of
94% with an EC50 of 4.2 nM for [Sar1]AngII (Fig. 6B) and a maximal response of 88% with an
EC50 of 9.2 nM for AngIII (data not shown). Dose-response curves with the analogs modified at
position 4 provided a maximal response of 95% with an EC50 of 50 nM for [Sar1Ile
4]AngII (Fig.
6C) and a maximal response of 93% with an EC50 of 1397 nM for [Ile4]AngII (data not shown).
Dose-response curves with the analogs modified at position 8 showed a maximal response of
27% with an EC50 of 11 nM for [Sar1Ile
8]AngII (Fig. 6D), a maximal response of 27% with an
EC50 of 40 nM for [Ile8]AngII (Fig. 6E), and a maximal response of 30% with an EC50 of 21 nM
for [Ile8]AngIII (Fig. 6F). All these results are summarized in Table 3. These results indicate that
the analogs modified at position 4 are partial agonists, although with very high efficacies (~94%)
for the EGFR-ERK pathway. Furthermore, [Sar1Ile
4]AngII showed a higher potency (~10 times)
in the EGFR-ERK pathway than the Gq, G12 and βarrestin pathways. The analogs modified at
position 8 of AngII are partial agonists of the EGFR-ERK pathway, with relatively low potencies
(~10 times lower than that of AngII) and with low efficacies (~30% of that of AngII).
Modifications at position 1 of AngII had no major impact on the EGFR-ERK pathway.
90
90
Figure 6. EGFR-dependent ERK activation by AngII analogs. HEK293 cells expressing the AT1
receptor were pretreated with 1 uM Go6983 for 30 min and then were stimulated with increasing
concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B), Sar
1Ile
4-AngII (C), Sar
1Ile
8-AngII (D), Ile
8-AngII
(E) and Ile8-AngIII (F) for 5 min at 37°C. ERK activity was measured as described in the
methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data are the mean ±
SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.
91
91
PKC-mediated ERK response
To evaluate the PKC-ERK pathway, HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor
were treated with increasing concentrations of each analog for 2 min, in the presence of
PD168393 (Fig. 7 and Table 3). The AngII dose-response curve shown at Fig. 7A shows a
maximal response of 58 391 luminescence arbitrary units (normalized to 100%) with an EC50 of
1.2 nM. Dose-response curves with the analogs modified at position 1 provided a maximal
response of 92% with an EC50 of 3.0 nM for [Sar1]AngII (Fig. 7B) and a maximal response of
88% with an EC50 of 4.0 nM for AngIII (data not shown). Dose-response curves with the analogs
modified at position 4 provided a maximal response of 94% with an EC50 of 32 nM for
[Sar1Ile
4]AngII (Fig. 7C) and a maximal response of 80% with an EC50 of 523 nM for
[Ile4]AngII (data not shown). Dose-response curves with the analogs modified at position 8
showed a maximal response of 28% with an EC50 of 45 nM for [Sar1Ile
8]AngII (Fig. 7D), a
maximal response of 38% with an EC50 of 55 nM for [Ile8]AngII (Fig. 7E), and a maximal
response of 25% with an EC50 of 40 nM for [Ile8]AngIII (Fig. 7F). These results indicate that the
analogs modified at position 4 are partial agonists, although with high efficacies (~85%) for the
PKC-ERK pathway. Furthermore, the analog [Sar1Ile
4]AngII showed a higher potency (~10
times) in the PKC-ERK pathway than the Gq, G12 and βarrestin pathways. The analogs
modified at position 8 of AngII are partial agonists of the PKC-ERK pathway, with relatively
low potencies (~10 times lower than AngII) and with low efficacies (~30% that of AngII).
Modifications at position 1 of AngII had no major impact on the PKC-ERK pathway.
92
92
Figure 7. PKC-dependent ERK activation by AngII analogs. HEK293 cells expressing the AT1
receptor were pretreated with 250 nM PD168393 for 30 min and then were stimulated with
increasing concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B), Sar
1Ile
4-AngII (C), Sar
1Ile
8-AngII (D),
Ile8-AngII (E) and Ile
8-AngIII (F) for 2 min at 37°C. ERK activity was measured as described in
the methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data are the mean
± SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.
93
93
Role of atypical PKC isoforms in the PKC-mediated ERK response
It is generally accepted that Gq activation leads to the production of DAG and IP3,
leading to the elevation of intracellular Ca2+
concentration. DAG and Ca2+
in turn lead to the
activation of most isoforms of PKC. How then can a ligand such as [Sar1Ile
8]AngII, that does not
engage Gq, activate the PKC-ERK pathway? Actually, PKC are comprised of at least 15
isomers which can be classified into 3 families: conventional PKCs (cPKCs) including PKCα,
PKCβ and PKCγ that are activated by Ca2+
and DAG, novel PKCs (nPKCs) including PKC,
PKC, PKC and PKC that are activated by DAG only and atypical PKCs (aPKCs) including
PKC and PKC that are not activated by Ca2+
nor by DAG, but by other, less understood
mechanisms (Wu-Zhang and Newton, 2013). We therefore hypothesized that [Sar1Ile
8]AngII
could activate atypical PKC isoforms PKC or PKC. To test this hypothesis, we used siRNA
directed against either PKC or PKC, and then measured the PKC-dependent ERK response.
Figure 8 shows that upon PKC depletion, the PKC-dependent ERK activity promoted by
[Sar1Ile
8]AngII was reduced by 55%. When PKC was depleted, PKC-dependent ERK activity
promoted by [Sar1Ile
8]AngII was reduced by 60%. Upon depletion of both isoforms
simultaneously, the PKC-dependent response elicited with [Sar1Ile
8]AngII was further
diminished by 75%. These results support a role for both atypical PKC isoforms PKC and PKC
in AT1 receptor signalling that may have previously been underestimated.
94
94
Figure 8. Atypical PKC-dependent ERK activation. HEK293 cells expressing the AT1 receptor
were transfected with siRNA against the indicated PKC isoforms as described in the methods.
Cells were stimulated with 100 nM Sar1Ile
8-AngII for 2 min at 37°C. ERK activity was
measured as described in the methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal
response. Data are the mean ± SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.
Quantification of ligand bias
Large variations in the potencies and efficacies of AngII analogs towards the different
signalling pathways were observed (Tables 2 and 3), which suggests the presence of signalling
bias. In order to clearly establish whether an analog was biased towards one pathway over the
others, the bias factors were determined for each analog and for all the signalling pathways.
Transduction ratios [log(/KA)] were first derived using the operational model (Table 4). The
95
95
log(/KA) of the reference compound AngII was then subtracted from the log(/KA) value of each
analog for a given pathway, yielding Δlog(/KA) as a within-pathway comparison for each
signalling pathway. The Δlog(/KA) value is indicative of how well a given signalling pathway
can be activated by a ligand, where a value of 0 indicates that a given ligand activates a pathway
to the same degree as the reference compound, a positive value indicating that the ligand more
strongly activates the signalling pathway than the reference compound and an increasingly
negative value indicating that the ligand poorly activates the signalling pathway, if at all. The
Δlog(/KA) values of each analog calculated for every signalling pathway was represented on a
radar plot (Figure 9). This allowed a graphic representation highlighting to what extent each
pathway can be activated (or not) by a given ligand. Ultimately, a between-pathway comparison
was achieved for a given ligand in the form of ΔΔlog(/KA), which is the actual bias factor
(Tables 5 and 6).
The different analogs were partitioned into 3 groups, based on their functional selectivity
profiles. The first group was comprised of the analogs modified solely at position 1, [Sar1]AngII
and AngIII (Table 5 and Fig. 9A). The analog [Sar1]AngII showed Δlog(/KA) values ranging
from -0.25 to 0.29, indicating that it is balanced relative to AngII (Fig. 9A). These results suggest
that position 1 of AngII is likely not an important molecular determinant for functional
selectivity towards the AT1 receptor. A second group of analogs included [Sar1Ile
4]AngII (Fig.
9B) and [Ile4]AngII that are modified at position 4 (Table 6). Figure 9B shows that
[Sar1Ile
4]AngII was a strong activator of both EGFR-dependent and PKC-dependent ERK
signalling with Δlog(/KA) values respectively of -1.51 and -1.72. The rank order of pathways
activated were as follows: βarrestin2 recruitment ((Δlog(/KA) of -2.35) , βarrestin1 recruitment
((Δlog(/KA) of -2.39), the G12 pathway (Δlog(/KA) of -2.49) and the Gq pathway (Δlog(/KA)
of -3.47). Table 6 shows that the biases of [Ile4]AngII and [Sar
1Ile
4]AngII towards EGFR-ERK
over Gq were 14-fold and 93-fold, respectively. The bias of [Ile4]AngII towards PKC-ERK over
Gq was 26-fold while for [Sar1Ile
4]AngII it was 57-fold. These represented the strongest biases
for AngII analogs modified at position 4. These results suggest that position 4 of AngII is likely
an important molecular determinant involved in functional selectivity towards the AT1 receptor.
The third group of analogs included [Sar1Ile
8]AngII (Figure 9C), [Ile
8]AngII (Figure 9D) and
[Ile8]AngIII (Figure 9E), that are modified at position 8. Figure 9C shows that for
[Sar1Ile
8]AngII, the rank order of pathways activated were as follows : βarrestin2 recruitment
96
96
Δlog(/KA) of -0.77), βarrestin1 recruitment (Δlog(/KA) of -0.79), the G12 pathway ((Δlog(/KA)
of -1.93) , EGFR-ERK ((Δlog(/KA) of -4.03) and PKC-ERK (Δlog(/KA) of -4.13). Analogs
[Ile8]AngII and [Ile
8]AngIII showed the same rank order of pathway activation than
[Sar1Ile
8]AngII, but were less proficient at recruiting both βarrestins and activating the G12
pathway. Since none of the analogs in this group activated the Gq pathway, no bias factor could
be calculated. However, this in itself represents an obviously strong bias of these ligands for all
the other pathways over the Gq pathway. Table 7 shows that the bias of [Sar1Ile
8]AngII towards
βarrestin2 over PKC-ERK was 2252-fold, while the bias of βarrestin1 over PKC-ERK was 2147-
fold. These represented the strongest biases found for AngII analogs modified at position 8.
These results confirm that position 8 of AngII is likely an important molecular determinant
involved in functional selectivity towards the AT1 receptor.
97
97
Figure 9. Effects of AngII analogs on AT1 signalling pathways. Radar graph representations
summarizing the calculated Δlog(/KA) values of the different ligand-activated pathways for
Sar1-AngII (A), Sar
1Ile
4-AngII (B), Sar
1Ile
8-AngII (C), Ile
8-AngII (D) and Ile
8-AngIII (E). The
balanced reference analog AngII is represented in blue.
98
98
DISCUSSION
Functional selectivity is a relatively new concept and its therapeutic potential is becoming
more and more acknowledged (Rominger, et al., 2014). Ligand bias is the ability of certain
ligands to stabilize distinct receptor-transducer pairs at the expense of others, leading to signal
pathway selectivity. The goal of our study was to identify biased ligands of the AT1 receptor and
to better characterize the molecular determinants of AngII that underlie functional selectivity. A
better understanding of the mechanisms leading to the recognition of distinct receptor-effector
states by biased ligands should lead to the development of better therapeutics with less off-target
effects. For this study, eleven AngII peptide analogs together with the reference ligand AngII
were selected to assess their functional selectivity profiles towards 6 different AT1 receptor
signalling outcomes. The pathways investigated were IP1 production (as a reporter of Gq
activation), βarrestin1 and βarrestin2 recruitment, G12 activation as assessed by a BRET
biosensor assay, and the ERK1/2 activation via either PKC activation or EGFR activation. The
ligands were chosen based on the previously characterised importance of positions 1, 4 and 8 for
AngII activity, as demonstrated by previous structure-activity relationship studies (Regoli, et al.,
1974; Holloway, et al., 2002).
We showed that the substitution of phenylalanine at position 8 of AngII for isoleucine
abolishes Gq signalling, whereas it maintains βarrestin recruitment, G12 and ERK activation. The
radar plot shown at Fig. 9 further indicates the strongest bias towards βarrestin recruitment.
[Ile8]AngII, [Sar
1Ile
8]AngII and [Ile
8]AngIII were antagonists for the Gq pathway, partial
agonists with relatively high efficacies for βarrestin recruitment and with lower efficacies for the
other pathways. It was known for a long time that AngII analogs containing an aliphatic residue
at position 8 are antagonists of the Gq pathway (Regoli, et al., 1974; Miura, et al., 1999). It was
only recently shown that these analogs can activate some pathways downstream of the AT1
receptor. For instance, it was shown that [Sar1Ile
8]AngII can activate total ERK (Holloway, et
al., 2002; Ahn, et al., 2004a) and recruit βarrestin (Zimmerman, et al., 2012; Ahn, et al., 2004b).
TRV027, an analog that contains D-Ala at position 8, is another recently developed biased ligand
towards β-arrestin recruitment (Violin, et al., 2010). These results suggest that the molecular
determinants present at position 8 of AngII contribute to AT1 receptor functional selectivity,
99
99
whereby Gq activation is abolished, while the G12, and βarrestin pathways are maintained and
ERK activity is strongly decreased.
Of particular interest, we found that [Sar1Ile
8]AngII, despite being unable to generate a
Gq-dependent response, was still able to activate ERK in an atypical PKC-dependent manner. It
was previously shown that PKC plays a role in AT1 receptor ERK activation in vascular smooth
muscle cells (Kim, et al., 2009; Liao, et al., 1997; Zhao, et al., 2005). These results support a role
for both atypical PKC isoforms PKC and PKC in AT1 receptor signalling that may have
previously been underestimated.
We showed that the substitution of aspartate at position 1 for sarcosine ([Sar1]AngII) or
its removal (AngIII) had very little impact on the capacity of the AT1 receptor to signal through
the different pathways tested (Table 5 and Fig. 9A). It has been long known that sarcosine at
position 1 of AngII peptides confers resistance to aminopeptidase degradation in vivo (Hall, et
al., 1974). Substitution at position 1 of AngII was seen to have little or no impact on smooth
muscle contraction (an assay dependent on Gq activation) (Hall, et al., 1974), on inositol
phosphates production (Holloway, et al., 2002) or on total ERK activation (Miura, et al., 2004).
Here, we further showed that substitution at position 1 of AngII also had no impact on G12
activation, EGFR transactivation and βarrestin recruitment. Altogether, these results suggest that
position 1 of AngII peptides has very little impact on AT1 receptor functional selectivity.
We showed that the substitution of tyrosine at position 4 of AngII for isoleucine caused a
bias towards ERK signalling. Both [Ile4]AngII and [Sar
1Ile
4]AngII are full agonists for PKC-
dependent and EGFR-dependent ERK activity, but partial agonists for the G12, βarrestin and Gq
pathways. Although the substitution of Tyr4 for Ile
4 decreased the potency for activation of all
the pathways, this decrease was markedly less for the ERK pathway. This modification at
position 4 appears to stabilize a receptor conformation that preferentially interacts with the
effectors of the ERK pathway. To our knowledge, we are the first to evaluate and compare the
impact of position 4 of AngII on different signalling pathways using a single model. We are also
the first to evaluate the impact of position 4 on G12 activation. It was previously shown that
[Sar1Ile
4]AngII is a partial agonist of the Gq pathway in CHO-K1 cells (Miura, et al., 2004).
Substitution at position 4 was also shown to decrease AngII potency and efficacy in smooth
muscle contraction assays (Regoli, et al., 1974; Samanen, et al., 1989). A previous report
indicated that substitutions at position 4 of AngII had very little impact on ERK activation in
100
100
CHO-K1cells (Holloway, et al., 2002). These results suggest that the molecular determinants
present at position 4 of AngII contribute to AT1 receptor functional selectivity, whereby ERK
activity is maintained while the G12, Gq and βarrestin pathways are negatively impacted.
In conclusion, the purpose of our study was to establish the impact of positions 1, 4 and 8
of AngII on different signalling pathways downstream of the AT1 receptor and thus gain some
insight into whether these molecular determinants of AngII were involved in conferring
functional selectivity. Our study reveals that position 1 of AngII does not confer functional
selectivity, while position 4 confers a bias towards ERK signalling over Gq signalling and that
position 8 confers a bias towards βarrestin recruitment over ERK activation and Gq signalling.
101
101
AUTHORSHIP CONTRIBUTIONS
Participated in research design : Domazet, Holleran, Lavigne, Escher, Leduc and Guillemette
Conducted experiments : Domazet, Holleran, Richard, Vanderberghe
Performed data analysis : Domazet, Holleran, Richard, Vanderberghe, Lavigne, Escher, Leduc
and Guillemette
Contributed to the writing of the manuscript : Domazet, Holleran, Leduc and Guillemette
102
102
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105
105
FOOTNOTES
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes of Health Research [MOP-
136770].
This work is part of the Ph.D thesis of I. Domazet.
106
106
TABLES
Table 1
Binding properties of AT1 receptor ligands
Kd (nM) n
AngII 1.1 ± 0.3 12
[Sar1]-AngII 1.8 ± 0.1 3
[Ile4]-AngII 894 ± 132 3
[Ile8]-AngII 3.2 ± 1.1 3
[Sar1Ile
4]-AngII 78 ± 11 3
[Sar1Ile
8]-AngII 1.7 ± 0.8 3
[Ile4Ile
8]-AngII 1254 ± 198 4
[Sar1Ile
4Ile
8]-AngII 223 ± 38 3
AngIII 5.2 ± 2.1 4
[Ile4]-AngIII 3689 ± 2027 3
[Ile8]-AngIII 12.3 ± 5.1 3
[Ile4Ile
8]-AngIII 5783 ± 1408 3
HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor were assayed as described in “Experimental
Procedure.” Binding affinities (Kd) are expressed as the means ± SD of values obtained in n
independent experiments performed in duplicate.
107
107
Table 2
Activation of Gq, βarrestin1, βarrestin2 and G12 by AT1 receptor ligands
Gq βarrestin1 βarrestin2 G12
EC50 (nM) Emax
(%
AngII)
EC50 (nM) Emax
(%
AngII)
EC50 (nM) Emax
(%
AngII)
EC50 (nM) Emax
(%
AngII)
AngII 2.4 ± 1.6 100 6.1 ± 1.7 100 4.6 ± 1.9 100 4.7 ± 1.9 100
[Sar1]-AngII 3.3 ± 0.8 98 ± 8 6.4 ± 3.0 100 ± 1 5.6 ± 2.3 94 ± 5 5.1 ± 2.0 104 ± 8
[Ile4]-AngII 3104 ±
106
67 ± 2 2802 ±
670
72 ± 6 3829 ±
649
84 ± 8 1056 ±
321
60 ± 9
[Sar1Ile
4]-
AngII
686 ± 52 43 ± 7 429 ± 126 81 ± 4 458 ± 158 86 ± 3 228 ± 62 65 ± 5
[Ile8]-AngII NR NR 7.0 ± 1.6 54 ± 6 5.7 ± 2.7 59 ± 6 3.5 ± 1.4 42 ± 5
[Sar1Ile
8]-
AngII
NR NR 4.5 ± 1.9 56 ± 6 5.6 ± 2.0 61 ± 8 1.0 ± 0.6 44 ± 6
AngIII 51 ± 19 87 ± 8 54 ± 8 94 ± 3 48 ± 16 93 ± 9 90 ± 33 98 ± 7
[Ile8]-AngIII NR NR 11.3 ± 1.0 50 ± 10 49 ± 2 48 ± 11 12.3 ± 7.1 38 ± 6
HEK293 cells expressing the AT1 receptor were assayed as described in the methods. EC50 and
Emax are expressed as the means ± SD of values obtained in at least 3 independent experiments
performed in triplicate. NR, no response.
108
108
Table 3
Activation of Gq, PKC-ERK and EGFR-ERK by AT1 receptor ligands
Gq PKC-ERK EGFR-ERK
EC50 (nM) Emax
(%
AngII)
EC50 (nM) Emax
(%
AngII)
EC50 (nM) Emax
(%
AngII)
AngII 2.4 ± 1.6 100 1.2 ± 0.1 100 2.8 ± 0.5 100
[Sar1]-AngII 3.3 ± 0.8 98 ± 8 3.0 ± 0.9 92 ± 4 4.2 ± 1.9 94 ± 2
[Ile4]-AngII 3104 ±
106
67 ± 2 523 ± 93 80 ± 10 1327 ±
264
93 ± 8
[Sar1Ile
4]-AngII 686 ± 52 43 ± 7 32 ± 5 94 ± 7 50 ± 9 95 ± 5
[Ile8]-AngII NR NR 55 ± 13 38 ± 4 40 ± 14 27 ± 3
[Sar1Ile
8]-AngII NR NR 45 ± 14 28 ± 4 11 ± 3 27 ± 1
AngIII 51 ± 19 87 ± 8 4.0 ± 0.6 88 ± 3 9.2 ± 1.9 88 ± 3
[Ile8]-AngIII NR NR 40 ± 5 25 ± 3 21 ± 4 30 ± 4
HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor were assayed as described in the methods.
EC50 and Emax are expressed as the means ± SD of values obtained in at least 3 independent
experiments performed in duplicate. NR, no response.
109
109
Table 4
Transduction ratios of AT1 receptor ligands
Gq βarrestin1 βarrestin2 G12 PKC-ERK EGFR-ERK
log(/KA) Δlog(/KA) log(/KA) Δlog(/KA) log(/KA) Δlog(/KA) log(/KA) Δlog(/KA) log(/KA) Δlog(/KA) log(/KA) Δlog(/KA)
AngII 8.46 ± 0.07 0.00 ± 0.10 8.29 ±
0.12
0.00 ± 0.16 8.42 ± 0.06 0.00 ± 0.08 8.25 ± 0.07 0.00 ± 0.10 8.96 ± 0.04 0.00 ± 0.06 8.76 ±
0.04
0.00 ± 0.06
[Sar1]-AngII 8.75 ± 0.07 0.29 ± 0.09 8.40 ±
0.28
0.11 ± 0.29 8.24 ± 0.06 -0.18 ±
0.08
8.48 ± 0.22 0.23 ± 0.23 8.72 ± 0.12 -0.25 ± 0.12 8.55 ±
0.15
-0.22 ± 0.15
[Ile4]-AngII 4.50 ± 0.41 -3.95 ± 0.41 5.25 ±
0.07
-3.04 ± 0.13 5.27 ± 0.08 -3.15 ±
0.10
5.02 ± 0.22 -3.23 ±
0.22
6.43 ± 0.24 -2.53 ± 0.24 5.94 ±
0.13
-2.82 ± 0.13
[Sar1Ile
4]-AngII 4.98 ± 0.23 -3.47 ± 0.23 5.90 ±
0.17
-2.39 ± 0.20 6.07 ± 0.18 -2.35 ±
0.18
5.76 ± 0.16 -2.49 ±
0.18
7.24 ± 0.36 -1.72 ± 0.36 7.26 ±
0.22
-1.51 ± 0.10
[Ile8]-AngII ND ND 6.81 ±
0.36
-1.48 ± 0.37 7.63 ± 0.20 -0.79 ±
0.20
5.15 ± 0.45 -3.10 ±
0.45
4.98 ± 0.20 -3.99 ± 0.20 4.96 ±
0.22
-3.81 ± 0.22
[Sar1Ile
8]-AngII ND ND 7.50 ±
0.38
-0.79 ± 0.39 7.65 ± 0.22 -0.77 ±
0.23
6.32 ± 0.56 -1.93 ±
0.56
4.84 ± 0.16 -4.13 ± 0.16 4.74 ±
0.04
-4.03 ± 0.05
AngIII 6.65 ± 0.12 -1.80 ± 0.14 7.29 ±
0.19
-0.99 ± 0.22 7.32 ± 0.16 -1.10 ±
0.16
7.25 ± 0.27 -1.00 ±
0.27
8.26 ± 0.05 -0.70 ± 0.06 8.39 ±
0.15
-0.37 ± 0.15
[Ile8]-AngIII ND ND 5.66 ±
0.16
-2.63 ± 0.19 5.55 ± 0.20 -2.87 ±
0.21
4.64 ± 0.15 -3.61 ±
0.16
4.55 ± 0.08 -4.42 ± 0.09 4.95 ±
0.18
-3.81 ± 0.18
110
110
HEK293 cells expressing the AT1 receptor were stimulated with the different analogs and responses were measured for 6 distinct signalling pathways. Data were analysed by
nonlinear regression using the Operational Model equation as described in the methods to determine log(/KA). Δlog(/KA) were calculated from log(/KA) using AngII as the
reference ligand. Data are the mean ± SEM of 3-6 independent experiments performed in triplicate. ND, Cannot be determined.
Table 5
Bias factors of AT1 receptor ligands modified at position 1
AngII [Sar1]-AngII AngIII
ΔΔlog(/KA
) BF
ΔΔlog(/KA
) BF ΔΔlog(/KA) BF
EGFR/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 -0.51 ± 0.18 0.31 1.43 ± 0.21 26.99
PKC/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 -0.54 ± 0.16 0.29 1.10 ± 0.16 12.63
G12/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 -0.06 ± 0.25 0.86 0.80 ± 0.31 6.35
βarrestin1/Gq 0.00 ± 0.19 1.00 -0.19 ± 0.32 0.65 0.80 ± 0.27 6.34
βarrestin2/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 -0.48 ± 0.13 0.33 0.70 ± 0.22 5.04
EGFR/βarrestin2 0.00 ± 0.11 1.00 -0.03 ± 0.18 0.93 0.73 ± 0.23 5.36
EGFR/βarrestin1 0.00 ± 0.17 1.00 -0.33 ± 0.34 0.47 0.63 ± 0.27 4.24
EGFR/G12 0.00 ± 0.12 1.00 -0.45 ± 0.28 0.93 0.63 ± 0.32 4.26
PKC/βarrestin2 0.00 ± 0.11 1.00 -0.06 ± 0.15 0.87 0.40 ± 0.18 2.51
PKC/βarrestin1 0.00 ± 0.17 1.00 -0.36 ± 0.32 0.44 0.30 ± 0.18 1.98
PKC/G12 0.00 ± 0.12 1.00 -0.48 ± 0.26 0.33 0.30 ± 0.29 1.99
EGFR/PKC 0.00 ± 0.09 1.00 -0.03 ± 0.20 0.94 0.33 ± 0.23 2.14
βarrestin1/βarrestin2 0.00 ± 0.19 1.00 0.30 ± 0.31 1.98 0.10 ± 0.28 1.74
βarrestin1/G12 0.00 ± 0.19 1.00 -0.12 ± 0.38 0.75 0.10 ± 0.36 1.50
βarrestin2/G12 0.00 ± 0.14 1.00 -0.42 ± 0.25 0.38 0.01 ± 0.33 1.01
ΔΔlog(/KA) and BF values were calculated as described in the methods. Data are the mean
± SEM of 3-6 independent experiments performed in triplicate.
112
112
Table 6
Bias factors of AT1 receptor ligands modified at position 4
AngII [Ile4]-AngII [Sar
1Ile
4]-AngII
ΔΔlog(/KA
) BF
ΔΔlog(/KA
) BF
ΔΔlog(/KA
) BF
EGFR/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 1.13 ± 0.44 13.53 1.97 ± 0.26 92.69
PKC/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 1.42 ± 0.48 26.24 1.76 ± 0.43 57.10
βarrestin2/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 0.80 ± 0.43 6.36 1.12 ± 0.30 13.27
βarrestin1/Gq 0.00 ± 0.19 1.00 0.92 ± 0.44 8.23 1.08 ± 0.31 12.11
G12/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 0.72 ± 0.47 5.29 0.98 ± 0.30 9.66
EGFR/G12 0.00 ± 0.12 1.00 0.41 ± 0.27 2.56 0.98 ± 0.20 9.60
EGFR/βarrestin1 0.00 ± 0.17 1.00 0.22 ± 0.19 1.64 0.88 ± 0.23 7.66
EGFR/βarrestin2 0.00 ± 0.11 1.00 0.33 ± 0.17 2.13 0.84 ± 0.21 6.99
PKC/G12 0.00 ± 0.12 1.00 0.70 ± 0.33 4.96 0.77 ± 0.40 5.91
PKC/βarrestin1 0.00 ± 0.17 1.00 0.50 ± 0.28 3.19 0.67 ± 0.42 4.72
PKC/βarrestin2 0.00 ± 0.11 1.00 0.62 ± 0.26 4.13 0.63 ± 0.41 4.30
βarrestin2/G12 0.00 ± 0.14 1.00 0.08 ± 0.25 1.20 0.14 ± 0.26 1.37
βarrestin1/G12 0.00 ± 0.19 1.00 0.19 ± 0.27 1.56 0.10 ± 0.27 1.25
βarrestin1/βarrestin2 0.00 ± 0.19 1.00 0.11 ± 0.17 1.29 -0.04 ± 0.28 0.91
PKC/EGFR 0.00 ± 0.09 1.00 0.29 ± 0.28 1.94 -0.21 ± 0.38 0.62
ΔΔlog(/KA) and BF values were calculated as described in the methods. Data are the mean
± SEM of 3-6 independent experiments performed in triplicate.
113
113
Table 7
Bias factors of AT1 receptor ligands modified at position 8
AngII [Ile8]-AngII [Sar
1Ile
8]-AngII [Ile
8]-AngIII
ΔΔlog(/KA
) BF
ΔΔlog(/KA
) BF
ΔΔlog(/KA
) BF
ΔΔlog(/KA
) BF
βarrestin2/PKC 0.00 ± 0.11 1.00 3.19 ± 0.29 1547.
8
3.35 ± 0.29 2252.
1
1.54 ± 0.23 34.88
βarrestin1/PKC 0.00 ± 0.17 1.00 2.50 ± 0.43 316.3 3.33 ± 0.43 2147.
7
1.78 ± 0.22 60.76
βarrestin2/EGFR 0.00 ± 0.11 1.00 3.02 ± 0.31 1035.
3
3.26 ± 0.24 1803.
9
0.94 ± 0.28 8.74
βarrestin1/EGFR 0.00 ± 0.17 1.00 2.33 ± 0.44 211.6
1
3.24 ± 0.40 1720.
3
1.18 ± 0.27 15.22
G12/PKC 0.00 ± 0.12 1.00 0.88 ± 0.50 7.62 2.19 ± 0.59 155.0
0
0.81 ± 0.19 6.42
G12/EGFR 0.00 ± 0.12 1.00 0.71 ± 0.51 5.10 2.09 ± 0.57 124.1
6
0.21 ± 0.25 1.61
βarrestin2/ G12 0.00 ± 0.14 1.00 2.31 ± 0.50 203.1
3
1.16 ± 0.61 14.53 0.74 ± 0.27 5.43
βarrestin1/ G12 0.00 ± 0.19 1.00 1.62 ± 0.59 41.52 1.14 ± 0.69 13.86 0.98 ± 0.25 9.47
PKC/EGFR 0.00 ± 0.09 1.00 0.17 ± 0.31 1.49 0.10 ± 0.18 1.25 0.60 ± 0.21 3.99
βarrestin2/
βarrestin1
0.00 ± 0.19 1.00 -0.69 ± 0.43 0.20 -0.02 ± 0.5 0.95 0.24 ± 0.29 1.74
βarrestin1 /Gq 0.00 ± 0.19 1.00 ND ND ND ND ND ND
βarrestin2/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 ND ND ND ND ND ND
G12/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 ND ND ND ND ND ND
PKC/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 ND ND ND ND ND ND
EGFR/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 ND ND ND ND ND ND
ΔΔlog(/KA) and BF values were calculated as described in the methods. Data are the mean
± SEM of 3-6 independent experiments performed in triplicate. ND, Cannot be determined.
114
114
DISCUSSION
Les GPCRs sont les protéines les plus nombreuses et le plus diversifiés impliqués
dans la transduction du signal. De 500 à 1000 GPCRs sont encodés parmi les 25000 gènes
humains soit plus de 2% du génome total (Kroeze, et al., 2003). La majorité des
médicaments disponibles sur le marché ont leurs effets thérapeutiques via un ou plusieurs
GPCRs d‟où l‟importance de comprendre leur structure et leur activation.
L‟Ang II, est une hormone jouant un rôle important dans l‟homéostasie
cardiovasculaire (de Gasparo, et al., 2000). Le récepteur AT1 médie la majorité des effets
physiologiques de l‟Ang II : vasoconstriction, sécrétion de l‟aldostérone (rétention Na+),
croissance cellulaire, stimulation du système sympathique (libération de la noradrénaline),
sécrétion de la vasopressine et sensation de la soif. L‟antagoniste non peptidique du
récepteur AT1, le losartan, est utilisé fréquemment dans le traitement de l‟hypertension.
Il est bien connu que les sept domaines transmembranaires (TM) des GPCRs
contribuent à former la pochette de liaison du ligand. Afin d‟identifier les acides aminés du
TM2 et du TM5 impliqués dans la formation de la pochette de liaison du récepteur AT1,
nous avons utilisé l‟approche SCAM (Substituted Cysteine Accessibility Method) qui
consiste à évaluer les propriétés de liaison du récepteur suite à sa réaction avec le
methanethiosulfonate (MTSEA). Le MTSEA alkyle les cystéines endogènes ou introduites
par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement stérique qui interfère avec la
liaison du ligand. Afin d‟identifier les changements structuraux qui se produisent lors de
l‟activation du récepteur AT1, nous avons utilisé l‟approche SCAM avec le récepteur AT1
humain de type sauvage et avec un mutant constitutivement actif, le N111G-AT1.
Pour le TMD2, une série de mutants ont été produits en remplaçant successivement
par une cystéine les résidus 70 à 94 du récepteur AT1 et de son mutant constitutivement
actif N111G-AT1.
Le récepteur AT1 possède 10 cystéines endogènes (fig.1-article1). Parmi ces
cystéines, quatre sont impliquées dans la formation de ponts disulfures. Une autre cystéine
(Cys-355) est orientée du côté intracellulaire et pourrait être palmitoylée. Ces cinq
cystéines ne sont probablement pas disponibles pour l‟alkylation par le réactif MTSEA. Les
cinq autres cystéines sont situées dans les domaines transmembranaires. Avant de procéder
115
115
à la substitution systématique de chacun des résidus du TM2 par des cystéines, il fallait
donc s‟assurer que les cystéines endogènes ne sont pas alkylées par le réactif MTSEA.
Nous avons montré que le récepteur AT1 de type sauvage est insensible au traitement par le
MTSEA à des concentrations aussi fortes que 6 mM. Ce résultat suggère que les cystéines
endogènes ne sont pas alkylées par le MTSEA ou que leur alkylation n‟a pas d‟effet sur les
propriétés de liaison du récepteur. Afin d‟exclure la possibilité que le MTSEA puisse
alkyler une cystéine du côté intracellulaire du récepteur AT1, nous avons effectué les
expériences avec des cellules intactes de façon à ce que uniquement le seul côté
extracellulaire du récepteur puisse être accessible au traitement par le MTSEA.
Avant de traiter les récepteurs mutants cystéine avec le MTSEA, nous avons évalué
leur capacité à lier le ligand 125
I-[Sar1,Ile
8]AngII. La majorité de nos mutants cystéine
conservent leur capacité à lier le ligand 125
I-[Sar1,Ile
8]AngII, suggérant que la mutation
n‟affecte pas la conformation globale du récepteur et que les récepteurs mutants sont bel et
bien exprimés à la surface cellulaire. Dans le cadre de notre étude sur les TM2 et TM5,
nous avons montré que les mutants P82C(2.58)
, W84C(2.60)
, Y87C(2.63)
, Y92C(2.68)
, W94C(2.70)
,
G196C(5.39)
, K199C(5.42)
et P207(5.50)
avaient perdu leur capacité à lier le 125
I-
[Sar1,Ile
8]AngII. Dans ce cas, on peut penser que soit ces mutants ne s‟expriment pas à la
surface cellulaire ou que leur conformation globale a changé suffisamment pour perdre
toute capacité de liaison. De plus, dans le cas du récepteur mutant W84C(2.60)
, une des
hypothèse est qu‟il pourrait s‟agir possiblement de ponts disulfure aberrants formé avec
l‟un des autres 10 cystéines endogènes. Sachant qu‟on retrouve les ponts disulfures dans les
domaines extracellulaires du récepteur AT1 et que le résidu W84(2.60)
est situé tout en haut
du domaine transmembranaire, ce résidu aurait pu possiblement réagir avec une cystéine
endogène en présence de l‟enzyme PDI (protéine disulfide isomérase) au niveau du
réticulum endoplasmique. Ceci aurait pour l‟effet la formation un pont disulfure aberrant,
et cette mauvaise conformation du récepteur serait incapable de reconnaitre et lier le
peptide.
Pour ce qui est du TM2, nous avons identifié 5 résidus sensibles au traitement par le
MTSEA. Suite au prétraitement avec le MTSEA, les mutants D74C(2.50)
, L81C(2.57)
,
A85C(2.61)
, T88C(2.64)
et A89C(2.65)
ont montré une diminution significative de liaison de
125I-[Sar
1,Ile
8]AngII
, suggérant que ces résidus sont orientés vers la pochette de liaison du
116
116
récepteur AT1. Il est intéressant de mentionner que les résidus D74C (2.50)
et L81C(2.57)
sont
situés dans le milieu du domaine transmembranaire alors que les résidus A85C(2.61)
,
T88C(2.64)
et A89C(2.65)
se retrouvent dans le haut du domaine transmembranaire. Ceci
suggère que les résidus capables d‟interagir avec le ligand se retrouvent dans cette portion
du TM2. De plus, on peut dire que le résidu Ala-89(2.65)
délimite le haut de la pochette de
liaison et que le résidu Asp-74(2.50)
délimite le bas de la pochette de liaison du récepteur
AT1. Les trois autres résidus (Leu-81(2.57)
, Ala-85(2.61)
et Thr-88 (2.64)
seraient situés sur la
même face hélicoïdale à l‟état basal du récepteur et donc exposés vers l‟environnement
hydrophile de la pochette de liaison (voir fig.8). Par un mécanisme stérique, électrostatique
ou autre, l‟alkylation de ces résidus empêche la liaison du 125
I-[Sar1,Ile
8]AngII .
Afin de confirmer que les résidus sensibles sont orientés vers la pochette de liaison,
nous avons effectué le test de protection qui consiste à ajouter un ligand compétitif avant le
traitement au MTSEA. Le principe est qu‟un ligand compétitif occupera la pochette de
liaison et protégera les résidus sensibles de l‟alkylation par le MTSEA. Le ligand
compétitif [Sar1,Ile
8]AngII a protégé tous les résidus sensibles de l‟alkylation par le
MTSEA, ce qui renforce l‟idée que ces 5 résidus du TMD2 sont orientés vers la pochette de
liaison.
Même si un autre mutant cystéine (L83C(2.59)
-AT1) a démontré une certaine
sensibilité au traitement MTSEA (voir fig.3B-article1), on considère que ce résidu (Leu-83)
n‟est pas situé dans la pochette de liaison pour deux raisons : 1) ce résidu n‟est pas situé sur
la même face hélicoïdale que les autres résidus sensibles; 2) dans le contexte du récepteur
constitutivement actif, le mutant L83C(2.59)
-N111G-AT1 n‟a montré aucune capacité de
liaison. Ces résultats suggèrent que le résidu Leu-83 serait plutôt impliqué dans le maintien
de la bonne conformation globale du récepteur.
Nos résultats suggèrent que les résidus Asp-74(2.50)
, Leu-81(2.57)
, Ala-85(2.61)
, Val-
86(2.62)
, Thr-88(2.64)
et Ala-89(2.65)
sont orientés vers la pochette de liaison du récepteur AT1.
Ces résultats sont en accord avec les conclusions de plusieurs autres études qui ont
caractérisé divers récepteurs comme la rhodopsine bovine (Palczewski, et al., 2000), la
rhodopsine du calmar (Murakami and Kouyama, 2008), l‟opsine (Park, et al., 2008), le
récepteur CXCR1 (Park, et al., 2012), le récepteur D3 de la dopamine (Chien, et al., 2010)
et le récepteur D2 de la dopamine (Javitch, et al., 1999). Par exemple, le résidu Thr-94(2.61)
117
117
est un des points de contact avec le rétinal dans la structure cristalline de la rhodopsine
bovine (Palczewski, et al., 2000) alors que le résidu Asn-87(2.57)
est un des points de contact
du rétinal dans la structure cristalline de la rhodopsine du calmar (Murakami et Kouyama,
2008). La récente structure cristalline du récepteur D3 de la dopamine lié à un antagoniste
(forme inactive du récepteur) montre que le résidu Val-86(2.61)
interagit directement avec le
ligand (Chien, et al., 2010). L‟utilisation de l‟approche SCAM sur le récepteur D2 de la
dopamine a montré que les résidus Asp-80(2.50)
, Val-87(2.57)
, Val-91(2.61)
, Val-92(2.62)
, Leu-
94(2.64)
et Glu-95(2.65)
sont orientés vers la pochette de liaison (Javitch, et al., 1999). La
structure cristalline du récepteur muscarinique M3 lié à un bronchodilatateur tiotropium
(antagoniste) suggère que la position 2.61 (Phe-124) est située à côté de la pochette de
liaison et que cette position jouerait un rôle important dans l‟activation du récepteur ainsi
que dans la sélectivité du ligand (Kruse, et al., 2012). Dans le cas du récepteur CXCR1, le
résidu Asp-85(2.50)
est orienté vers la pochette de liaison et ce résidu serait également
important pour la liaison du ligand et la transduction du signal (Park, et al., 2012).
Nous avons également utilisé l‟approche SCAM afin de déterminer la position
relative de chaque domaine transmembranaire suite à l‟activation du récepteur. Il est
important de mentionner que nous avons étudié l‟accessibilité du ligand suite à l‟alkylation
du récepteur par le MTSEA dans un contexte de récepteur de type sauvage (AT1) et dans un
contexte du récepteur constitutivement actif (N111G-AT1). L‟isomérisation de la forme
inactive vers la forme active du récepteur se fait suite à la liaison du ligand. Toutefois,
certaines mutations peuvent rendre un récepteur constitutivement actif, et ce, en absence du
ligand. En remplaçant le résidu Asn-111 par un résidu plus petit, tel que la glycine ou
l‟alanine, le récepteur AT1 adopte la conformation active sans la présence du ligand
agoniste (Balmforth, et al., 1997; Groblewski, et al., 1997; Feng, et al., 1998). Il est bien
connu que le mutant constitutivement actif N111G-AT1 active la voie classique de la
signalisation du récepteur AT1 (la voie Gq/PLC) en absence du ligand, mais nous avons
aussi testé ce mutant pour les autres voies de signalisation (la voie G12, recrutement de
l‟arrestine) et nous avons observé une augmentation d‟activation pour ces deux voies de
signalisation également (résultats non montrés) ce qui confirme que ce mutant est un bon
modèle pour étudier le récepteur dans sa forme active.
118
118
Nous avons déterminé l‟accessibilité du ligand 125
I-[Sar1,Ile
8]AngII dans un
contexte du récepteur constitutivement actif (N111G-AT1) et les résultats obtenus ont été
comparés avec ceux du récepteur à l‟état basal. Dans le contexte du récepteur N111G-AT1,
les mutants A85C(2.61)
-N111G-AT1, T88C(2.64)
-N111G-AT1 et A89C(2.65)
-N111G-AT1 ont
maintenu leur sensibilité au MTSEA alors que le mutant D74C(2.50)
-N111G-AT1 est devenu
insensible au MTSEA et que la sensibilité de L81C(2.57)
-N111G-AT1 fut grandement
diminuée. Par contre, le mutant V86C(2.62)
-N111G-AT1 s‟est avéré sensible au MTSEA
(voir Fig.3 versus fig.5-article1). Ainsi, suite à l‟activation du récepteur AT1, le résidu Asp-
74(2.50)
qui est situé plutôt vers le bas du domaine transmembranaire serait déplacé à
l‟extérieur de la pochette de liaison (fig.8-article1).
De façon intéressante, nos résultats suggèrent que dans le contexte du récepteur
constitutivement actif, les résidus Leu-81(2.57)
et Ala-85(2.61)
sont orientés vers la pochette de
liaison. Ces résultats sont compatibles avec la structure cristalline de l‟opsine. En effet, les
résidus Phe-91(2.57)
et Thr-94(2.61)
participent à la formation de la pochette de liaison de
l‟opsine à l‟état actif (Park, et al., 2008; Hildebrand, et al., 2009). Egalement, la structure
cristalline de la métarhodopsine montre que le résidu Thr-94(2.61)
est orienté vers la pochette
de liaison (Choe, et al., 2011).
Dans nos essais de protection, le ligand compétitif [Sar1,Ile
8]AngII a été capable de
protéger de façon efficace tous les mutants sensibles au traitement MTSEA (L81C(2.57)
-
N111G-AT1, A85C(2.61)
-N111G-AT1, T88C(2.64)
-N111G-AT1, V86C(2.62)
-N111G-AT1 et
A89C(2.65)
-N111G-AT1), ce qui suggère que ces résidus sont orientés vers la pochette de
liaison du récepteur AT1 (fig.6-article1).
Notre étude montre que le résidu en position 2.50, un acide aspartique très
conservé chez la majorité des GPCRs de la classe A, semble orienté vers la pochette de
liaison à l‟état basal mais pas à l‟état actif du récepteur AT1. Ce résidu est connu pour être
important dans l‟activation des GPCRs (Gether and Kobilka, 1998; Baldwin, 1993; Proulx,
et al., 2008; Cabana, et al., 2013). Il a été suggéré que l‟Asp-74(2.50)
fait partie d‟un réseau
des liens intramoléculaires impliquant les TM2 et TM7. En effet, la structure cristalline de
la rhodopsine de calmar montre que le groupement carboxyle du résidu Asp-80(2.50)
interagit directement avec la chaine latérale de l‟Asn-311(7.61)
(Murakami and Kouyama,
2008). Puisque la position 2.50 et le motif NPxxY du TM7 sont hautement conservés dans
119
119
les GPCRs de la classe A, il serait possible que cette interaction TM2-TM7 soit un facteur
commun chez plusieurs GPCRs (Miura, et al., 2003).
Nos résultats montrant que le résidu Asp-74(2.50)
est déplacé de la pochette de liaison
suite à l‟activation du récepteur suggèrent que ce résidu pourrait former des liens
intramoléculaires avec d‟autres domaines transmembranaires. Une récente étude de
simulation de dynamique moléculaire (Cabana, et al., 2013) met en évidence l‟importance
de la position 2.50 et de sa capacité à former des liens intramoléculaires. Cette étude
suggère que le résidu Asp-74(2.50)
forme un réseau de liens hydrogène avec le résidu Asn-
111(3.35)
et Asn-295(7.46)
à l‟état basal du récepteur AT1. Par contre, à l‟état actif (N111G-
AT1) ce réseau de liens hydrogène est brisé et le résidu Asp-74(2.50)
se réoriente vers le TM1
et fait un lien avec un autre résidu fortement conservé qui est l‟Asn-46(1.50)
. Dans ce cas, on
parle du réseau de liens hydrogène D74(2.50)
-N295(7.46)
-N46(1.50)
. Ces résultats suggèrent un
potentiel pour la formation des liens hydrogène entre Asp-74(2.50)
et Asn-46(1.50)
suite à
l‟activation du récepteur. Ceci pourrait expliquer le fait que suite à l‟activation du récepteur
AT1, le résidu Asp-74(2.50)
s‟oriente vers le TM1 et devient donc indisponible pour
l‟alkylation par le MTSEA.
Pour évaluer la position relative des domaines transmembranaires par rapport à la
pochette de liaison, nous avons comparé les résidus sensibles à l‟état basal à ceux sensibles
à l‟état constitutivement actif. La simple substitution d‟une asparagine pour une glycine à la
position 111 du TM3 fait en sorte que plusieurs résidus du TM2 changent leur orientation
par rapport à la pochette de liaison du récepteur AT1. Nos résultats suggèrent un
changement structural majeur au cours de l‟activation du récepteur AT1. Dans le mutant
constitutivement actif, nous avons démontré que le résidu Val-86(2.62)
situé dans le haut du
TM2 devient sensible à l‟alkylation par le MTSEA. Dans une représentation en roue
hélicale, le résidu Val-86 est situé complètement à la droite de la même face hélicale
composée des autres résidus sensibles au MTSEA identifiés à l‟état basal du récepteur
(Thr-88(2.64)
, Leu-81(2.57)
, Ala-85(2.61)
et Ala-89(2.65)
) (fig.8-article1). Nous avons vu que le
mutant D74C(2.50)
-N111G-AT1 est devenu complètement insensible au MTSEA, alors que
la sensibilité de L81C(2.57)
-N111G-AT1 fut sensiblement diminuée. L‟explication la plus
simple des changements observé pour les mutants cystéine à l‟état basal et à l‟état actif
serait que le TM2 subit un mouvement de pivot intégral, favorisant le rapprochement du
120
120
haut du TM2 vers la pochette de liaison tout en éloignant le bas du TM2 de la pochette de
liaison. Ce simple mouvement de pivot suite à l‟activation du récepteur rapprocherait le
résidu Val-86(2.62)
vers la pochette de liaison tout en excluant le résidu Asp-74(2.50)
de la
pochette. Cette interprétation de nos résultats correspond à un des quatre mouvements
simples mais variés (pivot, rotation, translation et piston) que les domaines
transmembranaires peuvent subir dans la bicouche lipidique (Matthews, et al., 2006). Une
autre étude utilisant l‟approche SCAM avec le récepteur AT1 de rat ayant la mutation
N111G a proposé que l‟activation cause une simple rotation du TM2 (Miura and Karnik,
2002). Dans cette étude, les auteurs ont observé une diminution dans l‟accessibilité des
résidus situés dans le bas du TM2. Cette conclusion est en partie compatible avec la nôtre
en ce sens qu‟un mouvement de pivot peut aussi expliquer que le bas du TM2 soit repoussé
à l‟extérieur de la pochette de liaison.
En conclusion, nous avons démontré que le TM2 participe à la formation de la
pochette de liaison du récepteur AT1. En comparant les résultats obtenus pour le récepteur
AT1 à l‟état basal et à l‟état actif, nous avons suggéré que l‟activation du récepteur implique
un mouvement de pivot qui expose le résidu Val-86(2.62)
vers la pochette de liaison. Ce
mouvement de pivot éloigne de la pochette de liaison le résidu Asp-74(2.50)
situé dans le bas
du TM2. Ce mouvement de pivot du TM2 pourrait être une caractéristique commune à
l‟activation d‟autres GPCRs de la classe A.
Après avoir identifié les acides aminés du TM2 qui sont orientés vers la pochette de
liaison du récepteur AT1, nous nous sommes intéressés au TM5. Par conséquent, nous
avons utilisé la même approche SCAM afin d‟identifier les résidus du TM5 qui sont
orientés vers la pochette de liaison. Une série de mutants ont été produits en remplaçant
successivement par une cystéine les résidus 190 à 217 du TM5 du récepteur AT1 et de son
mutant constitutivement actif N111G-AT1.
Après le prétraitement avec le MTSEA, les mutants L197C(5.40)
, N200C(5.43)
,
I201C(5.44)
, G203C(5.46)
et F204C(5.47)
ont montré une diminution significative de liaison du
125I-[Sar
1,Ile
8]AngII, suggérant que les résidus substitués sont orientés dans la pochette de
liaison du récepteur AT1 à l‟état sauvage (basal). De façon intéressante, quatre de ces
résidus se retrouvent dans la portion médiane du TM5 (N200C(5.43)
, I201C(5.44)
, G203C(5.46)
et F204C(5.47)
) et un résidu (L197C(5.40)
) est situé sur le côté extracellulaire du TM5 (en
121
121
haut). Ces données suggèrent que la portion médiane et le haut du TM5 seraient impliqués
dans l‟interaction avec le ligand. De plus, le résidu Leu-197(5.40)
semble délimiter le haut
alors que le résidu Phe-204(5.47)
délimiterait le bas de la pochette de liaison du récepteur
AT1. En plus de ces deux résidus, les trois autres (Asn-200(5.43)
, Ile-201(5.44)
et Gly-203(5.46)
)
font partie de la pochette de liaison à l‟état basal du récepteur. Encore une fois, par un
mécanisme qui pourrait être stérique, électrostatique ou indirect, l‟alkylation de ces 5
résidus par le MTSEA empêche la liaison du ligand.
L‟essai de protection qui consiste à ajouter le ligand compétitif Sar1, Ile
8AngII
avant le traitement au MTSEA, a montré que tous les résidus sensibles ont été protégés de
l‟alkylation par le MTSEA, confirmant que ces résidus sont orientés vers la pochette de
liaison.
Nos résultats suggérant que les résidus Leu-197(5.40)
, Asn-200(5.43)
, Ile-201(5.44)
, Gly-
203(5.46)
et Phe-204(5.47)
sont situés dans la pochette de liaison du récepteur AT1 sont en
accord avec les conclusions d‟études récentes effectuées sur la rhodopsine bovine
(Palczewski, et al., 2000), la rhodopsine du calmar (Murakami and Kouyama, 2008),
l‟opsine (Park, et al., 2008), le récepteur β1-adrénergique (Warne, et al., 2008), le récepteur
β2-adrénergique (Rosenbaum, et al., 2007; Rasmussen, et al., 2007; Cherezov, et al., 2007),
le récepteur muscarinique M3 (Kruse, et al., 2012), le récepteur H1 de l‟histamine
(Shimamura, et al., 2011), le récepteur μ-opioïde (Manglik, et al., 2012), le récepteur κ-
opioïde (Wu, et al., 2012), le récepteur D3 de la dopamine (Chien, et al., 2010) et le
récepteur D2 de la dopamine (Javitch, et al., 1995).
En effet, les résidus His-211(5.46)
et Phe-212(5.47)
interagissent avec le rétinal dans la
structure cristalline de la rhodopsine bovine (Palczewski, et al., 2000) alors que les résidus
Phe-205(5.43)
et Phe-209(5.47)
sont situés dans la pochette de liaison de la structure cristalline
de la rhodopsine de calmar (Murakami et Kouyama, 2008). La structure cristalline du
récepteur β1-adrénergique montre que les résidus Ser-212(5.43)
et Ser-215(5.46)
interagissent
avec l‟antagoniste cyanopindolol (Warne, et al., 2008). Également, la structure cristalline
du récepteur β2-adrénergique a révélé que les résidus Ser-204(5.43)
, Ser-207(5.46)
et Phe-
208(5.47)
sont importants pour la liaison des catécholamines (Rosenbaum, et al., 2007;
Rasmussen, et al., 2007). Les résidus Ser-193(5.43)
et Ser-196(5.46)
interagissent directement
avec leur antagoniste spécifique (eticlopride) tel que démontré dans la structure cristalline
122
122
du récepteur D3 de la dopamine (Chien, et al., 2010). Le résidu Phe-239(5.47)
interagit
directement avec l‟antagoniste tiotropium dans le cas du récepteur muscarinique M3
(Kruse, et al., 2012). Dans la structure cristalline du récepteur H1 de l‟histamine, les résidus
Thr-194(5.43)
et Asn-198(5.46)
sont en interaction directe avec l‟antagoniste doxepin
(Shimamura, et al., 2011). De plus, les structures cristallines des récepteurs μ-opioïde et κ-
opioïde stabilisées dans leur forme inactive par un antagoniste, montrent que la position
5.39 (K233 dans le cas du récepteur μ-opioïde et K227 dans le cas du récepteur κ-opioïde)
interagit de façon directe avec le ligand (Manglik, et al., 2012; Wu, et al., 2012). Par
ailleurs, en utilisant l‟approche SCAM, il a été démontré que les résidus Val-191(5.40)
, Ser-
194(5.43)
, Ile-195(5.44)
, Ser-197(5.46)
et Phe-198(5.47)
sont situés dans la pochette de liaison du
récepteur D2 de la dopamine (Javitch, et al., 1995).
De plus, en utilisant l‟approche méthionine proximity assay (MPA), notre groupe a
démontré que le résidu Asn-200(5.43)
interagit avec le ligand photosensible Sar1,Bpa
8AngII
(Clement, et al., 2009). À la lumière des résultats obtenus, il serait logique de penser que
l‟orientation du TM5 vers la pochette de liaison semble être une caractéristique commune à
plusieurs GPCRs de la classe A.
Dans l‟objectif d‟investiguer le mécanisme par lequel le récepteur AT1 entreprend
des changements structuraux suite à son activation, nous avons effectué l‟analyse SCAM
dans le contexte du mutant constitutivement actif N111G-AT1 qui représente une de formes
actives du récepteur. Il est intéressant de constater qu‟il y a des différences de sensibilité au
MTSEA pour certains résidus du TM5 selon que le récepteur soit dans son état basal ou
dans un état actif. Bien que les mutants L197C(5.40)
-N111G-AT1, N200C(5.43)
-N111G-AT1
et F204C(5.47)
-N111G-AT1 aient maintenu une sensibilité au MTSEA, le mutant I201C(5.44)
-
N111G-AT1 s‟est avéré plus sensible au MTSEA, alors que la sensibilité de G203C(5.46)
-
N111G-AT1 s‟est avérée plus faible. Dans les essais de protection, le ligand compétitif
Sar1, Ile
8AngII a offert une protection efficace à tous les mutants sensibles (L197C
(5.40)-
N111G-AT1, N200C(5.43)
-N111G-AT1, I201C(5.44)
-N111G-AT1, G203C(5.46)
-N111G-AT1 et
F204C(5.47)
-N111G-AT1) contre l‟alkylation par le MTSEA confirmant ainsi que ces résidus
sont situés dans la pochette de liaison (fig.6-article2).
Nos résultats suggérant que les résidus Leu-97(5.40)
, Asn-200(5.43)
, Ile-201(5.44)
, Gly-
203(5.46)
et Phe-204(5.47)
sont orientés vers la pochette de liaison à l‟état actif du récepteur
123
123
AT1 sont en accord avec les conclusions d‟une étude rapportant la structure cristalline de
l‟opsine (Park, et al., 2008). En effet, les résidus Ile-205(5.40)
, Phe-208(5.43)
et Phe-212(5.47)
entourent la pochette de liaison du rétinal à l‟état actif de l‟opsine (Park, et al., 2008;
Hildebrand, et al., 2009). Dans la structure cristalline de la rhodopsine dans sa forme active
(Li, et al., 2004), les résidus Met-207(5.43)
et His-211(5.46)
ont été retrouvés dans la pochette
de liaison. À l‟aide de la résonance magnétique nucléaire (RMN), il a été démontré que les
résidus His-211(5.46)
et Phe-212(5.47)
interagissent avec le rétinal dans le cas de la
métarhodopsine II (Patel, et al., 2004). De plus, la structure cristalline de la métarhodopsine
II confirme la présence du résidu His-211(5.46)
dans la pochette de liaison (Choe, et al.,
2011). Suite à la cristallisation d‟un mutant constitutivement actif (Glu113Gln) de la
rhodopsine, il a été démontré que les résidus Phe-208(5.43)
et Phe-212(5.47)
sont orientés vers
la pochette de liaison (Standfuss, et al., 2011).
Plusieurs études sur le récepteur β2-adrénergique pointent l‟importance des résidus
du TM5 dans l‟activation des GPCRs. Le cristal du récepteur β2-adrénergique stabilisé dans
sa forme active à l‟aide d‟une nanoparticule qui mime le couplage avec la protéine G
montre que les résidus Ser-204(5.43)
et Ser-207(5.46)
interagissent avec le BI-167107, un
agoniste de haute affinité (Rasmussen, et al., 2011). Ces résultats ont également été
confirmés par une autre étude qui met en jeu le récepteur β2-adrénergique lié avec un
agoniste (Rosenbaum, et al., 2011). Également, la structure cristalline à l‟état actif du
récepteur β2-adrénergique démontre que le résidu Ser-207(5.46)
interagit directement avec
l‟adrénaline (Ring, et al., 2013).
Pour ce qui est du récepteur β1-adrénergique, sa structure cristalline en présence de
quatre différents agonistes indique que leur caractéristique commune suite à la liaison de
l‟agoniste est la formation des liens hydrogène avec Ser-215(5.46)
situé dans le TM5 (Warne,
et al., 2011).
En testant la sensibilité de nos résidus au MTSEA dans le contexte du récepteur
constitutivement actif (N111G-AT1), nous avons observé un phénomène particulier. Nous
avons vu que le mutant K199C(5.42)
-N111G-AT1 a montré une augmentation de capacité de
liaison pour le ligand 125
I-Sar1,Ile
8AngII de l‟ordre de 127% suite au traitement avec
0.5mм de MTSEA. Évidemment, l‟alkylation du mutant K199C(5.42)
-N111G-AT1 n‟a
aucunement interféré mais au contraire plutôt facilité son interaction avec le ligand
124
124
compétitif Sar1,Ile
8AngII. Une de possibles explications serait que la charge positive
ajoutée suite à l‟alkylation par le MTSEA à cette position (5.42) pourrait favoriser la liaison
du ligand, possiblement en récupérant la charge initiale perdue par la substitution de cet
acide aminé (lysine) pour une cystéine. De façon intéressante, lorsque nous avons testé ce
mutant à l‟état sauvage du récepteur, nous avons observé que ce dernier avait perdu toute la
capacité de lier le ligand alors qu‟à l‟état actif, nous avons plutôt observé une diminution
importante (3X) de la capacité de lier le ligand (tableau1-article2). Ces données pourraient
suggérer que l‟alkylation de la Lys-199(5.42)
potentialise la liaison par un mécanisme
impliquant une interaction intramoléculaire à l‟intérieur du récepteur. D‟autres études sont
nécessaires pour clarifier ces données.
Les différences observées dans la sensibilité des mutants dans un contexte de l‟état
sauvage (AT1) et dans un contexte de l‟état actif du récepteur (N111G-AT1) suggèrent que
l‟accessibilité des résidus du TM5 et leur orientation vers la pochette de liaison sont altérés.
De façon intéressante, le mutant I201C(5.44)
-N111G-AT1 est devenu plus sensible au
MTSEA, alors que la sensibilité de G203C(5.46)
-N111G-AT1 fut diminuée lorsque comparé
avec les mêmes mutants dans l‟état sauvage (basal) du récepteur (Fig.3 versus Fig. 5-article
2). Ces résultats suggèrent un changement structurel majeur suite à l‟activation du récepteur
AT1. En effet, il est important de mentionner que le résidu Ile-201(5.44)
est situé à l‟extrême
droite alors que le résidu Gly-203(5.46)
est situé à l‟extrême gauche de la même face
hélicoïdale formée par les autres résidus sensibles au MTSEA : Leu-197(5.40)
, Asp-200(5.43)
et Phe-204(5.47)
identifiés à l‟état basal du récepteur (Fig.8-article2). Autrement dit,
l‟activation du récepteur AT1 amène le résidu Ile-201(5.44)
vers la pochette de liaison afin
qu‟il puisse être plus facilement alkylé alors qu‟il repousse le résidu Gly-203(5.46)
à
l‟extérieur de la pochette de liaison. L‟explication la plus simple pour ce changement de
sensibilité des mutants cystéines suite à l‟activation du récepteur AT1 serait que la surface
du TMD5 orientée vers la pochette de liaison tourne légèrement dans le sens anti-horaire.
Vu que les résidus sensibles sont tous situés dans le haut du TMD5, nos résultats ne nous
permettent pas d‟attribuer cette rotation à tout le domaine. Ce mouvement de rotation
correspond à un des quatre mouvements simples mais variés (pivot, rotation, translation et
piston) que les TM peuvent subir dans la bicouche lipidique (Matthews, et al., 2006).
125
125
Il a été suggéré que l‟interaction entre le motif hautement conservé E/DRY situé
dans le TM3 (position 3.49/3.50) et le résidu glutamate situé dans le TM6 (position 6.30)
qu‟on appelle aussi « ionic lock » stabilise le GPCR dans sa forme inactive (Vogel, et al.,
2008; Schwartz, et al., 2006). En utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN), il a
été montré que suite à l‟activation de la rhodopsine, le TM5 subit un mouvement de
rotation (Ahuja, et al., 2009a; Ahuja, et al., 2009b). Dans ce processus, le résidu His-
211(5.46)
s‟approche du Glu-122(3.37)
dans le TM3, causant l‟interruption de l‟ionic lock
(Ahuja, et al., 2009a; Ahuja, et al., 2009b).
En comparant les études récentes effectués sur le récepteur β2-adrénergique dans
l‟état actif (Rasmussen, et al., 2011) versus l‟état inactif en présence d‟un agoniste inverse
(Rosenbaum, et al., 2007), les auteurs ont observé que la transition de l‟état inactif du
récepteur vers l‟état actif implique un réarrangement des acides aminés hydrophobes des
TM5 et TM6. Ce réarrangement des acides aminés est combiné à des petites rotations des
TM5 et TM6, favorisant l‟ouverture du site de liaison de la protéine G. Par conséquent, la
rotation du TM5 semble jouer un rôle important dans la stabilisation de l‟état actif d‟un
GPCR.
En conclusion, nous avons identifié des résidus sensibles au MTSEA dans le haut
du TM5 et ces résidus participeraient donc à la formation de la pochette de liaison du
récepteur AT1. En interprétant les résultats obtenus l‟état basal versus l‟état actif du
récepteur AT1, nous suggérons que dans le processus d‟activation, il se produit une rotation
du TM5 dans le sens anti-horaire car le résidu situé à l‟extrême droite (Ile-201(5.44)
) de la
pochette de liaison devient plus sensible alors que le résidu situé à l‟extrême gauche (Gly-
203 (5.46)
perd de la sensibilité au traitement par le MTSEA.
Dans l‟objectif de caractériser la pochette de liaison du récepteur AT1 dans un
contexte du récepteur sauvage (AT1) et dans un contexte du récepteur à l‟état actif (N111G-
AT1), notre groupe a utilisé l‟approche SCAM sur chacun des 7 domaines
transmembranaires. En plus des mouvements déjà mentionnés pour les TM2 et TM5, nous
avons démontré que suite à l‟activation du récepteur, le TM7 s‟éloigne de la pochette de
liaison (Boucard, et al., 2003), le TM3 subit une petite rotation dans le sens anti-horaire
(Martin, et al., 2004) et le TM6 subit un mouvement de pivot (Martin, et al., 2007). On a
126
126
également déterminé que les TM1 et TM4 ne participent pas à la formation de la pochette
de liaison du récepteur AT1 (Yan, et al., 2010).
Il est important de connaitre la structure moléculaire du récepteur, en particulier la
pochette de liaison et les changements structuraux associés à l‟activation du récepteur afin
de pouvoir développer de nouveaux outils thérapeutiques. La caractérisation de la pochette
de liaison d‟un GPCR fournit des informations importantes sur les mécanismes de
reconnaissance moléculaire entre une hormone et son récepteur. L‟approche SCAM
(Substituted Cysteine Accessibility Method) nous a permis d‟identifier plusieurs résidus
dans les différents TM qui composent la pochette de liaison du récepteur AT1. L‟approche
SCAM nous a aussi permis de déterminer la position relative de chaque TM suite à
l‟activation du récepteur. Ces résultats nous ont servi à élaborer un premier modèle
moléculaire de la pochette de liaison du récepteur AT1 (Cabana,J. 2013).
Afin d‟améliorer ce modèle, nous avons étudié les changements conformationels qui
se produisent lors de l‟activation du récepteur AT1. On a longtemps pensé qu‟un GPCR
pouvait activer une seule voie de signalisation. Il est maintenant évident que les GPCRs
sont capables d‟activer plusieurs voies de signalisation, ce qui est à la base du concept de
signalisation biaisé. La signalisation biaisé est l‟efficacité de certains ligands à induire
sélectivement différentes conformations du récepteur qui couplent sélectivement à
différents effecteurs des voies de signalisation (Kenakin, 2011; Galandrin, et al., 2007;
Lefkowitz, 2007). Sachant que différents ligands stabilisent des conformations différentes
du récepteur et ainsi favorisent l‟activation ou l‟inhibition de certaines voies de
signalisation, il devient possible de déterminer les changements conformationnels qui
privilégient l‟une ou l‟autre des voies de signalisation.
Le récepteur AT1 active plusieurs voies de signalisation en interagissant avec
différents effecteurs. Le récepteur AT1 couple de façon préférentielle à la protéine Gq et les
propriétés fonctionnelles de ce récepteur ont surtout été évaluées en fonction de sa capacité
à induire la production des inositol phosphates (IPs) et à mobiliser le Ca2+
intracellulaire.
Cette voie de signalisation est responsable de la contraction vasculaire et de la sécrétion
d‟aldostérone par la corticosurrénale (Hunyady and Catt, 2006). À part la voie classique Gq,
on ne connaît à peu près rien quant à l‟efficacité des ligands du récepteur AT1 pour activer
les diverses autres voies de signalisation. Dans notre étude, nous avons testé l‟efficacité de
127
127
différents analogues de l‟AngII à activer la voie classique (Gq-PLC-IP3), la voie G12
impliquée dans le réarrangement du cytosquelette (Sagara, et al., 2007)(Auger-Messier, et
al., 2005), la voie de la MAP kinase impliquée dans la prolifération cellulaire (Tohgo, et al.,
2002; Ahn, et al., 2004) ainsi que leur capacité à recruter les arrestines, protéines
d‟échafaudage importantes, entre autres pour l‟internalisation du récepteur (β-arrestine1 et
β-arrestine2) (Gaborik, et al., 2001; Hunton, et al., 2005). Les agonistes et les agonistes
partiels ont été évalués pour leurs effets dose-dépendants afin de déterminer leurs propriétés
pharmacologiques (EC50 et Emax)
Dans le choix des analogues de l‟AngII à tester, nous nous sommes basé sur un des
premiers ligands biaisé du récepteur AT1, le [Sar1,Ile
4,Ile
8]AngII (Ahn, et al., 2004)(Tohgo,
et al., 2002). Ce composé n‟active pas la voie classique du récepteur (Gq-PLC-IP3-Ca2+
)
importante pour la vasoconstriction et la sécrétion d‟aldostérone. Par contre, le
[Sar1,Ile
4,Ile
8]AngII est capable de recruter l‟arrestine et d‟activer la voie des MAP kinases
(Ahn, et al., 2004; Wei, et al., 2003). Nous avons testé l‟analogue [Sar1,Ile
4,Ile
8]AngII dans
nos différents essais fonctionnels et nous avons obtenus des résultats similaires à ceux déjà
publiés (Ahn, et al., 2004)(Tohgo, et al., 2002), c‟est-à-dire qu‟il se comporte comme un
antagoniste pour la voie Gq et comme un agoniste partiel pour les deux voies de ERK
(PKC-ERK et EGFR-ERK) ainsi que pour le recrutement de deux arrestines (résultats non
montrés dans l‟article). Nous avons aussi testé une série d‟analogues modifiés aux positions
1, et/ou 4, et/ou 8.
Afin de s‟assurer que nos analogues lient bien le récepteur, nous avons déterminé
leur affinité de liaison. L‟AngII possède une très bonne affinité de l‟ordre de 1 nM pour le
récepteur AT1. Les analogues modifiés en position 1 ([Sar1]AngII et AngIII) possèdent une
affinité de liaison similaire à celle de l‟AngII. En remplaçant la tyrosine en position 4 par
une isoleucine ([Ile4]AngII), nous avons observé une importante perte d‟affinité. Par contre,
l‟analogue [Sar1,Ile
4]AngII a une affinité nettement plus élevée que le [Ile
4]AngII,
suggérant que la sarcosine en position 1 améliore l‟affinité de ce peptide. Les analogues
modifiés en position 8 ([Ile8]AngII, [Sar
1,Ile
8]AngII et [Ile
8]AngIII) ont une affinité de
liaison similaire au celle de l‟AngII. Ces résultats suggèrent que la position 1 et la position
8 de l‟AngII n‟affectent pas beaucoup la capacité du ligand à lier le récepteur AT1 alors que
la position 4 semble très importante pour la liaison.
128
128
L‟activation de la voie ERK par le récepteur AT1 est très complexe. Il est connu
qu‟il existe au moins trois façons d‟activer la voie ERK par le récepteur AT1. L‟activation
de ERK par un mécanisme dépendant de la protéine Gq met en jeu la PKC (Luttrell, 2002;
Tian, et al., 1998) alors que l‟activation de ERK par un mécanisme indépendant de la
protéine Gq passerait via les arrestines (Ahn, et al., 2004). Le récepteur AT1 peut également
activer la voie ERK par une voie de transactivation du récepteur de l‟EGF (Miura, et al.,
2004). Nous avons démontré la contribution de chacune de ces voies de signalisation dans
l‟activation de ERK en utilisant différents inhibiteurs. Nous avons montré que l‟activation
précoce de ERK passe via la PKC (voie PKC-ERK) et que l‟activation plus tardive de ERK
est dépendante de la transactivation du récepteur de l‟EGF (voie EGFR-ERK).
Parmi les analogues modifiés en position 1, le [Sar1]AngII possède des propriétés
pharmacologiques (EC50 et Emax) comparables à celles de l‟AngII. Le [Sar1]AngII n‟a pas
de sélectivité fonctionnelle pour aucune de voies de signalisation testées. L‟AngIII, cet
analogue n‟ayant pas d‟aspartate en position 1, démontre une certaine sélectivité au niveau
des puissances. L‟AngIII est plus puissant pour activer les voies PKC-ERK et EGFR-ERK
que pour activer les quatre autres voies de signalisation testées (voie Gq-PLC-IP3, voie G12
et voies de recrutement de l‟arrestine 1 et de l‟arrestine 2). Vu que l‟AngIII est capable de
produire des réponses maximales comparables à celles de l‟AngII pour toutes les voies de
signalisation testées, cet analogue n‟a donc aucune sélectivité au niveau des efficacités
(Emax).
Nous avons aussi observé que certains de nos analogues (dont l‟AngIII) avaient de
meilleures puissances (EC50) lorsque comparé à leurs affinités de liaison (interaction
ligand-récepteur). Ces résultats peuvent être expliqués par le modèle allostérique. Dans un
modèle pharmacologique simple, la formation du complexe ligand-récepteur (affinité de
liaison) favorise la signalisation à l‟intérieur de la cellule ce qui fait référence à l‟efficacité
(Rajagopal, 2013). Par contre, dans le modèle allostérique, la liaison initiale de l‟agoniste à
son récepteur en absence des effecteurs se fait dans un état de basse affinité de liaison.
Dans le modèle allostérique, un état de haute affinité de liaison est atteint lorsque
l‟effecteur se couple au complexe agoniste-récepteur pour former le complexe ternaire
(agoniste-récepteur-effecteur). L‟effecteur peut donc, de façon allostérique, moduler la
force d‟interaction entre l‟agoniste et le récepteur. C‟est ce qui pourrait expliquer que
129
129
certains agonistes démontrent des puissances dans certaines voies de signalisation qui sont
supérieures à leur affinité de liaison (Rajagopal, 2013).
L‟analogue [Ile4]AngII a démontré peu de puissance dans toutes les voies de
signalisation testées, ce qui est compatible avec sa faible affinité de liaison. Des
concentrations très élevées de [Ile4]AngII sont nécessaires pour obtenir des réponses
maximales, et ce dans toutes les voies de signalisation testées. Somme toute, vu ses faibles
puissances, l‟analogue [Ile4]AngII démontre peu de sélectivité fonctionnelle.
L‟analogue [Sar1,Ile
4]AngII s‟est avéré relativement peu puissant pour la production
des inositols phosphates, pour l‟activation de G12, ainsi que pour le recrutement des deux
arrestines, mais par contre il s‟est avéré plus puissant pour l‟activation des voies PKC-ERK
et EGFR-ERK. [Sar1,Ile
4]AngII est un agoniste partiel pour l‟activation des protéines G (Gq
et G12) et un agoniste complet pour le recrutement des arrestines et pour l‟activation des
deux voies de ERK. Nos résultats suggèrent que l‟analogue [Sar1,Ile
4]AngII possède une
sélectivité relative, car à des faibles concentrations, il active de façon robuste les deux voies
des ERK (PKC-ERK et EGFR-ERK) tandis qu‟il active faiblement la voie classique Gq.
Nous avons trouvé que les trois analogues ayant l‟isoleucine en position 8
([Ile8]Ang, [Sar
1,Ile
8]AngII et [Ile
8]AngIII) sont tous des antagonistes pour la voie
classique Gq (aucune production d‟inositol phosphate) et des agonistes partiels pour les
autres voies de signalisation testées : la voie G12,le recrutement de deux arrestines et les
deux voies d‟activation des ERK (PKC-ERK et EGFR-ERK). Il a déjà été démontré que la
modification de la position 8 de l‟Ang II pour une isoleucine donne des antagonistes pour la
voie classique Gq (Regoli, et al., 1971). Une étude récente a aussi confirmé que le
remplacement de la phénylalanine en position 8 par des petits acides aminés non
aromatiques tels que l‟isoleucine ou la glycine génère des analogues incapables d‟activer la
signalisation via la protéine Gq (Zimmerman, et al., 2012). Ces analogues sont des ligands
biaisés car ils n‟activent pas la voie classique Gq, mais ils sont capables d‟activer toutes les
autres voies de signalisation que nous avons testées.
Nous avons démontré que les analogues modifiés en position 8 ([Ile8]AngII,
[Sar1,Ile
8]AngII et [Ile
8]AngIII) activent la voie ERK via la PKC sans toutefois être capable
de produire des inositols phosphates. De façon classique, l‟hydrolyse des
polyphosphoinositides produit du diacylglycérol et de l‟IP3. L‟IP3 relâche du Ca2+
qui, en
130
130
combinaison avec le diacylglycérol, active la PKC (Parker and Murray-Rust, 2004). Il est
bien évident que les analogues modifiés en position 8 n‟activent pas la PKC par un
mécanisme dépendant du diacylglycérol et du Ca2+
. Nous avons montré que les cellules
HEK293 expriment les PKC atypiques (PKCι et PKCζ) et que l‟activation de ERK par les
analogues modifiés en position 8 est diminuée suite à l‟invalidation des PKC atypiques. Les
analogues modifiés en position 8 seraient donc capables d‟activer les PKC atypiques (PKCι
et PKCδ) par un mécanisme encore mal défini mais qui impliquerait des interactions
protéiques (Moscat, et al., 2000; Hirai, et al., 2003). Ces résultats sont compatibles avec
ceux d‟une autre étude démontrant que dans les cellules de muscle lisse vasculaire, une
PKC atypique (PKCδ ) est responsable de l‟activation de la voie ERK suite à la stimulation
du récepteur AT1 par l‟Ang II (Liao, et al., 1997).
Le fait que les ligands biaisés peuvent activer sélectivement certaines voies de
signalisation a stimulé beaucoup d‟intérêt dans les potentielles implications cliniques de ces
composés. Par ailleurs, plusieurs évidences supportent l‟idée que les ligands biaisés
possèdent des propriétés pharmacologiques uniques par rapport au ligand traditionnel. Dans
les dernières années, quelques ligands biaisés ont progressé vers les phases du
développement clinique. Un bon exemple est le ligand biaisé du récepteur AT1, le TRV027
développé par la compagnie TREVENA, présentement dans les essais cliniques pour le
traitement de l‟insuffisance cardiaque aigue (Soergel, et al., 2013). Le TRV027 est capable
de recruter les β-arrestines mais n‟active pas la voie classique Gq-PLCβ-IP3-Ca2+
(Violin, et
al., 2010). Il a été montré que le TRV027 réduit l‟hypertension, améliore la contractilité des
cardiomyocytes in vitro (Rajagopal, et al., 2006) et in vivo (Violin, et al., 2010; Boerrigter,
et al., 2011), et aussi améliore la performance cardiaque chez les rats (Violin, et al., 2010).
Dans le modèle canin ayant une insuffisance cardiaque aigue, une amélioration des
paramètres hémodynamiques, rénaux et cardiaques a été observée (Boerrigter, et al., 2011;
Boerrigter, et al., 2012). Parce que le TRV027 diminue la vasoconstriction au niveau rénal
et systémique, qu‟il génère une meilleure performance au niveau cardiaque et qu‟il agit en
tant que cardioprotecteur, ce ligand biaisé est présentement dans la phase clinique pour le
traitement de l‟insuffisance cardiaque (Soergel, et al., 2013). Dans les premières études
chez l‟humain, le TRV027 a été trouvé sans danger et tolérable lorsqu‟administré par la
131
131
voie intraveineuse, et ce traitement a diminué de façon significative la pression artérielle
moyenne chez les patients (Soergel, et al., 2013).
Un autre analogue biaisé du récepteur AT1 pour la voie des β-arrestines, TRV0023,
ayant un profil pharmacologique très similaire au TRV027, montre une réduction de la
mort cellulaire dans le modèle murin de l‟ischémie. Dans cette étude (Kim, et al., 2012), le
ligand TRV0023 favorise une augmentation de la contractilité cardiaque. Cette
augmentation de la contractilité cardiaque induite par le ligand TRV0023 n‟est pas due
directement à la mobilisation calcique comme c‟est le cas pour le ligand de référence
AngII. Il s‟agit en fait d‟une augmentation de la sensibilité au Ca2+
. Cette meilleure
sensibilité au Ca2+
pourrait être expliquée par des modifications post-traductionnelles aux
niveaux de myofilaments cardiaques (Monasky, et al., 2013). Ces données suggèrent que le
TRV023 pourrait être bénéfique pour le traitement de l‟insuffisance cardiaque aigue. Même
si les antagonistes du récepteur AT1 (losartan) et les inhibiteurs de l‟enzyme de conversion-
ACE (captopril) ont été bénéfiques pour le traitement de l‟insuffisance cardiaque
chronique, ils sont contre-indiqués car ils causent une hypotension prolongée ainsi qu‟une
diminution du débit cardiaque (Violin, et al., 2013; Swedberg, et al., 1992). TRV027
représente une nouvelle avenue thérapeutique car c‟est un peptide qui est rapidement
dégradé dans le sang et qui donc produit un effet réversible qui s‟estompe rapidement après
l‟arrêt de l‟infusion. TRV027 agit rapidement en diminuant l‟hypertension tout en
augmentant la contractilité cardiaque et en étant cardioprotecteur (Violin, et al., 2014). La
découverte des ligans biaisés offre donc des réponses pharmacologiques uniques lorsque
comparé avec un simple antagonisme du récepteur car on est capable de cibler les effets
bénéfiques tout en réduisant des effets indésirables.
En perspective, il serait intéressant de développer une nouvelle génération de
médicaments ayant des propriétés de ligands biaisés capables de bloquer préférentiellement
une voie de signalisation tout en favorisant l‟activation des autres voies de signalisation ou
encore capables d‟activer une seule voie de signalisation, tout en bloquant toutes les autres
voies. Par ce fait même, on pourrait espérer développer des médicaments pouvant contrôler
sélectivement certains aspects de la fonction du récepteur en séparant efficacement le
contrôle de la pression artérielle de la croissance pathologique des cardiomyocytes ou des
cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC).
132
132
La notion de sélectivité fonctionnelle est récente et décrit le fait que certains ligands
activent pleinement une voie de signalisation et peuvent avoir peu d‟effet sur d‟autres.
Cette étude suggère qu‟il n‟existerait pas qu‟une seule conformation pleinement active d‟un
récepteur et que le terme « activité » devrait donc obligatoirement être accompagné d‟une
précision quant à l‟effet auquel il se réfère. Différentes conformations du récepteur
transmettraient ainsi différentes activités. Selon ce nouveau modèle, le récepteur AT1
pourrait adopter de multiples conformations pouvant engendrer différentes conséquences
fonctionnelles. À plus long terme, après avoir identifié la sélectivité de plusieurs analogues
de l‟AngII, il sera intéressant d‟évaluer leurs effets dans les modèles plus physiologiques
où l‟AngII exerce ses effets tels que les modèles de contraction du muscle lisse vasculaire,
de régulation de la pression artérielle, de croissance et de prolifération cellulaire et
d‟angiogénèse.
En conclusion, nous avons démontré dans cette étude de signalisation biaisée que la
phénylalanine en position 8 semble essentielle pour l‟activation de la voie classique, la voie
Gq, mais pas pour les autres voies de signalisation que nous avons testées. La tyrosine en
position 4 est importante pour l‟affinité de liaison et elle confère aussi une sélectivité
relative pour la voie des ERKs. L‟aspartate en position 1 ne semble pas importante pour
l‟activation des différentes voies de signalisation et ne confère donc aucune sélectivité
fonctionnelle.
133
133
CONCLUSIONS
L‟approche SCAM appliquée au TM2 du récepteur AT1 démontre qu‟après le prétraitement
avec le MTSEA, les mutants D74C, L81C, L83C, A85C, A89C ont une diminution
significative d‟affinité pour le ligand 125
I-Sar1,Ile
8AngII, suggérant que ces résidus sont
orientés dans la pochette de liaison du récepteur AT1.Dans le cas du récepteur N111G-AT1,
le mutant D74C-N111G est devenu insensible au MTSEA, alors que la sensibilité de L81C-
N111G fut diminuée. Par contre, le mutant V86C-N111G s‟est avéré sensible au MTSEA.
Ces résultats suggèrent que l‟activation constitutive du récepteur AT1 implique un
mouvement de pivot du TM2, favorisant le rapprochement du haut du TM2 vers la pochette
de liaison.
L‟approche SCAM appliquée au TM5 du récepteur AT1 démontre qu‟après le prétraitement
avec le MTSEA, les mutants L197, N200, I201, G203 et F204 ont une diminution
significative d‟affinité pour le ligand 125
I-Sar1,Ile
8AngII, suggérant que ces résidus sont
orientés dans la pochette de liaison à l‟état basal du récepteur. Des résultats différents ont
été obtenus dans le cas du récepteur N111G-AT1. Le mutant I201C-N111G est devenu plus
sensible au MTSEA, alors que la sensibilité du G203C-N111G fut diminuée. Ces résultats
suggèrent que l‟activation constitutive du récepteur AT1 implique un mouvement de
rotation dans le sens antihoraire du TM5.
Les données obtenues avec l‟approche SCAM permettront d‟élaborer un modèle
moléculaire de la pochette de liaison du récepteur AT1.
Dans la notion de sélectivité fonctionnelle, divers ligands peuvent induire une variété de
conformations d‟un GPCR et ainsi inhiber ou activer plus ou moins sélectivement les
diverses voies de signalisation en aval du récepteur. Nous avons testé des analogues de
l‟AngII modifiés en position 1, 4 ou 8. Nous avons démontré que la phénylalanine en
position 8 semble essentielle pour l‟activation de la voie classique, la voie Gq, mais pas
pour les autres voies de signalisation que nous avons testées. La tyrosine en position 4 est
importante pour l‟affinité de liaison et elle confère aussi une sélectivité relative pour la voie
134
134
des ERKs. L‟aspartate en position 1 ne semble pas important pour l‟activation des
différentes voies de signalisation et ne confère donc aucune sélectivité fonctionnelle.
Toutes ces données nous permettront d‟améliorer notre modèle moléculaire du récepteur
AT1 de l‟Ang II.
135
135
REMERCIEMENTS
Tout d‟abord, je tiens à remercier mes directeurs de recherche, Dr. Gaétan Guillemette et
Dr. Emanuel Escher, pour m‟avoir accueilli dans leur laboratoire et m‟avoir confié ces
beaux projets de recherche. Merci pour votre confiance, votre disponibilité et pour vos
précieux conseils tout au long de mes études graduées. Merci pour votre mentorat durant
toutes ces années!
Je remercie aussi le Dr. François Marceau, le Dr. Marek Rola-Pleszczynski et le Dr. Michel
Grandbois pour avoir accepté d‟évaluer ma thèse. Vos commentaires ont grandement
amélioré la qualité de ce travail.
Je tiens à remercier tous les gens qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de mes
travaux de recherche. Un merci spécial à Stéphane Martin qui m‟a initié aux études de
SCAM ainsi qu‟à Brian Holleran avec qui j‟ai développé le projet de sélectivité
fonctionnelle.
Je voudrais également remercier ceux qui ont contribué à rendre ces années agréables,
c‟est-à-dire les collègues ainsi que tous les membres du département de pharmacologie.
Alors merci à Éric, Guillaume, Nancy, Brian, Martin, Stéphane, Maude, Jennifer ainsi que
tous les autres membres des labos Guillemette, Escher, Leduc et Boulay.
Un gros merci à ma famille (mes parents, ma sœur et mon conjoint) de m‟avoir encouragé
tout au long de mes études.
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