Propriétés structurales et fonctionnelles du récepteur AT ...

Université de Sherbrooke

Propriétés structurales et fonctionnelles du récepteur AT1 de

l’angiotensine II

Par

Ivana Domazet

Département de pharmacologie

Thèse présenté(e) à la Faculté de médecine et des sciences de la santé

en vue de l‟obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.)

en pharmacologie

Sherbrooke, Québec, Canada

mars, 2015

Membres du jury d‟évaluation

Dr.Gaétan Guillemette, département de pharmacologie

Dr.Emanuel Escher, département de pharmacologie

Dr. Michel Grandbois, département de pharmacologie

Dr. Marek Rola-Pleszczynski , département de pédiatrie

Dr. François Marceau, département de médecine, Université de Laval

© Domazet Ivana, 2015

À ma famille

La vie est authentique lorsqu’elle change.

Léon Tolstoї

iv

iv

RÉSUMÉ

Propriétés structurales et fonctionnelles du récepteur AT1 de l’angiotensine II

Par

Ivana Domazet

Programmes de pharmacologie

Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l‟obtention

du diplôme de philosophiae doctor (Ph.D.) en pharmacologie, Faculté de médecine et des

sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4

L‟angiotensine II (Ang II), une hormone jouant un rôle important dans l‟homéostasie

cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT1 appartenant à

la grande famille des GPCRs. Les sept domaines transmembranaires (TM) des GPCRs

contribuent à former la pochette de liaison du ligand. Afin d‟identifier les acides aminés du

TM2 et du TM5 impliqués dans la formation de la pochette de liaison du récepteur AT1,

nous avons utilisé l‟approche SCAM qui consiste à évaluer les propriétés de liaison du

récepteur suite à sa réaction avec le MTSEA. Le MTSEA alkyle les cystéines endogènes ou

introduites par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement stérique qui interfère

avec la liaison du ligand. Une série de mutants ont été produits en remplaçant

successivement par une cystéine les résidus 70 à 94 du TM2 ainsi que les résidus 190 à 217

du TM5 du récepteur AT1 et de son mutant constitutivement actif N111G-AT1. Après le

prétraitement avec le MTSEA, les mutants D74C, L81C, L83C, A85C, A89C ont montré

une diminution significative d‟affinité pour le ligand 125

I-Sar1,Ile

8Ang II, suggérant que

ces résidus sont orientés dans la pochette de liaison du récepteur AT1. Le mutant D74C-

N111G est devenu insensible au MTSEA, alors que la sensibilité de L81C-N111G fut

diminuée. Par contre, le mutant V86C-N111G s‟est avéré sensible au MTSEA. Ces

résultats suggèrent que l‟activation constitutive du récepteur AT1 implique un mouvement

de pivot du TM2, favorisant le rapprochement du haut du TM2 vers la pochette de liaison.

Pour le TM5, après le prétraitement avec le MTSEA, les mutants L197, N200, I201, G203

et F204 ont montré une diminution significative d‟affinité pour le ligand 125

I-Sar1,Ile

8Ang

II, suggérant que ces résidus sont orientés dans la pochette de liaison du récepteur AT1. Le

mutant I201C-N111G est devenu plus sensible au MTSEA, alors que la sensibilité de

G203C-N111G fut diminuée. Ces résultats suggèrent que l‟activation constitutive du

récepteur AT1 implique un mouvement de rotation du TM5 dans le sens anti-horaire. Le

récepteur AT1 est connu pour coupler préférentiellement à la protéine Gq et les propriétés

fonctionnelles de ce récepteur ont surtout été évaluées en fonction de sa capacité à induire

la production des inositol phosphates et à mobiliser le Ca2+

intracellulaire. Par contre, le

récepteur AT1 interagit avec d‟autres protéines G (Gi et G12/13) et active également des voies

de signalisation indépendantes des protéines G (MAPK). Nous avons évalué une série

d‟analogues de l‟Ang II pour leur capacité à inhiber ou activer plus ou moins sélectivement

les diverses voies de signalisation en aval du récepteur. C‟est la notion de sélectivité

fonctionnelle. Nos résultats démontrent que les substitutions à la position 1 ne confèrent

pas de séléctivité fonctionnelle, alors que les substitutions à la position 4 montrent un biais

vers la signalisation la MAPK et que les substitutions à la position 8 montrent un biais pour

le recrutement des β-arrestines.

v

v

Mots clés : récepteur AT1, angiotensine II, pochette de liaison, SCAM, sélectivité

fonctionnelle.

vi

vi

Table des matières

Résumé ............................................................................................................................................ iv

Liste des figures ........................................................................................................................... ix

Liste des tableaux ........................................................................................................................ xi

Liste des abréviations .............................................................................................................. xii

Introduction ................................................................................................................................... 1 Les récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs) ..................................................................... 1

Système rénine-angiotensine (RAS) ............................................................................................... 2

Effets physiologiques de l’Ang II:................................................................................................................. 3

Récepteurs de l’Ang II : ................................................................................................................................... 4

Structure générale du récepteur AT1 de l’Ang II ................................................................................... 4

Nomenclature des résidus situés dans TM .............................................................................................. 5

Ang II ....................................................................................................................................................................... 6

Structure du récepteur AT1 de l’Ang II ........................................................................................... 6

Pochette de liaison du récepteur AT1 ........................................................................................................ 6

Méthode SCAM : identification de la pochette de liaison du récepteur AT1 .............................. 8

Utilisation du SCAM afin de délimiter la pochette de liaison des GPCRs .................................... 9

État basal versus état actif du récepteur ............................................................................................... 10

Activation constitutive du récepteur AT1 .............................................................................................. 11

Activation des récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs) ............................................. 12

Mécanisme moléculaires impliqués dans l’activation des GPCRs ............................................... 12

Mécanisme d’activation du récepteur AT1 de l’Ang II ...................................................................... 12

Sélectivité fonctionnelle .................................................................................................................... 14

Concept de sélectivité fonctionnelle ....................................................................................................... 14

Pourquoi faire des études de sélectivité fonctionnelle? ................................................................. 15

La signalisation du récepteur AT1 .................................................................................................. 15

Voies de signalisation impliquées dans l’activité du récepteur AT1 .......................................... 15

Activation de la voie de MAPK/ERK par le récepteur AT1 ............................................................. 17

Méthodes utilisés pour mesurer l’activation de différentes voies de signalisation .... 19

Production des inositols phosphates ...................................................................................................... 19

Activation de la voie des ERKs ................................................................................................................... 19

Recrutement de l’arrestine et l’activation de la voie G12 ................................................................ 20

Calcul du biais de signalisation ................................................................................................................. 20

Importance de la sélectivité fonctionnelle du récepteur AT1 .............................................. 21

vii

vii

Problématique ...................................................................................................................................... 22

Objectifs .............................................................................................................................................................. 23

Article 1 ......................................................................................................................................... 24 The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor

participates in the formation of the ligand binding pocket and undergoes integral

pivoting movement during the process of receptor activation ........................................... 24

Résumé ................................................................................................................................................................ 25

Introduction ...................................................................................................................................................... 27

EXPERIMENTAL PROCEDURES ................................................................................................................ 29

RESULTS ............................................................................................................................................................. 34

DISCUSSION ....................................................................................................................................................... 38

FOOTNOTES ...................................................................................................................................................... 46

REFERENCES .................................................................................................................................................... 46

Article 2 ......................................................................................................................................... 48 The fifth transmembrane domain of angiotensin II Type 1 receptor participates in

the formation of the ligand-binding pocket and undergoes a counterclockwise

rotation upon receptor activation ................................................................................................. 48

Résumé ................................................................................................................................................................ 48

INTRODUCTION ............................................................................................................................................... 50

EXPERIMENTAL PROCEDURES ................................................................................................................ 52

RESULTS ............................................................................................................................................................. 54

DISCUSSION ....................................................................................................................................................... 64

REFERENCES .................................................................................................................................................... 70

Article 3 ......................................................................................................................................... 73 Characterization of Angiotensin II molecular determinants involved in AT1 receptor

functional selectivity .......................................................................................................................... 73

Résumé ................................................................................................................................................................ 73

INTRODUCTION ............................................................................................................................................... 75

MATERIALS AND METHODS ...................................................................................................................... 76

RESULTS ............................................................................................................................................................. 80

DISCUSSION ....................................................................................................................................................... 98

REFERENCES .................................................................................................................................................. 102

TABLES .............................................................................................................................................................. 106

viii

viii

Discussion .................................................................................................................................. 114

CONCLUSIONS ........................................................................................................................... 133

Liste des références ................................................................................................................ 136

ix

ix

LISTE DES FIGURES

INTRODUCTION

Figure 1 Le système rénine-angiotensine……………………………………………………3

Figure 2 Représentation schématique du récepteur AT1 ........................................................ 5

Figure 3 Arrangement des domaines transmembranaires autour de la pochette de liaison du

récepteur AT1 .................................................................................................................. 8

Figure 4 Substituted Cysteine Accessibility Method (SCAM) ............................................. 10

Figure 5 Sélectivité fonctionnelle ......................................................................................... 15

Figure 6 Les différentes voies de signalisation du récepteur AT1 ....................................... 17

ARTICLE 1

Figure 1 Schematic representation of the human AT1 receptor ............................................ 30

Figure 2 MTSEA treatment of the wild-type AT1 receptor and sensitive reporter cysteine-

bearing mutant receptors ............................................................................................... 32

Figure 3 Effects of MTSEA on different mutant AT1 receptors bearing a reporter cysteine

in TMD2 ....................................................................................................................... 33

Figure 4 MTSEA treatment of the N111G-AT1 receptor and sensitive reporter cysteine-

bearing mutant N111G-AT1 receptors .......................................................................... 36

Figure 5 Effect of MTSEA on different mutant N111G-AT1 receptors bearing a reporter

cysteine in TMD2 ........................................................................................................ 39

Figure 6 [Sar1,Ile

8]Ang II protection of MTSEA-sensitive mutant receptors ...................... 40

Figure 7 Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild type and mutant

AT1 receptors ................................................................................................................ 42

Figure 8 Helical wheel representation of TMD2 reporter cysteines and their pattern of

reactivity to MTSEA ..................................................................................................... 43

ARTICLE 2

Figure 1 Schematic representation of the human AT1 receptor ............................................ 57

x

x

Figure 2 MTSEA treatment of the wild-type AT1 receptor and sensitive reporter cysteine-

bearing mutant receptors ............................................................................................... 58

Figure 3 Effects of MTSEA on mutant AT1 receptors bearing a reporter cysteine in TMD5

...................................................................................................................................... 59

Figure 4 MTSEA treatment of the N111G-AT1 receptor and sensitive reporter cysteine-

bearing mutant N111G-AT1 receptors .......................................................................... 62

Figure 5 Effect of MTSEA on N111G-AT1 mutant receptors bearing a reporter cysteine in

TMD5 ............................................................................................................................ 63

Figure 6 [Sar1,Ile

8]Ang II protection of MTSEA-sensitive mutant receptors ...................... 65

Figure 7 Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild-type (WT) and

mutant AT1 receptors .................................................................................................... 66

Figure 8 Helical wheel representation of TMD5 reporter cysteines and their pattern of

reactivity to MTSEA ..................................................................................................... 68

ARTICLE 3

Figure 1 Inositol1-phosphate production induced by Ang II analogs……………………81

Figure 2 βarrestin1 recrutement to the AT1 receptor by Ang II analogs .............................. 84

Figure 3 βarrestin2 recrutement to the AT1 receptor by Ang II analogs .............................. 85

Figure 4 G12 activation by Ang II analogs……………………………………………….87

Figure 5 Ang II induced ERK activation .............................................................................. 88

Figure 6 EGFR-dependent ERK activation by Ang II analogs ........................................... 90

Figure 7 PKC-dependent ERK activation by Ang II analogs .............................................. 92

Figure 8 Atypical PKC-dependent ERK activation ............................................................. 94

Figure 9 Effects of AngII analogs on AT1 signalling pathways .......................................... 97

xi

xi

LISTE DES TABLEAUX

ARTICLE 1

Tableau 1 Binding Properties of [Sar1,Ile

8]Ang II to cysteine-substitued hAT1 mutant

receptors……………………………………………………………………………....29


8]Ang II to cysteine-substitued hAT1 mutant

receptors bearing the N111G mutation……………………………………………….35

ARTICLE 2


8] Ang II to Cysteine-Substitued hAT1 Mutant

Receptors………………………………………………………………………….55-56


8] Ang II to Cysteine-Substitued hAT1 Mutant

Receptors Bearing the Asn111

Gly Mutation……………………………………….60-61

ARTICLE 3

Tableau 1 Binding Properties of AT1 receptor ligands ………………………………......107

Tableau 2 Activation of Gq, βarrestin1, βarrestin2 and G12 by AT1 receptor

ligands……………………………………………………………………………….108

Tableau 3 Activation of Gq, PKC-ERK and EGFR-ERK by AT1 receptor ligands

……………………………….....................................................................................109

Tableau 4 Transduction ratios of AT1 receptor ligands………………………..…………110

Tableau 5 Biais factor of AT1 receptor ligands modified at position 1………………….112

Tableau 6 Biais factor of AT1 receptor ligands modified at position 4………………….113

Tableau 7 Biais factor of AT1 receptor ligands modified at position 8…………………..114

xii

xii

LISTE DES ABRÉVIATIONS

AT1

AT2

Ang II

Récepteur à l‟angiotensine II type 1

Récepteur à l‟angiotensine II type 2

angiotensine II

Ang III

Ang IV

angiotensine III

angiotensine IV

AMPc adénosine monophosphate 3', 5'-cyclique

ACE enzyme de conversion de l‟angiotensine II

Bpa para-benzoyl-L-phenylalanine

Ca2+

calcium

CAM mutant constitutivement actif

Cys cystéine

DAG

EGF

EGFR

ERK1/2

GDP

GPCR

GRK

Diacylglycérol

Facteur de croissance épidermique

Récepteur du facteur de croissance épidermique

Extracellular signal-regulated kinases

Guanosine diphosphate

Récepteur couplé à une protéine G

Kinase des récepteurs couplés à une protéine G

GTP

JAK

JNK3

Guanosine triphosphate

Janus kinase

c-Jun N-terminal kinase

IP3 inositol 1,4, 5-trisphosphate

IP3R Récepteur à inositol 1,4, 5-trisphosphate

PDGF platelet-derived growth factor

PIP2 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate

PKC protéine kinase C

RAF RAF kinase

IGFR insulin-like growth factor 1 receptor

PIP2 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate

xiii

xiii

PKC protéine kinase C

PLC phospholipase C

MAPK mitogen-activated kinase

MEK MAP kinase kinase

MMP métalloprotéinase

MPA methionine proximity assay

MTS méthanethiosulfonate

MTSEA méthanethiosulfonate-ethylammonium

MTSES méthanethiosulfonate-éthylsulfonate

TM domaine transmembranaire

SCAM substituted cysteine accessibility method

Src proto-oncogene tyrosine-protein kinase

1

1

INTRODUCTION

Les récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs)

Les récepteurs situés à la surface cellulaire permettent de capter un stimulus venant de

l‟extérieur afin de le traduire en une réponse appropriée à l‟intérieur de la cellule. Il existe

quatre grandes catégories de récepteurs : les récepteurs nucléaires, les récepteurs canaux, les

récepteurs à activité enzymatique et les récepteurs couplés à une protéine G. Les récepteurs

couplés à une protéine G sont les protéines transmembranaires les plus nombreuses et les

plus diversifiées impliquées dans la transduction du signal intracellulaire. Plus de 2% des

gènes de notre organisme codent pour des récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs).

Les GPCRs sont impliqués dans l‟homéostasie de divers systèmes. Ces récepteurs sont

impliqués dans le contrôle d‟une multitude de processus biologiques (vision, métabolisme,

neurotransmission, olfaction, réponse immunitaire, réponse inflammatoire) et

pathophysiologiques (maladies cardiovasculaires, cancer, diabète). Ils représentent donc des

cibles très intéressantes pour le traitement de différentes maladies telles que les maladies

cardiaques, certains désordres inflammatoires et autres (Lebon and Tate, 2012). Aujourd‟hui,

les GPCRs représentent la cible la plus importante de tous les médicaments sur le marché.

Environ 40% des médicaments actuellement disponibles sur le marché ont leurs effets

thérapeutiques via un ou des GPCRs (Ma and Zemmel, 2002), d‟où l‟importance de bien

comprendre leur structure et leur activation.

Des stimuli de nature très variée peuvent activer les GPCR (photons, ions, amines,

acides aminés, peptides, protéines, lipides, nucléotides, glycoprotéines et phospholipides)

(Kroeze, et al., 2003).

L‟unité de signalisation de base d‟un GPCR comprend un récepteur, une protéine G

hétérotrimérique et un effecteur. Suite à la liaison du ligand, le GPCR subit un changement

conformationnel qui permet l‟activation de la protéine G. Les GPCRs doivent leur nom à leur

mécanisme de transduction le mieux connu, soit l‟activation de protéines G hétérotrimériques.

Les protéines G hétérotrimériques servent d‟intermédiaires dans l‟activation d‟effecteurs à

l‟intérieur de la cellule tels que les enzymes, les canaux ioniques et autres. Les protéines G

sont composés de trois sous-unités, soit la sous-unité Gα, Gβ et Gγ. Les sous-unités Gβ et Gγ

forment un dimère stable. Suite à l‟activation, les GPCRs catalysent l‟échange d‟une molécule

de GDP pour une molécule de GTP à l‟intérieur de la sous-unité Gα de la protéine G. Cet

2

2

échange cause l‟activation et la dissociation de la sous-unité Gα du dimère Gβγ. Après

dissociation, Gα et Gβγ peuvent chacune activer leurs effecteurs respectifs (Pierce, et al.,

2002).

On peut classer la protéine Gα en fonction de sa capacité à activer certaines voies de

signalisation. Par exemple, la protéine Gαs active l‟adenylate cyclase, et favorise

l‟augmentation de l‟AMP cyclique. À l‟inverse, la protéine Gαi inhibe l‟adénylate cyclase et

cause une baisse de l‟AMP cyclique. La protéine Gαq active la phospholipase C (PLCβ) qui

clive le phosphatidyl inositol 4,5-biphosphate (PIP2) en diacylglycérol et en inositol 1,4,5-

triphosphate (IP3). La protéine Gα12∕13, quant à elle, active la Rho kinase impliquée dans la

réorganisation du cytosquelette (Pierce, et al., 2002).

Même si les protéines G sont responsables de la majorité des effets suite à l‟activation

des GPCRs, il est bien connu que les GPCRs sont capables d‟activer d‟autres voies de

signalisation indépendantes de la protéine G (Kenakin, 2011) telles que le recrutement

d‟arrestine, la transactivation du récepteur de l‟EGF, ainsi que l‟activation de certaines

kinases (Src).

Système rénine-angiotensine (RAS)

Le récepteur de l‟Ang II (récepteur AT1) est un GPCR et il constitue l‟élément central

du système rénine-angiotensine. Le système rénine-angiotensine joue un rôle clé dans la

régulation de la pression artérielle. Suite à une baisse de la concentration de sodium, ou à une

baisse du volume sanguin ou encore à une baisse de la pression artérielle, les reins sécrètent la

rénine. La rénine est une enzyme qui clive son unique substrat, l‟angiotensinogène, une

protéine plasmatique produite par le foie. Le clivage de l‟angiotensinogène produit

l‟angiotensine I (Ang I), un décapeptide qui ne possède aucune fonction biologique connue

mais qui est converti en Ang II) par l‟enzyme de conversion de l‟angiotensine (ACE). L‟Ang

II est la molécule active du système rénine-angiotensine; c‟est l‟agoniste du récepteur AT1

(figure 1). L‟Ang II a une demi-vie très courte et elle est rapidement métabolisée en

angiotensine III (Ang III) par l‟aminopeptidase A et cette dernière en angiotensine IV (Ang

IV) par l‟aminopeptidase N (Hunyady and Catt, 2006) .

3

3

FIGURE 1. Le système rénine-angiotensine. Représentation schématique de la production de

l‟angiotensine II et ses effets physiologiques.

Effets physiologiques de l‟Ang II:

L‟Ang II favorise une élévation de la pression artérielle par une variété d‟actions. Elle

stimule la sécrétion d‟aldostérone par le cortex de la glande surrénale qui favorise la

réabsorption de sodium (Na+) et de l‟eau par le tubule rénal. L‟Ang II est aussi un puissant

vasoconstricteur qui augmente la résistance vasculaire périphérique. De plus, l‟Ang II stimule

la croissance et la prolifération cellulaire. Également, l‟Ang II favorise la sécrétion de la

vasopressine afin d‟augmenter la réabsorption d‟eau. L‟Ang II agit aussi dans le cerveau,

pour augmenter la soif pour favoriser l‟absorption d‟eau, ce qui augmente le volume sanguin

et par conséquent augmente la pression artérielle (de Gasparo, et al., 2000; Bader, 2010).

Afin de réduire les effets physiologiques de l‟Ang II, il existe plusieurs classes de

médicaments sur le marché. Les inhibiteurs d‟ACE bloquent l‟enzyme de conversion et

empêchent la production d‟Ang II, abolissant ses principales fonctions : la vasoconstriction et

la libération d‟aldostérone. Ce type de médicament est utilisé pour traiter l‟hypertension

artérielle et l‟insuffisance cardiaque et le premier inhibiteur de cette classe a été le captopril.

Il existe aussi des antagonistes du récepteur AT1 qui bloquent son activation par l‟Ang II. Les

4

4

antagonistes du récepteur AT1 tel que le losartan agissent en diminuant l‟effet

vasoconstricteur et l‟effet mitogènique de l‟Ang II. Enfin, les inhibiteurs de la rénine

empêchent la formation de l‟Ang I à partir de l‟angiotensinogène. L‟aliskiren est un exemple

de la nouvelle génération d‟inhibiteurs de la rénine qui sont utilisés en clinique et qui peuvent

être administrés par la voie orale (Burnier, 2001; Paulis and Unger, 2010).

Récepteurs de l‟Ang II :

Deux types de récepteurs ont été identifiés pour l‟Ang II : le récepteur AT1 et le

récepteur AT2 (de Gasparo, et al., 2000). Le récepteur AT2 est composé de 363 acides aminés

et possède une homologie de séquence de 34 % avec le récepteur AT1. Il s‟exprime surtout

durant la vie fœtale. Le rôle physiologique du récepteur AT2 est encore relativement obscur

bien que certaines études suggèrent que ce récepteur aurait des actions d‟antagoniste

physiologique du récepteur AT1, ayant des effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques

(Steckelings, et al., 2005). La majorité des effets physiologiques connus de l‟Ang II passent

par le récepteur AT1 (Burnier, 2001; Miura, et al., 2003a).

Structure générale du récepteur AT1 de l‟Ang II

Le récepteur AT1 est présent dans plusieurs organes tels que le foie, la glande surrénale,

le cerveau, les poumons, le rein, le cœur et les vaisseaux sanguins. Composé de 359 acides

aminés, le récepteur AT1 fait partie de la classe A des GPCRs, ayant une forte homologie avec

le récepteur de la rhodopsine. Ce récepteur comme tous les autres GPCRs est composé de sept

domaines transmembranaires α-hélicaux (TM) ainsi que d‟un domaine N-terminal

extracellulaire et un domaine C-terminal intracellulaire. Le domaine extracellulaire de l‟AT1

se caractérise par la présence de trois sites consensus de glycosylation (Asn4, Asn176,

Asn188) ainsi que quatre résidus cystéine impliqués dans la formation de deux ponts

disulfures essentiels pour la liaison de l‟Ang II (figure 2) (Yamano, et al., 1992; Lanctot, et

al., 1999; Lanctot, et al., 2005).

Le domaine intracellulaire quant à lui est composé de 3 boucles intracellulaires et d‟une

queue C-terminale. Il contient plusieurs résidus sérine/thréonine pouvant être phosphorylés

par les kinases de récepteurs couplés à une protéine G (GRK) afin de recruter l‟arrestine et

initier le processus de désensibilisation et d‟internalisation du récepteur (Mehta and

Griendling, 2007).

5

5

Nomenclature des résidus situés dans TM

Pour faciliter la comparaison des résidus situés dans les domaines transmembranaires

(TM) de différentes GPCR de la classe A, plusieurs nomenclatures ont été proposées. Dans

cette thèse, j‟ai retenu la nomenclature de Ballesteros et Weinstein (Ballesteros, J.A. 1995).

La nomenclature est basée sur le fait que dans chaque TM le résidu le plus hautement

conservé est désigné le résidu X.50 où X représente le numéro du TM. Les autres résidus sont

numérotés relativement à leur position par rapport au résidu le plus conservés. Par exemple, le

résidu le plus hautement conservé dans le 2e TM est un aspartate qu‟on va désigner Asp-

74(2.50)

. Le résidu situé avant l‟aspartate est une alanine qui sera donc identifié comme Ala-

73(2.49)

. Par contre, le résidu situé après l‟aspartate 74 est une leucine et sera désigné en tant

que Leu-75(2.51)

.

FIGURE 2 : Représentation schématique du récepteur AT1. Les numéros indiquent les

positions des résidus dans le récepteur. Les cercles gris représentent les cystéines qui forment

les ponts disulfures et les cercles noirs représentent les cystéines qui ne sont pas impliquées

dans la formation de ponts disulfures. Les sites de glycosylation potentiels (Asn-4, Asn-176 et

Asn-188) sont aussi identifiés. L‟Asn-111 dans le TM3 est aussi indiquée en gris.

6

6

Ang II

L‟octapeptide Ang II (Asp1-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

8) est le médiateur principal du

système rénine-angiotensine (de Gasparo, et al., 2000). Les différentes études effectuées in

vivo et in vitro avec les analogues de l‟Ang II ont permis de déterminer les résidus impliqués

dans la liaison et dans l‟activation du récepteur AT1 (Khosla, et al., 1974; Regoli, et al., 1974).

L‟activité biologique de l‟Ang II dépend en grande partie du résidu aromatique Phe8 et

de son carboxylate dans la partie C-terminale du peptide (de Gasparo, et al., 2000). Les

chaines latérales aromatiques en position 4 et 6 (Tyr4 et His

6) semblent également impliquées

dans l‟activation du récepteur (Khosla, et al., 1974). Par exemple, en remplaçant les résidus

aromatiques Tyr4 et Phe

8 par des résidus aliphatiques, on génère des antagonistes du

récepteur AT1. Il faut cependant mentionner que le résidu Tyr-4 cause principalement une

importante baisse d‟affinité pour le récepteur, ce qui le rend moins intéressant du point de vue

structure-fonction (Guillemette, et al., 84). Les résidus situés dans la partie N-terminale sont

importants pour la liaison au récepteur ainsi que pour la durée d‟action du ligand. L‟Ang III

(Ang-2-8) formée par la délétion de l‟aspartate en position 1 est aussi puissante que l‟Ang II.

L‟Ang IV (Ang-3-8) garde une faible activité biologique et se comporte comme un agoniste

partiel ayant une faible affinité pour le récepteur AT1 (de Gasparo, et al., 2000).

Structure du récepteur AT1 de l‟Ang II

Pochette de liaison du récepteur AT1

Les GPCRs de la classe A possèdent une cavité hydrophile au centre de la protéine

appelée la pochette de liaison. La pochette de liaison est délimitée par les sept domaines

transmembranaires et sert à accommoder le ligand au sein du récepteur (voir figure 3). Il est

connu que dans le cas des GPCRs ayant des ligands plus volumineux comme les peptides

(Ang II), le site de liaison se situe en partie dans les domaines transmembranaires et en partie

dans les régions extracellulaires (Schwartz, et al., 2006).

Différentes études utilisant des analogues de l‟Ang II en combinaison avec de la

mutagénèse dirigée ont permis l‟identification des déterminants moléculaires importants pour

la liaison de l‟Ang II. Les acides aminés essentiels à la liaison de l‟Ang II incluent les résidus

cystéines qui forment les ponts disulfures ainsi que plusieurs autres résidus situés dans la

partie supérieure du récepteur. Par exemple, les résidus chargés situés dans les domaines

transmembranaires, tels que la Lys-102(3.26)

dans le haut du TM3 ainsi que la Lys-199(5.42)

7

7

dans le haut du TM5, participent à la liaison du peptide (Yamano, et al., 1995; de Gasparo, et

al., 2000).

Initialement, on a formulé l‟hypothèse selon laquelle le groupement carboxyle en C-

terminal de l‟Ang II, de même que les chaines latérales Arg2, Tyr

4 et His

6 sont importants

pour la liaison et l‟activité du peptide (Khosla, et al., 1974; Hsieh and Marshall, 1986). Il a été

également démontré que le groupement C-terminal de la Phe8

forme une liaison ionique avec

la chaine latérale du résidu Lys-199(5.42)

du récepteur AT1 (Monnot, et al., 1996), alors que la

chaine latérale de la Tyr4 du peptide lierait le résidu N111 du récepteur AT1 (Feng, et al.,

1998). De plus, les chaines latérales des résidus His6

et Phe8 de l‟Ang II se retrouvent à

proximité des résidus His-256(6.51)

et Phe-259(6.54)

du récepteur AT1 (Noda, et al., 1995).

Des études de marquage par photoaffinité ont permis d‟identifier de façon plus directe

les points de contact entre l‟Ang II et son récepteur. Notamment, l‟Asp1 du ligand entre en

contact avec la 2ième

boucle extracellulaire du récepteur AT1 (Laporte, et al., 1999), alors que

la Val3

de l‟Ang II est à proximité du résidu Ile-172 dans la 2ième

boucle extracellulaire

(Boucard, et al., 2000), et que la Phe8

de l‟AngII est à proximité des résidus Phe-293(7.44)

et

Asn-294(7.45)

situé dans le 7ième

domaine transmembranaire (Perodin, et al., 2002).

Avec une autre approche de photomarquage par affinité qui exploite la préférence

marquée du groupement photosensible para-benzoyl-L-phenylalanine (Bpa) pour le résidu

méthionine (Methionine Proximity Assay (MPA)), tous les résidus qui sont à une proximité

de 8Å de la position 8 de l‟Ang II et qui sont donc situés dans la pochette de liaison du

récepteur AT1 ont été identifiés (Clement, et al., 2005; Clement, et al., 2009; Fillion, et al.,

2009; Fillion, et al., 2010; Fillion, et al., 2013). Parmi ces résidus, on retrouve Phe77(2.53)

situé

dans 2e domaine transmembranaire, Leu112

(3.36), Tyr113

(3.37) situés dans 3

e domaine

transmembranaire, Asn200(5.43)

dans 5e domaine transmembranaire, Phe249

(6.44), Trp253

(6.48),

His256(6.51)

,Thr260(6.55)

situés dans 6e domaine transmembranaire, Phe293

(7.44), Asn294

(7.45),

Asn295(7.46)

, Cys296(7.47)

et Leu297(7.48)

situés dans 7e domaine transmembranaire (Fillion, et

al., 2010).

En ce qui concerne le récepteur AT1, on peut déduire que l‟Ang II est capable de

pénétrer profondément dans la pochette de liaison constituée à la fois des domaines

transmembranaires et des domaines extracellulaires.

8

8

FIGURE 3 : Pochette de liaison du récepteur AT1 : Arrangement des domaines

transmembranaires autour de la pochette de liaison du récepteur AT1.

Méthode SCAM : identification de la pochette de liaison du récepteur AT1

L‟acide aminé cystéine qui possède un souffre dans sa chaîne latérale est souvent utilisé

pour étudier les relations entre la structure et la fonction d‟une protéine. En effet, la cystéine

est capable de former un lien disulfure avec toute autre molécule possédant un groupement

thiol libre. Cette propriété peut être exploitée pour modifier les cibles de façon covalente, ce

qui a mené au développement des agents capables de réagir spécifiquement avec les cystéines.

La cystéine demeure un bon choix pour substituer un résidu natif dans une protéine puisque sa

taille est intermédiaire et elle n‟a pas tendance à former des structures secondaires et donc ne

change pas la structure globale de la protéine.

Ainsi, Roberts et collaborateurs (Roberts, et al., 1986) ont développé des composés

méthanthiosulfonates (MTS), hautement séléctifs au groupement thiol permettant de modifier

de façon spécifique les cystéines. Il existe des MTS contenant un groupement

éthylammonium (MTSEA) ou éthylsulfonate chargé négativement (MTSES). Ces composés

peuvent modifier des protéines (cibles) contenant des cystéines pour y introduire une charge,

ainsi qu‟un certain encombrement stérique. L‟approche SCAM (Substituted Cysteine

Accessibility Method) consiste à remplacer tous les acides aminés, un à la fois, par une

cystéine et ensuite d‟évaluer l‟effet d‟un MTS sur les propriétés de liaison du récepteur

mutant.

Dans un premier temps, le SCAM a été utilisé pour caractériser les canaux ioniques

(Akabas, et al., 1992). Les résidus constituant le pore du canal forment une pochette

9

9

hydrophile par laquelle passent les ions et ainsi la modification de ces résidus par un

composé MTS bloque l‟accès aux ions, modifiant ainsi la fonctionnalité du canal. En absence

de modification des propriétés fonctionnelles, il y a deux explications possibles : soit la

cystéine introduite n‟a pas pu réagir avec le réactif MTS, soit la modification de la cystéine ne

cause pas de changement détectable de la fonctionnalité de la protéine.

Utilisation du SCAM afin de délimiter la pochette de liaison des GPCRs

Afin de mieux comprendre les propriétés moléculaires du récepteur AT1, nous avons

utilisé l‟approche SCAM (Akabas, et al., 1992; Javitch, et al., 1994; Javitch, et al., 1995) qui

permet d‟identifier les acides aminés faisant partie de la pochette de liaison du récepteur en

plus de déterminer l‟orientation des domaines transmembranaires lors de l‟activation du

récepteur. Cette approche est basée sur la réactivité de dérivés des méthanethiosulfonates

(MTS) ayant une spécificité pour les groupements sulfhydryls des cystéines (Cys). Parmi les

différents MTS disponibles sur le marché, le MTSEA (2-aminoethyl méthanethiosulfonates)

est un réactif chargé et hydrophile. Il réagit un milliard de fois plus rapidement avec les

thiols ionisés (RS¯) qu‟avec les thiols non-ionisés (RSH). Ainsi, seulement les cystéines

présentes dans le compartiment aqueux sont ionisées et peuvent réagir avec le MTSEA. La

méthode de SCAM consiste à vérifier l‟accessibilité du ligand dans la pochette de liaison suite

à la réaction entre le réactif MTS et les cystéines introduites de façon systématique par

mutagénèse dirigée dans les domaines transmembranaires.

La première étape consiste donc à remplacer de façon successive un par un chacun des

résidus dans un domaine transmembranaire par une cystéine. Ces récepteurs mutants sont par

la suite traités avec le réactif MTSEA et leur propriété de liaison est évaluée. La cystéine

située dans la pochette de liaison sera alkylée par le MTSEA, causant ainsi l‟encombrement

stérique qui interférera avec la liaison du ligand (figure 4). Par contre, si l‟alkylation n‟affecte

pas les propriétés de liaison du récepteur mutant, on déduit que la cystéine substituante n‟est

pas située dans la pochette de liaison.

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FIGURE 4 : Substituted Cysteine Accessibility Method (SCAM). Le MTSEA réagit

spécifiquement avec les cystéines libres. Il réagit un milliard de fois plus rapidement avec les

thiols ionisés (RS-) qu‟avec les thiols non-ionisés (RSH). Ainsi, seulement les cystéines dans

le compartiment aqueux sont ionisées et réagiront avec le MTSEA. La cystéine située dans la

pochette de liaison sera alkylée par le MTSEA, causant ainsi un encombrement stérique qui

interférera avec la liaison du ligand.

État basal versus état actif du récepteur

Les GPCRs sont des protéines dynamiques capables de transition entre de multiples

conformations (Lefkowitz, 2007). Ces diverses conformations sont en équilibre dynamique

avec les effecteurs intracellulaires et les ligands extracellulaires. Le modèle ternaire cubique a

été formulé pour décrire l‟interaction dynamique entre le récepteur, son ligand et sa protéine

G effectrice (Schwartz, et al., 2006).

De façon générale, la forme basale d‟un GPCR est la plus énergétiquement favorable en

absence de ligand. La liaison d‟un agoniste complet stabilise une conformation active du

récepteur, (augmente la population des récepteurs de conformation active aux dépens de la

population étant dans la conformation inactive) ce qui augmente l‟affinité du récepteur pour

11

11

une protéine effectrice intracellulaire et mène à une signalisation maximale. Pour leur part, les

agonistes partiels stabilisent une conformation active du récepteur de façon moins efficace

que les agonistes complets, sans toutefois produire une réponse maximale. Les antagonistes

neutres occupent le site de liaison du récepteur, mais n‟ont aucune influence sur l‟adoption

des diverses conformations du récepteur. En fait, les antagonistes ne font que bloquer l‟accès

de l‟agoniste au récepteur. Les agonistes inverses stabilisent la conformation inactive du

récepteur. La notion de l‟agoniste inverse a été proposée récemment, suite à la découverte de

l‟activité constitutive de certains récepteurs, qui peuvent donc adopter une conformation

active en absence d‟agoniste (Seifert and Wenzel-Seifert, 2002).

En absence du ligand, la majorité des GPCRs possèdent un faible niveau d‟activité

constitutive (Seifert and Wenzel-Seifert, 2002) (une sous-population des récepteurs ayant

assez d‟énergie pour être dans leur conformation active). Certaines mutations peuvent

déstabiliser la forme inactive d‟un GPCR et favoriser les conformations plus actives : ce sont

des mutants constitutivement actifs (CAM). Les CAM favorisent le déplacement de l‟état

inactif vers l‟état actif des GPCRs et par ce fait, offrent un précieux outil dans l‟identification

des résidus impliqués dans l‟activation des GPCRs. En plus des résidus identifiés à l‟aide des

mutants constitutivement actifs (CAM), on croit que les résidus hautement conservés dans les

GPCRs jouent un rôle essentiel dans le mécanisme d‟activation (Gether and Kobilka, 1998).

Dans les études visant à identifier et caractériser les mouvements des domaines

transmembranaires qui accompagnent l‟activation d‟un GPCR, il est nécessaire de discriminer

entre les conformations basales et actives du récepteur. Dans le cas du récepteur AT1,

l‟utilisation du mutant constitutivement actif s‟avère donc très appropriée pour représenter la

conformation active du récepteur, alors que l‟utilisation du récepteur de type sauvage est un

bon modèle de la conformation basale.

Activation constitutive du récepteur AT1

La découverte d‟une activité constitutive chez certains GPCRs qui peuvent activer leur

protéine G en absence d‟agoniste fut une avancée importante. Il est connu que certaines

mutations favorisent l‟augmentation de l‟activité constitutive.

Le récepteur AT1 fait partie d‟un large groupe de GPCRs démontrant une certaine

activité constitutive. Une légère activité constitutive du récepteur AT1 a été observée lors de

sa surexpression dans les cellules COS-1, causant ainsi une augmentation de l‟activité basale

de la PLCβ (Noda, et al., 1996). Ensuite, d‟autres études indépendantes ont elles aussi

démontré une importante augmentation de l‟activité constitutive du récepteur AT1 lorsque le

12

12

résidu Asn111(3.35)

situé dans le 3e domaine transmembranaire est remplacé par des résidus

moins encombrants tels que l‟alanine ou la glycine (Noda, et al., 1996; Balmforth, et al.,

1997; Groblewski, et al., 1997).

Il a été suggéré que les GPCRs dans leur état basal sont contraints dans une

conformation inactive favorisé par certaines interactions intramoléculaires. Suite à la liaison

d‟un agoniste ou sous la présence d‟une mutation spécifique, cette contrainte est libérée ce qui

favorise la conformation active d‟un récepteur. Il est bien connu que le résidu Asn-111 est

hautement mais non strictement conservé dans la classe A des GPCRs.

Activation des récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs)

Mécanisme moléculaires impliqués dans l‟activation des GPCRs

Afin de propager un signal vers l‟intérieur de la cellule, un GPCR doit adopter une

conformation active. Dans le modèle le plus simple de l‟activation des GPCRs, un ligand

agoniste complet stabilise une conformation active du récepteur, ce qui augmente l‟affinité de

ce dernier pour un ou des effecteurs intracellulaires et mène à une signalisation maximale.

Les GPCRs possèdent tous une structure commune dictée par l‟arrangement des sept

domaines transmembranaires dans la membrane plasmique (Palczewski, et al., 2000; Park, et

al., 2008; Rasmussen, et al., 2007; Rasmussen, et al., 2011). Plusieurs résidus et motifs

(D/ERY, NPxxY) conservés pour les GPCRs de la classe A ont été impliqués dans leur

processus d‟activation (Katritch, et al., 2013; Rosenbaum, et al., 2009).

L‟ensemble des informations disponibles suggère que tous les GPCRs pourraient

partager un mécanisme d‟activation commun (Rosenbaum, et al., 2009). En dépit de toutes les

informations disponibles, il reste encore beaucoup de travail à effectuer afin de déterminer les

différentes conformations qu‟adoptent les GPCRs au cours de leur transition de l‟état inactivé

à l‟état activé.

Mécanisme d‟activation du récepteur AT1 de l‟Ang II

Chez plusieurs GPCRs, une étape clé de l‟activation est un éloignement entre le TM3 et

le TM6 du côté cytoplasmique du récepteur (Gether, et al., 1997; Ballesteros, et al., 2001). Si

on bloque ce mouvement, on empêche l‟activation de la protéine G. Dans le cas du récepteur

AT1, il y a des évidences qui montrent qu‟une interaction forte entre le résidu Tyr-113(3.37)

situé dans le 3e domaine transmembranaire et His-256

(6.51) situé dans le 6

e domaine

transmembranaire favorise l‟état inactif du récepteur et empêche l‟activation de la protéine Gq

13

13

(production des inositols phosphates) (Miura, et al., 2006). Il a été démontré qu‟un

mouvement vers l‟extérieur du côté cytoplasmique du 6e domaine transmembranaire favorise

la flexibilité de la 3e boucle intracellulaire, ce qui favorise l‟adoption d‟une conformation

active, présentant un lieu d‟ancrage pour la protéine G (Martin, et al., 2007; Conchon, et al.,

1997).

Il existe différents motifs impliqués dans l‟activation des GPCRs. Un de ces motifs, le

motif D/ERY est celui qui a été le plus étudié. Les trois résidus composant ce motif sont une

Asp ou un Glu en position 3.49, une arginine en position 3.50 et une tyrosine en position 3.51.

Ce motif est situé sur le côté cytoplasmique du 3e domaine transmembranaire, à l‟interface de

la 2e boucle intracellulaire. Plusieurs études montrent que ce motif joue un rôle central dans la

régulation de l‟état conformationnel des GPCRs. L‟arginine(3.50)

est impliquée dans une

interaction ionique avec l‟aspartate (3.49)

adjacente ainsi qu‟avec un résidu chargé situé en

position 6.30 dans le TM6 afin de former ce qu‟on appelle la serrure ionique (« ionic lock »).

L‟interaction intramoléculaire entre ces 3 résidus serait importante pour le maintien du

récepteur dans sa forme inactive et cette interaction doit être brisée lors de l‟activation. Les

structures cristallines de la rhodopsine (Palczewski, et al., 2000) ainsi que du récepteur β2-

adrénergique (Yao, et al., 2006) semblent appuyer cette hypothèse. Dans le cas du récepteur

AT1, il n‟y a pas de résidu chargé négativement à la position 6.30 mais le motif DRY semble

jouer un rôle dans l‟activation de la protéine G et dans le recrutement de l‟arrestine. Par

exemple, en substituant l‟aspartate (3.49)

par des résidus plus petits (alanine ou glycine), on

empêche l‟activation de la protéine G mais on permet encore une signalisation indépendante

de la protéine G (Wei, et al., 2003; Seta, et al., 2002; Gaborik, et al., 2003).

Des études suggèrent que lors de l‟activation du récepteur de l‟urotensine, les résidus

du motif DRY sont impliqués dans une interaction directe avec la protéine G. En effet, une

mutation à l‟intérieur du motif DRY conduit souvent à une forme inactivable du récepteur par

rapport à la protéine G (Proulx, et al., 2008).

Un autre motif impliqué dans l‟activation des GPCRs est le motif NPxxY situé dans le 7e

domaine transmembranaire. Il a été suggéré que ce motif joue le rôle d‟un interrupteur

moléculaire qui serait important dans la transition du récepteur de la conformation basale vers

la conformation active. Selon cette hypothèse, le résidu Asn(7.49)

est orienté vers le 6e domaine

transmembranaire dans la conformation inactive du récepteur et suite à l‟activation, ce résidu

se réoriente de façon à interagir avec l‟Asp-74(2.50)

du 2e domaine transmembranaire.

Plusieurs études montrent l‟importance de l‟Asp-74 (2.50)

(Bihoreau, et al., 1993) ainsi que de

plusieurs autres résidus situés dans le 7e domaine transmembranaire (Tyr-292

(7.43), Asn-

14

14

294(7.45)

, Asn-298(7.49)

, Tyr-302(7.52)

) (Perodin, et al., 2002; Clement, et al., 2005; Balmforth, et

al., 1997; Miura, et al., 2003b; Laporte, et al., 1996) pour l‟activation du récepteur AT1.

L‟activation du récepteur AT1 dans cette section fait référence à l‟activation du

récepteur via la protéine G mais récemment il a été mis en évidence que le récepteur AT1 est

également capable d‟activer des voies de signalisation indépendantes de la protéine G, d‟où

l‟importance du concept de sélectivité fonctionnelle.

Sélectivité fonctionnelle

Concept de sélectivité fonctionnelle

L‟interaction d‟un ligand avec un récepteur est l‟un des fondements de la

pharmacologie. Cette interaction (ligand-récepteur) est à l‟origine des principaux paramètres

pharmacologiques que sont la capacité du ligand à lier le récepteur (affinité) et la capacité à

produire la réponse biologique (efficacité). Jusqu‟à tout récemment, on évaluait l‟efficacité

d‟un récepteur par sa capacité à activer une seule voie de signalisation. Il est maintenant bien

connu que le récepteur AT1 active plusieurs voies de signalisation en interagissant avec

différents effecteurs responsables de la variété d‟actions de l‟Ang II. Il est donc logique de

penser que divers ligands peuvent induire une variété de conformations d‟un GPCR et ainsi

inhiber ou activer plus ou moins sélectivement les diverses voies de signalisation en aval du

récepteur. C‟est le concept de sélectivité fonctionnelle (Galandrin, et al., 2007)(Kenakin,

2011; Violin and Lefkowitz, 2007; Rajagopal, et al., 2010) (Figure 5). Par exemple, une

certaine conformation du récepteur peut coupler plus efficacement à une voie de signalisation

X et moins bien à la voie Y. À l‟inverse, une autre conformation adoptée par le récepteur

activera plus efficacement la voie Y et moins bien la voie X.

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FIGURE 5 : Sélectivité fonctionnelle. Représentation schématique de divers ligands pouvant

induire diverses conformations d‟un même récepteur et pouvant activer ainsi diverses voies de

signalisation engendrant différentes conséquences fonctionnelles.

Pourquoi faire des études de sélectivité fonctionnelle?

L‟importance de la sélectivité fonctionnelle est qu‟elle permet de concevoir des ligands

plus sélectifs qui favoriseront un effet voulu au détriment des effets indésirables. La

sélectivité fonctionnelle trouve son importance dans le développement des nouveaux

médicaments que l‟on veut plus sélectifs. Comment y parvenir? En testant plusieurs ligands

ayant une structure chimique différente, il sera possible de déterminer les voies d‟activation

privilégiées par ces derniers. Dans un premier temps, à partir de ces données, il sera possible

de tirer les conclusions sur l‟influence de la structure chimique des ligands sur la voie

d‟activation privilégiée par le récepteur AT1. Par la suite, en faisant du modelage moléculaire,

il sera possible de déduire la conformation du récepteur efficace à activer l‟une ou l‟autre voie

de signalisation. Finalement, l‟étape ultime sera de designer des super ligands agonistes ou

antagonistes pour chacune des voies de signalisation.

La signalisation du récepteur AT1

Voies de signalisation impliquées dans l‟activité du récepteur AT1

La voie de signalisation classique du récepteur AT1 passe par la protéine Gq qui active

la phospholipase Cβ (PLCβ). La PLCβ hydrolyse le phosphatidyl inositol 4,5-bisphosphate

(PIP2) menant à la production de deux seconds messagers : l‟inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3)

et le diacylglycérol (DAG) (Kojima, et al., 1984; Balla, et al., 1986). Ces seconds messagers

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amplifient d‟autres cascades de signalisation. L‟IP3 active un récepteur/canal, l‟IP3R, dans le

réticulum endoplasmique et provoque une relâche du Ca2+

intracellulaire (Ferris, et al., 1992).

Le DAG active la protéine kinase C (PKC), une sérine/thréonine kinase qui phosphoryle des

substrats dans la cellule et ainsi module leur activité (Kanashiro and Khalil, 1998). Les

connaissances actuelles suggèrent que le récepteur AT1 interagit aussi avec d‟autres protéines

G hétérotrimériques telles que la protéine Gi responsable de l‟inhibition de l‟adenylyl cyclase

et la protéine G12/13 impliquée dans le remodelage du cytosquelette (Hunyady and Catt,

2006b; Mehta and Griendling, 2007).

L‟effet hypertrophique de l‟Ang II met en jeu l‟activation de plusieurs protéines

kinases. L‟Ang II régule l‟activité des kinases de la famille JAK (Ali, et al., 1997; Ali, et al.,

1998; Mascareno and Siddiqui, 2000) et de la famille Src (Seta, et al., 2002; Sayeski, et al.,

1998; Sayeski and Ali, 2003). Les kinases de la famille JAK stimulent la phosphorylation et

l‟activité de facteurs de transcription tels que les STATs (Signal Transducers and Activators

of Transcription) (Liang, et al., 1999; McWhinney, et al., 1998). Les kinases de la famille Src

(cSrc) peuvent phosphoryler de nombreuses protéines et mener à l‟activation de MAP kinases

(mitogen activated protein) telles que les ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases)

(Seta, et al., 2002; Kim, et al., 2009). L‟Ang II est aussi capable de réguler l‟activité de

certains récepteurs de facteurs de croissance (PDGF, EGFR, IGFR) (Mehta and Griendling,

2007; Heeneman, et al., 2000; Shah and Catt, 2003; Folli, et al., 1997).

Le récepteur AT1 serait également capable d‟activer des voies n‟impliquant pas les

protéines G (figure 6). Par exemple, le récepteur AT1 peut lier l‟arrestine, une protéine

d‟échafaudage qui favorise la désensibilisation et l‟internalisation du récepteur via les puits

tapissés de clathrine (Gaborik, et al., 2001; Hunyady, et al., 2000). En inhibant une voie de

signalisation, l‟arrestine peut également en activer d‟autres. Par exemple, l‟arrestine permet la

formation des complexes pouvant activer la voie des MAP kinases (JNK3 et ERK1/2) (Wei,

et al., 2003; McDonald, et al., 2000; Wei, et al., 2004). En plus d‟activer les MAP kinases via

les arrestines (Wei, et al., 2003), il est aussi connu que le récepteur AT1 peut activer les MAP

kinases via la protéine kinase C (Tian, et al., 1998) et via la transactivation du récepteur à

l‟EGF (epidermal growth factor) (Shah, et al., 2004).

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FIGURE 6 : Les différentes voies de signalisation du récepteur AT1 : Récepteur AT1 de l‟Ang

II peut activer plus d‟une voie de signalisation en interagissant avec différents effecteurs.

Récepteur AT1 peut activer les voies de signalisation dépendante ou indépendante de la

protéine G.

Activation de la voie de MAPK/ERK par le récepteur AT1

Les voies de signalisation impliquant les MAP kinases contrôlent des processus

cellulaires importants tels que la croissance, la différenciation et la prolifération cellulaire. Ce

sont des protéines kinases qui catalysent la phosphorylation d‟autres protéines (enzymes,

facteurs de transcription) afin de les activer. L‟activation des MAP kinases se fait en cascade :

la protéine sérine/thréonine MAPK kinase kinase (Raf) phosphoryle MAPK kinase

(MEK1/2) et cette cascade de phosphorylation se poursuit par l‟activation des MAPK

(ERK1/2) (Rozengurt, 2007).

Comme déjà mentionné, le récepteur AT1 peut activer les ERK1/2, une des voies des

MAP kinases, de trois façons différentes : par une voie dépendante de la protéine Gq et

impliquant la protéine kinase C, par la transactivation du récepteur tyrosine kinase (EGFR) ou

par une voie indépendante de la protéine Gq et impliquant les arrestines.

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L‟activation des ERK1/2 passant par la voie de la protéine Gq met en jeu la PKC. Cette

dernière est responsable de la phosphorylation de cibles en amont de la cascade de

signalisation des ERK1/2. La PKC active une petite protéine G, la protéine Ras, qui interagit

avec la kinase Raf initiant l‟activation de la cascade de signalisation impliquant Raf, Mek1/2

et ERK1/2 (Tian, et al., 1998).

L‟activation de la voie des ERK1/2 n‟impliquant pas la protéine G passe par les

arrestines. Les arrestines favorisent le recrutement des complexes protéiques menant vers

l‟activation de MAP kinases (Wei, et al., 2003; Wei, et al., 2004).

L‟Ang II peut aussi activer les ERK1/2 via la transactivation du récepteur de l‟EGFR.

La transactivation de l‟EGFR est initiée par une augmentation du Ca2+

intracellulaire,

l‟activation de la PKC et de la kinase Src. Src active une métalloprotéinase (MMP) relâchant

le ligand EGF (epidermal growth factor) lié à l‟héparine (HB-EGF). La liaison du ligand EGF

entraîne un changement conformationnel de l‟EGFR et sa dimérisation. La dimérisation

favorise une autophosphorylation au niveau des résidus tyrosine dans la queue cytoplasmique

du récepteur. Cette phosphorylation crée des sites d‟ancrage pour d‟autres protéines

adaptatrices possédant les domaines SH2, et recrute ensuite le complexe Shc-Grb2-Sos. Ceci

permet l‟activation de la petite protéine G Ras menant à l‟activation des MAP kinases

impliquant Raf, Mek1/2 et ERK1/2 (Hunyady and Catt, 2006b; Mehta and Griendling, 2007).

La transactivation de l‟EGFR par le récepteur AT1 a été démontrée dans plusieurs tissus tels

que le foie, le rein, la prostate, le cœur et les cellules musculaires lisses vasculaires (Thomas,

et al., 2004).

Des études récentes montrent que l‟activation de ERK1/2 par la voie dépendante de la

protéine G (PKC) possède un profil cinétique très différent de l‟activation de ERK1/2 par la

voie indépendante de la protéine G (les arrestines) (Ahn, et al., 2004). L‟activation d‟ERK1/2

par la PKC est un phénomène rapide et transitoire favorisant la translocation des ERKs dans

le noyau et la transcription du gène c-Fos. Par contre l‟activation des ERKs par les arrestines

est un phénomène beaucoup plus lent et plus soutenu dans le temps et ERK activé reste dans

les compartiments cytosoliques (Wei, et al., 2003; Wei, et al., 2003; Ahn, et al., 2004; Ahn,

et al., 2004; Aplin, et al., 2007; Tohgo, et al., 2002).

Les conséquences moléculaires semblent aussi différer en fonction de la voie

d‟activation de ERK1/2. L‟activation des ERKs par les arrestines est associée aux phénotypes

cardioprotecteurs tels que la survie cellulaire (Ahn, et al., 2009b), la régulation de la

contraction cellulaire (Rajagopal, et al., 2006) et la migration (Hunton, et al., 2005). Dans les

études faites au niveau du cœur et de cardiomyocytes isolés, l‟activation de la voie des

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arrestines favorise la croissance et l‟hypertrophie (Zhai, et al., 2005), la prolifération des

cardiomyocytes (Aplin, et al., 2007; Hansen, et al., 2008), et une augmentation au niveau de

leur contractilité (Rajagopal, et al., 2006; Violin, et al., 2010). Dans les cellules musculaires

lisses vasculaires, la signalisation via les arrestines augmente la synthèse protéique en

interagissant avec la MAP kinase interacting kinase 1 (Mnk-1) (DeWire, et al., 2008) et

protège contre l‟apoptose par la phosphorylation de BAD (Ahn, et al., 2009)

Méthodes utilisés pour mesurer l‟activation de différentes voies de signalisation

Production des inositols phosphates

Nous avons mesuré l‟activation de la voie Gq/PLC/IP3/Ca2

par un immunoessai

compétitif IPone HTRF (homogeneous time resolved fluorescence) développé par la

compagnie Cisbio.Cet immunoessai mesure l‟accumulation de l‟IP1 en présence de LiCl qui

bloque la conversion de l‟IP1 en myoinositol. Le signal spécifique est généré entre l‟anticorps

dirigé contre l‟IP1 et l‟IP1 synthétique couplé à l‟accepteur fluorophore. Suite à la stimulation

du récepteur, l‟IP1 provenant de la dégradation de l‟IP3 rentre en compétition avec l‟IP1

synthétique pour la liaison à l‟anticorps ce qui produit une baisse du signal de fluorescence.

Donc, le transfert de l‟énergie est inversement proportionnel à la concentration de l‟IP1

produit suite à la stimulation du récepteur dans le lysat cellulaire.

Activation de la voie des ERKs

Afin de vérifier l‟état de l‟activation des ERK1/ 2, nous avons utilisé l‟essai Alpha

Screen Sure Fire (Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay). Dans cet essai, un

premier anticorps, reconnaissant la forme phosphorylée de ERK, est capturé par une bille

enrobée de protéine A (bille accepteuse). Un deuxième anticorps, reconnaissant ERK, est

biotinylé et capturé par une bille enrobée de streptavidine (bille donneuse). Les deux billes

sont à proximité seulement s‟il y a présence de ERK phosphorylé. Lorsque les deux billes

sont à proximité, l‟excitation de la bille donneuse par AlphaScreen libère le radical libre O2

qui excite la bille accepteuse, et cette dernière émet alors de la lumière. L‟activation de

ERK1/2 est proportionnelle à la quantité de la lumière émise par la bille accepteuse.

20

20

Recrutement de l‟arrestine et l‟activation de la voie G12

Afin de vérifier l‟activation de la voie G12 et le recrutement de l‟arrestine (β1-arrestine

et β2-arrestine), nous avons utilisé l‟essai BRET. L‟essai BRET est fondé sur le transfert

d‟énergie entre un donneur bioluminescent et un accepteur fluorescent. Pour qu‟il y ait un

transfert d‟énergie, le donneur et l‟accepteur doivent être situé à la proximité (10-100Å). La

méthode BRET utilise une luciférase RLuc dont le substrat est la coelenterazine. En présence

de l‟oxygène, la luciférase favorise la transformation du substrat coelenterazine en

coelenteramide en émettant une légère lumière visible dans le bleu (395nm). Lorsqu‟un

possible accepteur est situé à proximité de cette source lumineuse, la lumière bleu est captée

par l‟accepteur, dans ce cas la protéine GFP10. L‟excitation de cette dernière (GFP10)

entraîne l‟émission d‟une lumière verte à 510nm. L‟efficacité du transfert d‟énergie du

complexe Rluc à la GFP10 est déterminée par le rapport entre l‟intensité d‟émission de

l‟accepteur (lumière verte) sur l‟intensité d‟émission du donneur (lumière bleu). Pour le

recrutement des arrestines, nous avons utilisé la construction RLuc fusionné avec les

arrestines (β1 ou β2 arrestine) et la protéine GFP10 fusionnée avec le récepteur AT1. Pour

l‟activation de la voie G12, nous avons utilisé la construction de RLuc fusionnée avec la

protéine G12 et la protéine GFP10 fusionnée avec la sous-unité gamma de la protéine G

(Ggamma).

Calcul du biais de signalisation

Dans l‟objectif d‟identifier efficacement la signalisation biaisée de différents analogues

de l‟Ang II et de faciliter la compréhension des données, nous avons utilisé la méthode

proposée par le groupe de Kenakin nous permettant de calculer le biais de signalisation

(Kenakin, et al., 2012). Les ratios de transduction log(τ/Ka) ont été calculé en utilisant le

logiciel GraphPad Prism. Le ratio de transduction représente une estimation de l‟effet

(puissance et efficacité) d‟un analogue sur la conformation du récepteur et par la suite sur

l‟interaction du complexe ligand-récepteur avec les effecteurs intracellulaires. Afin d‟évaluer

le biais à l‟intérieur d‟une voie de signalisation donnée, il faut comparer le comportement

d‟un ligand avec le ligand de référence. L‟Ang II a été capable de produire une réponse

maximale ayant des puissances semblables pour toutes les voies de signalisation que nous

avons testées, et nous l‟avons choisi pour être notre ligand de référence. En comparant le

log(τ/Ka) du ligand de référence (Ang II) à la valeur du log(τ/Ka) de chaque analogue testé

pour une voie de signalisation, nous avons pu établir le biais à l‟intérieur d‟une voie de

21

21

signalisation donnée, soit le Δlog(τ/Ka). Afin d‟évaluer le biais entre les différentes voies de

signalisation pour chaque analogue, nous avons calculé le ΔΔlog(τ/Ka) et le facteur biaisé.

ΔΔ(τ/Ka) a été calculé en comparant la valeur du Δlog(τ/Ka) pour une voie de signalisation

versus la valeur du Δlog(τ/Ka) d‟une autre voie de signalisation. Le facteur biaisé représente

la base de 10 de la valeur calculée du ΔΔlog(τ/Ka).

Importance de la sélectivité fonctionnelle du récepteur AT1

Le récepteur AT1 fut un des premiers récepteurs pour lequel l‟importance de la

signalisation biaisée a été démontrée. Le récepteur AT1 joue un rôle important dans la

régulation de la pression sanguine et une suractivité peut mener à plusieurs pathologies telles

que l‟hypertension, la dysfonction rénale ainsi que l‟insuffisance cardiaque.

Les études de mutagénèse sur le récepteur AT1 montrent qu‟en bloquant sa capacité à

activer la protéine Gq, on n‟affecte pas sa phosphorylation, son internalisation, son

recrutement ainsi que sa signalisation via l‟arrestine (Wei, et al., 2003; Gaborik, et al., 2003).

Il a été démontré que l‟activation de la signalisation β-arrestine via le récepteur AT1 favorise

les effets cardioprotecteur et anti-apoptotique (Ahn, et al., 2009b; Rakesh, et al., 2010). Suite

à une délétion du récepteur AT1 ou des arrestines, le stress mécanique au niveau du cœur

induit l‟apoptose, suggérant que la signalisation via les β-arrestines par le récepteur AT1 est

cardioprotectrice (Rakesh, et al., 2010).

Les propriétés de l‟analogue [Sar1,Ile

4,Ile

8]Ang II (SII) qui active la voie des ERKs en

absence de production d‟inositol phosphate l‟ont fait reconnaître comme l‟un des premiers

ligands biaisés (Holloway, et al., 2002). D‟autres travaux montrent que SII améliore la

contractilité des cardiomyocytes chez la souris via la signalisation dépendante de la β-

arrestine et ceci en absence de la signalisation dépendante de la protéine Gq (Rajagopal, et al.,

2006). D‟autres expériences faites avec le SII montrent qu‟il cause une diminution de

l‟apoptose, qu‟il stimule la chimiotaxie, qu‟il augmente la contractilité cardiaque, la

croissance et la prolifération cellulaire (Aplin, et al., 2007; Ahn, et al., 2009b; Rajagopal, et

al., 2006; Hunton, et al., 2005; DeWire, et al., 2008). Il a également été suggéré que le ligand

biaisé SII et l‟Ang II stabilisent différentes conformations actives du récepteur AT1 (Sauliere,

et al., 2012).

Sadoshiwa et al ont généré des souris transgéniques qui surexpriment le récepteur AT1

de type sauvage et un mutant du récepteur AT1 incapable de coupler à la protéine Gq. Bien

que les deux groupes de souris aient développé une hypertrophie cardiaque suite à une

22

22

stimulation chronique par l‟Ang II, il y a eu moins d‟apoptose et de fibrose au niveau du

myocarde des souris exprimant le récepteur AT1 incapable de coupler à la protéine Gq (Zhai,

et al., 2005). Ceci porte à croire que ces deux aspects (fibrose et apoptose) impliqués dans la

progression de la maladie sont potentiellement reliés à l‟activité de la voie de signalisation

dépendante de la protéine Gq.

Les antagonistes du récepteur AT1 tel le losartan, utilisé couramment en clinique pour

traiter l‟hypertension, bloquent toutes les voies de signalisation en aval du récepteur. Par

contre, il serait intéressant de développer une nouvelle génération d‟antagonistes capables de

bloquer sélectivement une voie de signalisation et n‟influençant pas l‟activation des autres

voies de signalisation. Par ce fait même, on pourrait espérer développer des médicaments

pouvant contrôler sélectivement certains aspects de la fonction du récepteur où le contrôle de

la pression artérielle serait influencé indépendamment de la croissance pathologique des

cardiomyocytes ou des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC).

Problématique

Une connaissance approfondie de la structure moléculaire du récepteur, en particulier de

la topologie de la pochette de liaison ainsi que des changements structuraux associés à

l‟activation du récepteur est requise pour le développement de nouveaux outils

thérapeutiques. L‟élucidation de la pochette de liaison d‟un GPCR fournit des informations

importantes sur les mécanismes de reconnaissance moléculaire entre une hormone et son

récepteur. L‟interaction spécifique entre l‟hormone et son récepteur se fait au niveau de la

pochette de liaison. Les sept TM des GPCRs contribuent à former la pochette de liaison du

ligand. Il existe différentes approches biochimiques pour étudier la structure moléculaire d‟un

GPCR. Nous proposons d‟utiliser l‟approche SCAM (Substituted Cysteine Accessibility

Method) qui nous permettra de caractériser la pochette de liaison en identifiant les résidus de

chaque domaine transmembranaire impliqués dans sa formation. De plus, en utilisant le

mutant constitutivement actif N111G-AT1, l‟approche SCAM nous aidera à déterminer la

position relative de chaque domaine transmembranaire suite à l‟activation du récepteur. Ces

résultats seront utiles pour élaborer un modèle moléculaire de la pochette de liaison du

récepteur AT1 de l‟Ang II. Afin d‟améliorer ce modèle, nous allons étudier les différents

changements conformationels se produisant lors de l‟activation du récepteur. Au cours des

dernières années, il est devenu de plus en plus évident que le récepteur AT1 peut activer plus

23

23

d‟une voie de signalisation en interagissant avec différents effecteurs intracellulaires. Le

concept de sélectivité fonctionnelle suggère que différents ligands peuvent induire différentes

conformations du récepteur et ainsi favoriser l‟activation ou l‟inhibition de certaines voies de

signalisation. Nous proposons donc de tester les propriétés fonctionnelles d‟une série

d‟analogues de l‟Ang II possédant des structures chimiques différentes et possiblement des

propriétés pharmacologiques distinctes. Ces ligands nous donneront l‟information par rapport

à la sélectivité fonctionnelle en identifiant les voies de signalisation préférentiellement

activées ou inhibées par ces derniers. Les données obtenues serviront à améliorer notre

modèle moléculaire du récepteur AT1.

Objectifs

1ère

et 2ième

publication

1. Déterminer la pochette de liaison du récepteur AT1 avec l‟approche de SCAM

2. Identifier les résidus du TM2 et du TM5 qui participent dans la formation de la pochette de

liaison du récepteur AT1 et de son mutant constitutivement actif AT1-N111G

3. Déterminer le type de mouvement qui se produit lorsque le récepteur passe de la forme

inactive vers la forme active

3ième

publication

1.Étudier la sélectivité fonctionnelle de différents ligands analogues de l‟Ang II

2. Évaluer la puissance (EC50) et l‟efficacité (Emax) des différents analogues de l‟Ang II à

activer sélectivement une voie de signalisation.

1. Gq/PLC

2. G12

3. Le recrutement des arrestines

4. La voie de MAP kinases (PKC-ERK et EGFR-ERK)

24

24

ARTICLE 1

The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor participates in

the formation of the ligand binding pocket and undergoes integral pivoting movement during

the process of receptor activation

Ivana Domazet, Brian J. Holleran, Stéphane S. Martin, Pierre Lavigne, Richard Leduc,

Emanuel Escher and Gaétan Guillemette.

J. Biol. Chem, 284: 11922-11929 (2009).

Statut de l’article: publié dans Journal of Biological Chemistry .

Référence : Domazet I., Holleran B.J., Martin S.S, Lavigne P., Leduc R., Escher E. &

Guillemette G. (2009). The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II

receptor participates in the formation of the ligand binding pocket and undergoes integral

pivoting movement during the process of receptor activation. J. Biol. Chem. 284 (18): 11922-

9.

Avant-propos: J‟ai dirigé cette étude et produit toutes les manipulations de ce manuscrit. J‟ai

rédigé la première version de ce manuscrit.

25

25

Résumé : L‟angiotensine II, une hormone jouant un rôle important dans l‟homéostasie

cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT1 qui appartient à

la grande famille des GPCRs. Comme tous les autres GPCRs, le récepteur AT1 possède sept

domaines transmembranaires (TM) qui contribuent à former la pochette de liaison du ligand.

Afin d‟identifier les acides aminés du TM2 impliqués dans la formation de la pochette de

liaison du récepteur AT1, nous avons utilisé l‟approche SCAM (Substituted Cysteine

Accessibility Method) qui consiste à évaluer les propriétés de liaison du récepteur suite à sa

réaction avec le methanethiosulfonate (MTSEA). Le MTSEA alkyle les cystéines endogènes

ou introduites par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement stérique qui interfèrera

avec la liaison du ligand. Une série de mutants ont été produits en remplaçant successivement

par une cystéine les résidus 70 à 94 du TM2 du récepteur AT1 et de son mutant

constitutivement actif AT1-N111G. Après le prétraitement avec le MTSEA, les mutants

D74C, L81C, L83C, A85C, A89C ont montré une diminution significative d‟affinité pour le

ligand 125

ISar1, Ile

8AngII, suggérant que ces résidus sont orientés dans la pochette de liaison

du récepteur AT1. Des résultats différents ont été obtenus dans le cas du récepteur N111G-

AT1. Le mutant D74C-N111G est devenu insensible au MTSEA, alors que la sensibilité de

L81C-N111G fut grandement diminuée. Par contre, le mutant V86C-N111G s‟est avéré

sensible au MTSEA. Ces résultats suggèrent que l‟activation constitutive du récepteur AT1

implique un mouvement de pivot du TM2, favorisant le rapprochement du haut du TM2 vers

la pochette de liaison.

26

26

The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor participates in

the formation of the ligand binding-pocket and undergoes integral pivoting movement during

the process of receptor activation

Ivana Domazet, Brian J. Holleran, Stéphane S. Martin, Pierre Lavigne, Richard Leduc,

Emanuel Escher, and Gaétan Guillemette

Department of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de

Sherbrooke, Sherbrooke,

Quebec, Canada, J1H 5N4

Running title: SCAM method to study the ligand-binding pocket of the hAT1 receptor

Corresponding author: Gaétan Guillemette, Ph.D., Department of Pharmacology, Faculty of

Medicine, Université de Sherbrooke, 3001 12th Avenue North, Sherbrooke, Quebec, Canada,

J1H 5N4, Tel.: (819) 564-5347, Fax: (819) 564-5400, E-mail:

[email protected]

mailto:[email protected]

27

27

The octapeptide hormone angiotensin II (AngII) exerts a wide variety of cardiovascular

effects through the activation of the angiotensin II type-1 (AT1) receptor, which belongs to the

G protein-coupled receptor superfamily. Like other G protein-coupled receptors, the AT1

receptor possesses seven transmembrane domains that provide structural support for the

formation of the ligand-binding pocket. In order to identify those residues in the second

transmembrane domain (TMD2) that contribute to the formation of the binding pocket of the

AT1 receptor, we used the substituted cysteine accessibility method. All the residues within

the Leu-70 to Trp-94 region were mutated one at a time to a cysteine, and, after expression in

COS-7 cells, the mutant receptors were treated with the sulfhydryl-specific alkylating agent

methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA). MTSEA reacts selectively with water-

accessible, free sulfhydryl groups of endogenous or introduced point mutation cysteines. If a

cysteine is found in the binding pocket, the covalent modification will affect the binding

kinetics of the ligand. MTSEA substantially decreased the binding affinity of D74C-AT1,

L81C-AT1, A85C-AT1, T88C-AT1, and A89C-AT1 mutant receptors, which suggests that

these residues orient themselves within the water-accessible binding pocket of the AT1

receptor. Interestingly, this pattern of acquired MTSEA sensitivity was altered for TMD2

reporter cysteines engineered in a constitutively active N111G-AT1 receptor background.

Indeed, mutant D74C-N111G-AT1 became insensitive to MTSEA, whereas mutant L81C-

N111G-AT1 lost some sensitivity and mutant V86C-N111G-AT1 became sensitive to

MTSEA. Our results suggest that constitutive activation of the AT1 receptor causes TMD2 to

pivot, bringing the top of TMD2 closer to the binding pocket and pushing the bottom of

TMD2 away from the binding pocket.

Introduction

The octapeptide hormone angiotensin II (AngII)6 is the active component of the renin-

angiotensin system. It exerts a wide variety of physiological effects, including vascular

contraction, aldosterone secretion, neuronal activation, and cardiovascular cell growth and

proliferation (1). Virtually all the known physiological effects of AngII are produced through

the activation of the AT1 receptor, which belongs to the G protein-coupled receptor (GPCR)

superfamily (2, 3). GPCRs possess seven transmembrane domains (TMDs), which provide

structural support for signal transduction. The AT1 receptor interacts with the G protein Gq/11,

which activates a phospholipase C, which in turn generates inositol 1,4,5-trisphosphate and

diacylglycerol from the cleavage of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (4, 5). Inositol

28

28

1,4,5-trisphosphate causes the release of Ca2+

from an intracellular store whereas

diacylglycerol activates protein kinase C.

Like other GPCRs, the AT1 receptor undergoes spontaneous isomerization between its

inactive state (favored in the absence of agonist) and its active state (induced or stabilized by

the agonist) (6). Movement of TMD helices through translational or rotational displacement is

believed to be essential to achieve the active state (7, 8). It has been proposed that TMD3,

TMD5, TMD6, and TMD7 may participate in the activation process of the AT1 receptor by

providing a network of interactions through the AngII-binding pocket (9). The dynamics of

this network are thought to be modified following agonist binding, thereby forcing the

receptor to form new interactions between the TMDs.

Based on homology with the high resolution structure of rhodopsin, the archetypal

GPCR (10), it was expected that the binding site of the AT1 receptor would involve the seven

mostly hydrophobic TMDs and would be accessible to charged water-soluble ligands, like

AngII. For this receptor, the binding site would thus be contained within a water-accessible

crevice, the binding pocket, extending from the extracellular surface of the receptor to the

transmembrane portion. Using a photoaffinity labeling approach, we directly identified

ligand-contact points within the second extracellular loop and the seventh TMD of the AT1

receptor (11-13). Interestingly, numerous mutagenesis studies have provided the basis for a

model in which an interaction between Asn-111 in TMD3 and Tyr-292 in TMD7 maintains

the AT1 receptor in the inactive conformation. The agonist AngII would disrupt this

interaction and promote the active conformational state (14). In support of this model, it was

further shown that substitution of Asn-111 for a residue of smaller size (Ala or Gly) confers

constitutive activity on the AT1 receptor (15-17).

The substituted cysteine accessibility method (SCAM) (18-20) is an ingenious approach

for systematically identifying the residues in a TMD that contribute to the binding site pocket

of a GPCR. Consecutive residues within TMDs are mutated to cysteine, one at a time, and the

mutant receptors are expressed in heterologous cells. If ligand binding to a cysteine-

substituted mutant is unchanged compared with wild-type receptor, it is assumed that the

structure of the mutant receptor, especially around the binding site, is similar to that of the

wild-type and therefore that the substituted cysteine lies in a similar orientation to that of the

wild-type residue. In TMDs, the sulfhydryl of a cysteine oriented toward the binding site

pocket should react faster with a positively charged sulfhydryl reagent like

methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA) than sulfhydryls facing the interior of the

protein or the lipid bilayer. Two criteria are used for identifying engineered cysteines on the

29

29

surface of the binding-site pocket: (i) the reaction with MTSEA alters binding irreversibly and

(ii) the reaction is retarded by the presence of ligand. We previously used this approach to

identify the residues in TMD3, TMD6, and TMD7 that form the surface of the binding site

pocket in the wild-type AT1 receptor and in the constitutively active N111G-AT1 receptor

(21-23). Here we report the application of SCAM to probe TMD2 in the wild-type and

constitutively active receptors.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Materials –Bovine serum albumin, bacitracin, and soybean trypsin inhibitor were from

Sigma. The sulfhydryl-specific alkylating reagent MTSEA (CH3SO2-SCH2CH2NH3+) was

purchased from Toronto Research Chemicals, Inc. (Toronto, Canada). The cDNA clone for

the human AT1 receptor subcloned in the mammalian expression vector pcDNA3 was kindly

provided by Dr. Sylvain Meloche (Université de Montréal). LipofectAmine2000

and culture

media were obtained from Invitrogen. 125

I-[Sar1, Ile

8]AngII (specific radioactivity ~1500

Ci/mmol) was prepared with Iodo-GEN

(Perbio Science, Erembodegem, Belgium)

according to the method of Fraker and Speck (24)and as previously reported (25).

Numbering of Residues in TMD2 -Residues in TMD2 of the human AT1 receptor were

given two numbering schemes. First, residues were numbered according to their positions in

the human AT1 receptor sequence. Second, residues were also indexed according to their

position relative to the most conserved residue in the TMD in which it is located (26). By

definition, the most conserved residue was assigned the position index ″50″ (e.g. in TMD2,

Asp74 is the most conserved residue and was designated Asp-74(2.50)

, whereas the upstream

residue was designated Leu-75(2.51)

and the downstream residue, Ala-73(2.49)

. This indexing

simplified the identification of aligned residues in different GPCRs.

Oligodeoxynucleotide Site-directed Mutagenesis -Site-directed mutagenesis was

performed on the wild-type AT1 receptor with the overlap PCR method (Expand High

Fidelity PCR System; Roche Applied Science). Briefly, forward and reverse oligonucleotides

were constructed to introduce cysteine mutations between Leu-70(2.46)

and Trp-94(2.70)

. PCR

products were subcloned into the HindIII-XbaI sites of the mammalian expression vector

pcDNA3.1. Site-directed mutations were then confirmed by automated DNA sequencing by

aligning the AT1 sequence with multiAlin (26).

Cell Culture and Transfection -COS-7 cells were grown in Dulbecco‟s modified

Eagle‟s medium (DMEM) containing 2 mM L-glutamine and 10% (v/v) fetal bovine serum.

30

30

The cells were seeded into 100-mm culture dishes at a density of 2 x 106 cells/dish. When the

cells reached ~90% confluence, they were transfected with 4 g of plasmid DNA and 15 l of

lipofectAmine2000

. After 24 h, transfected cells were trypsinized, distributed into 12-well

plates, and grown for an additional 24 h in complete DMEM containing 100 IU/ml penicillin

and 100 g/ml streptomycin before the MTSEA treatment and binding assay.

Binding Experiments -COS-7 cells were grown for 36 h post-transfection in 100-mm

culture dishes, washed once with phosphate-buffered saline (PBS), and subjected to one

freeze-thaw cycle. Broken cells were then gently scraped into washing buffer (25 mM Tris-

HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2), centrifuged at 2500 X g for 15 min at 4 oC, and

resuspended in binding buffer (25 mм Tris-HCl, pH 7.4, 100 mм NaCl, 5 mм MgCl2, 0.1%

bovine serum albumin, 0.01% bacitracin, 0.01% soybean trypsin inhibitor). Saturation

binding experiments were done by incubating broken cells (20-40 g of protein) for 1 h at

room temperature with increasing concentrations of 125

I-[Sar1,Ile

8]AngII in a final volume of

500 µl. Nonspecific binding was determined in the presence of 1 µм unlabeled

[Sar1,Ile

8]AngII. Bound radioactivity was separated from free ligand by filtration through

GF/C filters presoaked for at least 3 h in binding buffer. Receptor-bound radioactivity was

evaluated by -counting.

Treatment with MTSEA -MTSEA treatment was performed according to the procedure

of Javitch et al. (18), with minor modifications. Two days after transfection, the cells, which

were grown in 12-well plates, were washed with PBS and incubated for 3 min at room

temperature with freshly prepared MTSEA at the desired concentrations (typically from 0.5 to

6 mм) in a final volume of 0.2 ml. The reaction was stopped by washing the cells with ice-

cold PBS. Intact cells were then incubated in binding medium (DMEM, 25 mм HEPES, 0.1%

bovine serum albumin, pH 7.4) containing 0.05 nм 125

I-[Sar1,Ile

8]AngII for 90 min at room

temperature. After washing with ice-cold PBS, the cells were lysed with 0.1 ɴ NaOH, and the

radioactivity was evaluated by -counting. The percentage of fractional binding inhibition was

calculated as (1- (specific binding after the MTSEA treatment/specific binding without the

treatment)) × 100.

TABLE1

Binding Properties of [Sar1, Ile

8]AngII to cysteine-substitued hAT1 mutant receptors

Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described under the

″Experimental Procedure". Binding affinities (Kd) and maximal binding capacities (Bmax) are

expressed as the means ± S.D. of values obtained in n independent experiments performed in

31

31

duplicate. Mutants P82C, W84C, Y87C, Y92C, and W94C did not demonstrate any

detectable binding.

Kd (nM) Bmax (fmol/mg) n

WT (Cys76

) 0.6 ± 0.3 4282 ± 903 11

L70C 0.7 ± 0.2 1428 ± 796 4

A71C 0.9 ± 0.3 2729 ± 523 3

L72C 0.4 ± 0.2 1923 ± 549 4

A73C 0.4 ± 0.1 1814 ± 309 3

D74C 1.2 ± 0.7 1141 ± 320 4

L75C 0.9 ± 0.4 1405 ± 232 3

F77C 3.1 ± 0.6 2256 ± 478 3

L78C 0.4 ± 0.1 1412 ± 300 3

L79C 0.5 ± 0.2 1833 ± 1020 3

T80C 0.3 ± 0.0 1918 ± 711 3

L81C 4.0 ± 1.3 2415 ± 872 3

L83C 1.8 ± 0.2 1288 ± 691 3

A85C 0.9 ± 0.3 1074 ± 405 4

V86C 0.6 ± 0.3 1709 ± 140 3

T88C 3.2 ± 1.9 5633 ± 72 3

A89C 0.5 ± 0.1 1061 ± 451 3

M90C 1.6 ± 1.0 490 ± 20 3

E91C 2.1 ± 0.6 1622 ± 950 3

R93C 0.8 ± 0.3 1152 ± 67 3

32

32

FIGURE 1. Schematic representation of the human AT1 receptor. The numbers indicate

the positions of cysteines and other residues in the receptor. The gray closed circles represent

cysteine residues that are thought to be linked via disulfide bridges, and the black closed

circles represent cysteine residues whose side chains do not form a disulfide bridge. Mutated

TMD2 residues are located between Leu70

and Trp94

inclusively. Potential N-glycosylation

sites (Asn4, Asn

176, and Asn

18) are indicated. Asn

111 in TMD3 is also shown in gray.

Protection against MTSEA reaction by [Sar1,Ile

8]AngII –Transfected cells grown in

12-well plates were washed once with PBS and incubated in the presence or absence of 100

nм [Sar1,Ile

8]AngII for 1 h at 16

oC (to avoid internalization of receptors). The cells were

washed to remove excess ligand and then treated with MTSEA. The cells were washed three

times with ice-cold PBS and once with an acidic buffer (150 mм NaCl, 50 mм acetic acid, pH

3.0) to dissociate bound ligand. They were then incubated for 3 h at 16oC in binding medium

(DMEM, 25 mм HEPES, 0.1% bovine serum albumin, pH 7.4) containing 0.05 nм 125

I-[Sar1,

Ile8]AngII. The percentage of protection was calculated as ((inhibition in the absence of [Sar

1,

Ile8]AngII) - (inhibition in the presence of [Sar

1,Ile

8]AngII)/(inhibition in the absence of [Sar

1,

Ile8]AngII)) ×100.

Phospholipase C assay- Inositol phosphates accumulation was determined as

described previously (27). In brief, COS-7 cells were seeded in 6-well plates, transfected, and

33

33

labeled for 16 h in serum-free M199 containing 10 Ci/ml [myo-3H]inositol (MP

Biomedicals, Solon, OH). Cells were washed twice with PBS plus 0.1% (w/v) dextrose and

then incubated in stimulation buffer (DMEM containing 25mм HEPES, 10mм LiCl, and 0.1%

bovine serum albumin, pH 7.4) for 30 min at 37°C. Incubations were terminated by the

addition of ice-cold perchloric acid (final concentration, 5% (v/v)). Water-soluble inositol

phosphates were then extracted with an equal volume of a 1:1 (v/v) mixture of 1,1,2-

trichlorotrifluoroethane and tri-N-octylamine. The samples were mixed vigorously and

centrifuged at 2500 × g for 30 min. The upper phase containing inositol phosphates was

applied to an AG1-X8 resin column (Bio-Rad). Inositol phosphates were eluted sequentially

by the addition of an ammonium formate/formic acid solution of increasing ionic strength.

Fractions containing inositol phosphates were collected and measured in a liquid scintillation

counter.

Data analysis -Results are presented as means ± SD. Specific binding data (Bmax and

Kd) were analyzed with Prism version 4.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego CA),

using a one-site binding hyperbola nonlinear regression analysis.

FIGURE 2. MTSEA treatment of the wild-type AT1 receptor and sensitive reporter

cysteine-bearing mutant receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type,

D74C, L81C, A85C, T88C, or A89C AT1 receptors were incubated for 3 min at room

temperature with increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mм). The

intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nм 125

I-[Sar1,Ile

8]

AngII, and their binding properties were evaluated as indicated in "Experimental Procedures."

Each curve represents the means ± S.D. of data obtained from at least three independent

experiments.

34

34

FIGURE 3. Effects of MTSEA on different mutant AT1 receptors bearing a reporter

cysteine in TMD2. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type or mutant AT1

receptors were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mм

MTSEA (A) or 2 mм MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room

temperature with 0.05 nм 125

I-[Sar1,Ile

8]AngII. The percentage of binding inhibition was

calculated as indicated in ″Experimental Procedures.″ The vertical line represents an arbitrary

threshold used to identify cysteine-sensitive mutants and was set at a value corresponding to

binding inhibition 20% greater than the value for the wild-type AT1 receptor. The white bars

indicate mutant receptors for which binding activities were not appreciably reduced compared

to the wild-type receptor after treatment with MTSEA. The gray and black bars indicate

mutant receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or strongly reduced

(black) after treatment with MTSEA. Each bar represents the means ± SD of data from at

least three independent experiments.

RESULTS

Binding Properties of Mutant Receptors Bearing Cysteines in TMD2 -To identify the

residues in TMD2 that face the binding site pocket of the AT1 receptor, we mutated 24

35

35

consecutive residues between Leu-70(2.47)

and Trp-94(2.70)

to cysteine, one at a time. Each

mutant receptor was transiently expressed in COS-7 cells. To assess the conservation of the

global conformation of these receptors after the substitution, pharmacological parameters

describing the equilibrium binding of the radiolabeled competitive ligand 125

I-[Sar1,Ile

8]

AngII such as Kd and Bmax were determined (Table 1). All mutant AT1 receptors exhibited

high binding affinity for 125

I-[Sar1,Ile

8]AngII (similar to that of the wild-type AT1 receptor)

except for mutants P82C(2.58)

, W84C(2.60)

, Y87C(2.63)

, Y92C(2.68)

, and W94C(2.70)

, which did not

demonstrate any detectable binding activity and were not used for the SCAM analysis. Bmax

values for all detectable receptors ranged from 490 to 4282 fmol/mg of protein.

Effect of Extracellularly Added MTSEA on the Binding Properties of Mutant

Receptors -To verify whether the reporter cysteines introduced into the TMD2 of the AT1

receptor were oriented toward the binding pocket, mutant receptors were treated with

concentrations of MTSEA varying between 0.5 and 6 mм. We also verified whether the wild-

type AT1 receptor, which contains 10 endogenous cysteines (Fig. 1) was sensitive to MTSEA

treatment. Fig. 2 shows that various concentrations of MTSEA had very little effect (no more

than a 25% reduction) on the binding properties of the wild-type AT1 receptor, indicating that

the endogenous cysteines made a relatively small contribution to the binding site pocket. A 3-

min treatment with 0.5 mм MTSEA (Fig. 3A) strongly inhibited the binding properties of

mutants L81C(2.57)

-AT1 (binding inhibition of 65%), A85C(2.61)

-AT1 (binding inhibition of

71%), and T88C(2.64)

-AT1 (binding inhibition of 75%), whereas it had only a minor effect on

the binding properties of the other mutant receptors. At higher MTSEA concentrations (2 mм

and above), the binding properties of mutant receptors D74C(2.50)

-AT1 and A89C(2.65)

-AT1

were also slightly affected (Fig. 3B). Overall, the most reactive cysteines were those

substituted for L81C(2.57)

, A85C(2.61)

and T88C(2.64)

, whereas the cysteine substituted for

D74C(2.50)

and A89C (2.65)

were less reactive.

Altered Accessibility to TMD2 Reporter Cysteines in the Constitutively Active N111G-

AT1 Receptor -We made use of the constitutively active N111G-AT1 receptor to assess and

map the potentially altered accessibility of MTSEA to the engineered cysteines. We first

determined the pharmacological properties of the 24 cysteine-substituted mutant receptors.

Within the N111G-AT1 receptor background, 18 cysteine-substituted mutants conserved a

high binding affinity for the competitive ligand 125

I-[Sar1,Ile

8]AngII (Table 2). The mutant

receptors P82C(2.58)

-N111G-AT1, L83C(2.59)

-N111G-AT1, W84C(2.60)

-N111G-AT1, Y87C(2.63)

-

N111G-AT1, Y92C(2.68))

-N111G-AT1, and W94C(2.70)

-N111G-AT1 did not have any

36

36

detectable binding activity and were not used for the SCAM analysis. Bmax values for all

detectable receptors ranged from 570 to 3967 fmol/mg of protein (Table 2).

TABLE 2

Binding Properties of [Sar1,Ile

8]AngII to cysteine-substitued hAT1 mutant receptors

bearing the N111G mutation

Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described under

″Experimental Procedure.″ Binding affinities (Kd) and maximal binding capacities (Bmax) are

expressed as the means ± SD of values obtained in n independent experiments performed in

duplicate. Mutants P82C-N111G, L83C-N111G, W84C-N111G, Y87C-N111G, Y92C-

N111G and W94C-N111G did not demonstrate any detectable binding.

Kd (nM) Bmax (Fmol/mg) n

N111G 0.8 ± 0.2 3003 ± 885 10

L70C 3.6 ± 1.6 3087 ± 235 3

A71C 1.3 ± 0.2 2787 ± 777 3

L72C 0.9 ± 0.6 2688 ± 877 3

A73C 0.6 ± 0.1 3967 ± 1516 4

D74C 1.8 ± 0.1 1781 ± 775 3

L75C 0.6 ± 0.0 2336 ± 689 3

F77C 0.7 ± 0.0 3004 ± 213 3

L78C 0.6 ± 0.1 1645 ± 704 3

L79C 0.5 ± 0.0 1868 ± 280 3

T80C 0.4 ± 0.0 3395 ± 456 3

L81C 1.7 ± 0.2 1780 ± 252 3

A85C 0.9 ± 0.1 622 ± 429 3

V86C 2.6 ± 0.6 570 ± 202 3

T88C 0.7 ± 0.1 819 ± 608 3

A89C 1.0 ± 0.4 1019 ± 854 3

M90C 2.9 ± 1.0 980 ± 492 3

E91C 2.1 ± 0.6 1622 ± 950 3

R93C 1.2 ± 0.5 1175 ± 75 3

37

37

FIGURE 4. MTSEA treatment of the N111G-AT1 receptor and sensitive reporter

cysteine-bearing mutant N111G-AT1 receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing

the N111G-AT1, L81C-N111G-AT1, A85C-N111G-AT1, V86C-N111G-AT1, T88C-N111G-

AT1, or A89C-N111G-AT1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with

increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mм). The intact cells were

then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nм125

I-[Sar1,Ile

8]AngII, and their

binding properties were evaluated as indicated under ″Experimental Procedures.″ Each curve

represents the means ± S.D. of data from at least three independent experiments.

Figure 4 (see also Fig. 2) shows that, like the wild-type receptor, the N111G-AT1 receptor

was relatively insensitive to a 3-min treatment with MTSEA concentrations ranging from 0.5

to 2 mм, again indicating the relatively low contribution of the endogenous cysteines to the

binding site pocket. Cysteine-substituted N111G-AT1 receptor mutants were also treated with

increasing concentrations of MTSEA, and their binding properties were assessed with 125

I-

[Sar1,Ile

8]AngII. Fig. 5 summarizes the effect of the MTSEA treatment on the different

cysteine-substituted N111G-AT1 receptor mutants. As observed in the wild-type background,

0.5 mм MTSEA decreased the binding activity of the A85C(2.61)

–N111G –AT1 and

T88C(2.64)

–N111G–AT1 by 78 and 82 % respectively. It is noteworthy that the V86C(2.62)

–

N111G–AT1 mutant, which was insensitive to MTSEA in the wild-type background, had

reduced binding activity by 47% in the N111G-AT1 background after a treatment with 0.5

mM MTSEA. On the other hand, L81C(2.57)

–N111G–AT1 which exhibited a significant

reduction in binding activity in the wild-type background, became less sensitive to MTSEA in

the N111G-AT1 background (reduction of 39% in binding activity after a treatment with 2

38

38

mM MTSEA) and that D74C(2.50)

–N111G–AT1 became completely insensitive to treatment

with MTSEA.

Protection against MTSEA Reaction by a Pretreatment with [Sar1,Ile

8]AngII –To

confirm that reporter cysteines accessible to MTSEA are located within the binding pocket,

receptor mutants were saturated with the competitive ligand [Sar1,Ile

8]AngII prior to the

MTSEA treatment. The cells were then washed with an acid buffer to dissociate the bound

ligand. The receptors were then assayed for binding with the radiolabeled competitive ligand.

Fig. 6 shows how a preincubation with the competitive ligand [Sar1,Ile

8]AngII protected

mutant receptors D74C(2.50)

-AT1, L81C(2.57)

-AT1, A85C(2.61)

-AT1, T88C(2.64)

-AT1, A89C(2.65)

-

AT1, L81C(2.57)

-N111G-AT1, A85C(2.61)

-N111G-AT1, V86C(2.62)

-N111G-AT1, T88C(2.64)

-

N111G-AT1, and A89C(2.65)

-N111G-AT1 from the inhibitory effect of MTSEA, with

protection levels ranging from 59 to 91%.

Functional Properties of Wild-type and Mutant AT1 receptors-The functional

properties of wild-type and mutant AT1 receptors were evaluated by measuring phospholipase

C activity in transiently transfected COS-7 cells. Fig. 7 shows the relative amounts of inositol

phosphates accumulated under basal conditions. Cells expressing cysteine mutant receptors in

the wild-type background produced inositol phosphates at levels that were not significantly

different from that produced by cells expressing the wild-type AT1 receptor. The basal level

of inositol phosphates found in cells expressing cysteine mutant receptors in the N111G

background was at least 3-fold higher than that found in cells expressing the wild-type AT1

receptor, thereby confirming the constitutive activity of all receptors bearing both cysteine

and N111G mutations. These results show that cysteine mutations within TMD2 do not

compromise the functional integrity of either the ground state AT1 receptor or the

constitutively active N111G-AT1 receptor.

DISCUSSION

The rationale of this study, which relied on SCAM analysis, was to gain an insight into

the orientation of TMD2 of the AT1 receptor by identifying the residues accessible to MTSEA

within the binding site pocket. Mapping these residues in the ground state receptor and the

constitutively active N111G background allowed us to measure relative changes in the

position of certain residues, thus providing valuable information with which to infer a

structural change underlying AT1 receptor activation. It is important to mention that our

approach of systematically substituting each residue within TMD2 for a cysteine did not alter

39

39

the functional properties of either the ground state AT1 receptor or the constitutively active

N111G-AT1 receptor (Fig.7).

FIGURE 5. Effect of MTSEA on different mutant N111G-AT1 receptors bearing a

reporter cysteine in TMD2. Intact COS-7 cells transiently expressing the mutant N111G-

AT1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mм

MTSEA (A) or 2 mм MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room

temperature with 0.05 nм 125

I-[Sar1,Ile


calculated as indicated under ″Experimental Procedures.″ The vertical line represents an

arbitrary threshold used to identify cysteine-sensitive mutants. It was set at a value

corresponding to binding inhibition 20% greater than the value for the N111G-AT1 receptor.

The white bars indicate mutant receptors for which binding activities were not appreciably

reduced compared to that of the N111G-AT1 receptor after treatment with MTSEA. The gray

and black bars indicate mutant receptors for which binding activities were slightly reduced

(gray) or strongly reduced (black) after treatment with MTSEA. Each bar represents the

means ± SD of data from at least three independent experiments.

40

40

FIGURE 6. [Sar1,Ile

8]AngII protection of MTSEA-sensitive mutant receptors. Intact

COS-7 cells transiently expressing MTSEA-sensitive mutant AT1 receptors were

preincubated for 1 h at 16oC in the absence or presence of 100 nм [Sar

1,Ile

8]AngII. The cells

were then incubated for 3 min at 16oC in the continued absence or presence of

[Sar1,Ile

8]AngII with optimal MTSEA concentrations to achieve maximal binding inhibition

of each receptor. The MTSEA concentrations were as follows: 0.5 mм for L81C-AT1, A85C-

AT1, T88C-AT1, A85C-N111G-AT1, V86C-N111G-AT1, and T88C-N111G-AT1; 2 mм for

D74C-AT1, A89C-AT1, L81C-N111G-AT1, and A89C-N111G-AT1. The cells were then

washed with ice-cold PBS and incubated for 3 h at 16oC with 0.05 nм

125I-[Sar

1,Ile

8]AngII.

Protection was calculated as described under ″Experimental Procedures.″ Each bar represents

the means ± S.D. of data from at least three independent experiments.

As previously reported, the insensitivity of the wild-type receptor to MTSEA suggests either

that endogenous cysteines are not alkylated by MTSEA or that their alkylation does not affect

the binding of the ligand (23). Our methodological approach of adding the MTSEA reagent to

whole adherent cells expressing the AT1 receptor essentially exposed only the extracellular

ligand-accessible side of the receptor to MTSEA. Interestingly, most of the MTSEA-

accessible residues that we identified with the SCAM approach lie in the middle (D74C(2.50)

,

L81C(2.57)

) to the top portion of TMD2 (A85C(2.61)

, T88C(2.64)

, A89C(2.65)

) (Fig.8). These

results imply that the residues involved in the interaction with the ligand are mostly located

within this interface. Thus, residue Ala-89(2.65)

would delineate the top of the binding pocket,

whereas residue Asp-74(2.50)

would delineate the bottom of the water-accessible binding

pocket of the receptor. Along with these residues, three other residues, Leu-81 (2.57)

, Ala-

41

41

85(2.61)

, and Thr-88(2.64)

, would lie on the same α-helix face in the ground state of the receptor,

with great exposure to a potential hydrophilic pocket (see Fig.8). By a mechanism that could

be steric, electrostatic, or indirect, the alkylation of these residues with MTSEA would

hamper the binding of the ligand. It is very likely that these two subsets of residues do not

interact with the same portion of the ligand. Furthermore, it is assumed that water-accessible

residues are in the binding site pocket if a competitive ligand protects them from the effect of

MTSEA. The competitive ligand [Sar1,Ile

8]AngII protected all the residues tested, thus

supporting the notion that these specific residues within TMD2 are located in the binding

pocket. Although the mutant L83C-AT1 did show sensitivity (Fig. 3B), we did not consider

residue Leu-83(2.59)

to be in the binding pocket, because 1) it is not on the same helical face as

the other MTSEA-sensitive residues 2) in the constitutively active background, the mutant

L83C(2.59)

-N111G-AT1 did not show any binding activity. These results suggest that residue

Leu-83(2.59)

is important to maintain the global conformation of the receptor.

Our finding that residues Asp-74(2.50)

, Leu-81(2.57)

, Ala-85(2.61)

, Val-86(2.62)

, Thr-88(2.64)

,

and Ala-89(2.65)

are located in the binding pocket of the AT1 receptor is in accordance with the

current models proposed for bovine rhodopsin (10), squid rhodopsin (28), the opsin receptor

(29), and dopamine D2 receptor (30). Indeed, residue Thr-94(2.61)

is thought to be one of the

contact points with retinal in the crystal structure of bovine rhodopsin (10) whereas residue

Asn-87(2.57)

is one of the contact points with retinal in the crystal structure of squid rhodopsin

(28). Also, the SCAM approach was used to show that residues Asp-80 (2.50)

, Val-87(2.57)

, Val-

91(2.61)

, Val-92(2.62)

, Leu-94(2.64)

, and Glu-95(2.65)

are located in the binding pocket of dopamine

D2 receptor (30).

42

42

FIGURE 7. Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild type and

mutant AT1 receptors. Transfected COS-7 cells were preloaded for 16-24 h with 10 Ci/ml

[myo-3H]inositol. Inositol phosphates (sum of inositol bisphosphate, inositol trisohosphate,

and inositol tetrakisphosphate) accumulated within a period of 30 min were determined as

described under ″Experimental Procedures.″ These results represent the mean ± S.D. values

from three independent experiments (done in triplicate), where inositol phosphates production

was normalized for incorporation of [myo- 3

H]inositol into phospholipids and for receptor

expression level (determined by saturation binding assays).

43

43

FIGURE 8. Helical wheel representation of TMD2 reporter cysteines and their pattern

of reactivity to MTSEA. A and B, positions in TMD2 of MTSEA-alkylated cysteines

affecting ligand binding are shown in a helical wheel representation viewed from the

extracellular side for receptors with no additional mutation in TMD2 (A) and for receptors in

which Asn-111 has been mutated to Gly in addition to the reporter cysteine in TMD2 (B).

The gray and black circles indicate mutant receptors for which binding activities were slightly

reduced (gray) or significantly reduced (black) after the treatment with MTSEA. White

circles indicate those mutant receptors that were insensitive to MTSEA treatment or positions

that resulted in little or no detectable binding when substituted for cysteine.

To further investigate the mechanism by which the AT1 receptor undergoes structural changes

during the transition from its inactive to its active state, we took advantage of the

constitutively active N111G-AT1 receptor. It is believed that the isomerization of conformers

toward the active state, which involves transmembrane movement, is stabilized by the binding

of an agonist and would be mimicked in part by the constitutively active receptor (6, 31).

Thus, within the structural background of the N111G-AT1 receptor, we verified the

accessibility of TMD2 residues to MTSEA, and we compared the pattern obtained with that

of the wild-type receptor. We found that Cys-substituted mutant A85C(2.61)

-N111G-AT1,

T88C(2.64)

-N111G-AT1, and A89C(2.65)

-N111G-AT1 maintained their sensitivity to MTSEA in

44

44

the constitutively active receptor background (Fig. 5). One more Cys-substituted mutant in the

N111G-AT1 receptor background,V86C(2.62)

-N111G-AT1, was found to be sensitive to

MTSEA (Fig. 5). It is important to mention that in the N111G-AT1 background, the

sensitivity of D74C(2.50)

-N111G-AT1 was completely abolished, and the sensitivity of

L81(2.57)

-N111G-AT1 was greatly diminished when compared with that observed in the basal

state (Fig. 3 versus Fig. 5). Thus, in the active state of the receptor, Asp-74(2.50)

, which is

located more toward the bottom of the TMD, would be displaced away from the binding

pocket (Fig. 8). Interestingly, our finding that residues Leu-81(2.57)

-N111G and Ala-85(2.61)

-

N111G are in the binding pocket in the active state of the AT1 receptor is in accordance to the

current model proposed for the ligand-free G-protein-coupled receptor opsin (29). Indeed,

residues Phe-91(2.57)

and Thr-94(2.61)

confine the retinal pocket in the active form of opsin (29,

32). In the protection assay for the mutants in the N111G- AT1 background, the competitive

ligand [Sar1,Ile

8]AngII offered effective protection to all sensitive mutants (L81C

(2.57)-

N111G-AT1, A85C(2,61)

-N111G-AT1, V86C(2,62)

-N111G-AT1, T88C(2,64)

-N111G-AT1, and

A89C(2,65)

-N111G-AT1) against the alkylating effect of MTSEA, suggesting that these

residues are located in the binding pocket (Fig. 6).

Our study showed that position 2.50, a well conserved aspartic acid residue found in

many class A receptors, appears to be facing the binding pocket in the ground state but not in

the N111G-AT1 background. This position in TMD2 is known to be crucial for G protein

activation (6, 33, 34). Also, this residue is suggested to be a part of an intermolecular

bonding network implicating interhelical interactions between TMD2 and TMD7. Indeed, the

recently elucidated crystal structure of squid rhodopsin shows that the carboxyl group of Asp-

80(2.50)

interacts directly with the side chain of Asn-311(7.61)

, corresponding to a state in which

rhodopsin is able to bind G proteins (28). Our data suggesting that residue Asp-74(2.50)

is

displaced away from the binding pocket in the active state of the receptor is concordant with

the suggestion that this residue forms intramolecular interactions with residues of other TMDs

and particularly of TMD7 upon activation. This would support the idea that the N111G

receptor stabilizes its constitutive activity partly by altering the conformation of this residue.

Since the residues corresponding to Asp-74(2.50)

in TMD2 and the NPXXY motif in TMD7 are

highly conserved in GPCRs, the functional significance of TMD2-TMD7 interaction may be

common to many GPCRs (3).

The divergence in the sensitivity of Cys-substituted mutants in the wild-type

background and in the N111G-AT1 receptor background suggests that the accessibility of

residues in TMD2 and their spatial proximity within the binding pocket were altered due to

45

45

the single substitution of an asparagine for a glycine at position 111 in TMD3. Our results

points to a considerable structural change during the process of activation of the receptor. In

the N111G-AT1 receptor background, Val-86(2.62)

, which is located near the top of TMD2,

became MTSEA-sensitive. This residue is located at the extreme right of the helical face

formed by the MTSEA-sensitive Thr-88(2.64),

Leu-81(2.57)

, Ala-85(2.61)

, and Ala-89(2.65)

residues

identified in the ground state (Fig.8). The simple explanation for such a gain in sensitivity of

mutant V86C-N111G-AT1 is that upon activation, TMD2 slightly rotates clockwise, bringing

Val-86(2.62)

within the binding pocket, where it can be alkylated by MTSEA. If this were the

case, one should expect that the sensitive residue at the extreme left of the helical face

forming the binding pocket would be displaced out of the binding pocket, where it could not

be alkylated by MTSEA. Because T88C(2.64)

-N111G-AT1 is still sensitive to MTSEA, this

explanation is unlikely. A clockwise rotation of TMD2 cannot either explain the reduced

sensitivity of mutant L81C(2.57)

-N111G-AT1 and the complete loss of sensitivity of mutant

D74C(2.50)

-N111G-AT1. The straightforward explanation for the sensitivity changes observed

between the mutant in the ground state and those in the constitutively active state could be

that TMD2 undergoes integral pivoting, bringing the top of TMD2 toward the binding pocket

and pushing the bottom of TMD2 away from the binding pocket. This simple pivoting

movement would then expose Val-86(2.62)

to the binding pocket and extrude Asp-74(2.50)

out of

the binding pocket. This explanation would go along with the four proposed simple but varied

types of movements (pivoting, rotation, translation and piston movements) that TM α-helices

can undergo in a lipid bilayer (35). Previous studies using the SCAM approach have proposed

a rigid body rotation of TMD2 for the constitutively active rat AT1 receptor bearing mutations

at residue Asn-111(3.35)

(36). In that study (36), a decrease in the accessibility of the residues

in the bottom of TMD2 to the binding pocket in the case of constitutively active receptor was

observed. This corresponds partly to our observations and could be interpreted as we suggest

as a pivoting movement, where the bottom of the TMD2 is pushed away from the binding

pocket.

In conclusion, we show that TMD2 participates in the formation of the binding pocket

of the AT1 receptor. Our data comparing the ground state versus an activated state of the AT1

receptor strongly point toward a pivoting movement of TMD2 that exposes Val-86(2.62)

and

alters the exposure of Leu-81(2.57)

to the binding pocket. The movement of the bottom of

TMD2 would shift Asp-74(2.50)

away from the binding pocket. This particular movement

could be a structural feature common to other rhodopsin-like GPCRs.

46

46

FOOTNOTES

This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research. This article was

submitted to fulfil the requirements of a Ph.D. thesis for I.D. at the Université de Sherbrooke.

E.E. is recipient of the J.C. Edwards Chair in Cardiovascular Research. R.L. is a Chercheur

National of the Fonds de la recherche en Santé du Québec. P.L. is a Chercheur Senior of the

Fonds de la recherche en Santé du Québec.

The abbreviations used are: AngII, angiotensinII; AT1 receptor, Angiotensin II Type-1

receptor; GPCR, G protein-coupled receptor; TMD, transmembrane domain; SCAM,

substituted-cysteine accessibility method; MTSEA, methanethiosulfonate-ethylammonium;

DMEM, Dulbecco‟s Modified Eagle‟s Medium.

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48

48

ARTICLE 2

The fifth transmembrane domain of angiotensin II Type 1 receptor participates in the

formation of the ligand-binding pocket and undergoes a counterclockwise rotation upon

receptor activation

Auteurs de l’article: Ivana Domazet, Stéphane S. Martin, Brian J. Holleran, Marie-Ève

Morin, Patrick Lacasse, Pierre Lavigne, Emanuel Escher, Richard Leduc et Gaétan

Guillemette

Statut de l’article: publié dans Journal of Biological Chemistry (2009) 284 :31953-31961

Avant-propos: j‟ai fait la majorité des expériences et j‟ai redigé la première version du

manuscrit.

Résumé : L‟angiotensine II, une hormone jouant un rôle important dans l‟homéostasie

cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT1 appartenant à la

grande famille des GPCRs. Les sept domaines TM des GPCRs contribuent à former la

pochette de liaison du ligand. Afin d‟identifier les acides aminés du TM5 impliqués dans la

formation de la pochette de liaison du récepteur AT1, nous avons utilisé l‟approche SCAM

(Substituted Cysteine Accessibility Method) qui consiste à évaluer les propriétés de liaison du

récepteur suite à sa réaction avec le methanethiosulfonate (MTSEA). Le MTSEA alkyle les

cystéines endogènes ou introduites par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement

stérique qui interfèrera avec la liaison du ligand. Une série de mutants ont été produits en

remplaçant successivement par une cystéine les résidus 190 à 217 du TM5 du récepteur AT1

et de son mutant constitutivement actif AT1-N111G. Après le prétraitement avec le MTSEA,

les mutants L197, N200, I201, G203 et F204 ont montré une diminution significative

d‟affinité pour le ligand 125

ISar1, Ile

8AngII, suggérant que ces résidus sont orientés dans la

pochette de liaison du récepteur AT1. Des résultats différents ont été obtenus dans le cas du

récepteur AT1-N111G. Le mutant I201C-N111G est devenu plus sensible au MTSEA, alors

que la sensibilité de G203C-N111G fut diminuée. Ces résultats suggèrent que l‟activation

constitutive du récepteur AT1 implique un mouvement de rotation dans le sens antihoraire du

TM5.

49

49

THE FIFTH TRANSMEMBRANE DOMAIN OF ANGIOTENSIN II TYPE 1

RECEPTOR PARTICIPATES IN THE FORMATION OF THE LIGAND BINDING

POCKET AND UNDERGOES A COUNTERCLOCKWISE ROTATION UPON

RECEPTOR ACTIVATION

Ivana Domazet, Stéphane S. Martin, Brian J. Holleran, Marie-Ève Morin, Patrick Lacasse,

Pierre Lavigne, Emanuel Escher, Richard Leduc and Gaétan Guillemette

Department of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de

Sherbrooke, Sherbrooke, Quebec, Canada, J1H 5N4

Running title: Rotation of transmembrane five upon AT1 receptor activation

Corresponding author: Gaétan Guillemette, Ph.D., Department of Pharmacology, Faculty of

Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 3001 12th Avenue North,

Sherbrooke, Quebec, Canada, J1H 5N4, Tel.: (819) 564-5347, Fax: (819) 564-5400, E-mail:

[email protected]

50

50

The octapeptide hormone angiotensin II exerts a wide variety of cardiovascular effects

through the activation of the angiotensin II Type 1 (AT1) receptor, which belongs to the G

protein-coupled receptor superfamily. Like other G protein-coupled receptors, the AT1

receptor possesses seven transmembrane domains that provide structural support for the

formation of the ligand-binding pocket. The role of the fifth transmembrane domain (TMD5)

was investigated using the substituted cysteine accessibility method. All of the residues within

Thr-190 to Leu-217 region were mutated one at a time to cysteine, and after expression in

COS-7 cells, the mutant receptors were treated with the sulfhydryl-specific alkylating agent

methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA). MTSEA reacts selectively with water-

accessible, free sulfhydryl groups of endogenous or introduced point mutation cysteines. If a

cysteine is found in the binding pocket, the covalent modification will affect the binding

kinetics of the ligand. MTSEA substantially decreased the binding affinity of L197C-AT1,

N200C-AT1, I201C-AT1, G203C-AT1, and F204C-AT1 mutant receptors, which suggests that

these residues orient themselves within the water-accessible binding pocket of the AT1

receptor. Interestingly, this pattern of acquired MTSEA sensitivity was altered for TMD5

reporter cysteines engineered in a constitutively active N111G-AT1 receptor background.

Indeed, mutant I201C-N111G-AT1 became more sensitive to MTSEA, whereas mutant

G203C-N111G-AT1 lost some sensitivity. Our results suggest that constitutive activation of

AT1 receptor causes an apparent counterclockwise rotation of TMD5 as viewed from the

extracellular side.

INTRODUCTION

The octapeptide hormone angiotensin II (AngII)6 is the active component of the renin-

angiotensin system. It exerts a wide variety of physiological effects, including vascular

contraction, aldosterone secretion, neuronal activation, and cardiovascular cell growth and

proliferation (1). Virtually all the known physiological effects of AngII are produced through


superfamily (2, 3). GPCRs possess seven transmembrane domains (TMDs), which provide

structural support for signal transduction. The AT1 receptor interacts with the G protein Gq/11,

which activates a phospholipase C, which in turn generates inositol 1,4,5-trisphosphate and

diacylglycerol from the cleavage of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (4, 5). Inositol

1,4,5-trisphosphate causes the release of Ca2+

from an intracellular store, whereas

diacylglycerol activates protein kinase C.

51

51

Like other GPCRs, the AT1 receptor undergoes spontaneous isomerization between its

inactive state (favored in the absence of agonist) and its active state (induced or stabilized by

the agonist) (6). Movement of TMD helices through translational or rotational displacement is

believed to be essential to achieve the active state (7, 8). For the AT1 receptor, it was

proposed that TMD3, TMD5, TMD6, and TMD7 participate in the activation process by

providing a network of interactions through the AngII-binding pocket (9). The dynamics of

this network are thought to be modified following agonist binding, which forces the receptor

to form new interactions or sever existing interactions between the residues forming the

TMDs.

Based on homology with the high resolution structure of rhodopsin, the archetypal

GPCR (10), it was expected that the binding site of the AT1 receptor would be formed

between its seven mostly hydrophobic transmembrane domains and would be accessible to

charged water-soluble agonists, like AngII. For this receptor, the binding site would thus be

contained within a water-accessible crevice, the binding pocket, extending from the

extracellular surface of the receptor to the transmembrane portion. Using a photoaffinity

labeling approach, we directly identified ligand contact points within the second extracellular

loop and the seventh TMD of the AT1 receptor (11-13). Interestingly, numerous mutagenesis

studies have provided the basis for a model in which an interaction between Asn-111 in

TMD3 and Tyr-292 in TMD7 maintains the AT1 receptor in the inactive conformation. The

agonist AngII would disrupt this interaction and promote the active conformational state (14).

In support of this model, it was further shown that substitution of Asn-111 for a residue of

smaller size (Ala or Gly) confers constitutive activity on the AT1 receptor (15-17).

The substituted cysteine accessibility method (SCAM) (18-20) is an ingenious

approach for systematically identifying the residues in a TMD that contribute to the binding

site pocket of a GPCR. Consecutive residues within TMDs are mutated to cysteine, one at a

time, and the mutant receptors are expressed in heterologous cells. If ligand binding to a

cysteine-substituted mutant is unchanged compared with wild-type receptor, it is assumed that

the structure of the mutant receptor, especially around the binding site, is similar to that of

wild type and therefore that the substituted cysteine lies in a orientation similar to that of the

wild-type residue. In TMDs, the sulfhydryl of a cysteine oriented toward the binding site

pocket should react more quickly with a positively charged sulfhydryl reagent like

methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA) than sulfhydryls facing the interior of the

protein or the lipid bilayer. Hence, two criteria are used for identifying engineered cysteines

on the surface of the binding-site pocket: (i) the reaction with MTSEA alters ligand binding

52

52

irreversibly and (ii) the reaction is retarded by the presence of ligand. We previously used this

approach to identify residues in TMD2, TMD3, TMD6, and TMD7 that form the surface of

the binding site pocket in the wild-type AT1 receptor and in the constitutively active N111G-

AT1 receptor (21-24). Here we report the application of SCAM to probe TMD5 in the wild-

type and constitutively active receptors.

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Materials -Bovine serum albumin, bacitracin, and soybean trypsin inhibitor were from

Sigma. The sulfhydryl-specific alkylating reagent MTSEA (CH3SO2-SCH2CH2NH3+) was

purchased from Toronto Research Chemicals, Inc. (Toronto, Canada). The cDNA clone for

the human AT1 receptor subcloned in the mammalian expression vector pcDNA3 was kindly

provided by Dr. Sylvain Meloche (Université de Montréal). LipofectAmine2000

, and culture

media were obtained from Invitrogen. 125

I-[Sar1, Ile

8]AngII (specific radioactivity, ~1500

Ci/mmol) was prepared with Iodo-GEN

(Perbio Science, Erembodegem, Belgium)

according to the method of Fraker and Speck (25) and as previously reported (26).

Numbering of residues in TMD5 -Residues in TMD5 of the human AT1 receptor were

given two numbering schemes. First, residues were numbered according to their positions in

the human AT1 receptor sequence. Second, residues were also indexed according to their

position relative to the most conserved residue in the TMD in which it is located (27). By

definition, the most conserved residue was assigned the position index „50‟, e.g., in TMD5,

Pro-207 is the most conserved residue and was designated Pro-207(5.50)

, whereas the upstream

residue was designated Phe-206(5.49)

and the downstream residue, Phe-208(5.51)

. This indexing

simplified the identification of aligned residues in different GPCRs.

Oligodeoxynucleotides site-directed mutagenesis -Site-directed mutagenesis was

performed on the wild-type AT1 receptor with the overlap PCR method (Expand High

Fidelity PCR System; Roche Applied Science). Briefly, forward and reverse oligonucleotides

were constructed to introduce cysteine mutations between Thr-190(5.33)

and Leu-217(5.60)

. PCR

products were subcloned into the HindIII-XbaI sites of the mammalian expression vector

pcDNA3.1. Site-directed mutations were then confirmed by automated DNA sequencing by

aligning the AT1 sequence using MultAlin (28).

Cell culture and transfection -COS-7 cells were grown in Dulbecco‟s modified Eagle‟s

medium (DMEM) containing 2 mM L-glutamine and 10% (v/v) fetal bovine serum. The cells

were seeded into 100-mm culture dishes at a density of 2 x 106 cells/dish. When the cells

53

53

reached ~90 % confluency, they were transfected with 4 g of plasmid DNA and 15 l of

lipofectAmine2000. After 24 h, transfected cells were trypsinized, distributed into 12-well

plates, and grown for an additional 24 h in complete DMEM containing 100 IU/ml penicillin

and 100 g/ml streptomycin before the MTSEA treatment and binding assay.

Binding experiments -COS-7 cells were grown for 36 h post-transfection in 100-mm

culture dishes, washed once with phosphate-buffered saline (PBS), and subjected to one

freeze-thaw cycle. Broken cells were then gently scraped into washing buffer (25 mM Tris-

HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2), centrifuged at 2500 g for 15 min at 4oC, and

resuspended in binding buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1%

BSA, 0.01% bacitracin, 0.01% soybean trypsin inhibitor). Saturation binding experiments

were done by incubating broken cells (20-40 g of protein) for 1 h at room temperature with

increasing concentrations of 125

I-[Sar1, Ile

8]AngII in a final volume of 500 µl. Non-specific

binding was determined in the presence of 1 µM unlabeled [Sar1,Ile

8]AngII. Bound

radioactivity was separated from free ligand by filtration through GF/C filters pre-soaked for

at least 3 h in binding buffer. Receptor-bound radioactivity was evaluated by counting.

Treatment with MTSEA -MTSEA treatment was performed according to the procedure

of Javitch et al. (29), with minor modifications. Two days after transfection, the cells, which

were grown in 12-well plates, were washed with PBS and incubated for 3 min at room

temperature with freshly prepared MTSEA at the desired concentrations (typically from 0.5

mM to 6 mM) in a final volume of 0.2 ml. The reaction was stopped by washing the cells with

ice-cold PBS. Intact cells were then incubated in binding medium (DMEM, 25 mM HEPES,

0.1% BSA, pH 7.4) containing 0.05 nM 125

I [Sar1, Ile

8]AngII for 90 min at room temperature.

After washing with ice-cold PBS, the cells were lysed with 0.1 N NaOH and the radioactivity

was evaluated by counting. The percentage of fractional binding inhibition was calculated as

[1-(specific binding after the MTSEA treatment/specific binding without the treatment)] x

100.

Protection against MTSEA reaction by [Sar1, Ile

8]AngII -Transfected cells grown in 12-

well plates were washed once with PBS and incubated in the presence or absence of 100 nM

[Sar1, Ile

8]AngII for 1 h at 16

oC (to avoid internalization of receptors). The cells were washed

to remove excess ligand and then treated with MTSEA. The cells were washed three times

with ice-cold PBS and once with an acidic buffer (150 mM NaCl, 50 mM acetic acid, pH 3.0)

to dissociate bound ligand. They were then incubated for 3 h at 16oC in binding medium

(DMEM, 25 mM HEPES, 0.1% BSA, pH 7.4) containing 0.05 nM 125

I-[Sar1, Ile

8]AngII. The

percentage of protection was calculated as [(inhibition in the absence of [Sar1, Ile

8]AngII) -

54

54

(inhibition in the presence of [Sar1, Ile

8]AngII)/(inhibition in the absence of [Sar

1, Ile

8]AngII)]

x 100.

Phospholipase C assay -Inositol phosphates accumulation was determined as described

previously (30). In brief, COS-7 cells were seeded in six-well plates, transfected, and labeled

for 16 h in serum-free M199 containing 10 Ci/ml [myo-3H]inositol (MP Biomedicals, Solon,

OH). Cells were washed twice with PBS/0.1% (w/v) dextrose and then incubated in

stimulation buffer (DMEM containing 25mM HEPES, 10mM LiCl, and 0.1% BSA, pH 7.4)

for 30 min at 37°C. Incubations were terminated by the addition of ice-cold perchloric acid

[final concentration, 5% (v/v)]. Water-soluble inositol phosphates were then extracted with an

equal volume of a 1:1 (v/v) mixture of 1,1,2-trichlorotrifluoroethane and tri-N-octylamine.

The samples were mixed vigorously and centrifuged at 2500g for 30 min. The upper phase

containing inositol phosphates was applied to an AG1-X8 resin column (Bio-Rad). Inositol

phosphates were eluted sequentially by the addition of an ammonium formate/formic acid

solution of increasing ionic strength. Fractions containing inositol phosphates were collected

and measured in a liquid scintillation counter.

Data analysis -Results are presented as means ± SD. Specific binding data (Bmax and

Kd) were analyzed with Prism version 4.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego CA),

using a one-site binding hyperbola nonlinear regression analysis.

RESULTS

Binding properties of mutant receptors bearing cysteines in TMD5 -To establish

whether residues in TMD5 orient themselves towards the binding-site pocket of the AT1

receptor, we mutated 27 consecutive residues between Thr-190(5.33)

and Leu-217(5.60)

to

cysteine, one at a time. Each mutant receptor was transiently expressed in COS-7 cells. To

assess the conservation of the global conformation of these receptors after the substitution,

pharmacological parameters describing the equilibrium binding of the radiolabeled

competitive ligand 125

I-[Sar1, Ile

8] AngII such as Kd and Bmax were determined (Table 1).

Most mutant AT1 receptors exhibited high binding affinity for 125

I-[Sar1, Ile

8] AngII (similar

to that of the wild-type AT1 receptor) except for mutant G203C(5.46)

-AT1 that showed a

moderate 5-fold decrease in binding affinity. The mutant receptors G196C(5.39)

-AT1,

K199C(5.42)

-AT1 and P207C(5.50)

-AT1 did not demonstrate any detectable binding activity and

55

55

were not used for the SCAM analysis. Bmax values for all detectable receptors ranged from

0.2 to 7.9 pmol/mg of protein.

Table 1


8] AngII to Cysteine-Substitued hAT1 Mutant Receptors

Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described in the Experimental

Procedure. Binding affinities (Kd) and maximal binding capacities (Bmax) are expressed as the

means ± SD of values obtained in n independent experiments performed in duplicate. Mutants

G196C, K199C and P207C did not demonstrate any detectable binding.

Kd Bmax n

nM pmol/mg

WT 0.9 ± 0.4 1.3 ± 0.9 18

T190C 0.8 ± 0.2 0.6 ± 0.3 3

L191C 2.2 ± 0.4 0.7 ± 0.4 3

P192C 1.0 ± 0.3 0.2 ± 0.02 3

I193C 2.1 ± 0.3 1.0 ± 0.4 4

G194C 0.7 ± 0.3 2.1 ± 0.5 3

L195C 3.5 ± 1.0 0.9 ± 0.1 4

L197C 1.8 ± 0.2 0.9 ± 1.4 3

T198C 0.8 ± 0.2 1.3 ± 1.1 3

N200C 0.9 ± 0.2 0.7 ± 0.4 4

I201C 1.0 ± 0.3 1.2 ± 0.4 3

L202C 1.5 ± 0.3 1.2 ± 0.2 3

G203C 5.0 ± 2.8 0.6 ± 0.5 3

F204C 2.4 ± 0.4 0.8 ± 0.5 3

L205C 0.9 ± 0.4 2.5 ± 1.5 4

F206C 0.9 ± 0.2 4.8 ± 3.2 4

F208C 1.1 ± 0.6 1.4 ± 0.3 3

L209C 0.8 ± 0.3 0.6 ± 0.1 3

I210C 1.2 ± 0.6 1.7 ± 1.0 3

I211C 0.7 ± 0.2 2.9 ± 1.0 4

L212C 0.8 ± 0.3 3.6 ± 0.3 3

56

56

T213C 0.8 ± 0.2 7.9 ± 0.3 3

S214C 1.1 ± 0.2 1.8 ± 1.9 3

Y215C 2.0 ± 0.3 2.4 ± 1.3 3

T216C 0.8 ± 0.1 2.1 ± 0.7 3

L217C 1.3 ± 0.8 2.8 ± 0.3 3

Effect of extracellularly added MTSEA on the binding properties of mutant receptors -To

verify whether the reporter cysteines introduced into TMD5 of the AT1 receptor were oriented

towards the binding pocket, mutant receptors were treated with concentrations of MTSEA

varying between 0.5 mM and 6 mM. We had initially verified whether the wild-type AT1

receptor, which contains 10 endogenous cysteines (Fig. 1) was sensitive to MTSEA. Fig. 2

shows that various concentrations of MTSEA had very little effect (no more than a 15%

reduction at high MTSEA concentrations) on the binding properties of the wild-type AT1

receptor, indicating that the endogenous cysteines made a relatively small contribution to the

binding-site pocket. A 3-min treatment with 0.5 mM MTSEA (Fig. 3A) strongly inhibited the

binding properties of mutants L197C(5.40)

-AT1 (binding inhibition of 35%), N200C(5.43)

-AT1

(binding inhibition of 38%), G203C(5.46)

-AT1 (binding inhibition of 57%) and F204C(5.47)

-AT1

(binding inhibition of 30%), whereas it had only a minor effect on the binding properties of

the other mutant receptors. At higher MTSEA concentrations (2 mM and above), the binding

properties of mutant receptor I201C(5.44)

-AT1 were also slightly affected (Fig. 3B). Overall,

the most reactive cysteines were those substituted for L197C(5.40)

, N200C(5.43)

, G203C(5.46)

and

F204C(5.47)

, whereas the cysteine substituted for I201C(5.44)

was less reactive.

Altered accessibility to TMD5 reporter cysteines in the constitutively active N111G-AT1

receptor -We made use of the constitutively active N111G-AT1 receptor to assess and map

the potentially altered accessibility of MTSEA to the engineered cysteines.

We first determined the pharmacological properties of the 27 cysteine-substituted mutant

receptors.

57

57

FIGURE 1. Schematic representation of the human AT1 receptor. The numbers indicate

the positions of cysteines and other residues in the receptor. The gray closed circles represent

cysteine residues that are thought to be linked via disulfide bridges, and the black closed

circles represent cysteine residues whose side chains do not form a disulfide bridge. Mutated

TMD5 residues are located between Thr-190 and Leu-217 inclusively. Potential N-

glycosylation sites (Asn-4, Asn-176, and Asn-188) are indicated. Asn-111 in TMD3 is also

shown in gray.

58

58

FIGURE 2. MTSEA treatment of the wild-type AT1 receptor and sensitive reporter

cysteine-bearing mutant receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type

(WT), L197C, N200C, I201C, G203C, or F204C AT1 receptors were incubated for 3 min at

room temperature with increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mm).

The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nm 125

I-[Sar1,

Ile8]AngII, and their binding properties were evaluated as indicated under “Experimental

Procedures.” Each curve represents the mean ± S.D. of data obtained from at least three

independent experiments.

Within the N111G-AT1 receptor background, 24 cysteine-substituted mutants conserved a

high binding affinity for the competitive ligand 125

I-[Sar1, Ile

8] AngII, whereas one mutant

G203C(5.46)

-N111G-AT1 displayed a moderate almost 8-fold decrease in binding affinity

(Table 2). It is interesting to note that the mutation K199C(5.42)

which abolished the binding

properties of the wild-type receptor, caused only a minor decrease of binding affinity in the

N111G-AT1 receptor background. The mutant receptors G196C(5.39)

-N111G-AT1, P207C(5.50)

-

N111G-AT1 and L212C(5.55)

-N111G-AT1 did not have any detectable binding activity and

were not used for the SCAM analysis. Bmax values for all detectable receptors ranged from

0.2 to 1.9 pmol/mg of protein (Table 2).

Figure 4 (see also Fig. 2) shows that, like the wild-type receptor, the N111G-AT1

receptor was relatively insensitive to a 3-min treatment with MTSEA concentrations ranging

from 0.5 mM to 2 mM, again indicating the relatively low contribution of the endogenous

cysteines in the binding-site pocket. Cysteine-substituted N111G-AT1 receptor mutants were

also treated with increasing concentrations of MTSEA and their binding properties were

assessed with 125

I-[Sar1, Ile

8] AngII.

59

59

FIGURE 3. Effects of MTSEA on mutant AT1 receptors bearing a reporter cysteine in

TMD5. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type (WT) or mutant AT1 receptors

were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mm MTSEA (A) or 2

mm MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with

0.05 nm 125

I-[Sar1, Ile

8]AngII. The percentage of binding inhibition was calculated as

indicated under “Experimental Procedures.” The vertical line represents an arbitrary threshold

used to identify cysteine-sensitive mutants and was set at a value corresponding to binding

inhibition 20% greater than the value for the wild-type AT1 receptor. The white bars indicate

mutant receptors for which binding activities were not appreciably reduced compared with the

wild-type receptor after treatment with MTSEA. The gray and black bars indicate mutant

receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or strongly reduced (black)

after treatment with MTSEA. Each bar represents the mean ± S.D. of data from at least three

independent experiments.

60

60

Table 2


8] AngII to Cysteine-Substitued hAT1 Mutant Receptors

Bearing the Asn111

Gly Mutation

Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described in the Experimental

Procedure. Binding affinities (Kd) and maximal binding capacities (Bmax) are expressed as the

means ± SD of values obtained in n independent experiments performed in duplicate. Mutants

G196C, P207C, and L212C did not demonstrate any detectable binding.

Kd Bmax n

nM pmol/mg

N111G 0.7 ± 0.2 1.0 ± 0.7 8

T190C 1.0 ± 0.2 0.5 ± 0.2 3

L191C 2.4 ± 0.4 0.6 ± 0.1 3

P192C 0.8 ± 0.3 0.5 ± 0. 2 4

I193C 3.2 ± 1.5 0.8 ± 0.3 4

G194C 0.9 ± 0.7 1.3 ± 0.3 3

L195C 2.0 ± 1.0 0.9 ± 0.2 3

L197C 3.1 ± 1.9 0.2 ± 0.1 4

T198C 0.6 ± 0.2 1.2 ± 0.3 3

K199C 3.2 ± 0.7 0.7 ± 0.4 3

N200C 1.8 ± 0.4 1.0 ± 0.3 4

I201C 1.4 ± 0.6 0.8 ± 0.4 4

L202C 1.4 ± 0.4 0.8 ± 0.4 3

G203C 7.7 ± 5.5 0.3 ± 0.2 3

F204C 1.7 ± 0.5 0.4 ± 0.1 4

L205C 0.9 ± 0.3 1.1 ± 0.2 3

F206C 1.8 ± 0.4 0.5 ± 0.3 3

F208C 1.2 ± 0.1 0.3 ± 0.2 3

L209C 0.7 ± 0.3 0.6 ± 0.2 3

I210C 1.6 ± 0.8 1.2 ± 0.7 3

I211C 0.7 ± 0.5 1.6 ± 0.6 4

T213C 1.6 ± 0.6 1.9 ± 0.8 3

S214C 1.3 ± 0.3 1.4 ± 0.7 3

Y215C 3.1 ± 0.5 1.6 ± 0.5 3

61

61

T216C 1.0 ± 0.8 1.3 ± 0.1 3

L217C 1.1 ± 0.4 0.7 ± 0.5 3

Figure 5 summarizes the effect of the MTSEA treatment on the different cysteine-substituted

N111G-AT1 receptor mutants. As observed in the wild-type background, mutants L197C(5.40)

-

N111G-AT1 (binding inhibition of 27%), N200C(5.43)

-N111G-AT1 (binding inhibition of 43%)

and F204C(5.47)

-N111G-AT1 (binding inhibition of 37%) were very sensitive to 0.5 mM

MTSEA. It is noteworthy that mutation I201C(5.44)

which conferred a low sensitivity to

MTSEA in the wild-type background (binding inhibition of 32% after treatment with a high 2

mM concentration of MTSEA), conferred a higher sensitivity to MTSEA in the N111G-AT1

background (binding inhibition of 48% after treatment with a low 0.5 mM concentration of

MTSEA). At the opposite, the mutation G203C(5.46)

conferred a high sensitivity to MTSEA in

the wild-type background whereas it conferred only a low sensitivity to MTSEA in the

N111G-AT1 background. Finally, of interest, MTSEA treatment increased (127%) the

binding activity of mutant K199C(5.42)

-N111G-AT1 (Fig.5)

Protection against MTSEA reaction by a pretreatment with [Sar1, Ile

8]AngII –To confirm

that reporter cysteines accessible to MTSEA are located within the binding pocket, receptor

mutants were saturated with the competitive ligand [Sar1, Ile

8]AngII prior to MTSEA

treatment. Cells were then washed with an acid buffer to dissociate the bound ligand and the

receptors were then assayed for binding with the radiolabeled competitive ligand. Figure 6

shows how a pre-incubation with the competitive ligand [Sar1, Ile

8]AngII protected all mutant

receptors that had exhibited changes in binding properties during MTSEA treatment

(L197C(5.40)

-AT1, N200C(5.43)

-AT1, I201C(5.44)

-AT1, G203C(5.46)

-AT1, F204C(5.47)

-AT1,

L197C(5.40)

-N111G-AT1, N200C(5.43)

-N111G-AT1, I201C(5.44)

-N111G-AT1, G203C(5.46)

-

N111G-AT1 and F204C(5.47)

-N111G-AT1) from the inhibitory effect of MTSEA, with

protection levels ranging from 60% to 95%.

Functional properties of wild-type and mutant AT1 receptors -The functional

properties of wild-type and mutant AT1 receptors were evaluated by measuring the

phospholipase C activity in transiently transfected COS-7 cells. Figure 7 shows the relative

amounts of inositol phosphates accumulated under basal conditions. The basal production of

inositol phosphates in cells expressing the cysteine mutant receptor in the wild-type

62

62

background were not significantly different from that produced by the cells expressing the

wild-type AT1 receptor.

FIGURE 4. MTSEA treatment of the N111G-AT1 receptor and sensitive reporter

cysteine-bearing mutant N111G-AT1 receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing

the N111G-AT1, L197C-N111G-AT1, N200C-N111G-AT1, I201C-N111G-AT1, G203C-

N111G-AT1, or F204C-N111G-AT1 receptors were incubated for 3 min at room temperature

with increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mm). The intact cells

were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nm 125

I-[Sar1, Ile

8]AngII, and

their binding properties were evaluated as indicated under “Experimental Procedures.” Each

curve represents the mean ± S.D. of data from at least three independent experiments.

63

63

FIGURE 5. Effect of MTSEA on N111G-AT1 mutant receptors bearing a reporter

cysteine in TMD5. Intact COS-7 cells transiently expressing the mutant N111G-AT1

receptors were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mm

MTSEA (A) or 2 mm MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room

temperature with 0.05 nm 125

I-[Sar1, Ile


calculated as indicated under “Experimental Procedures.” The vertical line represents an

arbitrary threshold used to identify cysteine-sensitive mutants. It was set at a value

corresponding to binding inhibition 20% greater than the value for the N111G-AT1 receptor.

The white bars indicate mutant receptors for which binding activities were not appreciably

reduced compared with that of the N111G-AT1 receptor after treatment with MTSEA. The

gray and black bars indicate mutant receptors for which binding activities were slightly

reduced (gray) or strongly reduced (black) after treatment with MTSEA. Each bar represents

the mean ± S.D. of data from at least three independent experiments.

The basal level of inositol phosphates found in cells expressing cysteine mutant receptors in

the N111G background was at least 4-fold higher than that found in cells expressing the wild-

type AT1 receptor, thereby confirming the constitutive activity of all receptors bearing both

64

64

cysteine and N111G mutations. These results show that cysteine mutations within TMD5 do

not compromise the functional integrity of either the ground state AT1 receptor or the

constitutively active N111G-AT1 receptor.

DISCUSSION

The rationale of this study, which relied on SCAM analysis, was to gain an insight into

the orientation of TMD5 of the AT1 receptor by identifying the residues accessible to MTSEA

within the binding site pocket. Mapping these residues in the ground state receptor and the

constitutively active N111G background allowed us to measure relative changes in the

position of certain residues, thus providing valuable information with which to infer a

structural change underlying AT1 receptor activation. It is important to mention that our

systematic approach of substituting each residue within TMD5 for a cysteine did not alter the

functional properties of either the wild-type AT1 receptor or the constitutively active N111G-

AT1 receptor (Fig.7)

As previously reported, the insensitivity of the wild-type receptor to MTSEA suggests

either that endogenous cysteines are not alkylated by MTSEA or that their alkylation does not

affect the binding of the ligand (24). Our approach of adding the MTSEA reagent to whole

adherent cells expressing the AT1 receptor essentially exposed only the extracellular ligand-

accessible side of the receptor to MTSEA. Interestingly, most of the MTSEA-accessible

residues that we identified with the SCAM approach are located from the middle (N200C(5.43)

,

I201C(5.44)

, G203C(5.46)

, F204C(5.47)

) to the top (L197C(5.40)

) portion of TMD5 (Fig.8). These

results suggest that this portion of TMD5 is involved in the interaction with the ligand.

Residue Leu-197(5.40)

would delineate the top whereas residue Phe-204(5.47)

would delineate

the bottom of the water-accessible binding pocket of the AT1 receptor. Along with these two

residues, three other residues, Asn-200 (5.43)

, Ile-201.44)

and Gly-203(5.46)

, would also be part of

the binding pocket in the ground state of the receptor. Indeed, by a mechanism that could be

steric, electrostatic, or indirect, the alkylation of these residues with MTSEA hampered the

binding of the ligand. This is further supported by the fact that the competitive ligand [Sar1,

Ile8]AngII protected them from the effect of MTSEA.

65

65

FIGURE 6. [Sar1, Ile

8]AngII protection of MTSEA-sensitive mutant receptors. Intact COS-7

cells transiently expressing MTSEA-sensitive mutant AT1 receptors were preincubated for 1 h at

16 °C in the absence or presence of 100 nm [Sar1, Ile

8]AngII. The cells were then incubated for 3

min at 16 °C in the continued absence or presence of [Sar1, Ile

8]AngII with optimal MTSEA

concentrations to achieve maximal binding inhibition of each receptor. The MTSEA

concentrations were as follows: 0.5 mm for L197C-AT1, N200C-AT1, G203C-AT1, F204C-AT1,

L197C-N111G-AT1, N200C-N111G-AT1, I201C-N111G-AT1, and F204C-N111G-AT1; and 2

mm for I201C-AT1 and G203C-N111G-AT1. The cells were then washed with ice-cold PBS and

incubated for 3 h at 16 °C with 0.05 nm 125

I-[Sar1, Ile

8]AngII. Protection was calculated as

described under “Experimental Procedures.” Each bar represents the mean ± S.D. of data from at

least three independent experiments.

66

66

FIGURE 7. Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild-type (WT) and

mutant AT1 receptors. Transfected COS-7 cells were preloaded for 16–24 h with 10 μCi/ml

[myo-3H]inositol. Inositol phosphates (sum of inositol bisphosphate, inositol trisphosphate, and

inositol tetrakisphosphate) accumulated within a period of 30 min were determined as described

under “Experimental Procedures.” These results represent the mean ± S.D. values from at least

three independent experiments (done in triplicate) where inositol phosphate production was

normalized for incorporation of [myo-3H]inositol into phospholipids and for receptor expression

level (determined by saturation binding assays).

Our finding that residues Leu-197(5.40)

, Asn-200(5.43)

, Ile-201(5.44)

, Gly-203(5.46)

and Phe-204(5.47)

are located in the binding pocket of the AT1 receptor is in accordance with the structures of

bovine rhodopsin (10), squid rhodopsin (31), opsin (32), β1-adrenergic receptor (33), β2-

adrenergic receptor (34-36) and dopamine D2 receptor (19). Indeed, residues His-211(5.46)

and

67

67

Phe-212(5.47)

are thought to constitute a contact point for retinal in the crystal structure of bovine

rhodopsin (10) whereas residues Phe-205(5.43)

and Phe-209(5.47)

are located in the binding pocket

of the crystal structure of squid rhodopsin (31). The crystal structure of the β1-adrenergic

receptor revealed that residues Ser-212(5.43)

and Ser-215(5.46)

are contact points for the high-

affinity antagonist cyanopindolol (33). Also, the crystal structure of the β2-adrenergic receptor

revealed that residues Ser-204(5.43)

, Ser-207(5.46)

and Phe-208(5.47)

are important for

catecholamines binding (34, 35). Furthermore, using the SCAM approach, it was shown that

residues Val-191(5.40)

, Ser-194(5.43)

, Ile-195(5.44)

, Ser-197(5.46)

and Phe-198(5.47)

are located in the

binding pocket of dopamine D2 receptor (19). Moreover, using the methionine proximity

approach, we recently observed that residue N200(5.43)

reacts with the photosensitive ligand [Sar1,

Bpa8]AngII (37). In light of these results, this orientation of TMD5 in the ligand-binding pocket

appears to be a common feature of many class A GPCRs.

To further investigate the mechanism by which the AT1 receptor undergoes structural

changes during the transition from its inactive to its active state, we took advantage of the

constitutively active N111G-AT1 receptor. It is believed that the isomerization of conformers

toward the active state, which involves transmembrane movement, is stabilized by the binding of

an agonist and would be mimicked at least in part by the constitutively active receptor (6, 38).

Thus, within the structural background of the N111G-AT1 receptor, we verified the accessibility

of TMD5 residues to MTSEA and we compared the pattern obtained with that of the wild-type

receptor. We found that Cys-substituted mutants L197C(5.40)

-N111G-AT1, N200C(5.43)

-N111G-

AT1 and F204C(5.47)

-N111G-AT1 maintained their sensitivity to MTSEA in the constitutively

active receptor background whereas mutant I201C(5.44)

-N111G-AT1 gained sensitivity and mutant

G203C(5.46)

-N111G-AT1 lost some sensitivity to MTSEA (Fig. 5). In the protection assay, the

competitive ligand [Sar1, Ile

8]AngII offered effective protection to all sensitive mutants

(L197C(5.40)

-N111G-AT1, N200C(5.43)

-N111G-AT1, I201C(5.44)

-N111G-AT1, G203C(5.46)

-N111G-

AT1 and F204C(5.47)

-N111G-AT1) against the alkylating effect of MTSEA, confirming that these

residues are located in the binding pocket (Fig. 6).

Our finding that residues Leu-197 (5.40)

, Asn-200 (5.43)

, Ile-201 (5.44)

, Gly-203(5.46)

and Phe-

204(5.47)

face the binding pocket in the active state of the AT1 receptor is in accordance with the

current model proposed for the crystal structure of opsin (32). Indeed, residues Ile-205(5.40)

, Phe-

208(5.43)

and Phe-212(5.47)

confine the binding pocket of the retinal in the active form of opsin (32,

68

68

39). In the crystal structure of activated rhodopsin (40), residues Met-207(5.43)

and His-211(5.46)

were also found in the binding pocket. Furthermore, using NMR spectroscopy measurements, it

was found that residues His-211(5.46)

and Phe-212(5.47)

interact with retinal in the receptor‟s active

intermediate form metarhodopsin II (41).

A peculiar observation made when the N111G-AT1 receptor was tested with the SCAM

approach was the increased binding activity (127%) of mutant K199C(5.42)

-N111G-AT1

following a treatment with 0.5 mM MTSEA. Obviously, the alkylation of this mutant did not

cause any constraint but rather facilitated its interaction with [Sar1, Ile

8]AngII. A likely

explanation is that the positive charge added by MTSEA at this position would promote ligand

binding, possibly by restoring the initial charge lost by substitution of this residue for cysteine.

Interestingly, when tested in the wild-type background, this mutant did not demonstrate any

detectable affinity, whereas in the constitutively active background K199C(5.42)

-N111G-AT1

displayed a 3-fold decrease in binding affinity. These results suggest that alkylation of K199(5.42)

potentiates binding via a mechanism involving an intramolecular ionic interaction within the

receptor. Further studies are needed to clarify this issue.

FIGURE 8. Helical wheel representation of TMD5 reporter cysteines and their pattern of

reactivity to MTSEA. The positions in TMD5 of MTSEA-alkylated cysteines affecting ligand

69

69

binding are shown in a helical wheel representation as viewed from the extracellular side for

receptors with no additional mutation in TMD5 (A) and for receptors in which Asn-111 has been

mutated to Gly in addition to the reporter cysteine in TMD5 (B). The gray and black circles

indicate mutant receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or

significantly reduced (black) after the treatment with MTSEA. The white circles indicate those

mutant receptors that were insensitive to MTSEA treatment or positions that resulted in little or

no detectable binding when substituted for cysteine.

The divergence in the sensitivity of Cys-substituted mutants in the wild-type background and in

the N111G-AT1 receptor background suggests that the accessibility of residues in TMD5 and

their spatial proximity within the binding pocket were altered due to the single substitution of an

Asparagine for a Glycine at position 111 in TMD3. Interestingly, mutant G203(5.46)

-N111G-AT1

was much less sensitive to MTSEA whereas mutant I201(5.44)

-N111G-AT1 was more sensitive to

MTSEA when compared to the analogous mutants in the ground state of the receptor (see Fig.3

versus Fig. 5). These results point to an appreciable structural change during the process of

receptor activation. In fact, residue Ile-201(5.44)

is located at the extreme right whereas residue

Gly-203(5.46)

is located at the extreme left of the helical face formed by the MTSEA-sensitive

residues Leu-197(5.40)

, Asp-200(5.43)

and Phe-204(5.47)

identified in the ground state receptor (Fig.

8). In other words, this structural change brings Ile-201(5.44)

within the binding pocket where it

can be more efficiently alkylated by MTSEA while it pushes Gly-203(5.46)

away from the binding

pocket. A simple and straightforward explanation for such changes in sensitivity is that upon

activation, the surface of TMD5 that is exposed to the binding site slightly rotates

counterclockwise as viewed from the extracellular side. Because the MTSEA- sensitive residues

lie in upper portion of TMD5, our data do not allow us to ascribe this rotation to the entire TMD.

Such a rotation would go along with the four proposed simple but varied types of movements

(pivoting, rotation, translation and piston movements) that TM α-helices can undergo within a

lipid bilayer (42).

It was suggested that an interaction between the highly conserved E/DRY motif on

TMD3 (positions 3.49/3.50 and a glutamate residue on TMD6 (position 6.30)), termed the ionic

lock, stabilizes the inactive conformation on many class A GPCRs (43). Using an NMR

spectroscopy approach, it was recently shown that upon activation of rhodopsin, TMD5

70

70

undergoes an apparent rotation movement (44, 45). In this process His-211(5.46)

moves closer to

Glu-122(3.37)

of TMD3, thus disrupting the ionic lock (44, 45). Therefore the rotation of TMD5 is

believed to play an important role in stabilizing the active state of the receptor.

In conclusion, we identified specific residues in the upper portion of TMD5 that participate

in the formation of the ligand-binding pocket of the AT1 receptor. Our data comparing the

ground state versus an activated state of the AT1 receptor strongly point towards a

counterclockwise rotation as viewed from the extracellular side of TMD5 in which the residue

facing the extreme right of the binding pocket (Ile-201(5.44)

) becomes more sensitive, while the

residue facing the extreme left of the binding pocket (Gly-203(5.46)

) becomes less sensitive to the

alkylating effect of MTSEA. Our results also suggest that the binding pocket of the AT1 receptor

shares some similarities with that of other class A GPCRs.

REFERENCES

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72

72

FOOTNOTES

This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research. This article was

submitted to fulfil the requirements of a Ph.D. thesis for I.D. at the Université de Sherbrooke.

E.E. is recipient of the J.C. Edwards Chair in Cardiovascular Research. R.L. is a Chercheur

National of the Fonds de la recherche en Santé du Québec. P.L. is a Chercheur Senior of the

Fonds de la recherche en Santé du Québec.

1 The abbreviations used are: AngII, angiotensinII; AT1 receptor, Angiotensin II Type-1 receptor;

GPCR, G protein-coupled receptor; TMD, transmembrane domain; SCAM, substituted-cysteine

accessibility method; MTSEA, methanethiosulfonate-ethylammonium; DMEM, Dulbecco‟s

Modified Eagle‟s Medium.

73

73

ARTICLE 3

Characterization of Angiotensin II molecular determinants involved in AT1 receptor functional

selectivity

Auteurs de l’article: Ivana Domazet, Brian J. Holleran, Alexandra Richard, Camille

Vanderberghe, Pierre Lavigne, Emanuel Escher, Richard Leduc et Gaétan Guillemette

Statut de l’article: soumis à Molecular Pharmacology, décembre 2014

Avant-propos: J‟ai participé à l‟élaboration des expériences, ensuite j‟ai effectué la plupart des

expériences et j‟ai collaboré à l‟écriture du manuscrit.

Résumé : L‟angiotensine II (AngII), une hormone jouant un rôle important dans l‟homéostasie

cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT1 appartenant à la

grande famille des GPCRs. Le récepteur AT1 est connu pour coupler préférentiellement la

protéine Gq. Pour cette raison, les propriétés fonctionnelles de ce récepteur ont surtout été

évaluées en fonction de sa capacité à induire la production d‟inositol phosphates et à mobiliser le

Ca2+

intracellulaire. Le récepteur AT1 interagit avec d‟autres protéines G hétérotrimériques (Gi et

G12/13) et active également des voies de signalisation indépendantes des protéines G telle que la

voie des ERKs, une des familles des MAP kinases. Notre hypothèse est que divers ligands

pourraient induire ou stabiliser une variété de conformations d‟un GPCR et ainsi inhiber ou

activer plus ou moins sélectivement les diverses voies de signalisation en aval du récepteur.

C‟est la notion de sélectivité fonctionnelle. Dans l‟étude présente, nous avons développé

différents essais permettant de mesurer six différentes voies de signalisation. Nous avons

sélectionné une série d‟analogues de l‟AngII modifiés en position 1, 4 et 8 qui diffèrent quant à

leur structure chimique. Dans cette étude, nous avons comme objectif de mieux caractériser les

déterminants moléculaires qui modulent la séléctivité fonctionnelle du récepteur AT1 dans les

cellules HEK 293. Nos résultats démontrent que la position 1 ne confère pas de séléctivité

fonctionnelle, la position 4 montre un biais vers la signalisation de la voie d‟ERK et la position 8

semble importante pour le recrutement des β-arrestines. De façon intéressante, nous avons

également demontré que les analogues modifiés en position 8 sont aussi des agonistes partiels de

la voie PKC-ERK via les isoformes atypiques de PKC (PKCζ et PKCι). Notre approche a donc

permis d‟identifier des ligands sélectifs des voies de signalisation du récepteur AT1. Ces résultats

mèneront éventuellement à la conception de nouveaux ligands sélectifs pour certaines voies de

signalisation, ce qui permettra de réduire ou même d‟éliminer les effets secondaires de plusieurs

médicaments.

74

74

ABSTRACT

The octapeptide angiotensin II (AngII) exerts a variety of cardiovascular effects through

the activation of the AngII type 1 receptor (AT1), a G protein-coupled receptor. The AT1 receptor

engages and activates several signalling pathways, including heterotrimeric G proteins Gq and

G12, as well as the ERK1/2 pathway. Additionally, following stimulation, β-arrestin is recruited

to the AT1 receptor, leading to receptor desensitization. It is increasingly recognized that specific

ligands selectively bind and favour the activation of some signalling pathways over others, a

concept termed ligand bias or functional selectivity. A better understanding of the molecular

basis of functional selectivity may lead to the development of better therapeutics with fewer

adverse effects. In the present study, we developed assays allowing the measurement of 6

different signalling modalities of the AT1 receptor. Using a series of AngII peptide analogs that

were modified in positions 1, 4 and 8, we sought to better characterize the molecular

determinants of AngII that underlie functional selectivity of the AT1 receptor in HEK293 cells.

The results reveal that position 1 of AngII does not confer functional selectivity, while position 4

confers a bias towards ERK signalling over Gq signalling and that position 8 confers a bias

towards βarrestin recruitment over ERK activation and Gq signalling. Interestingly, the analogs

modified in position 8 were also partial agonists of the PKC-dependent ERK pathway via

atypical PKC isoforms PKC and PKC.

75

75

INTRODUCTION

The octapeptide hormone angiotensin II (AngII) is the active component of the renin-

angiotensin system, responsible for controlling blood pressure and water retention via smooth

muscle contraction and ion transport. It exerts a wide variety of physiological effects, including

vascular contraction, aldosterone secretion, neuronal activation, and cardiovascular cell growth

and proliferation. Virtually all the known physiological effects of AngII are produced through


superfamily (de Gasparo, et al., 2000).

The AT1 receptor interacts with the G protein Gq/11, which activates a phospholipase C,

which in turn generates inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) and diacylglycerol (DAG) from the

cleavage of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (Hunyady and Catt, 2006). The second

messenger IP3 binds to the calcium channel receptor IP3R present at the surface of the

endoplasmic reticulum, thus liberating Ca2+

into the cytosol. G protein–coupled receptor kinases

(GRKs) phosphorylate the receptor, leading to β-arrestin recrutement and functional uncoupling

of G protein signaling. The AT1 receptor also activates the G protein G12 (Sagara, et al., 2007;

Suzuki, et al., 2009; Ushio-Fukai, et al., 1998; Gohla, et al., 2000). It is known that G12, through

the regulation of RhoGEF proteins, leads to the activation of RhoA/Rho kinase and cytoskeleton

reorganisation (Siehler, 2009). The AT1 receptor also activates extracellular signal–regulated

kinases 1 and 2 (ERK1/2) (Tian, et al., 1998; Wei, et al., 2003). ERK1/2 activation by the AT1

receptor is complex and can be mediated by PKC (G protein-dependent) or by EGFR

transactivation (G protein-independent) (Luttrell, 2002; Miura, et al., 2004).

Recent evidence has demonstrated that different ligands for a GPCR can stabilize the

receptor under distinct conformations that promote the activation of some signalling pathways

over others (Galandrin, et al., 2007). This phenomenon is referred to as ligand bias or functional

selectivity. Biased ligands have been proposed to stabilize receptor conformations that are

distinct from those induced by unbiased ligands and selectively change the propensity of GPCR

coupling to various effectors, leading to different signalling outcomes. Several biased agonists

have been recently described for numerous GPCRs (van der Westhuizen, et al., 2014; Rominger,

et al., 2014), and such ligands show much therapeutic promise which could translate to

compounds having less off target effects (Rominger, et al., 2014).

76

76

The goal of the present study was to better comprehend the molecular basis underlying

AT1 receptor functional selectivity. Early structure-activity relashionship studies using assays

measuring rabbit aorta strip contraction and rat blood pressure have shown that position 8 of

AngII is essential for ligand activity, while position 4 is critical for ligand affinity, as well as

some activity (Regoli, et al., 1974). Position 1 of AngII analogs is often substituted with

sarcosine (N-methylglycine), which allows the peptides to resist aminopeptidase degradation.

AngIII, also known as AngII (2-8), is an endogenous AngII peptide where the aspartic acid at

position 1 is removed by animopeptidase degradation. The ligand [Sar1Ile

4Ile

8]AngII, which is

unable to signal via the Gq pathway, is able to selectively recruit βarrestin (Wei, et al., 2003).

Based on these observations, the goal of the study was to ascertain the impact of positions 1, 4

and 8 of AngII on the signalling profiles of the AT1 receptor and thus gain some insight into

whether these molecular determinants of AngII are involved in conferring the property of

functional selectivity towards the AT1 receptor. We therefore synthesized and investigated a

series of peptide analogs containing amino acid substitutions at positions 1, 4 and 8 and

determined their signalling profiles towards six different signalling pathways.

MATERIALS AND METHODS

Materials

All reagents were from Sigma-Aldrich Canada Ltd. (Oakville, ON) unless otherwise

indicated. Culture media, trypsin, FBS, penicillin, and streptomycin were from Wisent (St-

Bruno, Qc, Canada). OPTI-MEM and RNAi max were from Invitrogen Canada Inc. (Burlington,

ON). Polyethyleneimine (PEI) was from Polysciences (Warrington, PA). All siRNAs were from

Sigma-Aldrich (St-Louis, MO). 125

I-AngII (specific radioactivity ~1000 Ci/mmol) was prepared

with Iodo-GEN® (Perbio Science, Erembodegem, Belgium) as reported previously.

Constructs

The cDNA clone for the human AT1 receptor was kindly provided by Dr. Sylvain

Meloche (University of Montréal). The AT1-GFP10 construct was built by inserting the GFP10

sequence at the C-terminus of the AT1 construct, joined by the linker GSAGT, using the In-

Fusion® PCR cloning system (Clontech Laboratories, Mountain View, CA) as recommended by

the manufacturer. The RLuc-βarrestin1, RLuc-βarrestin2, Gα12-RLuc, Gβ1 and Gγ1-GFP10

77

77

constructs were kindly provided by Dr. Michel Bouvier (University of Montréal). All constructs

were confirmed by automated DNA sequencing by alignment with multiAlin (Corpet, 1988).

Cell culture and transfection

Human embryonic kidney (HEK) 293 cells were maintained in DMEM medium

supplemented with 10% FBS, 100 IU/ml penicillin, and 100 µg/ml streptomycin at 37°C in a

humidified 5% CO2 atmosphere. HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor were

maintained in medium containing 0.5 mg/mL G418. For βarrestin recruitment assays, HEK293

cells (3 106 cells) were transiently transfected with 8700 ng of AT1-GFP10 and either 300 ng

of Rluc-βarrestin1 or 300 ng of Rluc-βarrestin2 using linear polyethylenimine (1 mg/ml)

(PEI:DNA ratio 4:1). For G12 activation assays, HEK293 cells (3 106 cells) were transiently

cotransfected with the following constructs: 3000 ng of AT1 receptor, 600 ng Gα12-RLuc, 3000

ng Gγ1-GFP10 and 1800 ng Gβ1, using linear polyethylenimine (PEI:DNA ratio 4:1). For

siRNA transfection, HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor were seeded in a 96-well

plate (50,000 cells/well) and each well was transfected with 1 pmol of the indicated siRNA using

RNAi max (0.3 uL).

Binding Experiments

For binding experiments, broken cells were gently scraped into washing buffer (25

mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2), centrifuged at 2500 × g for 15 min at 4 °C,

and resuspended in binding buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1%

bovine serum albumin, 0.01% bacitracin, 0.01% soybean trypsin inhibitor). Dose displacement

experiments were done by incubating broken cells (20–40 μg of protein) for 1 h at room

temperature with 0.8 nM 125

I-AngII as tracer and increasing concentrations of AngII. Bound

radioactivity was separated from free ligand by filtration through GF/C filters presoaked for at

least 3 h in binding buffer. Receptor-bound radioactivity was evaluated by γ counting. Results

are presented as means ± S.D. The Kd values in the displacement studies were determined from

the IC50 values using the Cheng-Prusoff equation.

78

78

Gq signalling

Gq signalling was evaluated by the measurement of inositol 1-phosphate (IP1) production

using the IP-One assay (Cisbio Bioassays, Bedford, MA). Necessary dilutions of each analog

were prepared in stimulation buffer (10 mM Hepes, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 4.2 mM KCl,

146 mM NaCl, 5.5 mM glucose, 50 mM LiCl, pH 7.4). HEK293 cells stably expressing the AT1

receptor were washed with PBS at room temperature, then trypsinized and distributed at 15 000

cells/well (7 μl) in a white 384-well plate in stimulation buffer. Cells were stimulated at 37 °C

for 30 min with increasing concentrations of AngII or analogues. Cells were then lysed with the

lysis buffer containing 3 μl of IP1 coupled to the dye d2. After addition of 3 μl of anti-

IP1 cryptate terbium conjugate, cells were incubated for 1 h at room temperature under agitation.

FRET signal was measured using a TECAN M1000 fluorescence plate reader (TECAN, Austria).

BRET-based biosensor assays

After 48 h post-transfection, cells were washed with PBS and resuspended in stimulation

buffer. For the βarrestin recruitment assays, the proximity of fusion protein RLuc-βarrestin to the

reporter AT1-GFP10 was evaluated. Upon stimulation, RLuc-βarrestin was recruited to the AT1-

GFP10 fusion protein, whereby the BRET signal was increased. For the G12 activation assay,

the biosensor measures the proximity of the fusion protein RLuc-Gα12 to GFP10-Gγ. Upon

activation, both RLuc-Gα12 and GFP10-Gγ move away from each other, which causes a decrease

in the measured BRET. For both the βarrestin recruitment assays and G12 activation assay, cells

transfected with the appropriate constructs were stimulated with the indicated ligands in 96-well

white plates (50 000 cells/well) for 8 min, and then coelentherazine 400A was added at a final

concentration of 5 uM. All BRET signals were measured using a TECAN M1000 fluorescence

plate reader. The BRET ratio was calculated as the GFP10 emission over luminescence emission.

Net BRET ratio was calculated by subtracting the BRET ratio under basal conditions from the

BRET ratio upon maximal stimulation. All data were expressed as a percentage of maximal

AngII response.

ERK1/2 activation assay

ERK1/2 activation was measured using the ERK1/2 AlphaScreen Surefire kit

(PerkinElmer, Waltham, MA). HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor were seeded

79

79

into 96-well plates at a density of 125 000 cells/well. After 24 h, cells were starved for at least 16

h in phenol red-free media before stimulation. Where specified, protein kinase C inhibitor

Go6983 (1 uM), EGFR tyrosine kinase inhibitor PD168393 (250 nM) or combination of both

inhibitors was added 30 min before stimulation. For time-course experiments, 100 nM AngII was

added for the indicated times. For concentration-response experiments, cells were stimulated

with increasing concentrations of indicated ligand. Cells were incubated at 37°C either for 2 min

(PKC-ERK) or 5 min (EGFR-ERK), as determined by the peak responses obtained in the time-

course assays. Stimulation of cells was terminated by the addition of lysis buffer to each well.

The plate was then agitated at room temperature for 10 min and 4 µl of lysate was transferred to

384-well ProxiPlates (PerkinElmer, Waltham, MA) and 5 ul of the assay reaction mix was added

to each well (reaction buffer : activation buffer : donor beads : acceptor beads = 120 : 40 : 1 : 1).

The plate was then incubated in the dark at room temperature for 24 h under agitation and the

signal was measured with an Enspire alpha reader (PerkinElmer, Waltham, MA) using standard

AlphaScreen settings. All data were expressed as a percentage of maximal AngII-induced

ERK1/2 phosphorylation.

Data analysis

Binding data were analyzed with Prism version 6.0 for Windows (GraphPad Software,

San Diego CA), using a one-site binding hyperbola nonlinear regression analysis. Transduction

ratios and bias factors were calculated based on the method of Kenakin (Kenakin, et al., 2012),

as described in detail by van der Westhuizen et al (van der Westhuizen, et al., 2014).

Transduction ratios [log(/KA)] were first derived using the operational model equation in

GraphPad Prism. The transduction ratio is an assessment of the effect (potency and efficacy) of a

compound on receptor conformation and the subsequent ligand-receptor interaction with

downstream effectors. In order to assess true ligand bias, system and observational bias which

may be present owing to the different sensitivities of the assays used must be eliminated by

comparing ligand activity at a given signalling pathway to that of a reference agonist. AngII,

which yielded similar potencies and maximally activated all the pathways, was the reference

compound. By subtracting log(/KA) of AngII to the log(/KA) value of each analog for a given

pathway, a within-pathway comparison was first established, yielding Δlog(/KA). Finally,

between-pathway comparisons were achieved for a given ligand in the form of ΔΔlog(/KA) and

80

80

the bias factor BF. ΔΔlog(/KA) were calculated by substracting Δlog(/KA) values of one

signalling pathway from the Δlog(/KA) of the signalling pathway to which it is compared. BF

values are the base 10 values of ΔΔlog(/KA) and are the actual bias factors.

RESULTS

Binding properties of AngII peptide analogs

We evaluated the binding properties of 8 selected peptide analogs of AngII (Table 1).

AngII (Kd = 1.1 nM), and its analogs [Sar1Ile

8]AngII (Kd = 1.7 nM), [Sar

1]AngII (Kd = 1.8 nM),

[Ile8]AngII (Kd = 3.2 nM), AngIII (Kd = 5.2 nM), [Sar

1Ile

8]AngIII (Kd = 12 nM) showed high

binding affinity in the low nanomolar range whereas analogs [Sar1Ile

4]AngII (Kd = 78 nM) and

[Ile4]AngII (Kd = 894 nM) showed lower binding affinities. These analogs modified at positions

1, 4 or 8 were appropriate to compare their relative efficacies in the different signalling

pathways.

Gq signalling

To assess AT1 receptor signalling via the heterotrimeric G protein Gq, we measured IP1

production after a 30 min stimulation with each analog, using AngII as a reference. The AngII

dose-response curve shown at Fig. 1A revealed a maximal response of 730.2 nM of IP1 produced

(normalized to 100%) with a half-maximal response (EC50) at a concentration of 3.1 nM. Dose-

response curves with the analogs modified at position 1 provided a maximal response of 98%

and EC50 of 3.3 nM for [Sar1]AngII (Fig. 1B) and a maximal response of 87% and EC50 of 51

nM for AngIII (data not shown). Dose-response curves with the analogs modified at position 4,

provided a maximal response of 43% and EC50 of 686 nM for [Sar1Ile

4]AngII (Fig. 1C) and a

maximal response of 67% and EC50 of 3100 nM for [Ile4]AngII (data not shown). Dose-response

experiments with the analogs modified at position 8 revealed that [Sar1Ile

8]AngII (Fig. 1D),

[Ile8]AngII (Fig. 1E) and [Ile

8]AngIII (Fig. 1F), did not produce any measurable IP1. All these

data are summarized in Table 2. These results indicate that position 8 of AngII is critical for

activating the Gq pathway. These results also indicate that position 4 of AngII affects both the

potency and the efficacy of the peptide in the activation of the Gq pathway whereas

modifications at position 1 did not show any impact.

81

81

Figure 1. Inositol 1-phosphate production induced by AngII analogs. HEK293 cells expressing

the AT1 receptor were stimulated with increasing concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B),

Sar1Ile

4-AngII (C), Sar

1Ile

8-AngII (D), Ile

8-AngII (E) and Ile

8-AngIII (F) for 30 min at 37°C. IP1

accumulation was measured with the IP-One assay, as described in the methods. Data are

expressed as a percentage of AngII maximal response. Data are the mean ± SD of 3-6

independent experiments performed in triplicate.

82

82

βarrestin recruitment

To evaluate the capacity of the receptor to recruit and engage with either βarrestin1 or

βarrestin2 following an 8 min stimulation with each analog, a BRET-based βarrestin recruitment

assay was used. The AngII dose-response curve for βarrestin1 recruitment revealed a maximal

net BRET ratio of 0.085 (normalized to 100%) with an EC50 of 6.1 nM (Fig. 2A), while that for

βarrestin2 recruitment revealed a maximal net BRET ratio of 0.106 (normalized to 100%) with

an EC50 of 4.6 nM (Fig. 3A). Dose-response curves for βarrestin recruitment by [Sar1]AngII

showed a maximal response of 100% with an EC50 of 6.4 nM for βarrestin1 (Fig. 2B) and a

maximal response of 94% with an EC50 of 5.6 nM for βarrestin2 (Fig. 3B).The analog AngIII

had a maximal response of 94% with an EC50 of 54 nM for βarrestin1 recruitment and a maximal

response of 93% with an EC50 of 48 nM for βarrestin2 recruitment (data not shown).

Dose-response curves were performed with two analogs modified at position 4.

[Sar1Ile

4]AngII showed maximal responses of 81% (βarrestin1) and 86% (βarrestin2) with EC50s

of 429 nM (βarrestin1) and 458 nM (βarrestin2) (Figs. 2C, 3C). [Ile4]AngII showed maximal

responses of 72% (βarrestin1) and 84% (βarrestin2) with EC50s of 2800 nM (βarrestin1) and

3829 nM (βarrestin2) (data not shown).

Dose-response curves were performed with three analogs modified at position 8.

[Sar1Ile

8]AngII showed maximal responses of 56% (βarrestin1) and 61% (βarrestin2) with EC50s

of 4.5 nM (βarrestin1) and 5.6 nM (βarrestin2) (Fig. 2D, 3D). [Ile8]AngII showed maximal

responses of 54% (βarrestin1) and 59% (βarrestin2) with EC50s of 7.0 nM (βarrestin1) and 5.7

nM (βarrestin2) (Fig. 2E, 3E). [Ile8]AngIII showed maximal responses of 50% (βarrestin1) and

49% (βarrestin2) with EC50s of 11.3 nM (βarrestin1) and 48 nM (βarrestin2) (Fig. 2F, 3F). All

these results are summarized in Table 2. These results indicate that the analogs modified at

position 8 of AngII are partial agonists for the recruitment of βarrestins with relatively high

potencies but with efficacies lower (~50%) than that of AngII. The analogs modified at position

4 are also partial agonists for the recruitment of βarrestins although with relatively high

efficacies (~80% compared to AngII) and with low potencies. Modifications at position 1 of

AngII did not show any impact on the recruitment of βarrestins.

83

83

Figure 2. βarrestin1 recruitment to the AT1 receptor by AngII analogs. HEK293 cells co-

transfected with fusion protein RLuc-βarrestin and the reporter AT1-GFP10 were stimulated with

increasing concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B), Sar

1Ile

4-AngII (C), Sar

1Ile

8-AngII (D),

Ile8-AngII (E) and Ile

8-AngIII (F) for 8 min at 37°C. βarrestin1 recruitment was measured as

described in the methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data

are the mean ± SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.




1Ile

4-AngII (C), Sar

1Ile

8-AngII (D),





84

84




1Ile

4-AngII (C), Sar

1Ile

8-AngII (D),





85

85

Figure 3. βarrestin2 recrutment to the AT1 receptor by AngII analogs. HEK293 cells co-



1Ile

4-AngII (C), Sar

1Ile

8-AngII (D),





86

86

G12 activation

The ability of the AT1 receptor to engage with and activate the G12 heterotrimer was

evaluated using a BRET-based biosensor assay. The AngII dose-response curve shown at Fig.

4A revealed a net BRET ratio of 0.096 (normalized to 100%) with an EC50 of 4.7 nM. Dose-

response curves with the analogs modified at position 1 provided a maximal response of 104%

with an EC50 of 5.1 nM for [Sar1]AngII (Fig. 4B) and a maximal response of 98% with an EC50

of 90 nM for AngIII (data not shown). Dose-response curves with the analogs modified at

position 4 showed a maximal response of 65% with an EC50 of 228 nM for [Sar1Ile

4]AngII (Fig.

4C) and a maximal response of 60% with an EC50 of 1056 nM for [Ile4]AngII (data not shown).

Dose-response curves with the analogs modified at position 8 showed a maximal response of

44% with an EC50 of 1.0 nM for [Sar1Ile

8]AngII (Fig. 4D), a maximal response of 42% with an

EC50 of 3.2 nM for [Ile8]AngII (Fig. 4E) and a maximal response of 38% with an EC50 of 12 nM

for [Ile8]AngIII (Fig. 4F). All these results are summarized in Table 2. These results indicate that

the analogs modified at position 8 of AngII are partial agonists for G12 activation with relatively

high potencies but with efficacies lower (~40%) than that of AngII. The analogs modified at

position 4 are also partial agonists for G12 activation with efficacies lower (~60%) than that of

AngII and with low potencies. Modifications at position 1 of AngII did not show any impact on

the activation of G12.

87

87

Figure 4. G12 activation by AngII analogs. HEK293 cells expressing the AT1 receptor and co-

transfected with Gα12-RLuc, Gγ1-GFP10 and Gβ1 were stimulated with increasing

concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B), Sar

1Ile

4-AngII (C), Sar

1Ile

8-AngII (D), Ile

8-AngII

(E) and Ile8-AngIII (F) for 8 min at 37°C. G12 activity was measured as described in the methods.

Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data are the mean ± SD of 3-6

independent experiments performed in triplicate.

88

88

ERK response

We evaluated the capacity of the selected AngII analogs to activate the ERK1/2 pathway

by measuring ERK phosphorylation levels upon stimulation, a hallmark of ERK activity. Figure

5 shows that under control conditions (circles), the addition of AngII increased ERK

phosphorylation which reached a maximal value at 5 min and then slowly declined towards the

basal level. In the presence of the EGFR tyrosine kinase inhibitor PD168393 (triangles), the

addition of AngII increased ERK phosphorylation which reached a maximal value at 2 min and

then slowly declined towards the basal level. In the presence of the PKC inhibitor Go6983

(squares), the addition of AngII increased ERK phosphorylation which reached a maximal value

at 5 min and then slowly declined towards the basal level. In the presence of both PD168393 and

Go6983 (diamonds), the addition of AngII did not produce any measurable ERK

phosphorylation. These results suggest that in our experimental model, within the limits of our

time-course, AngII activates the ERK1/2 pathway via PKC following Gq activation and also via

the transactivation of EGFR. Since the ERK1/2 response is completely abolished in the presence

of both inhibitors, we reasoned that the ERK response in the presence of Go6983 was mediated

by EGFR (pathway EGFR-ERK) while the ERK response in the presence of PD168393 was

mediated by PKC (pathway PKC-ERK).

89

89

Figure 5. AngII-induced ERK activation. HEK293 cells expressing the AT1 receptor were

pretreated as indicated for 30 min and then were stimulated with 100 nM AngII for different

periods of time. ERK activity was measured as described in the methods. Data are expressed as a

percentage of AngII maximal response. Data are the mean ± SD of 3-6 independent experiments

performed in triplicate.

EGFR-mediated ERK response

To evaluate the EGFR-ERK pathway, HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor

were treated with increasing concentrations of each analog for 5 min, in the presence of Go6983

(Fig. 6 and Table 3). The AngII dose-response curve shown at Fig. 6A shows a maximal

response of 49 677 luminescence arbitrary units (normalized to 100%) with an EC50 of 2.8 nM.

Dose-response curves with the analogs modified at position 1 provided a maximal response of

94% with an EC50 of 4.2 nM for [Sar1]AngII (Fig. 6B) and a maximal response of 88% with an

EC50 of 9.2 nM for AngIII (data not shown). Dose-response curves with the analogs modified at

position 4 provided a maximal response of 95% with an EC50 of 50 nM for [Sar1Ile

4]AngII (Fig.

6C) and a maximal response of 93% with an EC50 of 1397 nM for [Ile4]AngII (data not shown).

Dose-response curves with the analogs modified at position 8 showed a maximal response of

27% with an EC50 of 11 nM for [Sar1Ile

8]AngII (Fig. 6D), a maximal response of 27% with an

EC50 of 40 nM for [Ile8]AngII (Fig. 6E), and a maximal response of 30% with an EC50 of 21 nM

for [Ile8]AngIII (Fig. 6F). All these results are summarized in Table 3. These results indicate that

the analogs modified at position 4 are partial agonists, although with very high efficacies (~94%)

for the EGFR-ERK pathway. Furthermore, [Sar1Ile

4]AngII showed a higher potency (~10 times)

in the EGFR-ERK pathway than the Gq, G12 and βarrestin pathways. The analogs modified at

position 8 of AngII are partial agonists of the EGFR-ERK pathway, with relatively low potencies

(~10 times lower than that of AngII) and with low efficacies (~30% of that of AngII).

Modifications at position 1 of AngII had no major impact on the EGFR-ERK pathway.

90

90

Figure 6. EGFR-dependent ERK activation by AngII analogs. HEK293 cells expressing the AT1

receptor were pretreated with 1 uM Go6983 for 30 min and then were stimulated with increasing

concentrations of AngII (A), Sar1-AngII (B), Sar

1Ile

4-AngII (C), Sar

1Ile

8-AngII (D), Ile

8-AngII

(E) and Ile8-AngIII (F) for 5 min at 37°C. ERK activity was measured as described in the

methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data are the mean ±

SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.

91

91

PKC-mediated ERK response

To evaluate the PKC-ERK pathway, HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor

were treated with increasing concentrations of each analog for 2 min, in the presence of

PD168393 (Fig. 7 and Table 3). The AngII dose-response curve shown at Fig. 7A shows a

maximal response of 58 391 luminescence arbitrary units (normalized to 100%) with an EC50 of

1.2 nM. Dose-response curves with the analogs modified at position 1 provided a maximal

response of 92% with an EC50 of 3.0 nM for [Sar1]AngII (Fig. 7B) and a maximal response of

88% with an EC50 of 4.0 nM for AngIII (data not shown). Dose-response curves with the analogs

modified at position 4 provided a maximal response of 94% with an EC50 of 32 nM for

[Sar1Ile

4]AngII (Fig. 7C) and a maximal response of 80% with an EC50 of 523 nM for

[Ile4]AngII (data not shown). Dose-response curves with the analogs modified at position 8

showed a maximal response of 28% with an EC50 of 45 nM for [Sar1Ile

8]AngII (Fig. 7D), a

maximal response of 38% with an EC50 of 55 nM for [Ile8]AngII (Fig. 7E), and a maximal

response of 25% with an EC50 of 40 nM for [Ile8]AngIII (Fig. 7F). These results indicate that the

analogs modified at position 4 are partial agonists, although with high efficacies (~85%) for the

PKC-ERK pathway. Furthermore, the analog [Sar1Ile

4]AngII showed a higher potency (~10

times) in the PKC-ERK pathway than the Gq, G12 and βarrestin pathways. The analogs

modified at position 8 of AngII are partial agonists of the PKC-ERK pathway, with relatively

low potencies (~10 times lower than AngII) and with low efficacies (~30% that of AngII).

Modifications at position 1 of AngII had no major impact on the PKC-ERK pathway.

92

92

Figure 7. PKC-dependent ERK activation by AngII analogs. HEK293 cells expressing the AT1

receptor were pretreated with 250 nM PD168393 for 30 min and then were stimulated with


1Ile

4-AngII (C), Sar

1Ile

8-AngII (D),


8-AngIII (F) for 2 min at 37°C. ERK activity was measured as described in

the methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal response. Data are the mean

± SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.

93

93

Role of atypical PKC isoforms in the PKC-mediated ERK response

It is generally accepted that Gq activation leads to the production of DAG and IP3,

leading to the elevation of intracellular Ca2+

concentration. DAG and Ca2+

in turn lead to the

activation of most isoforms of PKC. How then can a ligand such as [Sar1Ile

8]AngII, that does not

engage Gq, activate the PKC-ERK pathway? Actually, PKC are comprised of at least 15

isomers which can be classified into 3 families: conventional PKCs (cPKCs) including PKCα,

PKCβ and PKCγ that are activated by Ca2+

and DAG, novel PKCs (nPKCs) including PKC,

PKC, PKC and PKC that are activated by DAG only and atypical PKCs (aPKCs) including

PKC and PKC that are not activated by Ca2+

nor by DAG, but by other, less understood

mechanisms (Wu-Zhang and Newton, 2013). We therefore hypothesized that [Sar1Ile

8]AngII

could activate atypical PKC isoforms PKC or PKC. To test this hypothesis, we used siRNA

directed against either PKC or PKC, and then measured the PKC-dependent ERK response.

Figure 8 shows that upon PKC depletion, the PKC-dependent ERK activity promoted by

[Sar1Ile

8]AngII was reduced by 55%. When PKC was depleted, PKC-dependent ERK activity

promoted by [Sar1Ile

8]AngII was reduced by 60%. Upon depletion of both isoforms

simultaneously, the PKC-dependent response elicited with [Sar1Ile

8]AngII was further

diminished by 75%. These results support a role for both atypical PKC isoforms PKC and PKC

in AT1 receptor signalling that may have previously been underestimated.

94

94

Figure 8. Atypical PKC-dependent ERK activation. HEK293 cells expressing the AT1 receptor

were transfected with siRNA against the indicated PKC isoforms as described in the methods.

Cells were stimulated with 100 nM Sar1Ile

8-AngII for 2 min at 37°C. ERK activity was

measured as described in the methods. Data are expressed as a percentage of AngII maximal

response. Data are the mean ± SD of 3-6 independent experiments performed in triplicate.

Quantification of ligand bias

Large variations in the potencies and efficacies of AngII analogs towards the different

signalling pathways were observed (Tables 2 and 3), which suggests the presence of signalling

bias. In order to clearly establish whether an analog was biased towards one pathway over the

others, the bias factors were determined for each analog and for all the signalling pathways.

Transduction ratios [log(/KA)] were first derived using the operational model (Table 4). The

95

95

log(/KA) of the reference compound AngII was then subtracted from the log(/KA) value of each

analog for a given pathway, yielding Δlog(/KA) as a within-pathway comparison for each

signalling pathway. The Δlog(/KA) value is indicative of how well a given signalling pathway

can be activated by a ligand, where a value of 0 indicates that a given ligand activates a pathway

to the same degree as the reference compound, a positive value indicating that the ligand more

strongly activates the signalling pathway than the reference compound and an increasingly

negative value indicating that the ligand poorly activates the signalling pathway, if at all. The

Δlog(/KA) values of each analog calculated for every signalling pathway was represented on a

radar plot (Figure 9). This allowed a graphic representation highlighting to what extent each

pathway can be activated (or not) by a given ligand. Ultimately, a between-pathway comparison

was achieved for a given ligand in the form of ΔΔlog(/KA), which is the actual bias factor

(Tables 5 and 6).

The different analogs were partitioned into 3 groups, based on their functional selectivity

profiles. The first group was comprised of the analogs modified solely at position 1, [Sar1]AngII

and AngIII (Table 5 and Fig. 9A). The analog [Sar1]AngII showed Δlog(/KA) values ranging

from -0.25 to 0.29, indicating that it is balanced relative to AngII (Fig. 9A). These results suggest

that position 1 of AngII is likely not an important molecular determinant for functional

selectivity towards the AT1 receptor. A second group of analogs included [Sar1Ile

4]AngII (Fig.

9B) and [Ile4]AngII that are modified at position 4 (Table 6). Figure 9B shows that

[Sar1Ile

4]AngII was a strong activator of both EGFR-dependent and PKC-dependent ERK

signalling with Δlog(/KA) values respectively of -1.51 and -1.72. The rank order of pathways

activated were as follows: βarrestin2 recruitment ((Δlog(/KA) of -2.35) , βarrestin1 recruitment

((Δlog(/KA) of -2.39), the G12 pathway (Δlog(/KA) of -2.49) and the Gq pathway (Δlog(/KA)

of -3.47). Table 6 shows that the biases of [Ile4]AngII and [Sar

1Ile

4]AngII towards EGFR-ERK

over Gq were 14-fold and 93-fold, respectively. The bias of [Ile4]AngII towards PKC-ERK over

Gq was 26-fold while for [Sar1Ile

4]AngII it was 57-fold. These represented the strongest biases

for AngII analogs modified at position 4. These results suggest that position 4 of AngII is likely

an important molecular determinant involved in functional selectivity towards the AT1 receptor.

The third group of analogs included [Sar1Ile

8]AngII (Figure 9C), [Ile

8]AngII (Figure 9D) and

[Ile8]AngIII (Figure 9E), that are modified at position 8. Figure 9C shows that for

[Sar1Ile

8]AngII, the rank order of pathways activated were as follows : βarrestin2 recruitment

96

96

Δlog(/KA) of -0.77), βarrestin1 recruitment (Δlog(/KA) of -0.79), the G12 pathway ((Δlog(/KA)

of -1.93) , EGFR-ERK ((Δlog(/KA) of -4.03) and PKC-ERK (Δlog(/KA) of -4.13). Analogs

[Ile8]AngII and [Ile

8]AngIII showed the same rank order of pathway activation than

[Sar1Ile

8]AngII, but were less proficient at recruiting both βarrestins and activating the G12

pathway. Since none of the analogs in this group activated the Gq pathway, no bias factor could

be calculated. However, this in itself represents an obviously strong bias of these ligands for all

the other pathways over the Gq pathway. Table 7 shows that the bias of [Sar1Ile

8]AngII towards

βarrestin2 over PKC-ERK was 2252-fold, while the bias of βarrestin1 over PKC-ERK was 2147-

fold. These represented the strongest biases found for AngII analogs modified at position 8.

These results confirm that position 8 of AngII is likely an important molecular determinant

involved in functional selectivity towards the AT1 receptor.

97

97

Figure 9. Effects of AngII analogs on AT1 signalling pathways. Radar graph representations

summarizing the calculated Δlog(/KA) values of the different ligand-activated pathways for

Sar1-AngII (A), Sar

1Ile

4-AngII (B), Sar

1Ile

8-AngII (C), Ile

8-AngII (D) and Ile

8-AngIII (E). The

balanced reference analog AngII is represented in blue.

98

98

DISCUSSION

Functional selectivity is a relatively new concept and its therapeutic potential is becoming

more and more acknowledged (Rominger, et al., 2014). Ligand bias is the ability of certain

ligands to stabilize distinct receptor-transducer pairs at the expense of others, leading to signal

pathway selectivity. The goal of our study was to identify biased ligands of the AT1 receptor and

to better characterize the molecular determinants of AngII that underlie functional selectivity. A

better understanding of the mechanisms leading to the recognition of distinct receptor-effector

states by biased ligands should lead to the development of better therapeutics with less off-target

effects. For this study, eleven AngII peptide analogs together with the reference ligand AngII

were selected to assess their functional selectivity profiles towards 6 different AT1 receptor

signalling outcomes. The pathways investigated were IP1 production (as a reporter of Gq

activation), βarrestin1 and βarrestin2 recruitment, G12 activation as assessed by a BRET

biosensor assay, and the ERK1/2 activation via either PKC activation or EGFR activation. The

ligands were chosen based on the previously characterised importance of positions 1, 4 and 8 for

AngII activity, as demonstrated by previous structure-activity relationship studies (Regoli, et al.,

1974; Holloway, et al., 2002).

We showed that the substitution of phenylalanine at position 8 of AngII for isoleucine

abolishes Gq signalling, whereas it maintains βarrestin recruitment, G12 and ERK activation. The

radar plot shown at Fig. 9 further indicates the strongest bias towards βarrestin recruitment.

[Ile8]AngII, [Sar

1Ile

8]AngII and [Ile

8]AngIII were antagonists for the Gq pathway, partial

agonists with relatively high efficacies for βarrestin recruitment and with lower efficacies for the

other pathways. It was known for a long time that AngII analogs containing an aliphatic residue

at position 8 are antagonists of the Gq pathway (Regoli, et al., 1974; Miura, et al., 1999). It was

only recently shown that these analogs can activate some pathways downstream of the AT1

receptor. For instance, it was shown that [Sar1Ile

8]AngII can activate total ERK (Holloway, et

al., 2002; Ahn, et al., 2004a) and recruit βarrestin (Zimmerman, et al., 2012; Ahn, et al., 2004b).

TRV027, an analog that contains D-Ala at position 8, is another recently developed biased ligand

towards β-arrestin recruitment (Violin, et al., 2010). These results suggest that the molecular

determinants present at position 8 of AngII contribute to AT1 receptor functional selectivity,

99

99

whereby Gq activation is abolished, while the G12, and βarrestin pathways are maintained and

ERK activity is strongly decreased.

Of particular interest, we found that [Sar1Ile

8]AngII, despite being unable to generate a

Gq-dependent response, was still able to activate ERK in an atypical PKC-dependent manner. It

was previously shown that PKC plays a role in AT1 receptor ERK activation in vascular smooth

muscle cells (Kim, et al., 2009; Liao, et al., 1997; Zhao, et al., 2005). These results support a role

for both atypical PKC isoforms PKC and PKC in AT1 receptor signalling that may have

previously been underestimated.

We showed that the substitution of aspartate at position 1 for sarcosine ([Sar1]AngII) or

its removal (AngIII) had very little impact on the capacity of the AT1 receptor to signal through

the different pathways tested (Table 5 and Fig. 9A). It has been long known that sarcosine at

position 1 of AngII peptides confers resistance to aminopeptidase degradation in vivo (Hall, et

al., 1974). Substitution at position 1 of AngII was seen to have little or no impact on smooth

muscle contraction (an assay dependent on Gq activation) (Hall, et al., 1974), on inositol

phosphates production (Holloway, et al., 2002) or on total ERK activation (Miura, et al., 2004).

Here, we further showed that substitution at position 1 of AngII also had no impact on G12

activation, EGFR transactivation and βarrestin recruitment. Altogether, these results suggest that

position 1 of AngII peptides has very little impact on AT1 receptor functional selectivity.

We showed that the substitution of tyrosine at position 4 of AngII for isoleucine caused a

bias towards ERK signalling. Both [Ile4]AngII and [Sar

1Ile

4]AngII are full agonists for PKC-

dependent and EGFR-dependent ERK activity, but partial agonists for the G12, βarrestin and Gq

pathways. Although the substitution of Tyr4 for Ile

4 decreased the potency for activation of all

the pathways, this decrease was markedly less for the ERK pathway. This modification at

position 4 appears to stabilize a receptor conformation that preferentially interacts with the

effectors of the ERK pathway. To our knowledge, we are the first to evaluate and compare the

impact of position 4 of AngII on different signalling pathways using a single model. We are also

the first to evaluate the impact of position 4 on G12 activation. It was previously shown that

[Sar1Ile

4]AngII is a partial agonist of the Gq pathway in CHO-K1 cells (Miura, et al., 2004).

Substitution at position 4 was also shown to decrease AngII potency and efficacy in smooth

muscle contraction assays (Regoli, et al., 1974; Samanen, et al., 1989). A previous report

indicated that substitutions at position 4 of AngII had very little impact on ERK activation in

100

100

CHO-K1cells (Holloway, et al., 2002). These results suggest that the molecular determinants

present at position 4 of AngII contribute to AT1 receptor functional selectivity, whereby ERK

activity is maintained while the G12, Gq and βarrestin pathways are negatively impacted.

In conclusion, the purpose of our study was to establish the impact of positions 1, 4 and 8

of AngII on different signalling pathways downstream of the AT1 receptor and thus gain some

insight into whether these molecular determinants of AngII were involved in conferring

functional selectivity. Our study reveals that position 1 of AngII does not confer functional

selectivity, while position 4 confers a bias towards ERK signalling over Gq signalling and that

position 8 confers a bias towards βarrestin recruitment over ERK activation and Gq signalling.

101

101

AUTHORSHIP CONTRIBUTIONS

Participated in research design : Domazet, Holleran, Lavigne, Escher, Leduc and Guillemette

Conducted experiments : Domazet, Holleran, Richard, Vanderberghe

Performed data analysis : Domazet, Holleran, Richard, Vanderberghe, Lavigne, Escher, Leduc

and Guillemette

Contributed to the writing of the manuscript : Domazet, Holleran, Leduc and Guillemette

102

102

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105

105

FOOTNOTES

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes of Health Research [MOP-

136770].

This work is part of the Ph.D thesis of I. Domazet.

106

106

TABLES

Table 1

Binding properties of AT1 receptor ligands

Kd (nM) n

AngII 1.1 ± 0.3 12

[Sar1]-AngII 1.8 ± 0.1 3

[Ile4]-AngII 894 ± 132 3

[Ile8]-AngII 3.2 ± 1.1 3

[Sar1Ile

4]-AngII 78 ± 11 3

[Sar1Ile

8]-AngII 1.7 ± 0.8 3

[Ile4Ile

8]-AngII 1254 ± 198 4

[Sar1Ile

4Ile

8]-AngII 223 ± 38 3

AngIII 5.2 ± 2.1 4

[Ile4]-AngIII 3689 ± 2027 3

[Ile8]-AngIII 12.3 ± 5.1 3

[Ile4Ile

8]-AngIII 5783 ± 1408 3

HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor were assayed as described in “Experimental

Procedure.” Binding affinities (Kd) are expressed as the means ± SD of values obtained in n

independent experiments performed in duplicate.

107

107

Table 2

Activation of Gq, βarrestin1, βarrestin2 and G12 by AT1 receptor ligands

Gq βarrestin1 βarrestin2 G12

EC50 (nM) Emax

(%

AngII)

EC50 (nM) Emax

(%

AngII)

EC50 (nM) Emax

(%

AngII)

EC50 (nM) Emax

(%

AngII)

AngII 2.4 ± 1.6 100 6.1 ± 1.7 100 4.6 ± 1.9 100 4.7 ± 1.9 100

[Sar1]-AngII 3.3 ± 0.8 98 ± 8 6.4 ± 3.0 100 ± 1 5.6 ± 2.3 94 ± 5 5.1 ± 2.0 104 ± 8

[Ile4]-AngII 3104 ±

106

67 ± 2 2802 ±

670

72 ± 6 3829 ±

649

84 ± 8 1056 ±

321

60 ± 9

[Sar1Ile

4]-

AngII

686 ± 52 43 ± 7 429 ± 126 81 ± 4 458 ± 158 86 ± 3 228 ± 62 65 ± 5

[Ile8]-AngII NR NR 7.0 ± 1.6 54 ± 6 5.7 ± 2.7 59 ± 6 3.5 ± 1.4 42 ± 5

[Sar1Ile

8]-

AngII

NR NR 4.5 ± 1.9 56 ± 6 5.6 ± 2.0 61 ± 8 1.0 ± 0.6 44 ± 6

AngIII 51 ± 19 87 ± 8 54 ± 8 94 ± 3 48 ± 16 93 ± 9 90 ± 33 98 ± 7

[Ile8]-AngIII NR NR 11.3 ± 1.0 50 ± 10 49 ± 2 48 ± 11 12.3 ± 7.1 38 ± 6

HEK293 cells expressing the AT1 receptor were assayed as described in the methods. EC50 and

Emax are expressed as the means ± SD of values obtained in at least 3 independent experiments

performed in triplicate. NR, no response.

108

108

Table 3

Activation of Gq, PKC-ERK and EGFR-ERK by AT1 receptor ligands

Gq PKC-ERK EGFR-ERK

EC50 (nM) Emax

(%

AngII)

EC50 (nM) Emax

(%

AngII)

EC50 (nM) Emax

(%

AngII)

AngII 2.4 ± 1.6 100 1.2 ± 0.1 100 2.8 ± 0.5 100

[Sar1]-AngII 3.3 ± 0.8 98 ± 8 3.0 ± 0.9 92 ± 4 4.2 ± 1.9 94 ± 2

[Ile4]-AngII 3104 ±

106

67 ± 2 523 ± 93 80 ± 10 1327 ±

264

93 ± 8

[Sar1Ile

4]-AngII 686 ± 52 43 ± 7 32 ± 5 94 ± 7 50 ± 9 95 ± 5

[Ile8]-AngII NR NR 55 ± 13 38 ± 4 40 ± 14 27 ± 3

[Sar1Ile

8]-AngII NR NR 45 ± 14 28 ± 4 11 ± 3 27 ± 1

AngIII 51 ± 19 87 ± 8 4.0 ± 0.6 88 ± 3 9.2 ± 1.9 88 ± 3

[Ile8]-AngIII NR NR 40 ± 5 25 ± 3 21 ± 4 30 ± 4

HEK293 cells stably expressing the AT1 receptor were assayed as described in the methods.

EC50 and Emax are expressed as the means ± SD of values obtained in at least 3 independent

experiments performed in duplicate. NR, no response.

109

109

Table 4

Transduction ratios of AT1 receptor ligands

Gq βarrestin1 βarrestin2 G12 PKC-ERK EGFR-ERK

log(/KA) Δlog(/KA) log(/KA) Δlog(/KA) log(/KA) Δlog(/KA) log(/KA) Δlog(/KA) log(/KA) Δlog(/KA) log(/KA) Δlog(/KA)

AngII 8.46 ± 0.07 0.00 ± 0.10 8.29 ±

0.12

0.00 ± 0.16 8.42 ± 0.06 0.00 ± 0.08 8.25 ± 0.07 0.00 ± 0.10 8.96 ± 0.04 0.00 ± 0.06 8.76 ±

0.04

0.00 ± 0.06

[Sar1]-AngII 8.75 ± 0.07 0.29 ± 0.09 8.40 ±

0.28

0.11 ± 0.29 8.24 ± 0.06 -0.18 ±

0.08

8.48 ± 0.22 0.23 ± 0.23 8.72 ± 0.12 -0.25 ± 0.12 8.55 ±

0.15

-0.22 ± 0.15

[Ile4]-AngII 4.50 ± 0.41 -3.95 ± 0.41 5.25 ±

0.07

-3.04 ± 0.13 5.27 ± 0.08 -3.15 ±

0.10

5.02 ± 0.22 -3.23 ±

0.22

6.43 ± 0.24 -2.53 ± 0.24 5.94 ±

0.13

-2.82 ± 0.13

[Sar1Ile

4]-AngII 4.98 ± 0.23 -3.47 ± 0.23 5.90 ±

0.17

-2.39 ± 0.20 6.07 ± 0.18 -2.35 ±

0.18

5.76 ± 0.16 -2.49 ±

0.18

7.24 ± 0.36 -1.72 ± 0.36 7.26 ±

0.22

-1.51 ± 0.10

[Ile8]-AngII ND ND 6.81 ±

0.36

-1.48 ± 0.37 7.63 ± 0.20 -0.79 ±

0.20

5.15 ± 0.45 -3.10 ±

0.45

4.98 ± 0.20 -3.99 ± 0.20 4.96 ±

0.22

-3.81 ± 0.22

[Sar1Ile

8]-AngII ND ND 7.50 ±

0.38

-0.79 ± 0.39 7.65 ± 0.22 -0.77 ±

0.23

6.32 ± 0.56 -1.93 ±

0.56

4.84 ± 0.16 -4.13 ± 0.16 4.74 ±

0.04

-4.03 ± 0.05

AngIII 6.65 ± 0.12 -1.80 ± 0.14 7.29 ±

0.19

-0.99 ± 0.22 7.32 ± 0.16 -1.10 ±

0.16

7.25 ± 0.27 -1.00 ±

0.27

8.26 ± 0.05 -0.70 ± 0.06 8.39 ±

0.15

-0.37 ± 0.15

[Ile8]-AngIII ND ND 5.66 ±

0.16

-2.63 ± 0.19 5.55 ± 0.20 -2.87 ±

0.21

4.64 ± 0.15 -3.61 ±

0.16

4.55 ± 0.08 -4.42 ± 0.09 4.95 ±

0.18

-3.81 ± 0.18

110

110

HEK293 cells expressing the AT1 receptor were stimulated with the different analogs and responses were measured for 6 distinct signalling pathways. Data were analysed by

nonlinear regression using the Operational Model equation as described in the methods to determine log(/KA). Δlog(/KA) were calculated from log(/KA) using AngII as the

reference ligand. Data are the mean ± SEM of 3-6 independent experiments performed in triplicate. ND, Cannot be determined.

Table 5

Bias factors of AT1 receptor ligands modified at position 1

AngII [Sar1]-AngII AngIII

ΔΔlog(/KA

) BF

ΔΔlog(/KA

) BF ΔΔlog(/KA) BF

EGFR/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 -0.51 ± 0.18 0.31 1.43 ± 0.21 26.99

PKC/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 -0.54 ± 0.16 0.29 1.10 ± 0.16 12.63

G12/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 -0.06 ± 0.25 0.86 0.80 ± 0.31 6.35

βarrestin1/Gq 0.00 ± 0.19 1.00 -0.19 ± 0.32 0.65 0.80 ± 0.27 6.34

βarrestin2/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 -0.48 ± 0.13 0.33 0.70 ± 0.22 5.04

EGFR/βarrestin2 0.00 ± 0.11 1.00 -0.03 ± 0.18 0.93 0.73 ± 0.23 5.36

EGFR/βarrestin1 0.00 ± 0.17 1.00 -0.33 ± 0.34 0.47 0.63 ± 0.27 4.24

EGFR/G12 0.00 ± 0.12 1.00 -0.45 ± 0.28 0.93 0.63 ± 0.32 4.26

PKC/βarrestin2 0.00 ± 0.11 1.00 -0.06 ± 0.15 0.87 0.40 ± 0.18 2.51

PKC/βarrestin1 0.00 ± 0.17 1.00 -0.36 ± 0.32 0.44 0.30 ± 0.18 1.98

PKC/G12 0.00 ± 0.12 1.00 -0.48 ± 0.26 0.33 0.30 ± 0.29 1.99

EGFR/PKC 0.00 ± 0.09 1.00 -0.03 ± 0.20 0.94 0.33 ± 0.23 2.14

βarrestin1/βarrestin2 0.00 ± 0.19 1.00 0.30 ± 0.31 1.98 0.10 ± 0.28 1.74

βarrestin1/G12 0.00 ± 0.19 1.00 -0.12 ± 0.38 0.75 0.10 ± 0.36 1.50

βarrestin2/G12 0.00 ± 0.14 1.00 -0.42 ± 0.25 0.38 0.01 ± 0.33 1.01

ΔΔlog(/KA) and BF values were calculated as described in the methods. Data are the mean

± SEM of 3-6 independent experiments performed in triplicate.

112

112

Table 6


AngII [Ile4]-AngII [Sar

1Ile

4]-AngII

ΔΔlog(/KA

) BF

ΔΔlog(/KA

) BF

ΔΔlog(/KA

) BF

EGFR/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 1.13 ± 0.44 13.53 1.97 ± 0.26 92.69

PKC/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 1.42 ± 0.48 26.24 1.76 ± 0.43 57.10

βarrestin2/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 0.80 ± 0.43 6.36 1.12 ± 0.30 13.27

βarrestin1/Gq 0.00 ± 0.19 1.00 0.92 ± 0.44 8.23 1.08 ± 0.31 12.11

G12/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 0.72 ± 0.47 5.29 0.98 ± 0.30 9.66

EGFR/G12 0.00 ± 0.12 1.00 0.41 ± 0.27 2.56 0.98 ± 0.20 9.60

EGFR/βarrestin1 0.00 ± 0.17 1.00 0.22 ± 0.19 1.64 0.88 ± 0.23 7.66

EGFR/βarrestin2 0.00 ± 0.11 1.00 0.33 ± 0.17 2.13 0.84 ± 0.21 6.99

PKC/G12 0.00 ± 0.12 1.00 0.70 ± 0.33 4.96 0.77 ± 0.40 5.91

PKC/βarrestin1 0.00 ± 0.17 1.00 0.50 ± 0.28 3.19 0.67 ± 0.42 4.72

PKC/βarrestin2 0.00 ± 0.11 1.00 0.62 ± 0.26 4.13 0.63 ± 0.41 4.30

βarrestin2/G12 0.00 ± 0.14 1.00 0.08 ± 0.25 1.20 0.14 ± 0.26 1.37

βarrestin1/G12 0.00 ± 0.19 1.00 0.19 ± 0.27 1.56 0.10 ± 0.27 1.25

βarrestin1/βarrestin2 0.00 ± 0.19 1.00 0.11 ± 0.17 1.29 -0.04 ± 0.28 0.91

PKC/EGFR 0.00 ± 0.09 1.00 0.29 ± 0.28 1.94 -0.21 ± 0.38 0.62


± SEM of 3-6 independent experiments performed in triplicate.

113

113

Table 7


AngII [Ile8]-AngII [Sar

1Ile

8]-AngII [Ile

8]-AngIII

ΔΔlog(/KA

) BF

ΔΔlog(/KA

) BF

ΔΔlog(/KA

) BF

ΔΔlog(/KA

) BF

βarrestin2/PKC 0.00 ± 0.11 1.00 3.19 ± 0.29 1547.

8

3.35 ± 0.29 2252.

1

1.54 ± 0.23 34.88

βarrestin1/PKC 0.00 ± 0.17 1.00 2.50 ± 0.43 316.3 3.33 ± 0.43 2147.

7

1.78 ± 0.22 60.76

βarrestin2/EGFR 0.00 ± 0.11 1.00 3.02 ± 0.31 1035.

3

3.26 ± 0.24 1803.

9

0.94 ± 0.28 8.74

βarrestin1/EGFR 0.00 ± 0.17 1.00 2.33 ± 0.44 211.6

1

3.24 ± 0.40 1720.

3

1.18 ± 0.27 15.22

G12/PKC 0.00 ± 0.12 1.00 0.88 ± 0.50 7.62 2.19 ± 0.59 155.0

0

0.81 ± 0.19 6.42

G12/EGFR 0.00 ± 0.12 1.00 0.71 ± 0.51 5.10 2.09 ± 0.57 124.1

6

0.21 ± 0.25 1.61

βarrestin2/ G12 0.00 ± 0.14 1.00 2.31 ± 0.50 203.1

3

1.16 ± 0.61 14.53 0.74 ± 0.27 5.43

βarrestin1/ G12 0.00 ± 0.19 1.00 1.62 ± 0.59 41.52 1.14 ± 0.69 13.86 0.98 ± 0.25 9.47

PKC/EGFR 0.00 ± 0.09 1.00 0.17 ± 0.31 1.49 0.10 ± 0.18 1.25 0.60 ± 0.21 3.99

βarrestin2/

βarrestin1

0.00 ± 0.19 1.00 -0.69 ± 0.43 0.20 -0.02 ± 0.5 0.95 0.24 ± 0.29 1.74

βarrestin1 /Gq 0.00 ± 0.19 1.00 ND ND ND ND ND ND

βarrestin2/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 ND ND ND ND ND ND

G12/Gq 0.00 ± 0.14 1.00 ND ND ND ND ND ND

PKC/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 ND ND ND ND ND ND

EGFR/Gq 0.00 ± 0.12 1.00 ND ND ND ND ND ND


± SEM of 3-6 independent experiments performed in triplicate. ND, Cannot be determined.

114

114

DISCUSSION

Les GPCRs sont les protéines les plus nombreuses et le plus diversifiés impliqués

dans la transduction du signal. De 500 à 1000 GPCRs sont encodés parmi les 25000 gènes

humains soit plus de 2% du génome total (Kroeze, et al., 2003). La majorité des

médicaments disponibles sur le marché ont leurs effets thérapeutiques via un ou plusieurs

GPCRs d‟où l‟importance de comprendre leur structure et leur activation.

L‟Ang II, est une hormone jouant un rôle important dans l‟homéostasie

cardiovasculaire (de Gasparo, et al., 2000). Le récepteur AT1 médie la majorité des effets

physiologiques de l‟Ang II : vasoconstriction, sécrétion de l‟aldostérone (rétention Na+),

croissance cellulaire, stimulation du système sympathique (libération de la noradrénaline),

sécrétion de la vasopressine et sensation de la soif. L‟antagoniste non peptidique du

récepteur AT1, le losartan, est utilisé fréquemment dans le traitement de l‟hypertension.

Il est bien connu que les sept domaines transmembranaires (TM) des GPCRs

contribuent à former la pochette de liaison du ligand. Afin d‟identifier les acides aminés du

TM2 et du TM5 impliqués dans la formation de la pochette de liaison du récepteur AT1,

nous avons utilisé l‟approche SCAM (Substituted Cysteine Accessibility Method) qui

consiste à évaluer les propriétés de liaison du récepteur suite à sa réaction avec le

methanethiosulfonate (MTSEA). Le MTSEA alkyle les cystéines endogènes ou introduites

par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement stérique qui interfère avec la

liaison du ligand. Afin d‟identifier les changements structuraux qui se produisent lors de

l‟activation du récepteur AT1, nous avons utilisé l‟approche SCAM avec le récepteur AT1

humain de type sauvage et avec un mutant constitutivement actif, le N111G-AT1.

Pour le TMD2, une série de mutants ont été produits en remplaçant successivement

par une cystéine les résidus 70 à 94 du récepteur AT1 et de son mutant constitutivement

actif N111G-AT1.

Le récepteur AT1 possède 10 cystéines endogènes (fig.1-article1). Parmi ces

cystéines, quatre sont impliquées dans la formation de ponts disulfures. Une autre cystéine

(Cys-355) est orientée du côté intracellulaire et pourrait être palmitoylée. Ces cinq

cystéines ne sont probablement pas disponibles pour l‟alkylation par le réactif MTSEA. Les

cinq autres cystéines sont situées dans les domaines transmembranaires. Avant de procéder

115

115

à la substitution systématique de chacun des résidus du TM2 par des cystéines, il fallait

donc s‟assurer que les cystéines endogènes ne sont pas alkylées par le réactif MTSEA.

Nous avons montré que le récepteur AT1 de type sauvage est insensible au traitement par le

MTSEA à des concentrations aussi fortes que 6 mM. Ce résultat suggère que les cystéines

endogènes ne sont pas alkylées par le MTSEA ou que leur alkylation n‟a pas d‟effet sur les

propriétés de liaison du récepteur. Afin d‟exclure la possibilité que le MTSEA puisse

alkyler une cystéine du côté intracellulaire du récepteur AT1, nous avons effectué les

expériences avec des cellules intactes de façon à ce que uniquement le seul côté

extracellulaire du récepteur puisse être accessible au traitement par le MTSEA.

Avant de traiter les récepteurs mutants cystéine avec le MTSEA, nous avons évalué

leur capacité à lier le ligand 125

I-[Sar1,Ile

8]AngII. La majorité de nos mutants cystéine

conservent leur capacité à lier le ligand 125

I-[Sar1,Ile

8]AngII, suggérant que la mutation

n‟affecte pas la conformation globale du récepteur et que les récepteurs mutants sont bel et

bien exprimés à la surface cellulaire. Dans le cadre de notre étude sur les TM2 et TM5,

nous avons montré que les mutants P82C(2.58)

, W84C(2.60)

, Y87C(2.63)

, Y92C(2.68)

, W94C(2.70)

,

G196C(5.39)

, K199C(5.42)

et P207(5.50)

avaient perdu leur capacité à lier le 125

I-

[Sar1,Ile

8]AngII. Dans ce cas, on peut penser que soit ces mutants ne s‟expriment pas à la

surface cellulaire ou que leur conformation globale a changé suffisamment pour perdre

toute capacité de liaison. De plus, dans le cas du récepteur mutant W84C(2.60)

, une des

hypothèse est qu‟il pourrait s‟agir possiblement de ponts disulfure aberrants formé avec

l‟un des autres 10 cystéines endogènes. Sachant qu‟on retrouve les ponts disulfures dans les

domaines extracellulaires du récepteur AT1 et que le résidu W84(2.60)

est situé tout en haut

du domaine transmembranaire, ce résidu aurait pu possiblement réagir avec une cystéine

endogène en présence de l‟enzyme PDI (protéine disulfide isomérase) au niveau du

réticulum endoplasmique. Ceci aurait pour l‟effet la formation un pont disulfure aberrant,

et cette mauvaise conformation du récepteur serait incapable de reconnaitre et lier le

peptide.

Pour ce qui est du TM2, nous avons identifié 5 résidus sensibles au traitement par le

MTSEA. Suite au prétraitement avec le MTSEA, les mutants D74C(2.50)

, L81C(2.57)

,

A85C(2.61)

, T88C(2.64)

et A89C(2.65)

ont montré une diminution significative de liaison de

125I-[Sar

1,Ile

8]AngII

, suggérant que ces résidus sont orientés vers la pochette de liaison du

116

116

récepteur AT1. Il est intéressant de mentionner que les résidus D74C (2.50)

et L81C(2.57)

sont

situés dans le milieu du domaine transmembranaire alors que les résidus A85C(2.61)

,

T88C(2.64)

et A89C(2.65)

se retrouvent dans le haut du domaine transmembranaire. Ceci

suggère que les résidus capables d‟interagir avec le ligand se retrouvent dans cette portion

du TM2. De plus, on peut dire que le résidu Ala-89(2.65)

délimite le haut de la pochette de

liaison et que le résidu Asp-74(2.50)

délimite le bas de la pochette de liaison du récepteur

AT1. Les trois autres résidus (Leu-81(2.57)

, Ala-85(2.61)

et Thr-88 (2.64)

seraient situés sur la

même face hélicoïdale à l‟état basal du récepteur et donc exposés vers l‟environnement

hydrophile de la pochette de liaison (voir fig.8). Par un mécanisme stérique, électrostatique

ou autre, l‟alkylation de ces résidus empêche la liaison du 125

I-[Sar1,Ile

8]AngII .

Afin de confirmer que les résidus sensibles sont orientés vers la pochette de liaison,

nous avons effectué le test de protection qui consiste à ajouter un ligand compétitif avant le

traitement au MTSEA. Le principe est qu‟un ligand compétitif occupera la pochette de

liaison et protégera les résidus sensibles de l‟alkylation par le MTSEA. Le ligand

compétitif [Sar1,Ile

8]AngII a protégé tous les résidus sensibles de l‟alkylation par le

MTSEA, ce qui renforce l‟idée que ces 5 résidus du TMD2 sont orientés vers la pochette de

liaison.

Même si un autre mutant cystéine (L83C(2.59)

-AT1) a démontré une certaine

sensibilité au traitement MTSEA (voir fig.3B-article1), on considère que ce résidu (Leu-83)

n‟est pas situé dans la pochette de liaison pour deux raisons : 1) ce résidu n‟est pas situé sur

la même face hélicoïdale que les autres résidus sensibles; 2) dans le contexte du récepteur

constitutivement actif, le mutant L83C(2.59)

-N111G-AT1 n‟a montré aucune capacité de

liaison. Ces résultats suggèrent que le résidu Leu-83 serait plutôt impliqué dans le maintien

de la bonne conformation globale du récepteur.

Nos résultats suggèrent que les résidus Asp-74(2.50)

, Leu-81(2.57)

, Ala-85(2.61)

, Val-

86(2.62)

, Thr-88(2.64)

et Ala-89(2.65)

sont orientés vers la pochette de liaison du récepteur AT1.

Ces résultats sont en accord avec les conclusions de plusieurs autres études qui ont

caractérisé divers récepteurs comme la rhodopsine bovine (Palczewski, et al., 2000), la

rhodopsine du calmar (Murakami and Kouyama, 2008), l‟opsine (Park, et al., 2008), le

récepteur CXCR1 (Park, et al., 2012), le récepteur D3 de la dopamine (Chien, et al., 2010)

et le récepteur D2 de la dopamine (Javitch, et al., 1999). Par exemple, le résidu Thr-94(2.61)

117

117

est un des points de contact avec le rétinal dans la structure cristalline de la rhodopsine

bovine (Palczewski, et al., 2000) alors que le résidu Asn-87(2.57)

est un des points de contact

du rétinal dans la structure cristalline de la rhodopsine du calmar (Murakami et Kouyama,

2008). La récente structure cristalline du récepteur D3 de la dopamine lié à un antagoniste

(forme inactive du récepteur) montre que le résidu Val-86(2.61)

interagit directement avec le

ligand (Chien, et al., 2010). L‟utilisation de l‟approche SCAM sur le récepteur D2 de la

dopamine a montré que les résidus Asp-80(2.50)

, Val-87(2.57)

, Val-91(2.61)

, Val-92(2.62)

, Leu-

94(2.64)

et Glu-95(2.65)

sont orientés vers la pochette de liaison (Javitch, et al., 1999). La

structure cristalline du récepteur muscarinique M3 lié à un bronchodilatateur tiotropium

(antagoniste) suggère que la position 2.61 (Phe-124) est située à côté de la pochette de

liaison et que cette position jouerait un rôle important dans l‟activation du récepteur ainsi

que dans la sélectivité du ligand (Kruse, et al., 2012). Dans le cas du récepteur CXCR1, le

résidu Asp-85(2.50)

est orienté vers la pochette de liaison et ce résidu serait également

important pour la liaison du ligand et la transduction du signal (Park, et al., 2012).

Nous avons également utilisé l‟approche SCAM afin de déterminer la position

relative de chaque domaine transmembranaire suite à l‟activation du récepteur. Il est

important de mentionner que nous avons étudié l‟accessibilité du ligand suite à l‟alkylation

du récepteur par le MTSEA dans un contexte de récepteur de type sauvage (AT1) et dans un

contexte du récepteur constitutivement actif (N111G-AT1). L‟isomérisation de la forme

inactive vers la forme active du récepteur se fait suite à la liaison du ligand. Toutefois,

certaines mutations peuvent rendre un récepteur constitutivement actif, et ce, en absence du

ligand. En remplaçant le résidu Asn-111 par un résidu plus petit, tel que la glycine ou

l‟alanine, le récepteur AT1 adopte la conformation active sans la présence du ligand

agoniste (Balmforth, et al., 1997; Groblewski, et al., 1997; Feng, et al., 1998). Il est bien

connu que le mutant constitutivement actif N111G-AT1 active la voie classique de la

signalisation du récepteur AT1 (la voie Gq/PLC) en absence du ligand, mais nous avons

aussi testé ce mutant pour les autres voies de signalisation (la voie G12, recrutement de

l‟arrestine) et nous avons observé une augmentation d‟activation pour ces deux voies de

signalisation également (résultats non montrés) ce qui confirme que ce mutant est un bon

modèle pour étudier le récepteur dans sa forme active.

118

118

Nous avons déterminé l‟accessibilité du ligand 125

I-[Sar1,Ile

8]AngII dans un

contexte du récepteur constitutivement actif (N111G-AT1) et les résultats obtenus ont été

comparés avec ceux du récepteur à l‟état basal. Dans le contexte du récepteur N111G-AT1,

les mutants A85C(2.61)

-N111G-AT1, T88C(2.64)

-N111G-AT1 et A89C(2.65)

-N111G-AT1 ont

maintenu leur sensibilité au MTSEA alors que le mutant D74C(2.50)

-N111G-AT1 est devenu

insensible au MTSEA et que la sensibilité de L81C(2.57)

-N111G-AT1 fut grandement

diminuée. Par contre, le mutant V86C(2.62)

-N111G-AT1 s‟est avéré sensible au MTSEA

(voir Fig.3 versus fig.5-article1). Ainsi, suite à l‟activation du récepteur AT1, le résidu Asp-

74(2.50)

qui est situé plutôt vers le bas du domaine transmembranaire serait déplacé à

l‟extérieur de la pochette de liaison (fig.8-article1).

De façon intéressante, nos résultats suggèrent que dans le contexte du récepteur

constitutivement actif, les résidus Leu-81(2.57)

et Ala-85(2.61)

sont orientés vers la pochette de

liaison. Ces résultats sont compatibles avec la structure cristalline de l‟opsine. En effet, les

résidus Phe-91(2.57)

et Thr-94(2.61)

participent à la formation de la pochette de liaison de

l‟opsine à l‟état actif (Park, et al., 2008; Hildebrand, et al., 2009). Egalement, la structure

cristalline de la métarhodopsine montre que le résidu Thr-94(2.61)

est orienté vers la pochette

de liaison (Choe, et al., 2011).

Dans nos essais de protection, le ligand compétitif [Sar1,Ile

8]AngII a été capable de

protéger de façon efficace tous les mutants sensibles au traitement MTSEA (L81C(2.57)

-

N111G-AT1, A85C(2.61)

-N111G-AT1, T88C(2.64)

-N111G-AT1, V86C(2.62)

-N111G-AT1 et

A89C(2.65)

-N111G-AT1), ce qui suggère que ces résidus sont orientés vers la pochette de

liaison du récepteur AT1 (fig.6-article1).

Notre étude montre que le résidu en position 2.50, un acide aspartique très

conservé chez la majorité des GPCRs de la classe A, semble orienté vers la pochette de

liaison à l‟état basal mais pas à l‟état actif du récepteur AT1. Ce résidu est connu pour être

important dans l‟activation des GPCRs (Gether and Kobilka, 1998; Baldwin, 1993; Proulx,

et al., 2008; Cabana, et al., 2013). Il a été suggéré que l‟Asp-74(2.50)

fait partie d‟un réseau

des liens intramoléculaires impliquant les TM2 et TM7. En effet, la structure cristalline de

la rhodopsine de calmar montre que le groupement carboxyle du résidu Asp-80(2.50)

interagit directement avec la chaine latérale de l‟Asn-311(7.61)

(Murakami and Kouyama,

2008). Puisque la position 2.50 et le motif NPxxY du TM7 sont hautement conservés dans

119

119

les GPCRs de la classe A, il serait possible que cette interaction TM2-TM7 soit un facteur

commun chez plusieurs GPCRs (Miura, et al., 2003).

Nos résultats montrant que le résidu Asp-74(2.50)

est déplacé de la pochette de liaison

suite à l‟activation du récepteur suggèrent que ce résidu pourrait former des liens

intramoléculaires avec d‟autres domaines transmembranaires. Une récente étude de

simulation de dynamique moléculaire (Cabana, et al., 2013) met en évidence l‟importance

de la position 2.50 et de sa capacité à former des liens intramoléculaires. Cette étude

suggère que le résidu Asp-74(2.50)

forme un réseau de liens hydrogène avec le résidu Asn-

111(3.35)

et Asn-295(7.46)

à l‟état basal du récepteur AT1. Par contre, à l‟état actif (N111G-

AT1) ce réseau de liens hydrogène est brisé et le résidu Asp-74(2.50)

se réoriente vers le TM1

et fait un lien avec un autre résidu fortement conservé qui est l‟Asn-46(1.50)

. Dans ce cas, on

parle du réseau de liens hydrogène D74(2.50)

-N295(7.46)

-N46(1.50)

. Ces résultats suggèrent un

potentiel pour la formation des liens hydrogène entre Asp-74(2.50)

et Asn-46(1.50)

suite à

l‟activation du récepteur. Ceci pourrait expliquer le fait que suite à l‟activation du récepteur

AT1, le résidu Asp-74(2.50)

s‟oriente vers le TM1 et devient donc indisponible pour

l‟alkylation par le MTSEA.

Pour évaluer la position relative des domaines transmembranaires par rapport à la

pochette de liaison, nous avons comparé les résidus sensibles à l‟état basal à ceux sensibles

à l‟état constitutivement actif. La simple substitution d‟une asparagine pour une glycine à la

position 111 du TM3 fait en sorte que plusieurs résidus du TM2 changent leur orientation

par rapport à la pochette de liaison du récepteur AT1. Nos résultats suggèrent un

changement structural majeur au cours de l‟activation du récepteur AT1. Dans le mutant

constitutivement actif, nous avons démontré que le résidu Val-86(2.62)

situé dans le haut du

TM2 devient sensible à l‟alkylation par le MTSEA. Dans une représentation en roue

hélicale, le résidu Val-86 est situé complètement à la droite de la même face hélicale

composée des autres résidus sensibles au MTSEA identifiés à l‟état basal du récepteur

(Thr-88(2.64)

, Leu-81(2.57)

, Ala-85(2.61)

et Ala-89(2.65)

) (fig.8-article1). Nous avons vu que le

mutant D74C(2.50)

-N111G-AT1 est devenu complètement insensible au MTSEA, alors que

la sensibilité de L81C(2.57)

-N111G-AT1 fut sensiblement diminuée. L‟explication la plus

simple des changements observé pour les mutants cystéine à l‟état basal et à l‟état actif

serait que le TM2 subit un mouvement de pivot intégral, favorisant le rapprochement du

120

120

haut du TM2 vers la pochette de liaison tout en éloignant le bas du TM2 de la pochette de

liaison. Ce simple mouvement de pivot suite à l‟activation du récepteur rapprocherait le

résidu Val-86(2.62)

vers la pochette de liaison tout en excluant le résidu Asp-74(2.50)

de la

pochette. Cette interprétation de nos résultats correspond à un des quatre mouvements

simples mais variés (pivot, rotation, translation et piston) que les domaines

transmembranaires peuvent subir dans la bicouche lipidique (Matthews, et al., 2006). Une

autre étude utilisant l‟approche SCAM avec le récepteur AT1 de rat ayant la mutation

N111G a proposé que l‟activation cause une simple rotation du TM2 (Miura and Karnik,

2002). Dans cette étude, les auteurs ont observé une diminution dans l‟accessibilité des

résidus situés dans le bas du TM2. Cette conclusion est en partie compatible avec la nôtre

en ce sens qu‟un mouvement de pivot peut aussi expliquer que le bas du TM2 soit repoussé

à l‟extérieur de la pochette de liaison.

En conclusion, nous avons démontré que le TM2 participe à la formation de la

pochette de liaison du récepteur AT1. En comparant les résultats obtenus pour le récepteur

AT1 à l‟état basal et à l‟état actif, nous avons suggéré que l‟activation du récepteur implique

un mouvement de pivot qui expose le résidu Val-86(2.62)

vers la pochette de liaison. Ce

mouvement de pivot éloigne de la pochette de liaison le résidu Asp-74(2.50)

situé dans le bas

du TM2. Ce mouvement de pivot du TM2 pourrait être une caractéristique commune à

l‟activation d‟autres GPCRs de la classe A.

Après avoir identifié les acides aminés du TM2 qui sont orientés vers la pochette de

liaison du récepteur AT1, nous nous sommes intéressés au TM5. Par conséquent, nous

avons utilisé la même approche SCAM afin d‟identifier les résidus du TM5 qui sont

orientés vers la pochette de liaison. Une série de mutants ont été produits en remplaçant

successivement par une cystéine les résidus 190 à 217 du TM5 du récepteur AT1 et de son

mutant constitutivement actif N111G-AT1.

Après le prétraitement avec le MTSEA, les mutants L197C(5.40)

, N200C(5.43)

,

I201C(5.44)

, G203C(5.46)

et F204C(5.47)

ont montré une diminution significative de liaison du

125I-[Sar

1,Ile

8]AngII, suggérant que les résidus substitués sont orientés dans la pochette de

liaison du récepteur AT1 à l‟état sauvage (basal). De façon intéressante, quatre de ces

résidus se retrouvent dans la portion médiane du TM5 (N200C(5.43)

, I201C(5.44)

, G203C(5.46)

et F204C(5.47)

) et un résidu (L197C(5.40)

) est situé sur le côté extracellulaire du TM5 (en

121

121

haut). Ces données suggèrent que la portion médiane et le haut du TM5 seraient impliqués

dans l‟interaction avec le ligand. De plus, le résidu Leu-197(5.40)

semble délimiter le haut

alors que le résidu Phe-204(5.47)

délimiterait le bas de la pochette de liaison du récepteur

AT1. En plus de ces deux résidus, les trois autres (Asn-200(5.43)

, Ile-201(5.44)

et Gly-203(5.46)

)

font partie de la pochette de liaison à l‟état basal du récepteur. Encore une fois, par un

mécanisme qui pourrait être stérique, électrostatique ou indirect, l‟alkylation de ces 5

résidus par le MTSEA empêche la liaison du ligand.

L‟essai de protection qui consiste à ajouter le ligand compétitif Sar1, Ile

8AngII

avant le traitement au MTSEA, a montré que tous les résidus sensibles ont été protégés de

l‟alkylation par le MTSEA, confirmant que ces résidus sont orientés vers la pochette de

liaison.

Nos résultats suggérant que les résidus Leu-197(5.40)

, Asn-200(5.43)

, Ile-201(5.44)

, Gly-

203(5.46)

et Phe-204(5.47)

sont situés dans la pochette de liaison du récepteur AT1 sont en

accord avec les conclusions d‟études récentes effectuées sur la rhodopsine bovine

(Palczewski, et al., 2000), la rhodopsine du calmar (Murakami and Kouyama, 2008),

l‟opsine (Park, et al., 2008), le récepteur β1-adrénergique (Warne, et al., 2008), le récepteur

β2-adrénergique (Rosenbaum, et al., 2007; Rasmussen, et al., 2007; Cherezov, et al., 2007),

le récepteur muscarinique M3 (Kruse, et al., 2012), le récepteur H1 de l‟histamine

(Shimamura, et al., 2011), le récepteur μ-opioïde (Manglik, et al., 2012), le récepteur κ-

opioïde (Wu, et al., 2012), le récepteur D3 de la dopamine (Chien, et al., 2010) et le

récepteur D2 de la dopamine (Javitch, et al., 1995).

En effet, les résidus His-211(5.46)

et Phe-212(5.47)

interagissent avec le rétinal dans la

structure cristalline de la rhodopsine bovine (Palczewski, et al., 2000) alors que les résidus

Phe-205(5.43)

et Phe-209(5.47)

sont situés dans la pochette de liaison de la structure cristalline

de la rhodopsine de calmar (Murakami et Kouyama, 2008). La structure cristalline du

récepteur β1-adrénergique montre que les résidus Ser-212(5.43)

et Ser-215(5.46)

interagissent

avec l‟antagoniste cyanopindolol (Warne, et al., 2008). Également, la structure cristalline

du récepteur β2-adrénergique a révélé que les résidus Ser-204(5.43)

, Ser-207(5.46)

et Phe-

208(5.47)

sont importants pour la liaison des catécholamines (Rosenbaum, et al., 2007;

Rasmussen, et al., 2007). Les résidus Ser-193(5.43)

et Ser-196(5.46)

interagissent directement

avec leur antagoniste spécifique (eticlopride) tel que démontré dans la structure cristalline

122

122

du récepteur D3 de la dopamine (Chien, et al., 2010). Le résidu Phe-239(5.47)

interagit

directement avec l‟antagoniste tiotropium dans le cas du récepteur muscarinique M3

(Kruse, et al., 2012). Dans la structure cristalline du récepteur H1 de l‟histamine, les résidus

Thr-194(5.43)

et Asn-198(5.46)

sont en interaction directe avec l‟antagoniste doxepin

(Shimamura, et al., 2011). De plus, les structures cristallines des récepteurs μ-opioïde et κ-

opioïde stabilisées dans leur forme inactive par un antagoniste, montrent que la position

5.39 (K233 dans le cas du récepteur μ-opioïde et K227 dans le cas du récepteur κ-opioïde)

interagit de façon directe avec le ligand (Manglik, et al., 2012; Wu, et al., 2012). Par

ailleurs, en utilisant l‟approche SCAM, il a été démontré que les résidus Val-191(5.40)

, Ser-

194(5.43)

, Ile-195(5.44)

, Ser-197(5.46)

et Phe-198(5.47)

sont situés dans la pochette de liaison du

récepteur D2 de la dopamine (Javitch, et al., 1995).

De plus, en utilisant l‟approche méthionine proximity assay (MPA), notre groupe a

démontré que le résidu Asn-200(5.43)

interagit avec le ligand photosensible Sar1,Bpa

8AngII

(Clement, et al., 2009). À la lumière des résultats obtenus, il serait logique de penser que

l‟orientation du TM5 vers la pochette de liaison semble être une caractéristique commune à

plusieurs GPCRs de la classe A.

Dans l‟objectif d‟investiguer le mécanisme par lequel le récepteur AT1 entreprend

des changements structuraux suite à son activation, nous avons effectué l‟analyse SCAM

dans le contexte du mutant constitutivement actif N111G-AT1 qui représente une de formes

actives du récepteur. Il est intéressant de constater qu‟il y a des différences de sensibilité au

MTSEA pour certains résidus du TM5 selon que le récepteur soit dans son état basal ou

dans un état actif. Bien que les mutants L197C(5.40)

-N111G-AT1, N200C(5.43)

-N111G-AT1

et F204C(5.47)

-N111G-AT1 aient maintenu une sensibilité au MTSEA, le mutant I201C(5.44)

-

N111G-AT1 s‟est avéré plus sensible au MTSEA, alors que la sensibilité de G203C(5.46)

-

N111G-AT1 s‟est avérée plus faible. Dans les essais de protection, le ligand compétitif

Sar1, Ile

8AngII a offert une protection efficace à tous les mutants sensibles (L197C

(5.40)-

N111G-AT1, N200C(5.43)

-N111G-AT1, I201C(5.44)

-N111G-AT1, G203C(5.46)

-N111G-AT1 et

F204C(5.47)

-N111G-AT1) contre l‟alkylation par le MTSEA confirmant ainsi que ces résidus

sont situés dans la pochette de liaison (fig.6-article2).

Nos résultats suggérant que les résidus Leu-97(5.40)

, Asn-200(5.43)

, Ile-201(5.44)

, Gly-

203(5.46)

et Phe-204(5.47)

sont orientés vers la pochette de liaison à l‟état actif du récepteur

123

123

AT1 sont en accord avec les conclusions d‟une étude rapportant la structure cristalline de

l‟opsine (Park, et al., 2008). En effet, les résidus Ile-205(5.40)

, Phe-208(5.43)

et Phe-212(5.47)

entourent la pochette de liaison du rétinal à l‟état actif de l‟opsine (Park, et al., 2008;

Hildebrand, et al., 2009). Dans la structure cristalline de la rhodopsine dans sa forme active

(Li, et al., 2004), les résidus Met-207(5.43)

et His-211(5.46)

ont été retrouvés dans la pochette

de liaison. À l‟aide de la résonance magnétique nucléaire (RMN), il a été démontré que les

résidus His-211(5.46)

et Phe-212(5.47)

interagissent avec le rétinal dans le cas de la

métarhodopsine II (Patel, et al., 2004). De plus, la structure cristalline de la métarhodopsine

II confirme la présence du résidu His-211(5.46)

dans la pochette de liaison (Choe, et al.,

2011). Suite à la cristallisation d‟un mutant constitutivement actif (Glu113Gln) de la

rhodopsine, il a été démontré que les résidus Phe-208(5.43)

et Phe-212(5.47)

sont orientés vers

la pochette de liaison (Standfuss, et al., 2011).

Plusieurs études sur le récepteur β2-adrénergique pointent l‟importance des résidus

du TM5 dans l‟activation des GPCRs. Le cristal du récepteur β2-adrénergique stabilisé dans

sa forme active à l‟aide d‟une nanoparticule qui mime le couplage avec la protéine G

montre que les résidus Ser-204(5.43)

et Ser-207(5.46)

interagissent avec le BI-167107, un

agoniste de haute affinité (Rasmussen, et al., 2011). Ces résultats ont également été

confirmés par une autre étude qui met en jeu le récepteur β2-adrénergique lié avec un

agoniste (Rosenbaum, et al., 2011). Également, la structure cristalline à l‟état actif du

récepteur β2-adrénergique démontre que le résidu Ser-207(5.46)

interagit directement avec

l‟adrénaline (Ring, et al., 2013).

Pour ce qui est du récepteur β1-adrénergique, sa structure cristalline en présence de

quatre différents agonistes indique que leur caractéristique commune suite à la liaison de

l‟agoniste est la formation des liens hydrogène avec Ser-215(5.46)

situé dans le TM5 (Warne,

et al., 2011).

En testant la sensibilité de nos résidus au MTSEA dans le contexte du récepteur

constitutivement actif (N111G-AT1), nous avons observé un phénomène particulier. Nous

avons vu que le mutant K199C(5.42)

-N111G-AT1 a montré une augmentation de capacité de

liaison pour le ligand 125

I-Sar1,Ile

8AngII de l‟ordre de 127% suite au traitement avec

0.5mм de MTSEA. Évidemment, l‟alkylation du mutant K199C(5.42)

-N111G-AT1 n‟a

aucunement interféré mais au contraire plutôt facilité son interaction avec le ligand

124

124

compétitif Sar1,Ile

8AngII. Une de possibles explications serait que la charge positive

ajoutée suite à l‟alkylation par le MTSEA à cette position (5.42) pourrait favoriser la liaison

du ligand, possiblement en récupérant la charge initiale perdue par la substitution de cet

acide aminé (lysine) pour une cystéine. De façon intéressante, lorsque nous avons testé ce

mutant à l‟état sauvage du récepteur, nous avons observé que ce dernier avait perdu toute la

capacité de lier le ligand alors qu‟à l‟état actif, nous avons plutôt observé une diminution

importante (3X) de la capacité de lier le ligand (tableau1-article2). Ces données pourraient

suggérer que l‟alkylation de la Lys-199(5.42)

potentialise la liaison par un mécanisme

impliquant une interaction intramoléculaire à l‟intérieur du récepteur. D‟autres études sont

nécessaires pour clarifier ces données.

Les différences observées dans la sensibilité des mutants dans un contexte de l‟état

sauvage (AT1) et dans un contexte de l‟état actif du récepteur (N111G-AT1) suggèrent que

l‟accessibilité des résidus du TM5 et leur orientation vers la pochette de liaison sont altérés.

De façon intéressante, le mutant I201C(5.44)

-N111G-AT1 est devenu plus sensible au

MTSEA, alors que la sensibilité de G203C(5.46)

-N111G-AT1 fut diminuée lorsque comparé

avec les mêmes mutants dans l‟état sauvage (basal) du récepteur (Fig.3 versus Fig. 5-article

2). Ces résultats suggèrent un changement structurel majeur suite à l‟activation du récepteur

AT1. En effet, il est important de mentionner que le résidu Ile-201(5.44)

est situé à l‟extrême

droite alors que le résidu Gly-203(5.46)

est situé à l‟extrême gauche de la même face

hélicoïdale formée par les autres résidus sensibles au MTSEA : Leu-197(5.40)

, Asp-200(5.43)

et Phe-204(5.47)

identifiés à l‟état basal du récepteur (Fig.8-article2). Autrement dit,

l‟activation du récepteur AT1 amène le résidu Ile-201(5.44)

vers la pochette de liaison afin

qu‟il puisse être plus facilement alkylé alors qu‟il repousse le résidu Gly-203(5.46)

à

l‟extérieur de la pochette de liaison. L‟explication la plus simple pour ce changement de

sensibilité des mutants cystéines suite à l‟activation du récepteur AT1 serait que la surface

du TMD5 orientée vers la pochette de liaison tourne légèrement dans le sens anti-horaire.

Vu que les résidus sensibles sont tous situés dans le haut du TMD5, nos résultats ne nous

permettent pas d‟attribuer cette rotation à tout le domaine. Ce mouvement de rotation

correspond à un des quatre mouvements simples mais variés (pivot, rotation, translation et

piston) que les TM peuvent subir dans la bicouche lipidique (Matthews, et al., 2006).

125

125

Il a été suggéré que l‟interaction entre le motif hautement conservé E/DRY situé

dans le TM3 (position 3.49/3.50) et le résidu glutamate situé dans le TM6 (position 6.30)

qu‟on appelle aussi « ionic lock » stabilise le GPCR dans sa forme inactive (Vogel, et al.,

2008; Schwartz, et al., 2006). En utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN), il a

été montré que suite à l‟activation de la rhodopsine, le TM5 subit un mouvement de

rotation (Ahuja, et al., 2009a; Ahuja, et al., 2009b). Dans ce processus, le résidu His-

211(5.46)

s‟approche du Glu-122(3.37)

dans le TM3, causant l‟interruption de l‟ionic lock

(Ahuja, et al., 2009a; Ahuja, et al., 2009b).

En comparant les études récentes effectués sur le récepteur β2-adrénergique dans

l‟état actif (Rasmussen, et al., 2011) versus l‟état inactif en présence d‟un agoniste inverse

(Rosenbaum, et al., 2007), les auteurs ont observé que la transition de l‟état inactif du

récepteur vers l‟état actif implique un réarrangement des acides aminés hydrophobes des

TM5 et TM6. Ce réarrangement des acides aminés est combiné à des petites rotations des

TM5 et TM6, favorisant l‟ouverture du site de liaison de la protéine G. Par conséquent, la

rotation du TM5 semble jouer un rôle important dans la stabilisation de l‟état actif d‟un

GPCR.

En conclusion, nous avons identifié des résidus sensibles au MTSEA dans le haut

du TM5 et ces résidus participeraient donc à la formation de la pochette de liaison du

récepteur AT1. En interprétant les résultats obtenus l‟état basal versus l‟état actif du

récepteur AT1, nous suggérons que dans le processus d‟activation, il se produit une rotation

du TM5 dans le sens anti-horaire car le résidu situé à l‟extrême droite (Ile-201(5.44)

) de la

pochette de liaison devient plus sensible alors que le résidu situé à l‟extrême gauche (Gly-

203 (5.46)

perd de la sensibilité au traitement par le MTSEA.

Dans l‟objectif de caractériser la pochette de liaison du récepteur AT1 dans un

contexte du récepteur sauvage (AT1) et dans un contexte du récepteur à l‟état actif (N111G-

AT1), notre groupe a utilisé l‟approche SCAM sur chacun des 7 domaines

transmembranaires. En plus des mouvements déjà mentionnés pour les TM2 et TM5, nous

avons démontré que suite à l‟activation du récepteur, le TM7 s‟éloigne de la pochette de

liaison (Boucard, et al., 2003), le TM3 subit une petite rotation dans le sens anti-horaire

(Martin, et al., 2004) et le TM6 subit un mouvement de pivot (Martin, et al., 2007). On a

126

126

également déterminé que les TM1 et TM4 ne participent pas à la formation de la pochette

de liaison du récepteur AT1 (Yan, et al., 2010).

Il est important de connaitre la structure moléculaire du récepteur, en particulier la

pochette de liaison et les changements structuraux associés à l‟activation du récepteur afin

de pouvoir développer de nouveaux outils thérapeutiques. La caractérisation de la pochette

de liaison d‟un GPCR fournit des informations importantes sur les mécanismes de

reconnaissance moléculaire entre une hormone et son récepteur. L‟approche SCAM

(Substituted Cysteine Accessibility Method) nous a permis d‟identifier plusieurs résidus

dans les différents TM qui composent la pochette de liaison du récepteur AT1. L‟approche

SCAM nous a aussi permis de déterminer la position relative de chaque TM suite à

l‟activation du récepteur. Ces résultats nous ont servi à élaborer un premier modèle

moléculaire de la pochette de liaison du récepteur AT1 (Cabana,J. 2013).

Afin d‟améliorer ce modèle, nous avons étudié les changements conformationels qui

se produisent lors de l‟activation du récepteur AT1. On a longtemps pensé qu‟un GPCR

pouvait activer une seule voie de signalisation. Il est maintenant évident que les GPCRs

sont capables d‟activer plusieurs voies de signalisation, ce qui est à la base du concept de

signalisation biaisé. La signalisation biaisé est l‟efficacité de certains ligands à induire

sélectivement différentes conformations du récepteur qui couplent sélectivement à

différents effecteurs des voies de signalisation (Kenakin, 2011; Galandrin, et al., 2007;

Lefkowitz, 2007). Sachant que différents ligands stabilisent des conformations différentes

du récepteur et ainsi favorisent l‟activation ou l‟inhibition de certaines voies de

signalisation, il devient possible de déterminer les changements conformationnels qui

privilégient l‟une ou l‟autre des voies de signalisation.

Le récepteur AT1 active plusieurs voies de signalisation en interagissant avec

différents effecteurs. Le récepteur AT1 couple de façon préférentielle à la protéine Gq et les

propriétés fonctionnelles de ce récepteur ont surtout été évaluées en fonction de sa capacité

à induire la production des inositol phosphates (IPs) et à mobiliser le Ca2+

intracellulaire.

Cette voie de signalisation est responsable de la contraction vasculaire et de la sécrétion

d‟aldostérone par la corticosurrénale (Hunyady and Catt, 2006). À part la voie classique Gq,

on ne connaît à peu près rien quant à l‟efficacité des ligands du récepteur AT1 pour activer

les diverses autres voies de signalisation. Dans notre étude, nous avons testé l‟efficacité de

127

127

différents analogues de l‟AngII à activer la voie classique (Gq-PLC-IP3), la voie G12

impliquée dans le réarrangement du cytosquelette (Sagara, et al., 2007)(Auger-Messier, et

al., 2005), la voie de la MAP kinase impliquée dans la prolifération cellulaire (Tohgo, et al.,

2002; Ahn, et al., 2004) ainsi que leur capacité à recruter les arrestines, protéines

d‟échafaudage importantes, entre autres pour l‟internalisation du récepteur (β-arrestine1 et

β-arrestine2) (Gaborik, et al., 2001; Hunton, et al., 2005). Les agonistes et les agonistes

partiels ont été évalués pour leurs effets dose-dépendants afin de déterminer leurs propriétés

pharmacologiques (EC50 et Emax)

Dans le choix des analogues de l‟AngII à tester, nous nous sommes basé sur un des

premiers ligands biaisé du récepteur AT1, le [Sar1,Ile

4,Ile

8]AngII (Ahn, et al., 2004)(Tohgo,

et al., 2002). Ce composé n‟active pas la voie classique du récepteur (Gq-PLC-IP3-Ca2+

)

importante pour la vasoconstriction et la sécrétion d‟aldostérone. Par contre, le

[Sar1,Ile

4,Ile

8]AngII est capable de recruter l‟arrestine et d‟activer la voie des MAP kinases

(Ahn, et al., 2004; Wei, et al., 2003). Nous avons testé l‟analogue [Sar1,Ile

4,Ile

8]AngII dans

nos différents essais fonctionnels et nous avons obtenus des résultats similaires à ceux déjà

publiés (Ahn, et al., 2004)(Tohgo, et al., 2002), c‟est-à-dire qu‟il se comporte comme un

antagoniste pour la voie Gq et comme un agoniste partiel pour les deux voies de ERK

(PKC-ERK et EGFR-ERK) ainsi que pour le recrutement de deux arrestines (résultats non

montrés dans l‟article). Nous avons aussi testé une série d‟analogues modifiés aux positions

1, et/ou 4, et/ou 8.

Afin de s‟assurer que nos analogues lient bien le récepteur, nous avons déterminé

leur affinité de liaison. L‟AngII possède une très bonne affinité de l‟ordre de 1 nM pour le

récepteur AT1. Les analogues modifiés en position 1 ([Sar1]AngII et AngIII) possèdent une

affinité de liaison similaire à celle de l‟AngII. En remplaçant la tyrosine en position 4 par

une isoleucine ([Ile4]AngII), nous avons observé une importante perte d‟affinité. Par contre,

l‟analogue [Sar1,Ile

4]AngII a une affinité nettement plus élevée que le [Ile

4]AngII,

suggérant que la sarcosine en position 1 améliore l‟affinité de ce peptide. Les analogues

modifiés en position 8 ([Ile8]AngII, [Sar

1,Ile

8]AngII et [Ile

8]AngIII) ont une affinité de

liaison similaire au celle de l‟AngII. Ces résultats suggèrent que la position 1 et la position

8 de l‟AngII n‟affectent pas beaucoup la capacité du ligand à lier le récepteur AT1 alors que

la position 4 semble très importante pour la liaison.

128

128

L‟activation de la voie ERK par le récepteur AT1 est très complexe. Il est connu

qu‟il existe au moins trois façons d‟activer la voie ERK par le récepteur AT1. L‟activation

de ERK par un mécanisme dépendant de la protéine Gq met en jeu la PKC (Luttrell, 2002;

Tian, et al., 1998) alors que l‟activation de ERK par un mécanisme indépendant de la

protéine Gq passerait via les arrestines (Ahn, et al., 2004). Le récepteur AT1 peut également

activer la voie ERK par une voie de transactivation du récepteur de l‟EGF (Miura, et al.,

2004). Nous avons démontré la contribution de chacune de ces voies de signalisation dans

l‟activation de ERK en utilisant différents inhibiteurs. Nous avons montré que l‟activation

précoce de ERK passe via la PKC (voie PKC-ERK) et que l‟activation plus tardive de ERK

est dépendante de la transactivation du récepteur de l‟EGF (voie EGFR-ERK).

Parmi les analogues modifiés en position 1, le [Sar1]AngII possède des propriétés

pharmacologiques (EC50 et Emax) comparables à celles de l‟AngII. Le [Sar1]AngII n‟a pas

de sélectivité fonctionnelle pour aucune de voies de signalisation testées. L‟AngIII, cet

analogue n‟ayant pas d‟aspartate en position 1, démontre une certaine sélectivité au niveau

des puissances. L‟AngIII est plus puissant pour activer les voies PKC-ERK et EGFR-ERK

que pour activer les quatre autres voies de signalisation testées (voie Gq-PLC-IP3, voie G12

et voies de recrutement de l‟arrestine 1 et de l‟arrestine 2). Vu que l‟AngIII est capable de

produire des réponses maximales comparables à celles de l‟AngII pour toutes les voies de

signalisation testées, cet analogue n‟a donc aucune sélectivité au niveau des efficacités

(Emax).

Nous avons aussi observé que certains de nos analogues (dont l‟AngIII) avaient de

meilleures puissances (EC50) lorsque comparé à leurs affinités de liaison (interaction

ligand-récepteur). Ces résultats peuvent être expliqués par le modèle allostérique. Dans un

modèle pharmacologique simple, la formation du complexe ligand-récepteur (affinité de

liaison) favorise la signalisation à l‟intérieur de la cellule ce qui fait référence à l‟efficacité

(Rajagopal, 2013). Par contre, dans le modèle allostérique, la liaison initiale de l‟agoniste à

son récepteur en absence des effecteurs se fait dans un état de basse affinité de liaison.

Dans le modèle allostérique, un état de haute affinité de liaison est atteint lorsque

l‟effecteur se couple au complexe agoniste-récepteur pour former le complexe ternaire

(agoniste-récepteur-effecteur). L‟effecteur peut donc, de façon allostérique, moduler la

force d‟interaction entre l‟agoniste et le récepteur. C‟est ce qui pourrait expliquer que

129

129

certains agonistes démontrent des puissances dans certaines voies de signalisation qui sont

supérieures à leur affinité de liaison (Rajagopal, 2013).

L‟analogue [Ile4]AngII a démontré peu de puissance dans toutes les voies de

signalisation testées, ce qui est compatible avec sa faible affinité de liaison. Des

concentrations très élevées de [Ile4]AngII sont nécessaires pour obtenir des réponses

maximales, et ce dans toutes les voies de signalisation testées. Somme toute, vu ses faibles

puissances, l‟analogue [Ile4]AngII démontre peu de sélectivité fonctionnelle.

L‟analogue [Sar1,Ile

4]AngII s‟est avéré relativement peu puissant pour la production

des inositols phosphates, pour l‟activation de G12, ainsi que pour le recrutement des deux

arrestines, mais par contre il s‟est avéré plus puissant pour l‟activation des voies PKC-ERK

et EGFR-ERK. [Sar1,Ile

4]AngII est un agoniste partiel pour l‟activation des protéines G (Gq

et G12) et un agoniste complet pour le recrutement des arrestines et pour l‟activation des

deux voies de ERK. Nos résultats suggèrent que l‟analogue [Sar1,Ile

4]AngII possède une

sélectivité relative, car à des faibles concentrations, il active de façon robuste les deux voies

des ERK (PKC-ERK et EGFR-ERK) tandis qu‟il active faiblement la voie classique Gq.

Nous avons trouvé que les trois analogues ayant l‟isoleucine en position 8

([Ile8]Ang, [Sar

1,Ile

8]AngII et [Ile

8]AngIII) sont tous des antagonistes pour la voie

classique Gq (aucune production d‟inositol phosphate) et des agonistes partiels pour les

autres voies de signalisation testées : la voie G12,le recrutement de deux arrestines et les

deux voies d‟activation des ERK (PKC-ERK et EGFR-ERK). Il a déjà été démontré que la

modification de la position 8 de l‟Ang II pour une isoleucine donne des antagonistes pour la

voie classique Gq (Regoli, et al., 1971). Une étude récente a aussi confirmé que le

remplacement de la phénylalanine en position 8 par des petits acides aminés non

aromatiques tels que l‟isoleucine ou la glycine génère des analogues incapables d‟activer la

signalisation via la protéine Gq (Zimmerman, et al., 2012). Ces analogues sont des ligands

biaisés car ils n‟activent pas la voie classique Gq, mais ils sont capables d‟activer toutes les

autres voies de signalisation que nous avons testées.

Nous avons démontré que les analogues modifiés en position 8 ([Ile8]AngII,

[Sar1,Ile

8]AngII et [Ile

8]AngIII) activent la voie ERK via la PKC sans toutefois être capable

de produire des inositols phosphates. De façon classique, l‟hydrolyse des

polyphosphoinositides produit du diacylglycérol et de l‟IP3. L‟IP3 relâche du Ca2+

qui, en

130

130

combinaison avec le diacylglycérol, active la PKC (Parker and Murray-Rust, 2004). Il est

bien évident que les analogues modifiés en position 8 n‟activent pas la PKC par un

mécanisme dépendant du diacylglycérol et du Ca2+

. Nous avons montré que les cellules

HEK293 expriment les PKC atypiques (PKCι et PKCζ) et que l‟activation de ERK par les

analogues modifiés en position 8 est diminuée suite à l‟invalidation des PKC atypiques. Les

analogues modifiés en position 8 seraient donc capables d‟activer les PKC atypiques (PKCι

et PKCδ) par un mécanisme encore mal défini mais qui impliquerait des interactions

protéiques (Moscat, et al., 2000; Hirai, et al., 2003). Ces résultats sont compatibles avec

ceux d‟une autre étude démontrant que dans les cellules de muscle lisse vasculaire, une

PKC atypique (PKCδ ) est responsable de l‟activation de la voie ERK suite à la stimulation

du récepteur AT1 par l‟Ang II (Liao, et al., 1997).

Le fait que les ligands biaisés peuvent activer sélectivement certaines voies de

signalisation a stimulé beaucoup d‟intérêt dans les potentielles implications cliniques de ces

composés. Par ailleurs, plusieurs évidences supportent l‟idée que les ligands biaisés

possèdent des propriétés pharmacologiques uniques par rapport au ligand traditionnel. Dans

les dernières années, quelques ligands biaisés ont progressé vers les phases du

développement clinique. Un bon exemple est le ligand biaisé du récepteur AT1, le TRV027

développé par la compagnie TREVENA, présentement dans les essais cliniques pour le

traitement de l‟insuffisance cardiaque aigue (Soergel, et al., 2013). Le TRV027 est capable

de recruter les β-arrestines mais n‟active pas la voie classique Gq-PLCβ-IP3-Ca2+

(Violin, et

al., 2010). Il a été montré que le TRV027 réduit l‟hypertension, améliore la contractilité des

cardiomyocytes in vitro (Rajagopal, et al., 2006) et in vivo (Violin, et al., 2010; Boerrigter,

et al., 2011), et aussi améliore la performance cardiaque chez les rats (Violin, et al., 2010).

Dans le modèle canin ayant une insuffisance cardiaque aigue, une amélioration des

paramètres hémodynamiques, rénaux et cardiaques a été observée (Boerrigter, et al., 2011;

Boerrigter, et al., 2012). Parce que le TRV027 diminue la vasoconstriction au niveau rénal

et systémique, qu‟il génère une meilleure performance au niveau cardiaque et qu‟il agit en

tant que cardioprotecteur, ce ligand biaisé est présentement dans la phase clinique pour le

traitement de l‟insuffisance cardiaque (Soergel, et al., 2013). Dans les premières études

chez l‟humain, le TRV027 a été trouvé sans danger et tolérable lorsqu‟administré par la

131

131

voie intraveineuse, et ce traitement a diminué de façon significative la pression artérielle

moyenne chez les patients (Soergel, et al., 2013).

Un autre analogue biaisé du récepteur AT1 pour la voie des β-arrestines, TRV0023,

ayant un profil pharmacologique très similaire au TRV027, montre une réduction de la

mort cellulaire dans le modèle murin de l‟ischémie. Dans cette étude (Kim, et al., 2012), le

ligand TRV0023 favorise une augmentation de la contractilité cardiaque. Cette

augmentation de la contractilité cardiaque induite par le ligand TRV0023 n‟est pas due

directement à la mobilisation calcique comme c‟est le cas pour le ligand de référence

AngII. Il s‟agit en fait d‟une augmentation de la sensibilité au Ca2+

. Cette meilleure

sensibilité au Ca2+

pourrait être expliquée par des modifications post-traductionnelles aux

niveaux de myofilaments cardiaques (Monasky, et al., 2013). Ces données suggèrent que le

TRV023 pourrait être bénéfique pour le traitement de l‟insuffisance cardiaque aigue. Même

si les antagonistes du récepteur AT1 (losartan) et les inhibiteurs de l‟enzyme de conversion-

ACE (captopril) ont été bénéfiques pour le traitement de l‟insuffisance cardiaque

chronique, ils sont contre-indiqués car ils causent une hypotension prolongée ainsi qu‟une

diminution du débit cardiaque (Violin, et al., 2013; Swedberg, et al., 1992). TRV027

représente une nouvelle avenue thérapeutique car c‟est un peptide qui est rapidement

dégradé dans le sang et qui donc produit un effet réversible qui s‟estompe rapidement après

l‟arrêt de l‟infusion. TRV027 agit rapidement en diminuant l‟hypertension tout en

augmentant la contractilité cardiaque et en étant cardioprotecteur (Violin, et al., 2014). La

découverte des ligans biaisés offre donc des réponses pharmacologiques uniques lorsque

comparé avec un simple antagonisme du récepteur car on est capable de cibler les effets

bénéfiques tout en réduisant des effets indésirables.

En perspective, il serait intéressant de développer une nouvelle génération de

médicaments ayant des propriétés de ligands biaisés capables de bloquer préférentiellement

une voie de signalisation tout en favorisant l‟activation des autres voies de signalisation ou

encore capables d‟activer une seule voie de signalisation, tout en bloquant toutes les autres

voies. Par ce fait même, on pourrait espérer développer des médicaments pouvant contrôler

sélectivement certains aspects de la fonction du récepteur en séparant efficacement le

contrôle de la pression artérielle de la croissance pathologique des cardiomyocytes ou des

cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC).

132

132

La notion de sélectivité fonctionnelle est récente et décrit le fait que certains ligands

activent pleinement une voie de signalisation et peuvent avoir peu d‟effet sur d‟autres.

Cette étude suggère qu‟il n‟existerait pas qu‟une seule conformation pleinement active d‟un

récepteur et que le terme « activité » devrait donc obligatoirement être accompagné d‟une

précision quant à l‟effet auquel il se réfère. Différentes conformations du récepteur

transmettraient ainsi différentes activités. Selon ce nouveau modèle, le récepteur AT1

pourrait adopter de multiples conformations pouvant engendrer différentes conséquences

fonctionnelles. À plus long terme, après avoir identifié la sélectivité de plusieurs analogues

de l‟AngII, il sera intéressant d‟évaluer leurs effets dans les modèles plus physiologiques

où l‟AngII exerce ses effets tels que les modèles de contraction du muscle lisse vasculaire,

de régulation de la pression artérielle, de croissance et de prolifération cellulaire et

d‟angiogénèse.

En conclusion, nous avons démontré dans cette étude de signalisation biaisée que la

phénylalanine en position 8 semble essentielle pour l‟activation de la voie classique, la voie

Gq, mais pas pour les autres voies de signalisation que nous avons testées. La tyrosine en

position 4 est importante pour l‟affinité de liaison et elle confère aussi une sélectivité

relative pour la voie des ERKs. L‟aspartate en position 1 ne semble pas importante pour

l‟activation des différentes voies de signalisation et ne confère donc aucune sélectivité

fonctionnelle.

133

133

CONCLUSIONS

L‟approche SCAM appliquée au TM2 du récepteur AT1 démontre qu‟après le prétraitement

avec le MTSEA, les mutants D74C, L81C, L83C, A85C, A89C ont une diminution

significative d‟affinité pour le ligand 125

I-Sar1,Ile

8AngII, suggérant que ces résidus sont

orientés dans la pochette de liaison du récepteur AT1.Dans le cas du récepteur N111G-AT1,

le mutant D74C-N111G est devenu insensible au MTSEA, alors que la sensibilité de L81C-

N111G fut diminuée. Par contre, le mutant V86C-N111G s‟est avéré sensible au MTSEA.

Ces résultats suggèrent que l‟activation constitutive du récepteur AT1 implique un

mouvement de pivot du TM2, favorisant le rapprochement du haut du TM2 vers la pochette

de liaison.

L‟approche SCAM appliquée au TM5 du récepteur AT1 démontre qu‟après le prétraitement

avec le MTSEA, les mutants L197, N200, I201, G203 et F204 ont une diminution

significative d‟affinité pour le ligand 125

I-Sar1,Ile

8AngII, suggérant que ces résidus sont

orientés dans la pochette de liaison à l‟état basal du récepteur. Des résultats différents ont

été obtenus dans le cas du récepteur N111G-AT1. Le mutant I201C-N111G est devenu plus

sensible au MTSEA, alors que la sensibilité du G203C-N111G fut diminuée. Ces résultats

suggèrent que l‟activation constitutive du récepteur AT1 implique un mouvement de

rotation dans le sens antihoraire du TM5.

Les données obtenues avec l‟approche SCAM permettront d‟élaborer un modèle

moléculaire de la pochette de liaison du récepteur AT1.

Dans la notion de sélectivité fonctionnelle, divers ligands peuvent induire une variété de

conformations d‟un GPCR et ainsi inhiber ou activer plus ou moins sélectivement les

diverses voies de signalisation en aval du récepteur. Nous avons testé des analogues de

l‟AngII modifiés en position 1, 4 ou 8. Nous avons démontré que la phénylalanine en

position 8 semble essentielle pour l‟activation de la voie classique, la voie Gq, mais pas

pour les autres voies de signalisation que nous avons testées. La tyrosine en position 4 est

importante pour l‟affinité de liaison et elle confère aussi une sélectivité relative pour la voie

134

134

des ERKs. L‟aspartate en position 1 ne semble pas important pour l‟activation des

différentes voies de signalisation et ne confère donc aucune sélectivité fonctionnelle.

Toutes ces données nous permettront d‟améliorer notre modèle moléculaire du récepteur

AT1 de l‟Ang II.

135

135

REMERCIEMENTS

Tout d‟abord, je tiens à remercier mes directeurs de recherche, Dr. Gaétan Guillemette et

Dr. Emanuel Escher, pour m‟avoir accueilli dans leur laboratoire et m‟avoir confié ces

beaux projets de recherche. Merci pour votre confiance, votre disponibilité et pour vos

précieux conseils tout au long de mes études graduées. Merci pour votre mentorat durant

toutes ces années!

Je remercie aussi le Dr. François Marceau, le Dr. Marek Rola-Pleszczynski et le Dr. Michel

Grandbois pour avoir accepté d‟évaluer ma thèse. Vos commentaires ont grandement

amélioré la qualité de ce travail.

Je tiens à remercier tous les gens qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de mes

travaux de recherche. Un merci spécial à Stéphane Martin qui m‟a initié aux études de

SCAM ainsi qu‟à Brian Holleran avec qui j‟ai développé le projet de sélectivité

fonctionnelle.

Je voudrais également remercier ceux qui ont contribué à rendre ces années agréables,

c‟est-à-dire les collègues ainsi que tous les membres du département de pharmacologie.

Alors merci à Éric, Guillaume, Nancy, Brian, Martin, Stéphane, Maude, Jennifer ainsi que

tous les autres membres des labos Guillemette, Escher, Leduc et Boulay.

Un gros merci à ma famille (mes parents, ma sœur et mon conjoint) de m‟avoir encouragé

tout au long de mes études.

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