Post on 19-Jan-2021
Pollution atmosphérique
3- Données expérimentales
Pr Armelle BAEZA,
baeza@univ-paris-diderot.fr
Equipe des réponses moléculaires et cellulaires aux xénobiotiques
Cliché J.J. Poirault
1-Données épidémiologiques
2-Principaux polluants. Réseaux de surveillance
de la pollution atmosphérique
1
Cliché J.J. Poirault 2
Plan
3
• L’appareil respiratoire voie d’entrée et cible des polluants inhalés:
ses mécanismes de protection
• L’ozone: mécanismes de toxicité
• Les particules atmosphériques:
• Leurs caractéristiques
• Quelques données épidémiologiques
• L’apport des études expérimentales in vivo
• Les études in vitro pour l’étude du mécanisme d’action
• A court terme Inflammation et stress oxydant Rôle de la composition
chimique et de la granulométrie
• A long terme Rôle dans le remodelage bronchique
• Particules et cancérogenèse
• Particules et réponse allergique
• Effets extra-pulmonaires des particules (cardiovasculaires et sur le
développement
Historique
Londres 1952
1ères études épidémiologiques
Annu. Rev. Public Health, 1994
4
mortality
hospital
admissions
emergency room visits
physician office visits
reduced physical performance
medication use
symptoms
impaired pulmonary function
subclinical (subtle) effects
Proportion of population affected
severity
of effect
POLLUTION ATMOSPHERIQUE ET
IMPACTS SANITAIRES
WHO, 2000
5
POLLUTION ATMOSPHERIQUE ET SANTE HUMAINE
• Effets à court terme:
gène respiratoire, toux, maux de gorge
crises d’asthmes
diminution des capacités respiratoires chez l’enfant
apparition de maladies cardiovasculaires
• Effets à long terme: difficiles à déceler
» Cancers,
» pathologies respiratoires inflammatoires chroniques:
asthme, BPCO
» Pathologies extrapulmonaires 6
cellules
ciliées
cellules
sécrétrices
cils
Pharynx
Larynx
Trachée
Bronche
Bronchiole
Ses mécanismes d’épuration
Voies
aériennes
Épithélium mucociliaire
L’appareil respiratoire:
7
épithélium
lame basale
glande sous-
muqueuse
Mouvement
unidirectionnel du mucus
épiphase
Hypophase:
Fluide périciliaire
MUCUS l’épithélium mucociliaire
8
Capillaires avec
hématies
Pneumocytes
de Type I
Pneumocytes
de Type II
macrophage
interstitium
cellules
ciliées
cellules
sécrétrices
cils
Pharynx
Larynx
Trachée
Bronche
Bronchiole
Alvéoles
Ses mécanismes d’épuration
Voies
aériennes
Épithélium mucociliaire
9
L’appareil respiratoire:
Les différents mécanismes de protection
L’appareil respiratoire:
• Barrière physique: jonctions serrées
• Transport mucociliaire: épuration des particules inhalées
• Fluide extracellulaire aux propriétés anti-oxydantes:
protection contre :
environnement riche en oxygène
espèces oxydantes relarguées par les cellules inflammatoires
polluants à action oxydante
O3: oxydant non radicalaire
NO2: radical stable
Particules
direct
oxydants secondaires (nitrites)
direct
produits secondaires (H2O2 et radicaux libres)
direct indirect (processus inflammatoires)
10
Equilibre rédox
Oxydants (EAO) anti-oxydants
O2.-, H2O2,
.OH,
ROOH….
GSH: glutathion
CAT: catalase
SOD: superoxyde dismutase
GPX: GSH peroxydase……
11
Stress oxydant
EAO: espèces activées de l’oxygène
Déséquilibre rédox stress oxydant
12
oxydants
anti-oxydants
Stress oxydant
13
Anti-oxydants du RTLF: respiratory tract lining fluid
Nasal RTLF Ascorbate 10-50 µM
Urate 100-400 µM
GSH 5-10 µM
a-tocopherol <5 nM
Distal RTLF Ascorbate 10-35 µM
Urate 150-330 µM
GSH 70-225 µM
a-tocopherol 100-500 nM
Proximal RTLF Ascorbate 20-45 µM
Urate 100-300 µM
GSH 50-200 µM
a-tocopherol 50-450 nM
Plasma Ascorbate 20-65 µM
Urate 100-500 µM
Total-SH 0.45-0.8mM
a-tocopherol 5-25 µM
+ anti-oxydants enzymatiques: GPX SOD CAT
+ piégeurs de métaux Caeruloplasmine transferrine
PENETRATION DES POLLUANTS DANS
L ’APPAREIL RESPIRATOIRE
GAZ
Région naso-pharyngée
Vapeurs d'acides
Arbre trachéo-bronchique
Gaz solubles (SO2)
Alvéoles Gaz peu solubles
(O3, NOx)
Action locale
Voie d’entrée
Devenir des gaz
Co
nc
en
tra
tio
n e
n
ga
z
Distance du centre des voies aériennes
mucus sang
cellules
épithéliales
conduit
aérien
gaz inerte
gaz réactif
Gaz hydrosolubles Gaz non hydrosolubles
Action systémique
Action locale
15
Devenir des gaz
hydrosoluble
réactif
non hydrosoluble
réactif
Solubilité dans l’eau
réa
ctiv
ité
Formaldéhyde:
Tumeurs nasales
ozone:
Dommages des voies
aériennes inférieures
non hydrosoluble
non réactif
benzène:
hématotoxique
hydrosoluble
non réactif
méthanol:
acidose
PENETRATION DES POLLUANTS DANS
L ’APPAREIL RESPIRATOIRE
GAZ
PARTICULES
Région naso-pharyngée
Vapeurs d'acides 5 à 30 µm
Arbre trachéo-bronchique
Gaz solubles (SO2) 1 à 5 µm
Alvéoles Gaz peu solubles
(O3, NOx)
1µm
Clairance mucociliaire
(heures)
Clairance alvéolaire
(jours)
gravité
impaction
interception sédimentation
diffusion
Dépôt électrostatique
Différents modes de dépôt des particules
18
Changements directionnels Vitesse de l’air
Région naso-pharyngée 5-30 µm impaction
Trachée Bronches
bronchioles 1-5 µm
sédimentation
alvéoles 1 µm
diffusion
Facteurs conditionnant le dépôt des
particules dans les voies respiratoires
Très abrupts
moins abrupts
faibles
++++
+++
0
++
+
D’après Lauwerys 19
bronche
bronchiole
Alvéole
bronche
Alvéole
Bronchiole respiratoire
Alvéole
20
Dépôt des particules
L’appareil respiratoire:
Fahmya et al, Environ Toxicol. Pharmacol, 2010, 29: 173-182
Inhalation (10 mn) par le rat de particules fluorescentes
Rouge: 1,6µm
Vert : 190 nm
21
22
Évaluation expérimentale
de la toxicité pulmonaire
Études in vivo chez l’animal exposé à
des aérosols ou gaz en chambre d’inhalation (essentiellement rat,
également souris, cobaye…) :
toxicité aiguë et chronique, cancérogenèse…
In vivo
Expositions humaines contrôlées (O3, NO2, PM)
étude des effets à court terme
23
Évaluation expérimentale
de la toxicité pulmonaire
Macrophages
macrophages Cellules épithéliales
épithélium
In vitro Études in vitro sur cultures de cellules
d’origine animale ou humaine :
tests de cytotoxicité,
mutagenèse,
études mécanistiques de toxicité.
24
Deux exemples de polluants
atmosphériques
L’ozone Les particules
atmosphériques
Polluant secondaire: issu de la transformation photochimique
des NOx et les COV
Sources primaires: issu des processus de combustion,
érosion, usure
Sources secondaires:
Condensation de précurseurs
inorganiques ou organiques
Oxydant puissant,
peu soluble dans l’eau
Pénètre aisément jusqu’aux alvéoles pulmonaires
Etudes épidémiologiques : Effets aigus
Corrélation entre les admissions à l’hôpital et les concentrations de l’air en O3
Augmentation de la prévalence de l’asthme
Fréquence des appels reçus par SOS médecins à Paris est significativement plus élevée les
jours correspondant à des teneurs élevées en O3 et /ou en sulfate particulaire
Chez les enfants: corrélation entre les paramètres fonctionnels respiratoires et
les maximum horaires des concentrations en O3
25
L’ozone
Expositions humaines contrôlées
Populations étudiées:
État de santé, âge, sexe
Tabagisme, activité sportive
Expositions: seuil d’alerte 360 ppb/h
Exposition de 500 à 200 ppb
Exposition de 120 à 80 ppb
Effets mesurés
Sphère respiratoire supérieure Irritation du nez, de la gorge, toux, expectoration
Atteinte des fonctions respiratoires Spirométrie (mesure des volumes et débits respiratoires, VEM (volume
expiratoire forcé)
Réactivité bronchique Comparaison entre VEM et la mesure de la résistance des voies
aériennes
Lavage broncho-alvéolaire (LBA)
26
réduction de la fonction pulmonaire effets aigus dose et temps dépendants résorption en 12 à 24 hrs majorés par l’exercice physique (Chitano et coll., 1995). augmentation de la réactivité bronchique non spécifique conséquences chez les patients déjà atteints par des maladies obstructives ou sensibilisés à des allergènes. accentuer la réponse bronchique des asthmatiques et abaisser le seuil de réponse aux allergènes auxquels ils sont sensibilisés (Devalia et coll., 1996). inflammation des voies aériennes ++ polynucléaires neutrophiles dans BAL dès 6 d’exposition (persiste au delà de 24 hrs). précédée par la synthèse de chimioattractants tel l’interleukine 8 (IL-8)
lésions tissulaires voies aériennes: déciliation, nécrose des cellules ciliées, dégranulation des cellules sécrétrices bronchioles: nécrose des pneumocytes de type I, diminution de l’activité phagocytaire des macrophages
Altération des jonctions serrées entre les cellules épithéliales atteinte de la perméabilité de l’épithélium, augmentation de protéines dans BAL oedèmes.
Grande variabilité selon les individus. 27
Radical peroxyl
Addition électrophile
28
GSH Ascorbate Acide urique
OZONE
a tocopherol
29
Endothélium
Tissu conjonctif
Tissus musculaire
lisse
Epithélium
mucociliaire
Mucus
Fluide
périciliaire
OZONE
Anti-oxydants (GSH, Ac urique, Vit C…)
Neutrophiles
ERO
protéines lipides
Oxydants
secondaires
Cellule
ciliée
Mastocytes Médiateurs
proinflammatoires
NFkB
Ligands
de EGFR
Macrophages
Cellule
à mucus
Lame
basale
30
Les particules atmosphériques
31
39%
J, Sciare, LSCE, Airparif
17%
44%
Le long du trafic
70%
30%
Dans l’agglomération
Origine des particules fines observées en Ile de France
PM2,5
Valeur limite : niveau à atteindre dans un délai donné et à ne pas dépasser, et fixé sur la base des connaissances scientifiques
afin d'éviter, de prévenir ou de réduire les effets nocifs sur la santé humaine ou sur l'environnement dans son ensemble.
Caractéristiques des particules atmosphériques
forte hétérogénéité taille
proximité du trafic
UF
30%
F
40%
G
30%
fond urbain
UF
7%
F
55% G
38%
Distribution relative en masse
Ramgolam et al., 2009, Val et al., 2011
Générées
mécaniquement
Générées par combustion
ou transformation
atmosphérique
Diamètre des particules (µm)
Nucléation Accumulation Grossières
Vo
lum
e r
ela
tif
de
s p
art
icu
les
Particules ultrafines
particules
grossières
particules
fines
HC/SO4
métaux
organique 33
Caractéristiques des particules atmosphériques
0,2 µm
MET
MEB 1 µm
Baulig et al., 2004, Val et al., 2011
« suies »
« suies »
forte hétérogénéité forme
Pneu
34
Caractéristiques des particules atmosphériques
COMPOSITION
- composés carbonés (élémentaires, organiques) - composés minéraux et sels (poussières) - ions (sulfates, nitrates) - métaux - composés biogènes (bactéries, virus, pollens)
- Hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)
- métaux - endotoxines
Principaux composés
chimiques des PM (Paris)
PM Grossières PM Fines
dusts
sea salt
ions
CE
CO
CO
Ramgolam et al., 2009
forte hétérogénéité composition
35
Association entre la mortalité et de la morbidité pour cause cardiorespiratoire et
augmentation de la pollution particulaire
(Katsouyanni 1997, Zanobetti 2000)
Pour une augmentation de 10 µg/m3
Mortalité pour cause respiratoire +3,4%
Mortalité pour cause cardiovasculaire +1,4% (Momas et coll., 1993)
Lien plus fort entre morbidité respiratoire à caractère allergique ou infectieux et
pollution :
+ 15% des manifestations allergiques (Medina et coll., 1997)
Relation significative
PM et BPCO chez les personnes âgées
PM et asthme chez l’enfant
APHEA
CAFE
Réduction de l’espérance de vie des européens de 9,6 mois
Impacts sanitaires de la pollution particulaire:
études épidémiologiques
36
INVS, S. Medina, 2012, Pascal et al, STE, 2013
39 millions d’habitants de 25 villes européennes:
19 000 décès prématurés dont 15 000 pour causes cardiovasculaires
PM2.5 : 25
µg/m3
37
INVS, S. Medina, 2012, Pascal et al, STE, 2013
15 à 30 % de nouveaux cas d’asthme
de pathologies chroniques respiratoires
et cardiovasculaires chez les adultes âgés
de 65 ans et plus
Asthme (0-17 ans)
Pathologies coronariennes (65 ans)
Bronchopneumopathies chroniques obstructives (65 ans)
38
Groupe 2a: probablement
cancérigène pour l’homme
Groupe 1: cancérigène
pour l’homme
Groupe 1: la pollution de
l’air extérieur est
cancérigène pour l’homme
Groupe 1: les particules,
composante majeure de la
pollution de l’air extérieur,
sont cancérigènes pour
l’homme 39
L’approche toxicologique à travers l’étude des particules atmosphériques
Exposition particulaire et pathologies respiratoires et cardiovasculaires:
relations directes?
Mécanismes d’action des particules sur les organes et cellules cibles
Fractions particulaires responsables et rôle des associations
40
Etudes expérimentales
Etudes in vivo: expositions contrôlées
volontaires sains ou asthmatiques
animaux de laboratoire: inhalation – instillation intratrachéale
Etudes in vitro:
tranches d’organe
cultures cellulaires - animales / humaines
- lignée / cultures primaires
Types de particules testées:
Particules Diesel, PM10, PM2.5, PM0.1 , CAP
noir de carbone
41
Expositions contrôlées de volontaires ou d’animaux à des PM (Diesel ou
des CAPs (concentrated ambient Particles) de 100 à 300 µg/m3 de 1 à 2 h
inflammation pulmonaire
inflammation systémique Troubles du rythme cardiaque
Modifications du tonus vasculaires
Effet prothrombotique….
Effets sanitaires des PM: à court terme
Lavage broncho-alvéolaire Biopsie
Salvi et al., 1999, 2000, Ghio et al, 2012
+ allergènes: Effet adjuvants…. 42
Ghio Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. 162: 981-988
• 8 sujets exposés à l'air versus 30 sujets exposés à des CAP (Concentrated Ambient Particles)
• Exposition 2 heures, PM : 23.1-311.1 µg/m3
•Effets 18h post-exposition
Pas de modification de la cellularité inflammatoire sanguine à 18h
Pas d'altération de la fonction respiratoire (immédiatement en post-exposition et après 18h)
Etudes in vivo: Réponse inflammatoire chez le volontaire sain
43
Etudes chez l’animal
Inhalation nose only instillation
Healthy /compromised animals
Méthodes pour évaluer la toxicité respiratoire
44
Saber Part. Fiber Toxicol. 2006. 3: 1-8
• Souris exposées à 20 ou 80mg/m3 Particules Diesel par inhalation, 90 mn
• Sacrifice à 1h, 3h ou 24h post-exposition.
Etudes in vivo: Réponse inflammatoire chez l’animal
Effets dépendants de la dose
Effets dépendants du temps
45
Rat
3 mg/kg, PM10 , Mexico, Instillation intraTrachéale
PM10 north PM10 south
Inflammation pulmonaire liée à
la fraction insoluble
Snow et al., J Tox Envir Health, 2014 46
PM et réponse inflammatoire: Rôle de la fraction soluble?
TNFa / neutrophiles Nombre de neutrophiles
PM totales
insoluble
water soluble
BALF: Lavage broncho-alvéolaire
Endothélium
Fibroblastes
cell musculaires
lisses
Épithélium respiratoire
Macrophages
médiateurs
inflammatoires (GM-CSF, IL8…)
acteurs cellulaires impliqués dans la réponse pro-inflammatoire
Mécanismes moléculaires et cellulaires
Rôle des composantes particulaires et de la taille dans cette réponse
47
PM et réponse inflammatoire: quels mécanismes d'action?
macrophages Cellules épithéliales
50
0
100
150
GM
-CSF
sé
crét
é (
pg/
mL)
1 5 10 20 30 1 5 10 20 30 µg/cm²
PM2,5 fond PM2,5 trafic
Sécrétion de GM-CSF
16 HBE, 24h
Baulig et al., 2004
Les PM induisent la sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires
48
Les études mécanistiques in vitro :
GM
-CSF
(% p
ar
rap
po
rt a
u t
ém
oin
)
50
100
150
200
250
300
a a
a c
a c
a
c
Sécrétion de GM-CSF
Baulig et al., Toxicol 2009
16 HBE
10 µg/cm2
24h
Boland et al., Am. J. Physiol., 1999- 2000
0
20
40
60
80
100
120
140
Te
- cata + cata
GM
-CSF p
g/m
l *
* *
*
PDi véhicule ± catalyseur
49
PM et réponse inflammatoire:
Rôle des composantes organiques et aqueuses?
fond trafic
Sécrétion de GM-CSF
PM2.5
PM
signal transduction
(implication of ROS, protein kinases?)
cytokines mRNA
Cytokines (GM-CSF)
inflammatory cells
recruitment
Transcription
factor activation (NF-kB)
Signal transduction (Involvement of ROS ,
protein kinases?)
Cytokine gene transcription
phagocytosis
Particules et réponse inflammatoire :
quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires induits par les particules?
IkB
50
IkB degradation: western blot
a-tubulin
IkBa
30 min 4 h 2 h
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
% o
f IkB
a d
eg
rad
ati
on
/ co
ntr
ol
Bonvallot et al., 2000, 2001
Les particules activent la voie NF-kB
IkB
NF-kB DNA-binding : EMSA
NF-kB
1 h 2 h 4 h
0
10
20
30
40
50
% o
f N
F-k
B D
NA
bin
din
g in
cre
as
e
/ c
on
tro
l
1 h 4 h 2 h
Densitometric analysis
51
Detection of phosphorylated kinases western blot
Erk-P
Erk
p38-P
30 min 4 h 2 h
Bonvallot et al., Inhalation Toxicol., 2000, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2001)
GM-CSF release 24 h of treatment
100
200
Without
inhibitor
+
PD98059 (10µM)
+
SB203580 (1µM)
*
* *° *
*° °
*: different from the control
°: different from treatment without inhibitor
Erk p38
Les particules activent les MAP kinases
Erk JNK p38
52
Pourazar et al., 2005
Implication des voies MAPK et NF-kB: confirmation in vivo
DEP: 300µg/m3
1h expo
Fixation 6h post-expo
immunohistochimie
53
Implication des voies MAPK et NF-kB: confirmation in vivo
P-p38 / IL-8 P-c-jun / IL-8
54
GM-CSF release
*: different from the control
*°
°: different from treatment without antioxidant
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Control DMTU NAC
° °
*°
*°
*° *°
10 mM 10 mM
NF-kB
NF-kB DNA binding
Control DMTU 10 mM
*
*
*
control
DEP 10 µg/cm2
OE-DEP (15µg/ml)
Carbon black
Bonvallot et al., Inhalation Toxicol., 2000, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2001
Implication du stress oxydant?
GM-CSF mRNA
GM-CSF
IkB Anti-oxydants
ROS?
55
Particules et stress oxydant: origine des EAO?
Composés biologiques (endotoxines….)
Ions (sulfates, nitrates) Cœur carboné Métaux Composés organiques
H2O2 + Fe2+
HO. + OH- + Fe
3+
Fe3+
+ O2 O2.- H2O2
Composés organiques:
Radicaux organiques stables
quinones: cycle rédox O2.-
Acide ascorbique
Glutathion
HAP CYP1A1 EAO
Composés
électrophiles
H2O2 + Fe2+
HO. + OH- + Fe
3+
Cœur carboné: réactivité de surface Composés organiques Métaux
Déplétion d’antioxydants
dans un fluide respiratoire
synthétique
détection de radicaux libres (RPE)
Déplétion du dithiothréitol
Oxydation de la DCF
Induction de cassures ADN
………
57
PM + 200 µM acide ascorbique
acide urique
glutathion
Potentiel oxydant: indicateur prédictif de la toxicité
• rôle central du stress oxydant
• production EAO liée à la composition des PM
• Métrique complémentaire de la masse
Méthodes de détection du PO intrinsèque pH 7
Ayres et al., IT, 2008
POAA
D E G H
0
20
40
60
80
10025
50
100
Trafic Biomasse
% d
ép
léti
on
AA
/ t
ém
oin
25 µl/mL
50 µl/mL
100 µl/mL
Potentiel oxydant
POTOX
A
C
E
L
L
U
L
A
I
R
E
PM2,5
58
59
POTOX
PM2,5
PO intrinsèque A
C
E
L
L
U
L
A
I
R
E
C
E
L
L
U
L
A
I
R
E
Stress oxydant
Réponse proinflammatoire
Réponses cellulaires
Comparaison de
plusieurs méthodes
ERO
Un indicateur PO prédictif des effets oxydants et inflammatoires ?
Ayres et al., Inhal Toxicol, 2008 Hellack et al., Environ Sci: nano, 2017 Crobeddu et al., Environ Poll 2017
POAA
D E G H
0
20
40
60
80
10025
50
100
Trafic Biomasse
% d
ép
léti
on
AA
/ t
ém
oin
25 µl/mL
50 µl/mL
100 µl/mL
D E G H
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1510
* p < 0.01
*
**
** p < 0.001**
*
****
µg/cm2
Trafic Biomasse
DCF cellulaire
oxyd
ati
on
DC
F / a
u t
ém
oin
1 µg/cm²
5 µg/cm²
10 µg/cm²
Oxy
da
tio
n D
CF
/ té
mo
in
EAO intracellulaire Potentiel oxydant
POTOX
A
C
E
L
L
U
L
A
I
R
E
C
E
L
L
U
L
A
I
R
E
PM2,5
60
POAA
D E G H
0
20
40
60
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50
100
Trafic Biomasse
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25 µl/mL
50 µl/mL
100 µl/mL
D E G H
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4
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6
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* p < 0.01
*
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** p < 0.001**
*
****
µg/cm2
Trafic Biomasse
DCF cellulaire
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1 µg/cm²
5 µg/cm²
10 µg/cm²
Oxy
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n D
CF
/ té
mo
in
EAO intracellulaire
expression de HO-1
D E G H0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
5
10
Exp
ressio
n n
orm
alis
ée
du
gèn
e H
O1
Hème oxygénase: enzyme anti-oxydante
Trafic Biomasse
expression d'IL-6
D E G H0
2
4
6
8
10
12
1
5
10E
xp
ressio
n n
orm
alis
ée
du
gèn
e IL
6
Cytokine IL-6
Trafic Biomasse
Potentiel oxydant
POTOX
A
C
E
L
L
U
L
A
I
R
E
C
E
L
L
U
L
A
I
R
E
PM2,5
61
62
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0
20
40
60
80
TRAFFIC
OP
AA/µ
g
PM
µg
/m3
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0
20
40
60
80
BIOMASS
OP
AA/µ
g
PM
µg
/m3
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0
20
40
60
80
TRAFFIC
OP
AA/µ
g
PM
µg
/m3
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0
20
40
60
80
BIOMASS
OP
AA/µ
g
PM
µg
/m3
Potentiel oxydant
POTOX
PO % déplétion AA / µg
Trafic
Bio
mas
se
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
% d
ép
léti
on
acid
e
asco
rbiq
ue /
µg
PO % déplétion AA / m3
Trafic
Bio
mas
se
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
% d
ép
léti
on
acid
e
asco
rbiq
ue /
m3
Métabolisation des composés organiques
Noyau
FAIBLE
Défense antioxydante
- Enzymes du métabolisme des Xénobiotiques
- Enzymes antioxydantes
INTERMEDIAIRE
Inflammation
- Cytokines
- Chimiokines
Cellule épithéliale bronchique
FORT
Mort Cellulaire
- Apoptose
- Nécrose
5µm
Niveau de stress oxydant
métaux
surface
FT
Boland et coll., 2000
Baulig et coll., 2009
Bonvallot et coll., 2001
Ferecatu et coll., 2010
Voies de signalisation EGFR, MAPK,
NFκB
Voi
e N
rf2
63
Knol et al, Part Fibre Toxicol, 2009, 6:19
Conclusion The overall medium to high likelihood rating of causality of health effects of UFP
exposure and
the high likelihood rating of at least one plausible causal mechanism explaining
associations between ultrafine particles and cardiac events (respiratory
inflammation and subsequent thrombotic effects),
supports the need to consider inclusion of ultrafine particles in future health impact
assessments of (transport-related) air pollution.
…. Et le rôle de la taille?
64
pollution urbaine de fond
7 campagnes (hiver/été)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7 0,8
0,9
1
0,01 0,1 1 10 100
d (µm)
dC
/d(l
og
D)
Impacteur Dekati
13 étages
Toit du LEPI (Paris 13)
10,5 µm
30 nm
PUFFIN1
Primequal 2
rôle de la taille dans la réponse pro-inflammatoire induite par les particules
65
stage D 50 %
12 ≈ 6,7 µm
11 ≈ 4 µm
10 ≈ 2,5 µm
9 ≈ 1,65 µm
8 ≈ 1 µm
7 ≈ 0,65 µm
6 ≈ 0,4 µm
5 ≈ 0,25 µm
13 ≈ 10,5 µm
4 ≈ 0,17 µm
3 ≈ 0,1 µm
2 ≈ 0,06 µm
1 ≈ 0,03 µm
PM [0.1-0.03]
PM [1-0.1]
PM [2.5-1]
PM [10-2.5]
Dekati Impactor
13 stages
12 filtres de polycarbonate (pore 0.2 µm)
divisés en 4 classes de taille
Récupération des particules
Chaque filtre : 3 sonications de 5 sec
Chaque classe de taille dans 600 µL
de milieu de culture 66
Impacteur Dekati
13 étages
PUFFIN1
Primequal 2
pollution urbaine de fond
stage D 50 %
12 ≈ 6,7 µm
11 ≈ 4 µm
10 ≈ 2,5 µm
9 ≈ 1,65 µm
8 ≈ 1 µm
7 ≈ 0,65 µm
6 ≈ 0,4 µm
5 ≈ 0,25 µm
13 ≈ 10,5 µm
4 ≈ 0,17 µm
3 ≈ 0,1 µm
2 ≈ 0,06 µm
1 ≈ 0,03 µm
PM [0.03-0.1] UF
PM [0.1-1] F
PM [1-2.5] I
PM [2.5-10] C
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
UF F I C UF F I C
* * * * ° *° *° *
a
ab
c bc
a
b c
d
1 µg/cm2 10 µg/cm2
*
isomasse
Ramgolam, Favez et al., PFT, 2009
67
PM et réponse inflammatoire: Rôle de la taille?
GM
-CS
F p
g/m
l
…. Et les effets à long terme?
Apport des études mécanistiques in vitro
68
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Te 0,1 1 10 30
AR
(n
g/m
L)
PM2.5 (µg/cm²)
Sécrétion d’Amphiréguline: Facteur de croissance ligand du récepteur à l’EGF
Blanchet et coll., 2004, Rumelhard et al., 2007 s
éc
réti
on
d’A
R
(% d
u t
ém
oin
)
PM2.5 Ex orga
0
200
400
600
800
0
200
400
600
800
Té
* *
0
5
10
15
20
25
30
Té
NAC
PM n
g A
R /
mL
+ +
+ anti-oxydant TGFa
0
10
20
30
40
0 10 20 30 40 50
[TG
Fa
] (p
g/m
L)
time (h) time (h)
amphiréguline
0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
0 10 20 30 40 50
[am
ph
ireg
ulin
] (n
g/m
L)
Identification d’un nouveau gène induit par l’exposition aux particules
69
Endothelium
fibroblasts
smooth muscle
cells
airway
epithelium
Macrophages
Remodelage
Effets long terme
Effets court terme
Inflammation mediators
Inflammatory (GM-CSF, IL8…)
Amphiréguline (EGFR ligands)
EGFR autocrine
effect
paracrine
effect
Rôle des ligands de l’EGFR?
70
x 50
Coupes de parenchymes pulmonaires
x 50
remodelage des parois des
voies respiratoires
Vancouver
(PM10 : 14 µg/m3)
Mexico
(PM10 : 66 µg/m3)
x 200
Churg et coll, 2003
Rôle des ligands de l’EGFR dans le remodelage bronchique?
Sécrétion AR dans les crachats chez les
asthmatiques (surexpression d’EGFR)
Sécrétion muqueuse est EGFR dépendante
71
Activation de la voie EGFR: confirmation in vivo
Pourazar et al., 2008
DEP: 300µg/m3
1h expo
Fixation 6h post-expo air DE
EGFR
P-Tyr1173
air DE
72
réponse
pro-inflammatoire
C PM C PM
siNeg siTACE
AR
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
pm
ol/
mL
GM-CSF
0
10
20
30
40
50
60
70
pm
ol/
mL
C PM C PM
siNeg siTACE
Stress oxydant
TACE
ADAM17
GM-CSF
EGFR ligands
Particules
EGFR P
Pro - EGFR ligands
Rumelhard et al., 2007, Ramgolam et al., 2012
EGFR
P
GM-CSF Ligands
EGFR
Ligands
EGFR
Effet autocrine des ligands de l’EGFR sur la réponse pro-inflammatoire
73
PM et sécrétion muqueuse (MUC5AC)
Ctrl 10 50
PM2,5 µg
Ind
uction
ARNm M
UC5AC
Trachée de souris
Contrôle PM2,5 10µg/cm²
MUC5AC DAPI
Val et al., Arch Toxicol, 2012
NCI-H292
0
2
4
6
8
10
12
14
%
ce
llu
les
MU
C5
AC
(+
) Ctl 0.1 1 5 10
PM2.5 (µg.cm-2)
EGF
Cell MUC5AC (+)
Inhibition de TACE
0
2
4
6
8
10
12
14
Ctrl TAPI-2 PM2.5 PM2.5
TAPI-2
ind
uc
tio
n A
RN
m M
UC
5A
C
74
IAL 2 4 5 3 semaines
1
4 traitements espacés de 48h
PM
IAL 6
?
différenciation pathologique
Différenciation normale
squamous epithelium Stratified epithelium
mucous epithelium Mucin hypersecretion
mucociliary epithelium
100µl ?
Cultures primaires de cellules épithéliales
bronchiques humaines
20 µm
Cellules ciliées
Cellules à mucus
Effets à long terme d’une exposition répétée aux PM
75
5µm
Boublil et al., 2012
NHBE particules 10µg/cm² 6 semaines
76
4 traitements
IAL 2 4 5 3 semaines
1 IAL 6
Persistance de la réponse pro-inflammatoire
Effets d’une exposition répétée aux PM: sécrétion GM-CSF
77
MUC5AC expression
x40
control Fine PM UltraFine PM
mucus
43
10
day
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
43 10
MU
C5AC m
RN
A e
xpre
ssio
n
ctl Fine UF ctl Fine UF
day day
78
Milieux conditionnés
Tau
x d
e cr
ois
san
ce
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
T PMF
Co-cultures
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
T PMF
Tau
x d
e cr
ois
san
ce
traitement 4 traitements
Effets paracrines: prolifération de fibroblastes
79
Particules et cancérogenèse
Juin 2012: Diesel classé cancérogène pour l’homme (cat 1)
Niveau de preuves suffisant d’une association entre
exposition et un risque augmenté de cancers du poumon
80
Particules et cancérogenèse: études chez l’homme
Études épidémiologiques: cohorte chez les mineurs, travailleurs du rail et de
l’industrie du camionnage
•Association positive entre exposition et cancer du poumon
•Analyses exposition-réponse montrent des tendances positives et
statistiquement significatives
81
Particules et cancérogenèse: études chez l’animal
Echappement de moteur Diesel (entier): inhalation
•Induction de tumeurs varie selon les espèces:
chez le rat
Chez souris, 1 étude (+) sur 4
Chez le hamster, 3 études (-)
Echappement de moteur Diesel (fraction gazeuse seulement): inhalation
(-) chez le rat, la souris, le hamster
Particules de moteur Diesel: instillation intratrachéale
•Induction de tumeurs varie selon les espèces:
chez le rat
chez souris (non significatif)
chez le hamster, 1 étude (-)
82
De Marini, 2013
Exposition: Sang: adduits protéiques Urine: 1-hydroxypyrène Air: HAP
Dommages à l’ADN
Lymphocytes périphériques
83
Effets cytogénétiques
Micronoyaux Aberrations chromosomiques
84
Particules et cancérogenèse: études chez l’animal
Chez le rat
Rôle de la surcharge pulmonaire
Études de mutagenèse
(+) avec des extraits organiques 85
Clairance
altérée
Cytokines
facteurs de
croissance,
protéases
Inflammation, recrutement de
neutrophiles
Lésions cellulaires
prolifération, hyperplasie
Surcharge
pulmonaire
Tumeur
pulmonaire
Cellule initiée
Cellule prénéoplasique
Macrophage surchargé
Espèces
Activées de
l’Oxygène
Désorption
des composés
organiques
Adduits ADN
Mutations
Activation de proto-oncogènes
inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs
métaux
génétique HAP: adduits
EAO: lésions oxydatives
épigénétique Réponse inflammatoire
Prolifération épithéliale
Inhibition de l’apoptose
Particules et réponse allergique
Chez l’allergique:
Induction de cytokines pro Th2 par les P. Diesel (IL-4, IL-6…)
Amplification de la réponse à un allergène
Rôle d’adjuvant des particules
Induction de l’état allergique chez un sujet sain?
Diaz-Sanchez et al, 1997
Instillation nasale
87
Particules et effets allergiques
Intranasal instillation
0,5µg PM
j1 j2
0,5µg PM + 10 µg OVA
j4 j7 j9
0,5µg PM + 10 µg OVA
0,5µg PM + 10 µg OVA
0,5µg PM + 10 µg OVA
J21 et 22 j23
1% OVA
cytokine levels in the lung
Cytokine Saline OVA UF#1+OVA
TNF-α 1.63 ± 0.1 2.75 ± 0.2 5.40 ± 0.5*
IFN-γ 1.13 ± 0.0 1.13 ± 0.0 1.48 ± 0.2
IL-5 0.95 ± 0.6 1.98 ± 0.2 13.5 ± 3.1*
IL-4 0.00 ± 0.0 0.25 ± 0.3 0.82 ± 0.4
IL-13 1.25 ± 0.5 1.51 ± 0.6 4.19 ± 0.8*
KC 3.84 ± 0.3 8.17 ± 0.8 12.8 ± 0.6*
IL-6 0.56 ± 0.3 1.41 ± 0.1 2.43 ± 0.3*
MCP-1 0.00 ± 0.0 0.00 ± 0.0 9.34 ± 3.2*
MIP1-α 1.09 ± 0.4 1.99 ± 0.1 4.25 ± 0.6*
Li et al, 2009
88
Li et al, 2009
Particules et réponse allergique
Histopathology and morphometry of the left lung lobe. Volume de mucus
Nb éosinophiles
PM amplifient l’inflammation allergique - inflammation éosinophile - hyperplasie muqueuse
89
Composés
organiques
Surface
Métaux
Macrophage Neutrophile
Stress oxydant
Médiateurs inflammatoires
épithélium
capillaire
poumon
Endothélium
vasculaire
inflammation
systémique
Effets extrapulmonaires
Translocation des particules
Composés / métabolites
solubles
Passage des particules ultrafines
/composés 90
Comment expliquer les effets cardiovasculaires des PM?
G Nalbone, Médecine et longévité, 2010
Passage des particules ultrafines
vers la circulation systémique (Nemmar, 2001, 2002)
inflammation systémique
91
Témoin PM fines PM ultrafines
Oil red O (lipides neutres)
Moma-2 (Monocytes, macrophages)
Araujo et al, 2008
Effets cardiovasculaires à long terme: action proathérogène
75h
438 µg/m3, 4.56x105/cm3
112 µg/m3, 5.59x105/cm3
representative aortic root sections
(5h/jr, 3 jrs/sem)
92
93
Han et al, 2018
Effets sur le développement après exposition in utero
PM10 – PM2,5
2h/j, 5j/sem,
sur 20 j Retard de croissance à mi-gestation (taille tête)
Avant le terme:
- réduction de l’efficacité placentaire (poids du foetus
/placenta)
- Baisse du flux sanguin placentaire et du volume des
vaisseaux foetaux
Valentino et al, 2016
NP visibles dans le sang maternel, les cellules
trophoblastiques et le sang foetal
transfert transplacentaire
Diesel 1mg/m3
CONCLUSIONS
- PM fines et ultrafines: réponse inflammatoire via un stress oxydant
- Importance des composés organiques et des métaux dans les mécanismes d’action
- Importance de la granulométrie
- Induction de nombreux gènes dont ceux de l’inflammation, de la prolifération, de la différenciation
- Rôle d’adjuvant dans la réaction allergique
- Effets systémiques: - Effets cardiovasculaires - Effets sur le développement
- Effet cancérigène
94