Pollution atmosphérique

3- Données expérimentales

Pr Armelle BAEZA,

baeza@univ-paris-diderot.fr

Equipe des réponses moléculaires et cellulaires aux xénobiotiques

Cliché J.J. Poirault

1-Données épidémiologiques

2-Principaux polluants. Réseaux de surveillance

de la pollution atmosphérique

1

Cliché J.J. Poirault 2

Plan

3

• L’appareil respiratoire voie d’entrée et cible des polluants inhalés:

ses mécanismes de protection

• L’ozone: mécanismes de toxicité

• Les particules atmosphériques:

• Leurs caractéristiques

• Quelques données épidémiologiques

• L’apport des études expérimentales in vivo

• Les études in vitro pour l’étude du mécanisme d’action

• A court terme Inflammation et stress oxydant Rôle de la composition

chimique et de la granulométrie

• A long terme Rôle dans le remodelage bronchique

• Particules et cancérogenèse

• Particules et réponse allergique

• Effets extra-pulmonaires des particules (cardiovasculaires et sur le

développement

Historique

Londres 1952

1ères études épidémiologiques

Annu. Rev. Public Health, 1994

4

mortality

hospital

admissions

emergency room visits

physician office visits

reduced physical performance

medication use

symptoms

impaired pulmonary function

subclinical (subtle) effects

Proportion of population affected

severity

of effect

POLLUTION ATMOSPHERIQUE ET

IMPACTS SANITAIRES

WHO, 2000

5

POLLUTION ATMOSPHERIQUE ET SANTE HUMAINE

• Effets à court terme:

gène respiratoire, toux, maux de gorge

crises d’asthmes

diminution des capacités respiratoires chez l’enfant

apparition de maladies cardiovasculaires

• Effets à long terme: difficiles à déceler

» Cancers,

» pathologies respiratoires inflammatoires chroniques:

asthme, BPCO

» Pathologies extrapulmonaires 6

cellules

ciliées

cellules

sécrétrices

cils

Pharynx

Larynx

Trachée

Bronche

Bronchiole

Ses mécanismes d’épuration

Voies

aériennes

Épithélium mucociliaire

L’appareil respiratoire:

7

épithélium

lame basale

glande sous-

muqueuse

Mouvement

unidirectionnel du mucus

épiphase

Hypophase:

Fluide périciliaire

MUCUS l’épithélium mucociliaire

8

Capillaires avec

hématies

Pneumocytes

de Type I

Pneumocytes

de Type II

macrophage

interstitium

cellules

ciliées

cellules

sécrétrices

cils

Pharynx

Larynx

Trachée

Bronche

Bronchiole

Alvéoles

Ses mécanismes d’épuration

Voies

aériennes

Épithélium mucociliaire

9

L’appareil respiratoire:

Les différents mécanismes de protection

L’appareil respiratoire:

• Barrière physique: jonctions serrées

• Transport mucociliaire: épuration des particules inhalées

• Fluide extracellulaire aux propriétés anti-oxydantes:

protection contre :

environnement riche en oxygène

espèces oxydantes relarguées par les cellules inflammatoires

polluants à action oxydante

O3: oxydant non radicalaire

NO2: radical stable

Particules

direct

oxydants secondaires (nitrites)

direct

produits secondaires (H2O2 et radicaux libres)

direct indirect (processus inflammatoires)

10

Equilibre rédox

Oxydants (EAO) anti-oxydants

O2.-, H2O2,

.OH,

ROOH….

GSH: glutathion

CAT: catalase

SOD: superoxyde dismutase

GPX: GSH peroxydase……

11

Stress oxydant

EAO: espèces activées de l’oxygène

Déséquilibre rédox stress oxydant

12

oxydants

anti-oxydants

Stress oxydant

13

Anti-oxydants du RTLF: respiratory tract lining fluid

Nasal RTLF Ascorbate 10-50 µM

Urate 100-400 µM

GSH 5-10 µM

a-tocopherol <5 nM

Distal RTLF Ascorbate 10-35 µM

Urate 150-330 µM

GSH 70-225 µM

a-tocopherol 100-500 nM

Proximal RTLF Ascorbate 20-45 µM

Urate 100-300 µM

GSH 50-200 µM

a-tocopherol 50-450 nM

Plasma Ascorbate 20-65 µM

Urate 100-500 µM

Total-SH 0.45-0.8mM

a-tocopherol 5-25 µM

+ anti-oxydants enzymatiques: GPX SOD CAT

+ piégeurs de métaux Caeruloplasmine transferrine

PENETRATION DES POLLUANTS DANS

L ’APPAREIL RESPIRATOIRE

GAZ

Région naso-pharyngée

Vapeurs d'acides

Arbre trachéo-bronchique

Gaz solubles (SO2)

Alvéoles Gaz peu solubles

(O3, NOx)

Action locale

Voie d’entrée

Devenir des gaz

Co

nc

en

tra

tio

n e

n

ga

z

Distance du centre des voies aériennes

mucus sang

cellules

épithéliales

conduit

aérien

gaz inerte

gaz réactif

Gaz hydrosolubles Gaz non hydrosolubles

Action systémique

Action locale

15

Devenir des gaz

hydrosoluble

réactif

non hydrosoluble

réactif

Solubilité dans l’eau

réa

ctiv

ité

Formaldéhyde:

Tumeurs nasales

ozone:

Dommages des voies

aériennes inférieures

non hydrosoluble

non réactif

benzène:

hématotoxique

hydrosoluble

non réactif

méthanol:

acidose

PENETRATION DES POLLUANTS DANS

L ’APPAREIL RESPIRATOIRE

GAZ

PARTICULES

Région naso-pharyngée

Vapeurs d'acides 5 à 30 µm

Arbre trachéo-bronchique

Gaz solubles (SO2) 1 à 5 µm

Alvéoles Gaz peu solubles

(O3, NOx)

1µm

Clairance mucociliaire

(heures)

Clairance alvéolaire

(jours)

gravité

impaction

interception sédimentation

diffusion

Dépôt électrostatique

Différents modes de dépôt des particules

18

Changements directionnels Vitesse de l’air

Région naso-pharyngée 5-30 µm impaction

Trachée Bronches

bronchioles 1-5 µm

sédimentation

alvéoles 1 µm

diffusion

Facteurs conditionnant le dépôt des

particules dans les voies respiratoires

Très abrupts

moins abrupts

faibles

++++

+++

0

++

+

D’après Lauwerys 19

bronche

bronchiole

Alvéole

bronche

Alvéole

Bronchiole respiratoire

Alvéole

20

Dépôt des particules

L’appareil respiratoire:

Fahmya et al, Environ Toxicol. Pharmacol, 2010, 29: 173-182

Inhalation (10 mn) par le rat de particules fluorescentes

Rouge: 1,6µm

Vert : 190 nm

21

22

Évaluation expérimentale

de la toxicité pulmonaire

Études in vivo chez l’animal exposé à

des aérosols ou gaz en chambre d’inhalation (essentiellement rat,

également souris, cobaye…) :

toxicité aiguë et chronique, cancérogenèse…

In vivo

Expositions humaines contrôlées (O3, NO2, PM)

étude des effets à court terme

23

Évaluation expérimentale

de la toxicité pulmonaire

Macrophages

macrophages Cellules épithéliales

épithélium

In vitro Études in vitro sur cultures de cellules

d’origine animale ou humaine :

tests de cytotoxicité,

mutagenèse,

études mécanistiques de toxicité.

24

Deux exemples de polluants

atmosphériques

L’ozone Les particules

atmosphériques

Polluant secondaire: issu de la transformation photochimique

des NOx et les COV

Sources primaires: issu des processus de combustion,

érosion, usure

Sources secondaires:

Condensation de précurseurs

inorganiques ou organiques

Oxydant puissant,

peu soluble dans l’eau

Pénètre aisément jusqu’aux alvéoles pulmonaires

Etudes épidémiologiques : Effets aigus

Corrélation entre les admissions à l’hôpital et les concentrations de l’air en O3

Augmentation de la prévalence de l’asthme

Fréquence des appels reçus par SOS médecins à Paris est significativement plus élevée les

jours correspondant à des teneurs élevées en O3 et /ou en sulfate particulaire

Chez les enfants: corrélation entre les paramètres fonctionnels respiratoires et

les maximum horaires des concentrations en O3

25

L’ozone

Expositions humaines contrôlées

Populations étudiées:

État de santé, âge, sexe

Tabagisme, activité sportive

Expositions: seuil d’alerte 360 ppb/h

Exposition de 500 à 200 ppb

Exposition de 120 à 80 ppb

Effets mesurés

Sphère respiratoire supérieure Irritation du nez, de la gorge, toux, expectoration

Atteinte des fonctions respiratoires Spirométrie (mesure des volumes et débits respiratoires, VEM (volume

expiratoire forcé)

Réactivité bronchique Comparaison entre VEM et la mesure de la résistance des voies

aériennes

Lavage broncho-alvéolaire (LBA)

26

réduction de la fonction pulmonaire effets aigus dose et temps dépendants résorption en 12 à 24 hrs majorés par l’exercice physique (Chitano et coll., 1995). augmentation de la réactivité bronchique non spécifique conséquences chez les patients déjà atteints par des maladies obstructives ou sensibilisés à des allergènes. accentuer la réponse bronchique des asthmatiques et abaisser le seuil de réponse aux allergènes auxquels ils sont sensibilisés (Devalia et coll., 1996). inflammation des voies aériennes ++ polynucléaires neutrophiles dans BAL dès 6 d’exposition (persiste au delà de 24 hrs). précédée par la synthèse de chimioattractants tel l’interleukine 8 (IL-8)

lésions tissulaires voies aériennes: déciliation, nécrose des cellules ciliées, dégranulation des cellules sécrétrices bronchioles: nécrose des pneumocytes de type I, diminution de l’activité phagocytaire des macrophages

Altération des jonctions serrées entre les cellules épithéliales atteinte de la perméabilité de l’épithélium, augmentation de protéines dans BAL oedèmes.

Grande variabilité selon les individus. 27

Radical peroxyl

Addition électrophile

28

GSH Ascorbate Acide urique

OZONE

a tocopherol

29

Endothélium

Tissu conjonctif

Tissus musculaire

lisse

Epithélium

mucociliaire

Mucus

Fluide

périciliaire

OZONE

Anti-oxydants (GSH, Ac urique, Vit C…)

Neutrophiles

ERO

protéines lipides

Oxydants

secondaires

Cellule

ciliée

Mastocytes Médiateurs

proinflammatoires

NFkB

Ligands

de EGFR

Macrophages

Cellule

à mucus

Lame

basale

30

Les particules atmosphériques

31

39%

J, Sciare, LSCE, Airparif

17%

44%

Le long du trafic

70%

30%

Dans l’agglomération

Origine des particules fines observées en Ile de France

PM2,5

Valeur limite : niveau à atteindre dans un délai donné et à ne pas dépasser, et fixé sur la base des connaissances scientifiques

afin d'éviter, de prévenir ou de réduire les effets nocifs sur la santé humaine ou sur l'environnement dans son ensemble.

Caractéristiques des particules atmosphériques

forte hétérogénéité taille

proximité du trafic

UF

30%

F

40%

G

30%

fond urbain

UF

7%

F

55% G

38%

Distribution relative en masse

Ramgolam et al., 2009, Val et al., 2011

Générées

mécaniquement

Générées par combustion

ou transformation

atmosphérique

Diamètre des particules (µm)

Nucléation Accumulation Grossières

Vo

lum

e r

ela

tif

de

s p

art

icu

les

Particules ultrafines

particules

grossières

particules

fines

HC/SO4

métaux

organique 33

Caractéristiques des particules atmosphériques

0,2 µm

MET

MEB 1 µm

Baulig et al., 2004, Val et al., 2011

« suies »

« suies »

forte hétérogénéité forme

Pneu

34

Caractéristiques des particules atmosphériques

COMPOSITION

- composés carbonés (élémentaires, organiques) - composés minéraux et sels (poussières) - ions (sulfates, nitrates) - métaux - composés biogènes (bactéries, virus, pollens)

- Hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP)

- métaux - endotoxines

Principaux composés

chimiques des PM (Paris)

PM Grossières PM Fines

dusts

sea salt

ions

CE

CO

CO

Ramgolam et al., 2009

forte hétérogénéité composition

35

Association entre la mortalité et de la morbidité pour cause cardiorespiratoire et

augmentation de la pollution particulaire

(Katsouyanni 1997, Zanobetti 2000)

Pour une augmentation de 10 µg/m3

Mortalité pour cause respiratoire +3,4%

Mortalité pour cause cardiovasculaire +1,4% (Momas et coll., 1993)

Lien plus fort entre morbidité respiratoire à caractère allergique ou infectieux et

pollution :

+ 15% des manifestations allergiques (Medina et coll., 1997)

Relation significative

PM et BPCO chez les personnes âgées

PM et asthme chez l’enfant

APHEA

CAFE

Réduction de l’espérance de vie des européens de 9,6 mois

Impacts sanitaires de la pollution particulaire:

études épidémiologiques

36

INVS, S. Medina, 2012, Pascal et al, STE, 2013

39 millions d’habitants de 25 villes européennes:

19 000 décès prématurés dont 15 000 pour causes cardiovasculaires

PM2.5 : 25

µg/m3

37

INVS, S. Medina, 2012, Pascal et al, STE, 2013

15 à 30 % de nouveaux cas d’asthme

de pathologies chroniques respiratoires

et cardiovasculaires chez les adultes âgés

de 65 ans et plus

Asthme (0-17 ans)

Pathologies coronariennes (65 ans)

Bronchopneumopathies chroniques obstructives (65 ans)

38

Groupe 2a: probablement

cancérigène pour l’homme

Groupe 1: cancérigène

pour l’homme

Groupe 1: la pollution de

l’air extérieur est

cancérigène pour l’homme

Groupe 1: les particules,

composante majeure de la

pollution de l’air extérieur,

sont cancérigènes pour

l’homme 39

L’approche toxicologique à travers l’étude des particules atmosphériques

Exposition particulaire et pathologies respiratoires et cardiovasculaires:

relations directes?

Mécanismes d’action des particules sur les organes et cellules cibles

Fractions particulaires responsables et rôle des associations

40

Etudes expérimentales

Etudes in vivo: expositions contrôlées

volontaires sains ou asthmatiques

animaux de laboratoire: inhalation – instillation intratrachéale

Etudes in vitro:

tranches d’organe

cultures cellulaires - animales / humaines

- lignée / cultures primaires

Types de particules testées:

Particules Diesel, PM10, PM2.5, PM0.1 , CAP

noir de carbone

41

Expositions contrôlées de volontaires ou d’animaux à des PM (Diesel ou

des CAPs (concentrated ambient Particles) de 100 à 300 µg/m3 de 1 à 2 h

inflammation pulmonaire

inflammation systémique Troubles du rythme cardiaque

Modifications du tonus vasculaires

Effet prothrombotique….

Effets sanitaires des PM: à court terme

Lavage broncho-alvéolaire Biopsie

Salvi et al., 1999, 2000, Ghio et al, 2012

+ allergènes: Effet adjuvants…. 42

Ghio Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. 162: 981-988

• 8 sujets exposés à l'air versus 30 sujets exposés à des CAP (Concentrated Ambient Particles)

• Exposition 2 heures, PM : 23.1-311.1 µg/m3

•Effets 18h post-exposition

Pas de modification de la cellularité inflammatoire sanguine à 18h

Pas d'altération de la fonction respiratoire (immédiatement en post-exposition et après 18h)

Etudes in vivo: Réponse inflammatoire chez le volontaire sain

43

Etudes chez l’animal

Inhalation nose only instillation

Healthy /compromised animals

Méthodes pour évaluer la toxicité respiratoire

44

Saber Part. Fiber Toxicol. 2006. 3: 1-8

• Souris exposées à 20 ou 80mg/m3 Particules Diesel par inhalation, 90 mn

• Sacrifice à 1h, 3h ou 24h post-exposition.

Etudes in vivo: Réponse inflammatoire chez l’animal

Effets dépendants de la dose

Effets dépendants du temps

45

Rat

3 mg/kg, PM10 , Mexico, Instillation intraTrachéale

PM10 north PM10 south

Inflammation pulmonaire liée à

la fraction insoluble

Snow et al., J Tox Envir Health, 2014 46

PM et réponse inflammatoire: Rôle de la fraction soluble?

TNFa / neutrophiles Nombre de neutrophiles

PM totales

insoluble

water soluble

BALF: Lavage broncho-alvéolaire

Endothélium

Fibroblastes

cell musculaires

lisses

Épithélium respiratoire

Macrophages

médiateurs

inflammatoires (GM-CSF, IL8…)

acteurs cellulaires impliqués dans la réponse pro-inflammatoire

Mécanismes moléculaires et cellulaires

Rôle des composantes particulaires et de la taille dans cette réponse

47

PM et réponse inflammatoire: quels mécanismes d'action?

macrophages Cellules épithéliales

50

0

100

150

GM

-CSF

sé

crét

é (

pg/

mL)

1 5 10 20 30 1 5 10 20 30 µg/cm²

PM2,5 fond PM2,5 trafic

Sécrétion de GM-CSF

16 HBE, 24h

Baulig et al., 2004

Les PM induisent la sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires

48

Les études mécanistiques in vitro :

GM

-CSF

(% p

ar

rap

po

rt a

u t

ém

oin

)

50

100

150

200

250

300

a a

a c

a c

a

c

Sécrétion de GM-CSF

Baulig et al., Toxicol 2009

16 HBE

10 µg/cm2

24h

Boland et al., Am. J. Physiol., 1999- 2000

0

20

40

60

80

100

120

140

Te

- cata + cata

GM

-CSF p

g/m

l *

* *

*

PDi véhicule ± catalyseur

49

PM et réponse inflammatoire:

Rôle des composantes organiques et aqueuses?

fond trafic

Sécrétion de GM-CSF

PM2.5

PM

signal transduction

(implication of ROS, protein kinases?)

cytokines mRNA

Cytokines (GM-CSF)

inflammatory cells

recruitment

Transcription

factor activation (NF-kB)

Signal transduction (Involvement of ROS ,

protein kinases?)

Cytokine gene transcription

phagocytosis

Particules et réponse inflammatoire :

quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires induits par les particules?

IkB

50

IkB degradation: western blot

a-tubulin

IkBa

30 min 4 h 2 h

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

% o

f IkB

a d

eg

rad

ati

on

/ co

ntr

ol

Bonvallot et al., 2000, 2001

Les particules activent la voie NF-kB

IkB

NF-kB DNA-binding : EMSA

NF-kB

1 h 2 h 4 h

0

10

20

30

40

50

% o

f N

F-k

B D

NA

bin

din

g in

cre

as

e

/ c

on

tro

l

1 h 4 h 2 h

Densitometric analysis

51

Detection of phosphorylated kinases western blot

Erk-P

Erk

p38-P

30 min 4 h 2 h

Bonvallot et al., Inhalation Toxicol., 2000, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2001)

GM-CSF release 24 h of treatment

100

200

Without

inhibitor

+

PD98059 (10µM)

+

SB203580 (1µM)

*

* *° *

*° °

*: different from the control

°: different from treatment without inhibitor

Erk p38

Les particules activent les MAP kinases

Erk JNK p38

52

Pourazar et al., 2005

Implication des voies MAPK et NF-kB: confirmation in vivo

DEP: 300µg/m3

1h expo

Fixation 6h post-expo

immunohistochimie

53

Implication des voies MAPK et NF-kB: confirmation in vivo

P-p38 / IL-8 P-c-jun / IL-8

54

GM-CSF release

*: different from the control

*°

°: different from treatment without antioxidant

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control DMTU NAC

° °

*°

*°

*° *°

10 mM 10 mM

NF-kB

NF-kB DNA binding

Control DMTU 10 mM

*

*

*

control

DEP 10 µg/cm2

OE-DEP (15µg/ml)

Carbon black

Bonvallot et al., Inhalation Toxicol., 2000, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2001

Implication du stress oxydant?

GM-CSF mRNA

GM-CSF

IkB Anti-oxydants

ROS?

55

Particules et stress oxydant: origine des EAO?

Composés biologiques (endotoxines….)

Ions (sulfates, nitrates) Cœur carboné Métaux Composés organiques

H2O2 + Fe2+

HO. + OH- + Fe

3+

Fe3+

+ O2 O2.- H2O2

Composés organiques:

Radicaux organiques stables

quinones: cycle rédox O2.-

Acide ascorbique

Glutathion

HAP CYP1A1 EAO

Composés

électrophiles

H2O2 + Fe2+

HO. + OH- + Fe

3+

Cœur carboné: réactivité de surface Composés organiques Métaux

Déplétion d’antioxydants

dans un fluide respiratoire

synthétique

détection de radicaux libres (RPE)

Déplétion du dithiothréitol

Oxydation de la DCF

Induction de cassures ADN

………

57

PM + 200 µM acide ascorbique

acide urique

glutathion

Potentiel oxydant: indicateur prédictif de la toxicité

• rôle central du stress oxydant

• production EAO liée à la composition des PM

• Métrique complémentaire de la masse

Méthodes de détection du PO intrinsèque pH 7

Ayres et al., IT, 2008

POAA

D E G H

0

20

40

60

80

10025

50

100

Trafic Biomasse

% d

ép

léti

on

AA

/ t

ém

oin

25 µl/mL

50 µl/mL

100 µl/mL

Potentiel oxydant

POTOX

A

C

E

L

L

U

L

A

I

R

E

PM2,5

58

59

POTOX

PM2,5

PO intrinsèque A

C

E

L

L

U

L

A

I

R

E

C

E

L

L

U

L

A

I

R

E

Stress oxydant

Réponse proinflammatoire

Réponses cellulaires

Comparaison de

plusieurs méthodes

ERO

Un indicateur PO prédictif des effets oxydants et inflammatoires ?

Ayres et al., Inhal Toxicol, 2008 Hellack et al., Environ Sci: nano, 2017 Crobeddu et al., Environ Poll 2017

POAA

D E G H

0

20

40

60

80

10025

50

100

Trafic Biomasse

% d

ép

léti

on

AA

/ t

ém

oin

25 µl/mL

50 µl/mL

100 µl/mL

D E G H

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1510

* p < 0.01

*

**

** p < 0.001**

*

****

µg/cm2

Trafic Biomasse

DCF cellulaire

oxyd

ati

on

DC

F / a

u t

ém

oin

1 µg/cm²

5 µg/cm²

10 µg/cm²

Oxy

da

tio

n D

CF

/ té

mo

in

EAO intracellulaire Potentiel oxydant

POTOX

A

C

E

L

L

U

L

A

I

R

E

C

E

L

L

U

L

A

I

R

E

PM2,5

60

POAA

D E G H

0

20

40

60

80

10025

50

100

Trafic Biomasse

% d

ép

léti

on

AA

/ t

ém

oin

25 µl/mL

50 µl/mL

100 µl/mL

D E G H

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1510

* p < 0.01

*

**

** p < 0.001**

*

****

µg/cm2

Trafic Biomasse

DCF cellulaire

oxyd

ati

on

DC

F / a

u t

ém

oin

1 µg/cm²

5 µg/cm²

10 µg/cm²

Oxy

da

tio

n D

CF

/ té

mo

in

EAO intracellulaire

expression de HO-1

D E G H0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1

5

10

Exp

ressio

n n

orm

alis

ée

du

gèn

e H

O1

Hème oxygénase: enzyme anti-oxydante

Trafic Biomasse

expression d'IL-6

D E G H0

2

4

6

8

10

12

1

5

10E

xp

ressio

n n

orm

alis

ée

du

gèn

e IL

6

Cytokine IL-6

Trafic Biomasse

Potentiel oxydant

POTOX

A

C

E

L

L

U

L

A

I

R

E

C

E

L

L

U

L

A

I

R

E

PM2,5

61

62

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0

20

40

60

80

TRAFFIC

OP

AA/µ

g

PM

µg

/m3

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0

20

40

60

80

BIOMASS

OP

AA/µ

g

PM

µg

/m3

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0

20

40

60

80

TRAFFIC

OP

AA/µ

g

PM

µg

/m3

-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0

20

40

60

80

BIOMASS

OP

AA/µ

g

PM

µg

/m3

Potentiel oxydant

POTOX

PO % déplétion AA / µg

Trafic

Bio

mas

se

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

% d

ép

léti

on

acid

e

asco

rbiq

ue /

µg

PO % déplétion AA / m3

Trafic

Bio

mas

se

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

% d

ép

léti

on

acid

e

asco

rbiq

ue /

m3

Métabolisation des composés organiques

Noyau

FAIBLE

Défense antioxydante

- Enzymes du métabolisme des Xénobiotiques

- Enzymes antioxydantes

INTERMEDIAIRE

Inflammation

- Cytokines

- Chimiokines

Cellule épithéliale bronchique

FORT

Mort Cellulaire

- Apoptose

- Nécrose

5µm

Niveau de stress oxydant

métaux

surface

FT

Boland et coll., 2000

Baulig et coll., 2009

Bonvallot et coll., 2001

Ferecatu et coll., 2010

Voies de signalisation EGFR, MAPK,

NFκB

Voi

e N

rf2

63

Knol et al, Part Fibre Toxicol, 2009, 6:19

Conclusion The overall medium to high likelihood rating of causality of health effects of UFP

exposure and

the high likelihood rating of at least one plausible causal mechanism explaining

associations between ultrafine particles and cardiac events (respiratory

inflammation and subsequent thrombotic effects),

supports the need to consider inclusion of ultrafine particles in future health impact

assessments of (transport-related) air pollution.

…. Et le rôle de la taille?

64

pollution urbaine de fond

7 campagnes (hiver/été)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7 0,8

0,9

1

0,01 0,1 1 10 100

d (µm)

dC

/d(l

og

D)

Impacteur Dekati

13 étages

Toit du LEPI (Paris 13)

10,5 µm

30 nm

PUFFIN1

Primequal 2

rôle de la taille dans la réponse pro-inflammatoire induite par les particules

65

stage D 50 %

12 ≈ 6,7 µm

11 ≈ 4 µm

10 ≈ 2,5 µm

9 ≈ 1,65 µm

8 ≈ 1 µm

7 ≈ 0,65 µm

6 ≈ 0,4 µm

5 ≈ 0,25 µm

13 ≈ 10,5 µm

4 ≈ 0,17 µm

3 ≈ 0,1 µm

2 ≈ 0,06 µm

1 ≈ 0,03 µm

PM [0.1-0.03]

PM [1-0.1]

PM [2.5-1]

PM [10-2.5]

Dekati Impactor

13 stages

12 filtres de polycarbonate (pore 0.2 µm)

divisés en 4 classes de taille

Récupération des particules

Chaque filtre : 3 sonications de 5 sec

Chaque classe de taille dans 600 µL

de milieu de culture 66

Impacteur Dekati

13 étages

PUFFIN1

Primequal 2

pollution urbaine de fond

stage D 50 %

12 ≈ 6,7 µm

11 ≈ 4 µm

10 ≈ 2,5 µm

9 ≈ 1,65 µm

8 ≈ 1 µm

7 ≈ 0,65 µm

6 ≈ 0,4 µm

5 ≈ 0,25 µm

13 ≈ 10,5 µm

4 ≈ 0,17 µm

3 ≈ 0,1 µm

2 ≈ 0,06 µm

1 ≈ 0,03 µm

PM [0.03-0.1] UF

PM [0.1-1] F

PM [1-2.5] I

PM [2.5-10] C

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

UF F I C UF F I C

* * * * ° *° *° *

a

ab

c bc

a

b c

d

1 µg/cm2 10 µg/cm2

*

isomasse

Ramgolam, Favez et al., PFT, 2009

67

PM et réponse inflammatoire: Rôle de la taille?

GM

-CS

F p

g/m

l

…. Et les effets à long terme?

Apport des études mécanistiques in vitro

68

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Te 0,1 1 10 30

AR

(n

g/m

L)

PM2.5 (µg/cm²)

Sécrétion d’Amphiréguline: Facteur de croissance ligand du récepteur à l’EGF

Blanchet et coll., 2004, Rumelhard et al., 2007 s

éc

réti

on

d’A

R

(% d

u t

ém

oin

)

PM2.5 Ex orga

0

200

400

600

800

0

200

400

600

800

Té

* *

0

5

10

15

20

25

30

Té

NAC

PM n

g A

R /

mL

+ +

+ anti-oxydant TGFa

0

10

20

30

40

0 10 20 30 40 50

[TG

Fa

] (p

g/m

L)

time (h) time (h)

amphiréguline

0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0 10 20 30 40 50

[am

ph

ireg

ulin

] (n

g/m

L)

Identification d’un nouveau gène induit par l’exposition aux particules

69

Endothelium

fibroblasts

smooth muscle

cells

airway

epithelium

Macrophages

Remodelage

Effets long terme

Effets court terme

Inflammation mediators

Inflammatory (GM-CSF, IL8…)

Amphiréguline (EGFR ligands)

EGFR autocrine

effect

paracrine

effect

Rôle des ligands de l’EGFR?

70

x 50

Coupes de parenchymes pulmonaires

x 50

remodelage des parois des

voies respiratoires

Vancouver

(PM10 : 14 µg/m3)

Mexico

(PM10 : 66 µg/m3)

x 200

Churg et coll, 2003

Rôle des ligands de l’EGFR dans le remodelage bronchique?

Sécrétion AR dans les crachats chez les

asthmatiques (surexpression d’EGFR)

Sécrétion muqueuse est EGFR dépendante

71

Activation de la voie EGFR: confirmation in vivo

Pourazar et al., 2008

DEP: 300µg/m3

1h expo

Fixation 6h post-expo air DE

EGFR

P-Tyr1173

air DE

72

réponse

pro-inflammatoire

C PM C PM

siNeg siTACE

AR

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

pm

ol/

mL

GM-CSF

0

10

20

30

40

50

60

70

pm

ol/

mL

C PM C PM

siNeg siTACE

Stress oxydant

TACE

ADAM17

GM-CSF

EGFR ligands

Particules

EGFR P

Pro - EGFR ligands

Rumelhard et al., 2007, Ramgolam et al., 2012

EGFR

P

GM-CSF Ligands

EGFR

Ligands

EGFR

Effet autocrine des ligands de l’EGFR sur la réponse pro-inflammatoire

73

PM et sécrétion muqueuse (MUC5AC)

Ctrl 10 50

PM2,5 µg

Ind

uction

ARNm M

UC5AC

Trachée de souris

Contrôle PM2,5 10µg/cm²

MUC5AC DAPI

Val et al., Arch Toxicol, 2012

NCI-H292

0

2

4

6

8

10

12

14

%

ce

llu

les

MU

C5

AC

(+

) Ctl 0.1 1 5 10

PM2.5 (µg.cm-2)

EGF

Cell MUC5AC (+)

Inhibition de TACE

0

2

4

6

8

10

12

14

Ctrl TAPI-2 PM2.5 PM2.5

TAPI-2

ind

uc

tio

n A

RN

m M

UC

5A

C

74

IAL 2 4 5 3 semaines

1

4 traitements espacés de 48h

PM

IAL 6

?

différenciation pathologique

Différenciation normale

squamous epithelium Stratified epithelium

mucous epithelium Mucin hypersecretion

mucociliary epithelium

100µl ?

Cultures primaires de cellules épithéliales

bronchiques humaines

20 µm

Cellules ciliées

Cellules à mucus

Effets à long terme d’une exposition répétée aux PM

75

5µm

Boublil et al., 2012

NHBE particules 10µg/cm² 6 semaines

76

4 traitements

IAL 2 4 5 3 semaines

1 IAL 6

Persistance de la réponse pro-inflammatoire

Effets d’une exposition répétée aux PM: sécrétion GM-CSF

77

MUC5AC expression

x40

control Fine PM UltraFine PM

mucus

43

10

day

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

43 10

MU

C5AC m

RN

A e

xpre

ssio

n

ctl Fine UF ctl Fine UF

day day

78

Milieux conditionnés

Tau

x d

e cr

ois

san

ce

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

T PMF

Co-cultures

*

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

T PMF

Tau

x d

e cr

ois

san

ce

traitement 4 traitements

Effets paracrines: prolifération de fibroblastes

79

Particules et cancérogenèse

Juin 2012: Diesel classé cancérogène pour l’homme (cat 1)

Niveau de preuves suffisant d’une association entre

exposition et un risque augmenté de cancers du poumon

80

Particules et cancérogenèse: études chez l’homme

Études épidémiologiques: cohorte chez les mineurs, travailleurs du rail et de

l’industrie du camionnage

•Association positive entre exposition et cancer du poumon

•Analyses exposition-réponse montrent des tendances positives et

statistiquement significatives

81

Particules et cancérogenèse: études chez l’animal

Echappement de moteur Diesel (entier): inhalation

•Induction de tumeurs varie selon les espèces:

chez le rat

Chez souris, 1 étude (+) sur 4

Chez le hamster, 3 études (-)

Echappement de moteur Diesel (fraction gazeuse seulement): inhalation

(-) chez le rat, la souris, le hamster

Particules de moteur Diesel: instillation intratrachéale

•Induction de tumeurs varie selon les espèces:

chez le rat

chez souris (non significatif)

chez le hamster, 1 étude (-)

82

De Marini, 2013

Exposition: Sang: adduits protéiques Urine: 1-hydroxypyrène Air: HAP

Dommages à l’ADN

Lymphocytes périphériques

83

Effets cytogénétiques

Micronoyaux Aberrations chromosomiques

84

Particules et cancérogenèse: études chez l’animal

Chez le rat

Rôle de la surcharge pulmonaire

Études de mutagenèse

(+) avec des extraits organiques 85

Clairance

altérée

Cytokines

facteurs de

croissance,

protéases

Inflammation, recrutement de

neutrophiles

Lésions cellulaires

prolifération, hyperplasie

Surcharge

pulmonaire

Tumeur

pulmonaire

Cellule initiée

Cellule prénéoplasique

Macrophage surchargé

Espèces

Activées de

l’Oxygène

Désorption

des composés

organiques

Adduits ADN

Mutations

Activation de proto-oncogènes

inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs

métaux

génétique HAP: adduits

EAO: lésions oxydatives

épigénétique Réponse inflammatoire

Prolifération épithéliale

Inhibition de l’apoptose

Particules et réponse allergique

Chez l’allergique:

Induction de cytokines pro Th2 par les P. Diesel (IL-4, IL-6…)

Amplification de la réponse à un allergène

Rôle d’adjuvant des particules

Induction de l’état allergique chez un sujet sain?

Diaz-Sanchez et al, 1997

Instillation nasale

87

Particules et effets allergiques

Intranasal instillation

0,5µg PM

j1 j2

0,5µg PM + 10 µg OVA

j4 j7 j9

0,5µg PM + 10 µg OVA

0,5µg PM + 10 µg OVA

0,5µg PM + 10 µg OVA

J21 et 22 j23

1% OVA

cytokine levels in the lung

Cytokine Saline OVA UF#1+OVA

TNF-α 1.63 ± 0.1 2.75 ± 0.2 5.40 ± 0.5*

IFN-γ 1.13 ± 0.0 1.13 ± 0.0 1.48 ± 0.2

IL-5 0.95 ± 0.6 1.98 ± 0.2 13.5 ± 3.1*

IL-4 0.00 ± 0.0 0.25 ± 0.3 0.82 ± 0.4

IL-13 1.25 ± 0.5 1.51 ± 0.6 4.19 ± 0.8*

KC 3.84 ± 0.3 8.17 ± 0.8 12.8 ± 0.6*

IL-6 0.56 ± 0.3 1.41 ± 0.1 2.43 ± 0.3*

MCP-1 0.00 ± 0.0 0.00 ± 0.0 9.34 ± 3.2*

MIP1-α 1.09 ± 0.4 1.99 ± 0.1 4.25 ± 0.6*

Li et al, 2009

88

Li et al, 2009

Particules et réponse allergique

Histopathology and morphometry of the left lung lobe. Volume de mucus

Nb éosinophiles

PM amplifient l’inflammation allergique - inflammation éosinophile - hyperplasie muqueuse

89

Composés

organiques

Surface

Métaux

Macrophage Neutrophile

Stress oxydant

Médiateurs inflammatoires

épithélium

capillaire

poumon

Endothélium

vasculaire

inflammation

systémique

Effets extrapulmonaires

Translocation des particules

Composés / métabolites

solubles

Passage des particules ultrafines

/composés 90

Comment expliquer les effets cardiovasculaires des PM?

G Nalbone, Médecine et longévité, 2010

Passage des particules ultrafines

vers la circulation systémique (Nemmar, 2001, 2002)

inflammation systémique

91

Témoin PM fines PM ultrafines

Oil red O (lipides neutres)

Moma-2 (Monocytes, macrophages)

Araujo et al, 2008

Effets cardiovasculaires à long terme: action proathérogène

75h

438 µg/m3, 4.56x105/cm3

112 µg/m3, 5.59x105/cm3

representative aortic root sections

(5h/jr, 3 jrs/sem)

92

93

Han et al, 2018

Effets sur le développement après exposition in utero

PM10 – PM2,5

2h/j, 5j/sem,

sur 20 j Retard de croissance à mi-gestation (taille tête)

Avant le terme:

- réduction de l’efficacité placentaire (poids du foetus

/placenta)

- Baisse du flux sanguin placentaire et du volume des

vaisseaux foetaux

Valentino et al, 2016

NP visibles dans le sang maternel, les cellules

trophoblastiques et le sang foetal

transfert transplacentaire

Diesel 1mg/m3

CONCLUSIONS

- PM fines et ultrafines: réponse inflammatoire via un stress oxydant

- Importance des composés organiques et des métaux dans les mécanismes d’action

- Importance de la granulométrie

- Induction de nombreux gènes dont ceux de l’inflammation, de la prolifération, de la différenciation

- Rôle d’adjuvant dans la réaction allergique

- Effets systémiques: - Effets cardiovasculaires - Effets sur le développement

- Effet cancérigène

94