Analyse des lipides par chromatographie en phase gazeuse

couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS)

Par Helena ALVES- REMYNAMC, équipe communication chimique

CNRS, UMR 8620Université Paris Sud, bât 446

ORSAY. Octobre 2004

Définition : Molécules insolubles dans l’eau, mais solubles dans les solvants organiques non polaires comme l’éther, le chloroforme, le méthanol ou le cyclohexane.

LIPIDES

Lipides simples :

• Alcools, aldéhydes, acides, esters gras• Acylglycérols (MG, DG, TG)• Stérols• Hydrocarbures (alcanes, alcènes, ß-carotène,..)• Quinones (vit. K, coenzyme Q)• Céramides • Cires• Lipides aminés (dopamine,…)

Lipides complexes :

• Phospholipides (PE, PI, PC, PS, SM, …)

• Glycolipides (groupes sanguins,…)

Mise en évidence des différentes classes de lipides

Chromatographie sur Couche Mince (CCM) ou Thin Layer Chromatography (TLC)

Chromatographie

Définition:

Méthode de séparation des constituants d’un mélange qui utilise deux phases non miscibles:

• Une phase stationnaire qui établit des liaisons +/- fortes avec les molécules à séparer

• Une phase mobile qui entraîne et décroche les molécules retenues sur la phase stationnaire.

CCM lipides

Migration

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

Té c h

• Phase stationnaire = Gel de silice

• Phase mobile = 4 mélanges de solvants différents

• Visualisation des spots: sous UV après vaporisation de Primuline.

R f :

D ista n c e p a r c o u r u e p a r le l ip id e

D ista n c e p a r c o u r u e p a r le fr o n t so lva n t

Lipides totaux transportés par la lipophorine

• Lipophorine: lipoprotéine hémolymphatique spécialisée dans le transport des lipides chez les insectes.

• Lipides totaux extraits par un mélange Méthanol – Chloroforme (1:2, v/v).

Lipides transportés par la lipophorine

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

TL ip o

C H - ( C H ) n - C H3 2 3

Hydrocarbures

C H - ( C H ) n - C H = C H - 3 2

( C H ) n - C H2 3

Lipides transportés par la lipophorine

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

TL ip o

Hydrocarbures

Triglycérides

CO

C H 2 O

C H

C H

2O C R

1

O C

O

R 3

O

R

Lipides transportés par la lipophorine

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

TL ip o

Hydrocarbures

Triglycérides

R C

O

O H

AGL

Lipides transportés par la lipophorine

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

TL ip o

Hydrocarbures

Triglycérides

AGL

C H

C H

C H2

2O C

O

R1

H O

O C

O

R2

D G 1 ,3

DG 1,3

Lipides transportés par la lipophorine

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

TL ip o

Hydrocarbures

Triglycérides

AGL

DG 1,3

R C

O

C H2

O

C H

C H2

2O C

O

R1

O H

D G 1 ,2

DG 1,2

Lipides transportés par la lipophorine

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

TL ip o

Hydrocarbures

Triglycérides

AGL

DG 1,3DG 1,2

H O

Sit o s t éro l

Stérols

Lipides transportés par la lipophorine

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

TL ip o

Hydrocarbures

Triglycérides

AGL

DG 1,3DG 1,2 Stérols

C H O H

C H2 O C

O

R

C H O H2

MG

Lipides transportés par la lipophorine

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

TL ip o

Hydrocarbures

Triglycérides

AGL

DG 1,3DG 1,2 Stérols

MG

R C

O

C H2 O

C H

C H2

2O C

O

R1

O P

O

O

O C H2

C H2

N H2

P E-

PE

Lipides transportés par la lipophorine

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

TL ip o

Hydrocarbures

Triglycérides

AGL

DG 1,3DG 1,2 Stérols

MGPE

R C

O

C H2

O

C H

C H2

2O C

O

R1

O P

O

N

O

O C H2

C H2

+C H

3C H

3C H

3P C

PC

Identification individuelle de chaque lipide

Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse ou GC-MS

Chromatographie en phase gazeuse ou CPG:

• Phase mobile = éluant gazeux inerte (He, H2, N2) qui entraîne le mélange à analyser.

• Phase stationnaire, fixée sur un support inerte, retient +/- les constituants du mélange.

Injection à haute températureCPG s’applique aux gaz et aux composés susceptibles

d’être vaporisés sans décomposition à haute température

G a z v ec teu r

Zo n e ch au ffée - 30 0°C

L in er

S ep tu m en m éth y l-silico n e

C arto u ch ech au ffan te

Th erm o co u p le

é c h a n tillo n liq u id e

C o lo n n e

En masquant les fonctions polaires, elles permettent d'augmenter:

• la volatilité• la stabilité• la détectabilité

Réactions de dérivation des lipides

Alkylation; Silylation

CO

HR

O

Ac i de g r as

+ C H3 O H

KO H

B F3C

OR

O C H3

E ste r m é thyl i que

Alkylation: réduit la polarité des lipides en remplaçant les H actifs par des groupements alkyles

Silylation: réduit la polarité des lipides en remplaçant les H actifs par des groupements triméthylsilyl ou tert-butyl-diméthyl-silyl (t-BDMS)

CO

HR

O

Ac i de g r as

+ M T B S T F A C

O

RO S i C

C H3

C H 3

C H3

C H3C H 3

1 H , 6 0 °C

t-B D M C S

D é r i vé t-B D M S

Séparation des lipides dans la colonne capillaire

G a z ve c te ur

T e m ps d 'a na lys e

0 t 0 t t t1 2 3

C o lo nneM é la ng eà s é pa re r

P ha s e s ta tio nna ire

= T e m ps de ré te ntio n

Phase stationnaire

C H 3

S i OC H 3

C H 3

C H 3 C H 3C H 3

S i S i S i S iO O O

C H 3 C H 3

. . . . . . . O

C H 3

. . . . . .

Sé par ati o n e n fo nc t i o n de : - l a po l ar i té ( i nté r ac t i o ns hydr o pho be s)- l a m asse m o l ai r e- l a te m pé r atur e

Phase stationnaire apolaire de type BP-X5 = Polymethylphenylsiloxanes

5% diphényl95% dim éthyl po lysilo xaneB P X5

Le détecteur de masse

S o u rce S ys tèm e d isp ers if D étec teu rM olécu le s S ign a lion s ion s

F e n te d 'e n tré e F e n te d e so rt ie Sp e c tre

S o u rc e d 'io n s: io n isa t io n d e s m o lé c u le s e t fra gm e n ta t io n d e s io n s

S y stè m e d isp e rsif: sé p a ra t io n d e s io n s su iva n t l e u r ra p p o r t m a sse / c h a rge

D é te c te u r: m e su re l 'a b o n d a n c e re la t ive d e c h a q u e io n

A n a ly s e d e s lip id e s p a r G C -M S

H e liu m1 5 p s i

F o ur

Inje c te ur s p litle s s3 0 0 °C

S o urc ed 'io ns

E I +

Inte rfa c e3 5 0 °C

P o m pa g e du v ide

A na ly s e urqua dripo la ire

P ho to -m ultip lic a te ur

d 'é

3 0 0 °C m /z 3 0 -8 0 0 D a

D e te c te ur de m a s s e M D -8 0 0

A cq u isit io n e t t ra it em en t d es

d o n n ées( M a ssL a b )

C o lo nne c a p illa ireB P - X 5 , L = 3 0 m

1 0 0 à 2 0 0 °C a v e c 1 0 ° /m in

C hro m a to g ra m m eS pe c tre de m a s s e du c o m po s é x

2 0 0 à 3 6 0 °C a v e c 1 0 ° /m in3 0 m in à 3 6 0 °C

G C 8 0 0 0

L ip ide s s ily lé s

ide ntific a tio n de x

1 m A

Io ns

7 0 e V

e -

F ila m e nt

R e po us s e ur

T ra ppe

L e ntille s de fo ca lis a tio n

A na lys e urIntro ductio né cha ntillo n

B lo c s o urc e3 0 0 ° C

P rin c ip e d 'u n e sou rce à im p act é lec tron iq u e

Electrons cibles de l’impact électronique

• Électron arraché, par ordre de préférence:

• 1) électron des doublets n (O, N, …)• 2) électron Π (double liaison)• 3) électron σ

• Réarrangements moléculaires• Rupture de liaisons• Les fragments chargés + sont détectés.

F iltre d e m a sse q u a d rip o la ire

S o urc e

D é te c te ur

Io ns sta ble s

2 pa ire s de ba rre sc o nduc tric e s , is o lé e s

c o nne c té e s 2 pa r 2

+ U + V c o s (w t)

-U -V c o s (w t)

Io n s

V o ltage co ntinu + , V o ltage a lternatif

V o ltage co ntinu - , V o ltage a lternatif

C ham p électro sta tiqu equ i fa it o scille r les io ns

m /z d o n n é

A n a ly s e d e s lip id e s p a r G C -M S

H e liu m1 5 p s i

F o ur

Inje c te ur s p litle s s3 0 0 °C

S o urc ed 'io ns

E I +

Inte rfa c e3 5 0 °C

P o m pa g e du v ide

A na ly s e urqua dripo la ire

P ho to -m ultip lic a te ur

d 'é

3 0 0 °C m /z 3 0 -8 0 0 D a

D e te c te ur de m a s s e M D -8 0 0

A cq u isit io n e t t ra it em en t d es

d o n n ées( M a ssL a b )

C o lo nne c a p illa ireB P - X 5 , L = 3 0 m

1 0 0 à 2 0 0 °C a v e c 1 0 ° /m in

C hro m a to g ra m m eS pe c tre de m a s s e du c o m po s é x

2 0 0 à 3 6 0 °C a v e c 1 0 ° /m in3 0 m in à 3 6 0 °C

G C 8 0 0 0

L ip ide s s ily lé s

ide ntific a tio n de x

15.000 20.000 25.000 30.000 35.000 40.000 45.000 50.000 55.000 60.000 65.000 70.000 75.000

rt0

100

%

47.18

46.97

27.32

19.85

1 9 .4 5

1 5 .7 0

2 3 .8 5

20.30

24.49

2 8 .7 3

43.37

33.40

29.21

33.29

50.69

47.77

54.09

51.27

57.27

62.76

l ip id e sP

T r ia c y l-sn -g ly c é r o ls

S té ro ls

12:0

-14:

0 1

,2

14:0

-14:

0 1

,2

16:0

-16:

1

16:0

-18:

1

12:0

-14:

1

14:0

-14:

1

D ia c y l-sn -g ly c é r o ls

H y d r o c a r b u r e s

M GA G L

12:0

-12:

0 1

,2

Tri

capr

ine

- SI

12:0

-14:

0 1

,3

14:0

-14:

0 1

,3

14:0

-16:

1

16:0

-18:

1

18:0

-18:

0

14:0

x3

C12

:0

C14

:0

C16

:1 C16

:0

C18

:1

C23

:1

C23

:0

C25

:1

C26

:0-S

I

2MC

26

2MC

28

7,11

-HD

C27

:1C

27:0

7,11

-ND

C18

:2

C18

:0

C25

:0

S ép aration et id en tification d es lip id es tran s p ortés p ar la lip op h orin e p ar G C-M S

16:0

-16:

112

:0 x

3

12:0

x2-

14:

0

16:0

-18:

0

12:0

- 14:

0 X

2

14:0

- 16:

1- 1

4:0

12:0

-12:

0 1

,3

fe m e lle â g é e d e 4 jo u r s

Acides gras libres (AGL) avant dérivation :

3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 210 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 2 6 0 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0

m /z0

1 0 0

%

7360

4 1

3 9

3 6

4 3

5 5

4 5

5 3

5 1

5 7

6 9

6 1

6 7

6 5

129

8 3

7 48 1

7 9

8 5 9 78 7

9 5

9 3

1 1 59 8

1 1 11 0 1

1 0 9 1 2 51 1 6

185

1 7 11 4 3

1 3 0

1 4 01 5 7

1 4 41 5 3

1 6 6 1 7 2

228

1 9 91 8 6

1 9 2 2 0 7208 2 2 3

2 2 9

M . +

O

O H

C 1 4 :0

Esters méthyliques d’acides gras :

R C

+O

O C H 3

M LC H 3 O

C

O+H

7 4

3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 2 6 0 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0 3 6 0 3 7 0 3 8 0 3 9 0 4 0 0

m /z0

1 0 0

%

74

4 3

4 1

3 9

3 2

5 5

5 3

5 7

6 9

5 9

6 7

6 0

87

7 5

8 3

8 1

1 4 3

9 7

8 8 1 0 1 1 2 9

1 1 1 1 1 51 3 0

2 5 51 9 9

1 8 51 5 71 4 4 1 7 11 8 1 1 8 6

2 1 32 0 0 2 4 12 2 7 2 4 2

2982 6 72 5 6 2 6 9 2 9 9

E s te r mé thyl iq ue d e C 1 8 :0

M. +

AGL après silylation :

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0 4 2 0 4 4 0 4 6 0

m /z0

1 0 0

%

285

7 5

7 3

4 3

41

3 9

575 5

4 7

6 95 9

1 2 9

1 1 7

1 1 5

9 57 69 3 9 9 1 0 5 1 1 8

131

1 7 1

1 4 3 1 5 7 1 5 91 8 5

1 7 2 1 8 7 2 0 7 2 1 32 4 12 2 7 2 6 92 4 3 2 5 5

2 8 6

2 8 7

3272 8 8

3 2 52 9 9 3 2 83 4 1 342

M -15M+.

S i C

O

O

M -57

M -57

131

Standard de distéarine après silylation

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0 4 2 0 4 4 0 4 6 0 4 8 0 5 0 0 5 2 0 5 4 0 5 6 0 5 8 0 6 0 0 6 2 0 6 4 0 6 6 0 6 8 0 7 0 0 7 2 0 7 4 0 7 6 0 7 8 0 8 0 0

m /z0

1 0 0

%

341

4 3

4 1

5 7

5 5 1317 3

6 97 5

1 2 9

8 3 1 1 78 5

9 79 8

1 7 1

1 4 7

267

1 8 5 2 3 13 3 9

2 9 9

681

3 4 2 455

4 1 53 4 33 5 5

4 5 44 1 6

4 5 66 0 6

4 6 9 6 7 6

6 8 3

6 8 4

6 8 5

A

B

C

M -57

+

+ +

C 1 8 :0

C 1 8 :0

tB D M S

Spectre de la tricaprine

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0 4 2 0 4 4 0 4 6 0 4 8 0 5 0 0 5 2 0 5 4 0 5 6 0

m /z0

1 0 0

%

155

5 7

4 3

4 1

3 9

5 5

7 1

6 9

6 7

8 5

8 4

7 3

9 8

8 61 1 2

1 3 71 1 6

383

229

2 2 7

1 5 61 7 1

1 5 9 1 8 5 2 1 31 9 6

2 7 0

2 3 02 4 1 2 5 5

2 8 3

2 7 2

3 3 9

3 2 53 1 12 9 7

3 6 9

3 4 0 3 5 33 7 0

3 8 4

4 2 43 8 54 5 2

A +

C +

B +

C 1 0 :0

C 1 0 :0

C 1 0 :0

TG composé de 3 AG différents

4 0 6 0 8 0 100 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 360 3 8 0 4 0 0 4 2 0 4 4 0 460 4 8 0 5 0 0 5 2 0 5 4 0 5 6 0 5 8 0 6 0 0 6 2 0 640 6 6 0 6 8 0

m /z0

1 0 0

%

523

5 7

5 5

4 3

4 1

3 9 5 3

2366 9

6 7

8 3

7 1

8 1

2119 5

8 5

9 8

1 0 9

1 1 11 3 5 1 3 7

1 9 31 5 1 1 7 1

1 5 7 1 8 51 9 4

2 2 1

521

285239

2 4 0

313

311

3 0 9

2 9 5

5 2 0

4 2 3339

3 2 6

3 6 7

3 6 5

3 5 4

3 9 5

3 8 1

4 2 1

4 0 9

4954 7 7

4 5 14 2 45 0 5

5495 2 4

5 2 5

5 5 1

5 5 25 6 4 5 7 7 5 9 2 6 0 9 6 3 7 6 8 8

C 1 4 : 0

C 1 6 : 0

C 1 6 : 1

A+

A+

A+ B+

B+

B+

C +

C +

C +

Mécanismes de fragmentation des acyl-sn-glycérols:

F orm ation d es ion s A +

.

.R

O H

1 OO

O CR 2

3O

+

O

R

F orm ation d es ion s B e t C

R - C O O2 ( o u t B D M S O )

R

O

H1 O

+

O(R - C H )23 C M - R C O O2

R C O3

R

O

1 O O H+

B R C O O H + 5 71

O

+ +

+

+

.

. .

1,3-dimyristine

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0 4 2 0 4 4 0 4 6 0 4 8 0 5 0 0 5 2 0 5 4 0 5 6 0 5 8 0 6 0 0 6 2 0 6 4 0 6 6 0 6 8 0

m/z0

1 0 0

%

569

5 7

4 3

4 1

3 9

5 5

4 4

5 6 7

2852117 37 1

6 9

6 7

7 5

8 59 5 9 7

1 0 9 1 7 1131

1 4 71 4 9

1 8 3 1 9 1

2 8 3

2 1 22 3 9

2 3 6 2 5 7

3 5 92 8 6

3 3 93 1 32 8 7 3 2 6

3 5 9

3 6 0

3994 9 44 1 3

4 5 1 4 9 24 9 5

5 7 0

5 7 1

5 7 2

C '

C 1 4 :0

C 1 4 :0

OS iC

A+ B+

C +

M - 5 7

1,2-dimyristine

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700

m /z0

100

%

285

57

43

41

44

21173

67

17113175

831 2 9

95 115

147 149 191

283236

212 237269

569

286 399

339287

311 326395

359383

567

400

421 494477451423 520495 565549

570

571

572611 613

CA

B

M -5 7

C 14:0

C 14:0

O S i C

M - 5 7

+ +

+

Hydrocarbures ramifiés:Formation de carbocations secondaires

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440

m /z0

100

%

85

57

43

55

54

71

69

58

83

82

72

81

99

97

96

86

95

168113

111

110

109

127

125

124

1 4 0

139

138

133

155

154

147166

196

169

183170 195

197

224

211

323253239238 266 309294 322 324 341 355

M -1 5

M + = 3 3 8

+io ns d é tec té s

m /z m /z

+

1 6 8 196

Localisation des doubles liaisons:dérivation au DMDS

I 2

C H3

C H3

C H3

C H3

S

SS S

D M D SC C C C

Spectre du 7-pentacosène

C H 5 1623 )(C H C H

S

C H 2 )(C H C H 3

1 4 5

299

S C H 3

C H 3

+ .

.+

4 0 6 0 8 0 1 0 0 120 140 160 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 340 360 380 4 0 0 4 2 0 4 4 0 4 6 0 480 5 0 0 5 2 0 5 4 0 560

m /z0

1 0 0

%

299145

4 3

4 1

3 2

5 5

4 7

6 19 7

6 9

8 3

8 1 9 5

1 0 9 111 1 2 9

1 4 6

2 8 31 4 7

1 7 31 5 7 199 2502 1 3 2 2 72 7 1

300

4443 0 1

3 9 73 0 2

3813 4 83 1 1 3 2 5 355 398445

M + 2S C H3

7-p entac o s ène

Phéromones chez Drosophila melanogaster Femelle

7,11 Heptacosadiene

1 7 8 11 12 27CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)2-CH=CH-(CH2)14-CH3

5,9 Heptacosadiene

1 5 6 9 10 27CH3-(CH2)3-CH=CH-(CH2)2-CH=CH-(CH2)16-CH3

7 Tricosene

1 7 8 23

CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)14-CH3

7 Pentacosene

1 7 8 25

CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)16-CH3

Cis-vaccenyl acetate

1 7 8 18

CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)9-CH2-O-C-CH3

O

Phéromones chez Drosophila melanogaster

Mâle

Identification des phospholipides

• 1) identification du type de PL par CCM grâce à la co-migration de standards

• 2) identification des AG estérifiés par GC-MS

Lipides transportés par la lipophorine

1 6 c m

8 c m

4 c m

d é p ô t

TL ip o

Hydrocarbures

Triglycérides

AGL

DG 1,3DG 1,2 Stérols

MGPE

R C

O

C H2

O

C H

C H2

2O C

O

R1

O P

O

N

O

O C H2

C H2

+C H

3C H

3C H

3P C

PC

Analyse des spots correspondant à PE et à PC par GC-MS

4 8 .0 0 0 4 9 .0 0 0 5 0 .0 0 0 5 1 .0 0 0 5 2 .0 0 0 5 3 .0 0 0 5 4 .0 0 0 5 5 .0 0 0 5 6 .0 0 0 5 7 .0 0 0 5 8 .0 0 0 5 9 .0 0 0

r t0

100

%

0

100

%

5 3 .7 6 5

5 6 .8 2 2

PE

5 6 .7 9 0

5 3 .4 0 3

5 6 .5 5 5

5 4 .5 1 6

PC

PL

16:

0- 1

6:1

PL

16:

0- 1

6:1

PL

16:

0- 1

8:0

PL

16:

0- 1

8:1

PL

16:

0- 1

8:1

PL

16:

0- 1

8:0

PL

16:

0- 1

8:2

X 3 0

L’analyse des lipides par GC-MS permet :

• d’identifier les AG libres• d’identifier les AG estérifiés dans les MG, DG,

TG et PL• de distinguer entre DG 1,2 et 1,3• d’identifier les hydrocarbures• de localiser la position d’une ramification• de localiser la position d’une double liaison• d’identifier les stérols