L’isolement et la manipulation des gènes

B. Quelques applications de l'ADN recombinant

– La synthèse des gènes et leur expression : la production de protéines recombinantes.

– Organismes transgéniques: plantes.– Thérapie génique.– Détection des gènes responsable des maladies

génétiques.

Objectifs– Connaître quelques applications de l'ADN

recombinant.

Expression de l’hormone de croissance humaine, avec élimination de la séquence humaine de signalisation

Production pharmaceutique de l’insuline humaine

Système d'expression en 2 étapes: Amplification

Génétique inverse

La génétique inverse se base sur la construction de mutants pour découvrir le phénotype d'un gène (génotype).

Génétique Génétique inverse phénotype mutant séquence d'une protéine

allèle mutant séquence d'ADN

séquence d'ADN allèle mutant

séquence de la protéine phénotype mutant?

Organismes transgéniques

Modification du génome d'une espèce par l'introduction d'ADN extrinsèque

– De la même espèce ou d'une espèce différente

Méthodes d'introduction1- transformation2- injection3- virus4- bombardement

Intégration homologue (même locus) ouhétérologue (locus différent)

Destruction d'un gène

2) Enlever des gènesProblème: Les tomates mûres sont trop fragiles pour être transportées

Solution habituelle1) Cueillies vertes et transportées dans des camions réfrigérés2) Exposées au gaz éthylique avant d'être envoyé aux magasins

A) Stimule la synthèse de carotène (couleur)B) Stimule la synthèse de sucres (goût)C) Stimule la dégradation de la pectine dans les parois des cellules (amollissement)

Solution génétique : Production de tomates qui restent fermes lorsqu'elles mûrissent

– En inhibant la production de l'enzyme polygalacturonase (PG) qui catalyse la solubilisation de la pectine

– En produisant de l'ARNm antisense: qui sera complémentaire à l’ARNm du gène de l’enzyme PG. Ceci entraîne une inhibition de la traduction.

– Nature 334: 724-726 (1988)– Plant Mol. Biol. 14: 369-379

ARNm

Anti-ARNm

Pas de traduction de l’enzyme PG

Critiqué, parce que:1) La construction anti-PG est réalisé dans un plasmide qui contient un gène de résistance à un antibiotique.

La résistance à cet antibiotique pourrait être transmise à des bactéries vivant dans le sol.Ce gène était nécessaire pour la sélection de cellules ayant la construction anti-PG.

2) L'insertion de ces gènes dans le chromosome des tomates pourrait aussi causer une mutation par intégration dans le génome.

Trois types de thérapie génique

Thérapie somatique

Les virus seront les vecteurs portant un allèle sain du géne deficient dans une maladie donnéeA) Rétrovirus désarmé :

Intégration aléatoire (possibilité de muter un gène utile).N'affectent que les cellules en cours de prolifération (sanguines).

• Utilisé dans la SCID (enfants-Bulles)

B) AdénovirusNe s'intègre pas dans le génome (pas d'inactivation par insertion)Infecte aussi les cellules en état de non-proliférationLimité aux cellules épithéliales du système respiratoire

• Mucoviscidose: gène CFTR

Détection des gènes responsables des maladies

génétiques: Diagnostic

Techniques classiques de détection

1) Détection de modifications physiologiquesEx. Phénylcétonurie => accumulation de phénylalanine

2) Détection de présence ou absence d'activités enzymatiques

Ex. Galactosémie => pas de galactose 1-puridyl transférase

Problème: ne permet pas de détecter les maladies qui ne s'accompagnent pas de ces modifications

Ex. Ne permet pas de détecter la dystrophie de DuchenneSolution: cloner le gène et établir quels allèles sont présents

1) sites de restriction dans la séquence codante2) sites de restriction près de la séquence codante3) sonder avec des oligonucléotides4) séquençage

Sites de restriction dans la séquence codante

Gène fonctionnel = A = 999 bases = 333 acides aminés

Gène non-fonctionnel = a = 996 bases = 332 acides aminés

lys glu gly phéfonctionnel = ... AAA GAA GGC TTC ...non-fonc. = ... AAA GAA --- TTC ...

base 661 Eco RI

Après une digestion avec Eco RI:1) homozygote pour le gène fonctionnel (AA)

Un fragment d'ADN de 999 bases 2) homozygote pour le gène non-fonctionnel (aa)

Un fragment d'ADN de 666 bases et Un fragment d'ADN de 330 bases et

3) hétérozygote (Aa)Un fragment d'ADN de 999 bases etUn fragment d'ADN de 666 bases etUn fragment d'ADN de 330 bases

1 2 3

Anémie falciforme

Maladie : Disparition d’un site de restriction dans la séquence codante du gène de beta-globine.

AS

1.3

1.1

0.2