Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 2

aspartateCarbamyl phosphate carbamyla

spartate

ATCase

BCM311 - rappel comportement

embouts

boite vide

boîte moitié vide - retourner au buffet

- remplir (gants) et mettre à l'endroit pour stérilisation ultérieure (ne pas remettre au buffet)

BCM311 - rappel comportement

remplir flacons laveurs

vider poubelles de table

enlever cuvettes des spectrophotomètres

ne pas laisser des cuvettes pleines sous la hotte

départs hâtifs - manipulations- ménage- vérification du cahier

Jour 1 - variabilité

0 5 10 15 20 250

1

2

3

[Asp] mM

DO

46

6

1/1001/5001/10001/20001/50001/10000

0 5 10 15 20 250

1

2

3

[Asp] mM

DO

46

6

1/1001/5001/1000

0 5 10 15 20 250

1

2

3

[Asp] mM

DO

46

6

1/1001/5001/10001/2 0001/5 0001/10 000

0 5 10 15 20 250

1

2

3

[Asp] mM

DO

46

6

1/1001/5001/10001/20001/50001/10000

Jour 1 - allostérie

0 5 10 15 20 250.0

0.5

1.0

1.5

[Asp] mM

DO

46

6

0 5 10 15 20 250.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

[Asp] mM

DO

46

6

0 5 10 15 20 250.0

0.5

1.0

1.5

[Asp] mM

DO

46

6

0 5 10 15 20 250.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

[Asp] mM

DO

46

6

R2 = 0,9933 R2 = 0,9893

R2 = 0,9961R2 = 0,9997

Jour 1 - faibles préparations

0 5 10 15 20 250.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

[Asp] mM

DO

46

6

1/100

ATCase - but

ATCase est une enzyme allostérique

1ère semaine - préparation de l'enzyme - détermination de la dilution

étudier les propriétés cinétiques de aspartate transcarbamylase (ATCase) d'E. coli

vite

sse

Organigramme - semaine 2

effecteurs d’ATCase (séries A, B et C)

Préparation d’ATCase de la première semaine

Dosage d’ATCase sans effecteur(Série A)

Dosage d’ATCase en présence de CTP

(Série B)

Dosage d’ATCase en présence d’ATP

(Série C)

Courbe standard de carbamyl aspartate

Organigramme - semaine 2

désensibilisation du site allostérique (A,D+E)

Préparation d’ATCase de la première semaine

Dosage d’ATCase sans effecteur(Série A)

Dosage d’ATCase en présence de Hg

(Série D)

Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP

(Série E)

Organigramme - semaine 2

effecteurs d’ATCase (séries A, B et C)

Préparation d’ATCase de la première semaine

Dosage d’ATCase sans effecteur(Série A)

Dosage d’ATCase en présence de CTP

(Série B)

Dosage d’ATCase en présence d’ATP

(Série C)

Courbe standard de carbamyl aspartate

CTP est un inhibiteur d'ATCase ATP est un activateur d'ATCase assure une production égale de purines + pyrimidines

Biosynthèse des pyrimidines

0 10 20 300

1

2

3native+CTP+ATP

Vmax ave

Vmax/2

[aspartate] mM

DO466

ATCase

Vmax ne change pas

Kprime change

+CTP+ATP

À noter: ►Kprime n'est pas la [S] à Vmax/2

►ici à titre d'exemple seulement

ATCase

enzyme allostérique: cinétique non-michaelienne

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

native+ATP

+CTP

[aspartate] mM

Vit

esse

BCM311 - résultats typiques

Michaelis-Menten

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5

2.0native+CTP+ATP

[aspartate] mM

DO

46

6

+CTP+ATP

Michaelis-Menten d'ATCase

Organigramme - semaine 2

désensibilisation du site allostérique (A,D+E)

Préparation d’ATCase de la première semaine

Dosage d’ATCase sans effecteur(Série A)

Dosage d’ATCase en présence de Hg

(Série D)

Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP

(Série E)

Structure d'ATCase - séries A, D + E

enzyme native, C6R6, 300 kDa

Structure d'ATCase - séries A, D + E

sous-unité catalytique (C3) catalysent encore la réaction souvent plus active que l’holoenzyme cinétique michaelienne (courbe hyperbolique) pas sous la régulation de CTP ou d’ATP

Structure d'ATCase - séries A, D + E

Structure d'ATCase - effet de Hg

Michaelis-Menten

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5native+Hg+Hg+CTP

[aspartate] mM

DO

46

6

Michaelis-Menten

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5native+Hg+Hg+CTP

[aspartate] mM

DO

46

6

ATCase+Hg plus active que natif courbe hyperbolique ATCase ne répond plus à CTP

Structure d'ATCase - effet de Hg

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5native+CTP

Vmax ave

Vmax/2

VitesseMichaelis-Menten

[aspartate] mM

Structure d'ATCase - effet de Hg

Michaelis-Menten

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5native+Hg+Hg+CTP

[aspartate] mM

DO

46

6

Michaelis-Menten

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5native+Hg+Hg+CTP

[aspartate] mM

DO

46

6

ATCase+Hg plus active que natif courbe hyperbolique ATCase ne répond plus à CTP

Points techniques

préparer suffisamment d’enzyme diluée pour effectuer les séries en question(A-C ou A+D+E)

diluer l’enzyme immédiatement avant son utilisation

garder l’enzyme sur glace en tout temps sauf durant l’incubation

préparer le réactif (attention: H2SO4) colorimétrique juste avant son utilisation (protège-le de la lumière)

préparer seulement le volume du réactif requis (~210 ml; surplus à Will)

lire les DO rapidement après la terminaison des réactions: la couleur diminue avec le temps

Lunettes et gants obligatoire

Points techniques

Réactions à 30oC (bains personnels) réactifs (tubes) préchauffés laissez des intervalles assez longs vérifiez la température des bains

Points techniques

préparation des solutions

1.aspartate 125 mM(préparer 50 ml / table)

2.carbamyl phosphate 36 mM(préparer 50 ml / table)

solutions préparées semaine I

1.acide perchlorique 2%

2.tampon sodium phosphate 0,16 M pH 7,0

Points techniques

Études cinétiques = précision chronométrage concentrations/dilutions/volumes homogène température

Points techniques

ATCase - questions ?

aspartateCarbamyl phosphate carbamyla

spartate

ATCase

ATCase - graphique de Hill

log (V/Vmax-V) vs log [aspartate]

pente = nh

besoin de Vmax

Vmax historiquement déterminé à l’aide des graphiques "linéaires" de Lineweaver-Burk et d'Eadie-Hofstee

0.5 1.0 1.5

-3

-2

-1

0

1

2native+CTP+ATP

log [aspartate]

log

V/V

ma

x-V

ATCase - graphique de Hill

pour un enzyme allostérique, la courbe M+M est sigmoïde

Michaelis-Menten

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5Vmax 

[aspartate] mM

Vit

esse

ATCase - graphique de Hill

alors, les graphiques linéaires (LB et EH) ne sont pas

Comment déterminer Km et Vmax ?

Lineweaver-Burk

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0

10

20

30

1/[aspartate] mM-1

1/V

Eadie-Hofstee

0.00 0.02 0.04 0.06 0.080.0

0.2

0.4

0.6

0.8

V/[aspartate] DO/mM

V

Régression non-linéaire ("Curve fitting")

logiciels puissants (Graphpad) utilise le formule MM pour les enzymes

allostériques et détermine Vmax, Kprime et nH pour que la courbe tracée suit les données

Régression non-linéaire ("Curve fitting")

Effecteurs allostériques

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5Série A (natif)Série B (+ CTP)Série C (+ ATP)

[aspartate] mM

DO

46

6

Effecteurs allostériques

0 10 20 300.0

0.5

1.0

1.5

[aspartate] mM

DO

46

6

native+CTP+ATP

GraphPad 6 - utilisation dans BCM311

présentation PowerPoint disponible sur le site internet du cours

régression linéaire (courbe standard) régression non-linéaire (Michaelis-Menten) comparaison de modèles (ex. MM vs sigmoïde)

Analyse des données - Excel

préparez une « super » tableau avec toutes les données AVANT de faire les graphiques pour une série (ex. Série A)

bien identifier les colonnes (unités etc.) copiez le tableau, changez les DO et tous les

calculs se fait automatiquement pour la 2e série

Analyse des données - Excel

Analyse des données - Excel

1 µM = 1 µmole/Lvolume de réaction = 2 ml = 2 x 10-3 L

Alors: µmole CA = µM x 2 x 10-3 L

Analyse des données - Excel

= µmoles CA / (0,5 hr X 0,1 ml)

Analyse des données - Excel

Analyse des données - ExcelSérie A

Série B

Cette semaine

nouvelle courbe standard chaque équipe analyse ses propres résultats analyse des résultats (graphiques MM) avec GraphPad en fin de journée (fichier à Will)

rapport à remettre dans 2 semaines