Post on 04-Apr-2015
Les méthodes d’analyse des
transcrits différentiels
Christine Bole-Feysot
INTRODUCTION
Qu’est-ce qui caractérise une cellule ?-les gènes exprimés-leur niveau d’expression
Les mécanismes moléculaires à l’origine de tous les processus biologiques normaux et pathologiques
passent par des modifications quantitatives et qualitatives des ARN et des protéines.
Méthodes permettant de repérer et d’identifier les ARN et les protéines dont la
quantité varie
La régulation de l’expression des gèneschez les organismes eucaryotes
Définitions
Protéome : ensemble des protéines présentes dans une cellule ou un tissu
Transcriptome : ensemble des ARN présents dans une cellule ou un tissu
Transcrit ou Protéine différentielle :Transcrit ou Protéine dont la quantité est modifiée ( ou )
Historique des techniques d’analyse des transcrits différentiels
Technologies appliquées aux ADNc
Techniques d’analyse des transcrits différentiels dérivées
Caractéristiquede l’analyse
Années 80
Banques d’ADN complémentaires
Banques soustractives
QualitativeNon exhaustive
Années 90
PCR
-Differential Display,CDNA-AFLP-RDA-SSH
QualitativeNon exhaustiveFacile à réaliser
Fin années 90
Séquençage systématique :-de génomes entiers-de séquences exprimées (EST)Bio-informatiqueMicrotechniques appliquées à la biologie moléculaire
-SAGE-microarrayspuces à ADN (« DNA chips »)
Quantitative« exhaustive »lourde et onéreuse
Cellules A
ARNm A
ADNc A
Cellules B
ARNm B
ADNc B
BANQUE SOUSTRACTIVE
dNTP-Biotine
Hybridation
A /A A /B B /B
Banque soustractive A-B
Elimination des ADNc portant de la biotine
Méthodes d’analyses des transcrits différentielsA PETITE ECHELLE
mRNA Differential Display
PCR soustractive :Representational Difference Analysis (RDA)Subtractive Suppressive Hybridization (SSH)
Arrays sur membrane
mRNA - DIFFERENTIAL DISPLAY
CMAAAAAAAAA-An
CMAAAAAAAAA-AnGMTTTTTT
GMTTTTTTAGCCAGCGAA
GMTTTTTTAGCCAGCGAA
GMTTTTTTAGCCAGCGAA
Transcription inverse
Amplification par PCR
5’-TTTTTTTTTTTTMG-3’ (T12MG)dNTPsTranscriptase inverse
5’-AGCCAGCGAA-3’ (amorce AP1)5’-TTTTTTTTTTTTMG-3’ (T12MG) dNTPs-(35S-dATP) ou -(33P-dATP)Taq polymerase
ADNc A
Cellules B
ARNm B
ADNc BElectrophorèse (polyacrylamide)
mRNA - DIFFERENTIAL DISPLAY
Analyse des ADNc positifs potentiels(clonage, élimination des « faux positifs »)
A BAutoradiographie
Bande « positive »
Extraction des bandes « positives » du gel
PCR
RT(oligodT ancré)
TTTTTTTAAAAAAAAAAA
PCR (oligodT/amorce aléatoire)dATP-S35
AAAAAAAAAAA
TTTTTTTAGCCAGCAA
Cellules A
ARNm A
RT (oligodT ancré)
TTTTTTTAAAAAAAAAAA
PCR (oligodT/amorce aléatoire)dATP-S35
AAAAAAAAAAA
TTTTTTTAGCCAGCAA
Autoradiogramme de Differential DisplayComparaison des cellules A et B
A B A B A B A B A B A B
mRNA Differential Display
Nombre d’oligonucléotides et de PCR possibles
- Transcription inverse
T AATTTTTTTTTTTTCC GG
3 possibilités 4 possibilités
12 oligonulcéotides différents
- PCR
Primer 3’ (T12MX) : 12 possibilitésPrimer 5’ (10-mers) : 16 possibilités
Nombre de PCR différentes possibles par échantillon : 12 x 16 = 192
Pour 2 échantillons : 192 x 2 = 384 PCR
Pour 2 échantillons, PCR en duplicat ou triplicat : 768 ou 1152 PCR !!!
Autoradiogramme de Differential Display
Induced
Induced
Constant
Comparaisons Contrôle et échantillon : C / E2 (3 PCR différentes pour C et 3 PCR différentes pour E2)
Avantages du mRNA Differential Diplay
Peu d’ARN nécessaire
Détection possible des transcrits différentiels correspondant à des gènes :- faiblement exprimés (en principe)- inconnus-soumis à épissage alternatif
Comparaison simultanée de plusieurs échantillons (cinétique, dose/réponse…)
Mise en évidence de régulation positive et négative
Facile à mettre en œuvre
Très rapide
Peu onéreux
Inconvénients du mRNA Differential Diplay
Non exhaustif -compatibilité avec les oligonucléotides de PCR-Taille des produits de PCR ne doit pas excéder 500 pb
Biais de la PCR : Grand nombre de « faux positifs »
température d’annealing trop basse PCR manque de reproductibilité
Elimination des faux positifs longue et fastidieuse
Amplification préférentielle de certains ADNc- Réduction de la complexité des ADNc- Représentation de chaque type d’ADNc très différente de celle des ARNm dont ils sont issus
Identification des ADNc pas toujours facile (dépend de l’espèce)
Electrophorèse (polyacrylamide)
A BAutoradiographie
Bande « positive »
Digestion enzymatique
Cellules A
ARNm A
ADNc A
Ligation d’adaptateurs
Cellules B
ARNm B
ADNc B
PCR
cDNA - AFLP
Principe général des techniques de PCR soustractives (RDA & SSH)
Hybridation
PCR suppressiveA - B
Sous-clonage
Banque soustractive A - B
A/A
A/B
B/B Pas d’amplification
Amplification linéaire
Amplification exponentielle
Digestion enzymatique
Cellules A
ARNm A
ADNc A
Ligation d’adaptateurs PCR
Cellules B
ARNm B
ADNc B
Digestion enzymatique
REPRESENTATIONAL DIFFERENCE ANALYSIS (RDA)
SUBTRACTIVE SUPPRESSIVE HYBRIDIZATION (SSH)
Banque soustractive A - B
Avantages de la RDA et de la SSH
Peu d’ARN nécessaire
Détection possible des transcrits différentiels correspondant à des gènes :- faiblement exprimés (SSH surtout)- inconnus-soumis à épissage alternatif
Identification facile des cDNA
Assez facile à mettre en œuvre
Rapide
Peu onéreux
Inconvénients de la RDA et de la SSH
Comparaison simultanée de plusieurs échantillons difficile
Non exhaustif Les cDNA doivent avoir un minimum de 2 sites de restriction pour générer des produits amplifiables.
Fabrication de 2 banques soustractives pour voir les gènes induits ET réprimés
Biais de la PCR : Amplification préférentielle de certains ADNc- Réduction de la complexité des ADNc- Détection préférentielle des transcrits différentiels abondants-Faux positifs
MACROARRAYS
ADNc « positif »
indétectable
MACROARRAYSAnalyse de l’expression de 96 gènes au cous du cycle cellulaire d’une lignée synchronisée
GA
G1/S
G1
G2
NS
Cellules non synchronisées (NS), en arrêt de croissance (GA), en phases G1, G1/S et G2 du cycle cellulaire.
Avantages des macroarrays
Peu d’ARN nécessaire
Comparaison simultanée de plusieurs échantillons (cinétique, dose/réponse…)
Choix du matériel à spotter sur les membranes :-produits de PCR : RT-PCR, plasmides ou lysats bactériens amplifiés -clones bactériens : issus de banques d’ADNc, de banques soustractives
Assez facile à mettre en œuvre (automatisation possible)
Inconvénients des macroarrays
Non exhaustif
Préparation des membranes peut être longue
Attention à la qualité du matériel spotté
Cross-hybridation (faux négatifs)
Microarrays sur Nylon8000 gènes
Méthodes d’analyses des transcrits différentielsA GRANDE ECHELLE
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)
Microarrays sur lames, DNA chips (puces à ADN)
Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)
SERIAL ANALYSIS OF GENES EXPRESSION (SAGE)
TTTTTTAAAAAA
AAAAAA
TTTTTTAAAAAA
ATTTTTTAAAAAA
B
BA
ARNm
Transcription inverse sur bille
Digestion par l ’enzyme d ’ancrage
Ligation d’adaptateurs (A ou B)
Digestion par l’enzyme d ’étiquettage
Digestion (bouts francs)Ligation
Amplification par PCR
Digestion, Concaténattion
Clonage, Séquençage
BA
Restriction digest double-stranded cDNA with a 4-base cutter “anchoring enzyme” (NlaIII); bind to streptavidin coated beads
GGATGCATGXXXXXXXXXXCCTACGTACXXXXXXXXXX
AAAATTTT
AAAATTTTGTAC
AAAATTTT
AAAATTTT
GGATGCATGOOOOOOOOOOCCTACGTACOOOOOOOOOO
GGATGCATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATGCATCCCCTACGTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTACGTAGG
CATGGTAC
1CATGGTAC
2
1 2
Generate cDNA primed withbiotin-oligo(dT)
Divide pool in half & ligate to different linkers (1 or 2),both of which have a restriction site for the “tagging enzyme” (BsmFI)
Restriction digest with a “reach & grab” enzyme (BsmFI) which recognizes the linker sequences and cuts downstream in a sequence independent fashion; fill-in 5’ overhang to blunt ends.
Blunt end ligate pool 1 to pool 2, and PCR amplify with primers specific to linker sequences 1 and 2
Restriction digest with same anchoring enzyme (above); gel isolate ‘di-tags’; concatenate ditags and ligate to cloning/sequencing vector
1 2
AAAATTTT
AAAATTTTGTAC
Tag 1 Tag 2
Ditag
----- CATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATGXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOCATG-------- GTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTACXXXXXXXXXXOOOOOOOOOOGTAC----
Ditag Ditag
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4
SAGE
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATAAANNNNNNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3’
CATGNNNNNNNNNN : 14 pb4 pb site de restriction pour NlaIII + 10 pb étiquette (TAG) spécifique
ADNc complet5’
SAGE : analyse des résultats
NB : La qualité des résultats dépend du nombre de Tags séquencés
1-Précision du SAGE:Echantillonnage de Tags statistiquement représentatif de la totalité du transcriptome : 50 000 Tags ->QuantitatifEn-dessous de 50 000 Tags les quantités relatives calculées de chaque transcrit ne sont pas constantes (pour 1000, 1500, 2000 Tags) -> seulement semi-quantitatif 2-Sensibilité du SAGE : dépend du nombre de Tags séquencés(résultats moins fiables pour les transcrits rares)
Compilation des résultats de séquençageCalcul de la fréquence d’apparition
Séquençage en série
Avantages du SAGE
~ ExhaustifBilan transcriptionnel
Détection possible des transcrits différentiels correspondant à des gènes :- faiblement exprimés (limite en fonction du nombre de tags séquencés)-Inconnus
Mise en évidence de régulation positive et négative
Construction de bases de données de SAGE
Inconvénients du SAGE
Techniquement difficile à mettre en œuvre
Haute capacité de séquençage nécessaire
Long et onéreux
Identification des ADNc pas toujours facile - Attention aux erreurs de séquençage (des Tags de SAGE et des bases de données)- Identification très difficile pour les espèces
« exotiques »- Comparaison d’un grand nombre d’échantillon difficile
Initialement beaucoup d’ARN nécessaireOptimisation MicroSAGE, SADE
Biais de la PCR : - Amplification préférentielle de certains ADNc (même avec des amplicons de taille identique)
- Modification de la représentation de chaque type d’ADNc par rapport à celle des ARNm dont ils sont issus
- Parfois grand nombre de Ditags identiques : artefacts