Laboratoire Matière et Systèmes Complexes

CNRS UMR 7057 – Université Paris Diderot (P7)

10, rue Alice Domont et Léonie Duquet – 75 013 Paris

Propriétés mécaniques passives et actives de cellules vivantes isolées

Atef Asnacios

Propriétés PassivesViscoélasticité des tissusstructure propagation de la force

Propriétés Actives Réponse mécanique à un signal biochimique

chemo-attractant,adhesion polarisation, migration

Réponse Mécanique/biochimique à un signal mécanique: mécano-transduction

cellules cultivées: toujours sous tensionsécrétions d’un épithélium modulées par la flux sanguin

nucleus

Mécanique fonction biologique

Cellule et mécanique

Membrane plasmique

Protéines transmembranaires

d’adhérence

matrice extracellulaire(collagène,...)

noyau

Cytosquelette dynamique (2D-3D) : - Filaments d’actine (Ø=8nm, Lp=15µm)

- Filaments intermédiaires (Ø≈10nm, Lp≈500nm)

- Microtubules (Ø=25nm, Lp ≈ qq mm)

Cellule et mécanique

15 µm

Appliquer à la cellule une contrainte contrôlée et déterminer sa:

Réponse mécaniqueMesure de déformation (fluage)Détermination du module viscoélastique

Avec collaborations Réponse structurale

visualisation du cytosquelette par fluorescence

Réponse biochimique (génétique)suivi de marqueurs d’activité protéique ou génétique

Propriétés passives

F

-F

Observer l’évolution d’une cellule dans une géométrie (3D) prédéfinie et simple :

Activité mécaniqueMesure de la force appliquée par une celluleCorrélation avec l’évolution de sa forme

Avec collaborations Réponse structurale

visualisation du cytosquelette par fluorescence

F

-F

Propriétés actives

Propriétés passives:

Rhéologie à l’échelle d’une cellule vivante

t

0

Solide linéaire standard

t

0

Liquide avec élasticité instantannée

t

0

liquide

Bausch et al., Biophys J. 1998

Wilhelm et al., Phys Rev E. 2003

Wu et al., Scanning. 2003

Quelques temps caractérisqtiques

Dissipation visqueuse

Comportements très différents

Mesures locales, domaine temporel

1 m

Ttorque

displacement

twistingfield

Comportement de milieu vitreux mou Hors d’équilibre Désordre structural Métastabilité Température effective (transition vitreuse)

Fabry et al., Phys Rev Lett. 2001

G*() = G0(2-x)(j 0)x-1 + j

Pas de temps caractéristiques

Elasticité et dissipation d’origine commune

Comportement unique conservé

Rhéométrie locale, analyse en fréquence

0.001

0.01

1

0.1

G’, G” [Pa/nm]

0.01 0.1 1 10 100 1000f [Hz]

MOYENNES !

Principe de l’étirement uniaxial

Microplaque flexible(“ressort” de raideur k)

Microplaque rigide

Thoumine et Ott, J. Cell Sci. 110 p 2109 (1997)

DDéplacement

Déflexion

Thoumine et Ott, J. Cell Sci. 110 p 2109 (1997)

F = k Force

Microplaque flexible(“ressort” de raideur k)

Microplaque rigide

Principe de l’étirement uniaxial

1. De l’étirement uniaxial au rhéomètre à cellule unique

L’étirement uniaxial

(t)

D

L(t)

(t)

D

L(t)

L(0)

L(0)

L(0)L(t))(

t

0

')'()'()0()()( dttttJtJt

relation contrainte-déformation

)0et 0(

0 Extrêmement difficile de déterminer J

Lamelle souple (k)

Lamelle rigide

S

tFt

)()(

)(.)( tktF

Contrainte :

Déformation :

S’affranchir du produit de convolution oscillations ()0( ou contrainte constante

1. De l’étirement uniaxial au rhéomètre à cellule unique

Le rhéomètre

)0(

)0()()( tJt

À contrainte constante : mesure de J mesure de la

déformation F = k.

constante0

µm1011 .15.3, µmnNkµmnNOO

µNFpN 1300

x

z

y

Plaque étirée Capillaire rigide

5mm

Rhéomètre à cellule unique

Desprat et al., Rev.Sci. Instrum. 77, 055111-1 (2006)

x

z

y

x

y

z

objectif

Desprat et al., Rev.Sci. Instrum. 77, 055111-1 (2006)

Rhéomètre à cellule unique

PiezoPiezo

PID

Expérience de fluage

PiezoPiezo

PID

Déflexion

F = k Force

Expérience de fluage

PiezoPiezo

PID

Déflexion

D (t)

Déplacementcroissant

F = k = csteForce

Expérience de fluage

PiezoPiezo

PID

D (t) Force F = k = cste

Déplacementcroissant

Déflexion

Expérience de fluage

PiezoPiezo

PID

D (t) Force F = k = cste

Elongation cellulaire D(t) sous force constante

Déplacementcroissant

Déflexion

Expérience de fluage

5 m

Traitement des plaques au Glutaraldheyde, adhésion non spécifique

Expérience de fluage

L0 L(t)

0

0)(LLtL

(t) =

F0 = k 0 = cstForce

Déformation

0.1

1

10

0.1 1 10 100 1000 104

stra

in

time (s)

stra

in

(t)=A.t

Pas de temps caractéristiques

Expérience de fluage

Ln A=-6.04±0.13

=0.24±0.01

Desprat et al., Biophys. J., 88, 3 (2005)

0.1

1

0.1 1 10 100

y = 0.31032 * x^(0.25668) R= 0.9997

stra

in

time (s)

0.1

1

0.1 1 10 100

y = m1*(1-m2*exp(-(m0/m3)))+...

ErrorValue0.00238090.63647m1 0.00367390.55928m2

0.159539.0841m3 3.9603e-050.0041108m4

NA0.067816ChisqNA0.99803R

time (s)

stra

in

Comparaison aux modèles mécaniques simples

EE

’

’Pas de temps caractéristiques

(t)=A.t

0.0001

0.001

0.01

0.1

0.1 1 10 100 1000time (s)

f(t)

(Pa

-1)

primary cultured macrophagesHeLa (epithelial cells)C2.7 (myoblast)primary cultured fibroblast V+/+

cellules cancéreuses F9, J774 macrophages alvéolaires, A549 de l’épithélium alvéolaire, BEAS-2B des bronches,

neutrophiles humains

Comportement « universel »

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Pla

te t

ip/b

asis

po

sit

ion

(µ

m)

Time (s)

100

1000

0,01 0,1 1 10

G' ,

G''

(P

a)

Frequency (Hz)

(t) = sin (t)ptie 0)(~

)(0)(~ tie

Module viscoélastique à faibles déformations

Comportement en loi de puissance cohérentLinéarité à fortes déformations

Desprat et al., Rev.Sci. Instrum. 77, 055111-1 (2006)

AFM: L~30 nm ~ 0,20 ; G0 ~ 710 Pa (Alcaraz et al., Biophys J., 2003)

MTC; OT: L~3 m ~ 0,20 ; G0 ~ 300 à 3000 Pa (Fabry et al., Phys Rev E., 2003)

(Balland et al., E. Biophys. J., 2005)

Auto-similarité ?

En accord avec nos mesures à l’échelle de la cellule L~30 m

G0 = 660 Pa

Soft Glassy Material or … Fractal Gel

ffG

)1(A

)2

cos()2()(

tAtJ .)( T.F

Un modèle simple de comportement

On modélise le réseau d’actine par une série infinie d'unités viscoélastiques élémentaires imbriquées et présentant une distribution large p() de temps de relaxation

F0

1 2 3 i

Réseau d'actine : - filaments individuels- faisceaux- fibres

inégalement distribués dans le corps cellulaire

Distribution des temps de réponse

p() ~ -2 en loi de puissance fonction de fluage J(t) aussi

1

0

2

1

)exp()exp(

tdtt

dt

dJ

i i

Prédiction conforme aux observations expérimentales

Hypothèses simples:

- N(d) nombre d'unités de taille d N(d) ~ d-a si structure self-similaire

- temps de ralaxation liés à l’échelle spatiale : ~ db

Alors p() ~ -2 avec = 1 - a/b

Soit J(t) ~ t

Balland et al., Phys.Rev.E 74, 021911 (2006)

…

tm

…

tm

Réponse du systèmeDistributioncomplète (idéale)

Distribution incomplète : on conserve aléatoirement une fraction s des éléments

(Simule la variabilité d’une cellule à l’autre )

Distribution complètedJ/d =A0 -1

Ensemble de distributions incomplètes dJ/d =A -1

Ln

(dJ/d

Ln (tm)

dJ/d =A -1

J() = (A/ s = 0.1 0 = 0.20

0

50

100

150

200

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,250

20

40

60

80

100

120

140

-3,6 -3,2 -2,8 -2,4 -2 -1,6

Dispersion des coefficients de la loi de puissance

J() = A

Exposant

Préfacteur A Ln (préfacteur) = ln(A)

- Distribution normale des exposants - Distribution log-normale des préfacteurs A

cf résultats expérimentaux

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

ModelLn(modG) StretchingLn(modG) OT

exponent

Corrélation préfacteur-exposant

Seul paramètre ajustable du modèle :

m = plus grand temps de relaxation dans la cellule

m ~ 1000 s

Prendre en compte l'influence :- de l'activité des moteurs moléculaires ? - de la dynamique des filaments - des agents réticulants ?- des traitements biochimiques ?…

Modèle en bon accord avec l'expérience

M

MSC – UMR 7057 Matière et Systèmes Complexes

(Paris-Rive Gauche)

Equipe Physique du vivant

Martial BALLANDJulien BROWAEYSFrançois GALLETAxel GUIROYNicolas DESPRATOlivia DU ROUREMarion GHIBAUDOSylvie HÉNONDelphine ICARTBenoit LADOUXAlain RICHERTAlexandre SAEZJacqueline SIMEONAlain XAYAPHOUMMINE

COLLABORATIONS:

Institut Jacques Monod

Isabelle VALLOISChristiane DURIEUXMaïté COPPEY

Institut du Fer à Moulin

Mireille LAMBERT

F0

F0

F0

F0 F0

F0

S0 S ≈ S0

S < S0

0 = F0 /S0(t) ≈ 0 =F0 /S0

(t)>≈ F0 L(t)/S0 L0

= 0 [1 + (t)]

High Strains : the Simplest Model

Assuming a constant cell volume :

V(t) = V0 = S0 L0

(t)>≈ F0 L(t)/V(t)

Some Calculus

The fudamentale relation of linear viscoelasticity

t

tdtttJtJt0

)()()0()()(

Then becomes t

tdtttJtJt0

)()0()()0()()(

Laplace transform then yelds )](

~)0(1[

)(~

)0()(~

sJs

sJs

Assuming thatAttJ )( as measured in the creep regime, one finds

1 )1(

]A)0()1([)(

n

n

n

tt

Thus, at high strains, deformation should well be described by a sum of integerpowers of the creep function J(t)

0.1

1

10

0.1 1 10 100 1000 104

Str

ain

time (s)

y = m1*m0^ m2+0.961*(m1*m0^ ...

ErrorValue

0.00044490.26912m1

0.000237860.17207m2

NA4.7092Chisq

NA0.9983R

Fitting Experimental Data

Agreement from

0.1 to more than 1000 sec

Only two parameters A and

CONCLUSION

Power law (scale free) behaviour seems a fundamental feature of cell mechanics but…

…we need a more rigourous definition of the strain to compare our results to refined models of cell mechanical structure (fractal network for example).

microplates

DMEM+

cells x

z

y

fexiblerigid

PCI-6535EPCI-6713 PID filter

constant strain

Linear opticalsensorco

nsta

nt s

tres

sSingle Cell Rheometer

3 axispiezo

3 axispiezo

Soft Glassy Material or …

Like foams, emulsion, sluries

Desordered medium with a great number of elements and out of equimibrium

Interaction between mesoscopic elements leads to

large distributions of sizes and relaxation times:no characteristic time scale

specific relaxation processes : non viscous dissipation

Parameter of control x (noise temperature)

power law rheological behaviour, = x - 1

Soft Glassy Materials (SGM) Materials at the « Sol-Gel » transition

foams, emulsions, pastes, slurries

Partially polymerized gels

- Out of equilibrium

- Permanent structural rearrangement

- Fixed structure

- Fractal dimension

Dynamic origin Structural origin

Sollich, Phys. Rev. E (1998) Winter et al., J. of Rheology (1986)

Possible origins of the power law behavior