Post on 09-Aug-2020
Induction de photoproduits de l’ADNpar les UV : données récentes
Thierry Douki
Laboratoire « Lésions des Acides Nucléiques »INAC/SCIB UMR E3 CEA/UJF
CEA-Grenoble
ADN
Conséquences des dommages de l’ADN
mutations
dommage
Agents génotoxiques
Radiationsionisantes
RadiationUV
Stressoxydant
Produitschimiques
Réparation
Mortcellulaire
vieillissementcancer
UV solaire
L’ADN, cible majeure du rayonnement UVC et UVB
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
UVC UVB UVA
Longueur d’onde (nm)
abso
rptio
nAbsorption ADN
Pyrimidinesadjacentes
(TT)
Les dimères de pyrimidinesDimère cyclobutane (CPD)
UVC, UVB
NH
NO
O
O
O
O
P
O-O
N
N
O
OH
O
O
O
Oxetane
Photoproduitpyrimidine (6-4)
pyrimidone
UVC, UVB
Mêmes réaction aux sites TC, CT et CC !!
Mutations induites par le rayonnement UVB
autres substitutions
autres mutations
Substitutions à des sites TC etCC
Un effet mutagène principalement des dimères cyclobutane, les photoproduits (6-4)étant rapidement réparés (You et al J. Biol. Chem. 2001; Jans et al. Current Biol. 2005)
plasmide
transfection
réplication
gènes de cellulesen cultures
gènes mutés dans lestumeurs de la peau
(Brash et al. (1991) PNAS 88, 10124)
UVA et dommages de l’ADN
Théories admises :1) les UVA endommagent l’ADN par la production d’espèces
oxydantes dues à des photosensibilisateurs intracellulaires.2) L’ADN n’absorbe pas les UVA (donc pas de dimères)
300 350 400250
Longueur d’onde (nm)
Act
ion
rela
tive
par
quan
tum
1
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6Mutagénèse
létalité
Absorptionde l’ADN
d‘après Coohill(1987)
Le rayonnement UVA, un autre agent génotoxique
En UVB (et UVC) (280 < l < 320 nm) :- Effet direct- Formation des dimères de pyrimidines
En UVA (320 < l < 400 nm) :- Effet indirect- Photosensibilisateurs endo- ou exogènes- Stress oxydant intense
Cellules en cultures
+ dimères cyclobutane par absorptiondirecte (beaucoup plus faible qu’avecUVB)
Induction du stress oxydant par les UVA :des mécanismes indirects (photosensibilisation)
PS PS*UVA
(PS: photosensibilisateur)
O2
O2°-
H2O2
°OH
UVAFe2+/Fe3+
Chimie type Fenton
mitochondries
ferritine
O2
1O2
Production d’oxygènesingulet
type II
majoritaire
NH
N N
N
NH2
O
dR
O
H
8-oxoGuanine
R+ + PS- Production de radicaux libres
type I
Coupuresde chaine
Pyrimidinesoxydées
HN
N
O
O
CH3
OH
OH
Dimères de pyrimidine et UVA
CPDs induits par les UVA dans la peauYoung et al. 1998, J. Invest. Dermatol, 111, 936-940
keratinocytes
melanocytes
340 nm 360 nm
melanocyteskeratinocytes
(aussi Freeman, 1989, Burren et al. 1998,Mouret et al. 2006)
Formation dans des cellules en cultureDouki et al. (2003) Biochemistry 42, 9221-9226
(aussi Tyrrell 1974, Freeman 1990, Kielbassa 1997, Zhang1997, Perdiz 2000, Rochette 2003, Courdavault 2004)
6-4 TCTC CPD
CC CPDCT CPD
6-4 TTTT CPD
UVB
UVA
UVB (0.2 J/cm2)
0
10
20
30
40
50
60
70
0.5 1 1.5 2 2.5 3
DEM (J/cm2)
TT
CP
Dper
10
6base
s
phototype II
phototype IV
UVA (200 J/cm2)
0
10
20
30
40
50
60
70
TT
CP
Dper
10
6base
s
phototype II
phototype IV
0.5 1 1.5 2 2.5 3
DEM (J/cm2)
Phototype et CPDs chez des volontaires
Le phototype reflète la protection contre les dimères induits par les UVB et les UVA
Irradiations ex-vivo
Mouret et al. (2011) J. Invest. Dermatol. 131, 1539
Un mécanisme direct du à une faible absorption des UVA par l’ADN
l cut-off(nm)
ADN isolé Kératinocytes
322 0.188 0.197
351 0.168 0.205
374 0.151 0.204
390 0.246 0.233
Mouret et al. (2010) Org. Biomol. Chem., 8, 1706–1711
Même rendement entre ADN isolé et cellulaire :pas de rôle majeur de photosensibilisateursendogènesObservation à toutes les longueurs d’onde UVA :pas un problème de contamination UVB
Comparaison ADN isolé / cellules
(en lesions/106 bases per J cm-2)
Les doubles brins d’ADNabsorbent (un peu !) les UVA
Wavelength (nm)
250 275 300 325 350 375 400
1
10
100
1000
10000
250 275 300 325 350 375 400
Mola
re
xtin
ctio
nco
effic
ient(M
-1cm
-1)
1
10
100
1000
10000
Wavelength (nm)
250 275 300 325 350 375 400
1
10
100
1000
10000
250 275 300 325 350 375 400
Mola
re
xtin
ctio
nco
effic
ient(M
-1cm
-1)
1
10
100
1000
10000dA20:dT20
dT + dA
Données en accord avec ADNbactérien (Sutherland 1981)
Les CPDs en UVA :un mécanisme direct
Plus de dimères que d’oxydation après irradiation UVA
Douki et al. (2003) Biochemistry 42, 9221 Courdavault et al. (2004) Mutat. Res. 556, 135Mouret et al. (2006) PNAS 103, 13765 Mouret et al. (2012) Photochem. Photobiol. Sci. 11, 155
TT-CPD
HN
NO ON
NH
O O
CHO kératinocytes fibroblastes Peau(6 donneurs)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
lési
ons/
10
6base
sper
J/cm
2
8-oxoGua
HNN
N
O
H2N
O
H
mélanocytes
Plus grandesensibilité des
mélanocytes austress oxydant
Mélanocytes de souris(quantification par anticorps)
Mélanocytes de souris avec ou sans mélanine(détection HPLC-spectrométrie de masse)
Le plusmutagène
La formation retardées de dimères après l’exposition aux UVAPremi et al. (2015) Science 347
Sans lumière
mélanine
polymérisation
Réactionsbiochimiques
normales
Précurseursde mélanine Transfert
d’énergie
Un mécanisme complexe
Absorptiondes UVA
oxydantsON
NH
O
HN
NO
O
ON
NH
O
HN
NO
O
HN
NO
OO
NH
N O
Absorptiondirecte des
UV parl’ADN
Dimères dans l’ADN
In the nucleus
Bilan sur la nature des dommages de l’ADN après exposition aux UV
0
25
50
75
100
Rendem
entre
latif(%
)
Dimèrescyclobutane
NH
N N
NH
O O
O O
dR dR
HN
N
O
O
dR N
N
O
OH
dR
Photoproduits(6-4)
UVB
NH
N N
NH
O O
O O
dR dR
0
25
50
75
100
Rendem
entre
latif(%
)
Dimèrescyclobutane
Guanineoxydée
cassures Pyrimidinesoxydées
PontagesADN-Protéines
HN
N
N
N
O
O H
H2N
HN
N
O
O
CH3
OH
OH
UVAX 100 à 1000
La réparation des dimères de pyrimidines
- Mécanisme de Réparation par Excision de Nucléotides (NER)- Présente dans tous les types cellulaires- Différentes protéines entre prokaryotes et eukaryotes mais les mêmes fonctions
Détection des dommages :• par arrêt de l’ARN polymérase dans les gènes transcrits• Par des protéines spécifiques dans le reste du génome
Reconnaissancedu dommage
Déroulementde l’ADN
Synthèsed’ADN intact
Excision du brinendommagé
Le syndrome Xeroderma Pigmentosum
Déficience en réparation de dimères = grande fréquence de cancer de la peau
Maladie génétique; décrite pour la première fois en 1870
Prévalence: 1 à 105 - 106
Associé avec des mutations de gènes de la réparation par excision de nucléotides
1000 fois plus de cancer de la peau que dans le population normale
Mort prématurée
Un effet des UVA sur la réparation des dimères
0
0
1
2
3
4
5
6
20 40 60Temps (h)
TT-C
PD
rest
ant
po
ur
10
6b
ases
UVB 25 J/m2
UVA 60 J/cm2
40%
15%
Cinétique après UVA ou UVB
TT-64PP TT-CPD TC-64PP TC-CPD
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Dim
ère
sre
sta
nt
à24
h(%
) UVB
UVA + UVB
p<0.01
p<0.05
p<0.05p<0.1
Effet d’une pré-irradiation UVA
Dans les kératinocytes humains en culture Courdavault et al. (2005) DNA Repair 4, 836
0
25
50
75
100
0 12 24 36 48
temps (h)
Dim
ère
sre
sta
nt
(%)
TT CPD UVB TT (6-4) UVB TT CPD UVA
72 vs 55 %p<0.05
UVB: 0.1 J/cm2; UVA 100 J/cm2
Cinétique de réparationdans la peau humainesMouret et al. (2006) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 103
L’oxydation des protéines de réparation par les UVA
Pontage de PCNA
UVA UVA + 6-thioguanine
Montaner et al. EMBO reports 8 2008
Oxydation de RPA
UVA + fluoroquinolones
Guven et al. J. Invest. Dermatol. 135 2015
Conclusions
- Un rôle majeur des dimères de pyrimidines dans le déclenchement desprocessus de cancérisation dus aux UV
- Les UVB, la portion la plus délétères du spectre solaire
- Les UVA comme agents génotoxiques et mutagènes : lésions oxydatives,formation de dimères directe et retardée; quelques % des dommages induitspar la lumière solaire
- Un impact négatif des UVA sur la réparation de l’ADN (importance dela combinaison des effets UVA et UVB)
- Une nécessaire réévaluation à la hausse des effets des UVA :photoprotection adaptée, risques associés aux bronzage artificiel, …
- Autres effets délétères des UV solaires : modifications épigénétiques,immunosupression, vieillissement cutané, effets oculaires …
Remerciements
Au laboratoire LAN
• Jean-Luc Ravanat• Sylvie Sauvaigo
+ les doctorants et les post-docs
Financements
Les collaborations
• Evelyne SageInstitut Curie d’Orsay
• Jean-Claude Béani et Marie-Thérèse LecciaDermatologie CHU-Grenoble
• Dimitra Markovitsi et Akos BanyaszIRAMIS, CEA-Saclay
• Douglas BrashYale School of Medecine
Merci de votre attention !