Identifikasi Biohidrogen Secara FermentatifDengan Kultur Campuran Menggunakan

Glukosa Sebagai Substrat

Disusun Oleh : Rizkhi Agrinda Setya

1407 100 020

Pembimbing :Prof. Dr. Surya Rosa Putra, M.SHerdayanto Sulistyo Putro, M.Si

HIDROGEN

KIMIAFISIKABIOLOGI

BIOHIDROGEN(Das dan Nejat, 2008)

BIOFOTOLISIS Cyanobacteria

FOTODEKOMPOSISIPurple Non-Sulfuric

Bacteria

Produksitanpa Cahaya

SubstratBervariasi

HematEnergi

(Das dan Nejat, 2008) Cyanobacteria

FERMENTASI GELAP

Bacteria

HYBRID SYSTEM Microbial Fuel Cell

Lebih ramah lingkungandan efisien karena

menghasilkan uap air sbg emisi (Gupta, 2009).

Memiliki kalorpembakaran 2,75 kali

lebih besar dibanding dg bahan bakar

hidrokarbon (Dong-Hon Kim et al., 2006)

FERMENTASI

GELAP

• Genus Clostridium, Obligatif Anaerob- Adanya O2 akan menghambat kinerja Enzim Hidrogenase (Madigan, 2006).

• Genus Enterobacter, Fakultatif Anaerob- Termasuk Bakteri Coliform, Kemungkinan Bersifat Enteropatogenik atauToksigenik (Ferdiaz, 1993).Toksigenik (Ferdiaz, 1993).

• Selain Strain Tunggal, Kultur Campuran dapat juga

menghasilkan H2 (Maintinguer et al., 2008; Patel et al.,

2010; Singh et al., 2010)

Apakah kultur campuran yang digunakan dapat menghasilkan biohidrogensecara fermentatif dengan menggunakan glukosa sebagai substrat

Penelitian ini bertujuan untuk mengatasi kelemahan bakteri penghasil hidrogenseperti Clostridium dan Enterobacter dengan menggunakan kultur campurandan mengetahui jumlah biohidrogen yang dihasilkan secara fermentatif dengan menggunakan substrat glukosa

• Pembuatan Media Padat dan Cair• Regenerasi Kultur Campuran• Pewarnaan Gram dan Uji Morfologi• Penentuan Kurva Pertumbuhan• Produksi Biohidrogen Secara Fermentatif dengan Kultur Campuran• Analisis Gas Hasil Fermentasi• Analisis Gula Pereduksi dan Jumlah Sel

Prosedur Kerja

Alat

Nutrient Agar (Oxoid), Glukosa p.a (Merck), Ekstrak Ragi (Oxoid),FeSO4·7H2O p.a (Merck), NaOH, Metilen Blue, Asam 3,5-Dinitrosalisilat(Sigma Aldrich), Na-K tartat (Merck), Na-Metabisulfit (Merck), GasNitrogen, Aquades Steril dan Alkohol Teknis 70%.

Bahan

Botol, Tabung Reaksi, Pipet ukur, Magnetic stirrer, Hotplate strirrer,microtube, Thermoshaker, Mikroskop, Sentrifuge Hermle, Vortex,Spektrofotometer, Neraca analitik, Autoclave, Hydrogen bag, Hydrogensensor, Kromatografi Gas

Alat

Pembuatan Media Padat dan Cair1

• Nutrien Agar 2 g• Aquades 100 mL

Yeast Extract 0,5 % (w/v)

Glukosa 2 % (w/v)

Diautoclave pada 121 C selama15 menit

Media padat sterildan diinkubasi 1 hari dg posisi miring

Media Cair Sterildidinginkan kemudian

dicampur secara aseptisdlm Laminary Flow

Regenerasi Kultur Campuran2

Proses ini dilakukan dalam Laminary

flow dengan teknik aseptik

Diambil 1 ose dan di goreskan secara

zigzag pada media padat steril

Strain KulturCampuran

Diinkubasi dalam inkubator selama

24 jamHasil regenerasidisimpan dalam

lemari es

Pewarnaan Gram Sederhana dan Uji Morfologi3

Proses ini dilakukan dalam Laminary

flow dengan teknik aseptik

Dibilas dengan Aquades steril

Diambil 1 ose dan digoreskan pada

kaca preparat

Kaca preparat

Difiksasi diatasapi

Kaca preparatSteril

Ditetesi Metilen Blue pada goresan

Digoyang hinggamerata dan kering

Dibilas sedikit dgn alkoholo 96%

Penentuan Kurva Pertumbuhan4

Proses ini dilakukan dalam Laminary

flow dengan teknik aseptik

Diambil 1 ose

30 mL media cairatau (10% v/v)

FeSO •7H O

Di shaker selama 14 jam dengan suhu

40°C kec. 125 rpm Hasil inkubasidiinokulasikan

lagiDiambil 1 ose

dan diinokulasi kedalam media

FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v)

Media 270 mLatau 90% (v/v)+ FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v)

Di shaker pada suhu40°C kec. 125 rpm dan diambil sampel

tiap jamDiukur

absorbansinyapada λ = 600 nm

Produksi Biohidrogen secara Fermentasi menggunakanKultur campuran5

Proses ini dilakukan dalam Laminary

flow dengan teknik aseptik

FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v)

dan magnetic

stirrer steril

• Tahap pembuatan inokulum

Dialiri gas nitrogen selama 1 menit

Media CairSteril 500 mL

5 mL

45 mL

stirrer steril

Diambil 1 ose dan diinokulasi kedalam media

Diinkubasi dan di stirerselama 14 jam, suhu40°C dg kec.125 rpm

Diinokulasi kedalammedia 45 mL yang

sblmnya dipreparasiseperti diatas

Kemudian diinkubasi

Produksi Biohidrogen secara Fermentasi menggunakanKultur campuran5

• Tahap fermentasi

FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v)

dan magnetic

stirrer steril

Dialiri gas nitrogen selama 1 menit

media 450 mL

50 mL media inokulum

Rangkaian

Alat

pH dimonitor dan diatur 6-5 dengan

NaOH, Suhu 40°C, kec. 125 rpm

Diambil sampelmedia tiap 6 jam

Hasil dianalisis

Rangkaian Alat Fermentasi Sistem Batch denganPengadukan☺

Termometer Selang Poliuretan

Hydrogen Bag

Sumbat Karet

Indikator Gas berisiAquades steril

Hotplate stirrer Magnetic stirrer

�

Metode Analisis6

A. Analisis Gas Gas yang dihasilkan

Uji KuantitatifUji KualitatifVolume

3

1

3

2

4

Hidrogen bag

Botol berisi air vol. 1L dimodifikasidengan infus

Gelas ukur

GC - TCD

Hydrogen sensor

Metode Analisis6

B. Analisis Jumlah sel

SampelFermentasi

- diambil sampel tiap 6 jam sebanyak 1,5 mL- dimasukkan dalam microtube- disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 8000 rpm- dipisahkan secara dekantasi dan dimasukkan kedalam tabung

Biomassa Supernatan

−biomassa dalam microtube ditambahkan aquades steril hingga 1,5 mL−disuspensikan dengan vortex−dituang ke dalam tabung berisi 3 mL aquades steril−disuspensikan dengan vortex−diukur absorbansi dengan panjang gelombang 600 nm

Hasil

Metode Analisis6

C. Analisis Gula Pereduksi – Kurva Standar Glukosa

Laruta Glukosa Stok 0,2 M

Laruta Glukosa Konsentrasi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1 M

-Diambil sebanyak 1; 2; 3; 4; dan 5 mL-Diencerkan dengan aquades sampai 10 mL

-Diambil masing-masing 0,2 mL dan ditambah 1,8 mLaquades-Ditambahkan 3 mL reagen DNS-Dipanaskan ke dalam air mendidih selama 10 menit-Didinginkan pada air dingin selama 10 menit-Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm-Dibuat kurva standar glukosa (Cglukosa vs A)

Hasil

Metode Analisis6

C. Analisis Gula Pereduksi

Supernatan

-Diambil masing-masing 0,2 mL dan ditambah 1,8 mLaquades-Ditambahkan 3 mL reagen DNS-Dipanaskan ke dalam air mendidih selama 10 menit-Didinginkan pada air dingin selama 10 menit-Didinginkan pada air dingin selama 10 menit-Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm

Hasil

Gambar 1. Hasil Regenerasi KulturCampuran pada Media Padat

Menunjukkan Koloni kultur campuran berwarna putih, permukaanrata.

Dari hasil Foto mikroskopik dengan perbesaran 1000x,menunjukkan bahwa bakteri tersebut berbentuk batang atau bacildengan ukuran yang berbeda, panjang dan pendek. Hal inimenunjukkan bahwa terbukti kultur campuran.

Gambar 2. Bentuk Morfologi Kultur Campuran

Lab. Mikrobiologi ITS

Bacillus cereus :Gram Positif, Fakultatif Anaerob

Actinobacillus sp. :Gram Negatif, Fakultatif Anaerob

Lab. Mikrobiologi Unair

Bacillus subtilis:Gram Positif, Fakultatif Anaerob

Pseudomonas fluorescence :Gram Negatif, AerobGram Negatif, Fakultatif Anaerob Gram Negatif, Aerob

Hasil tersebut sesuai dengan (Holt et al., 1994)

• Hasil tersebut belum dapat ditentukan kebenarannya, sehingga harusditeliti secara biomolekular dengan Metode 16S RNA• Berdasarkan data tersebut, yang memungkinkan berpotensi penghasilhidrogen adalah golongan Bacillus sp. yaitu Bacillus cereus (Patel et al.,2010, Kotay dan Das, 206)

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

De

nsi

tas

Op

tik

(n

m)

Fase log Fase stasioner Fase kematian

0

0.05

0.1

0.15

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54

De

nsi

tas

Op

tik

(n

m)

Waktu (jam)

Adanya pertumbuhan sel selama fermentasi menunjukkan substrat yang digunakan tidak dikonversikan menjadi H2 secara maksimal

Gambar 4. Kurva Pertumbuhan selama Fermentasi

Fase log Fase stasioner Fase kematian

• Metabolisme Pemecahan Glukosa

• Berdasarkan data identifikasi strain, Golongan Bacillus sp.Seperti Bacillus cereus, Bacillus subtilis dan Actinobacillus sp.melakukan pemecahan glukosa melalui jalur EMP (Embden-Mayerhoff). Sedangkan dan Pseudomonas fluorescencemelakukan pemecahan glukosa melalui jalur ED (Entner-Doudoroff) (Kim dan Gad, 2008).

• Bakteri penghasil H biasanya bersifat fakultatif anaerob, sehingga• Bakteri penghasil H2 biasanya bersifat fakultatif anaerob, sehinggadata identifikasi dari ITS yang digunakan dalam penelitian ini.

• Reaksi produksi H2 :Piruvat + CoA + 2Fd(oks) → Asetil-CoA + 2Fd(red) + CO2 2H+ + 2Fd(red) + enzim hidrogenase → H2 + Fd(oks)

• Produk akhir :C6H12O6 + 2 H2O → 2 CH3COOH + 2 CO2 + 4 H2C6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + 2 CO2 + 2 H2

• Produksi Gas

• Produksi gas dimulai pada jam ke- 13 dan optimum pada jam ke-20 dengan jumlah gelembung pada indikator mencapai 11x/menit

• pH akhir sebesar 4. Hal ini disebabkan terbentuknya asam-asamorganik

• Volume gas yang dihasilkan sebanyak 970 ml • Uji kualitatif dengan Hydrogen sensor terbukti bahwa terbentuk gas H2

Gambar 5. Kondisi media dan indikator saat terbentuknya gas

• Hasil Analisis H2

Hidrogen muncul pada waktu retensi 1,08 menit dengan luas peak 2,22x10-4

. Kadar H2 yang dihasilkan yaitu sebesar 13,3 % sehingga H2kumulatif sebanyak 148,41 mL.

Gambar 6. Kromatogram hasil analisis H2

• Kultur campuran yang digunakan dapat menghasilkanbiohidrogen.

• Uji kuantitatif dengan GC-TCD, kadar H2 yang dihasilkanyaitu sebesar 13,3 % sehingga H2 kumulatif sebanyak148,41 mL.

• Strain yang berpengaruh dalam produksi H2 adalah Bacillus cereus.

2Bacillus cereus.

TERIMA KASIHTERIMA KASIH