Identifikasi Biohidrogen Secara Fermentatif Dengan Kultur...
Transcript of Identifikasi Biohidrogen Secara Fermentatif Dengan Kultur...
Identifikasi Biohidrogen Secara FermentatifDengan Kultur Campuran Menggunakan
Glukosa Sebagai Substrat
Disusun Oleh : Rizkhi Agrinda Setya
1407 100 020
Pembimbing :Prof. Dr. Surya Rosa Putra, M.SHerdayanto Sulistyo Putro, M.Si
HIDROGEN
KIMIAFISIKABIOLOGI
BIOHIDROGEN(Das dan Nejat, 2008)
BIOFOTOLISIS Cyanobacteria
FOTODEKOMPOSISIPurple Non-Sulfuric
Bacteria
Produksitanpa Cahaya
SubstratBervariasi
HematEnergi
(Das dan Nejat, 2008) Cyanobacteria
FERMENTASI GELAP
Bacteria
HYBRID SYSTEM Microbial Fuel Cell
Lebih ramah lingkungandan efisien karena
menghasilkan uap air sbg emisi (Gupta, 2009).
Memiliki kalorpembakaran 2,75 kali
lebih besar dibanding dg bahan bakar
hidrokarbon (Dong-Hon Kim et al., 2006)
FERMENTASI
GELAP
• Genus Clostridium, Obligatif Anaerob- Adanya O2 akan menghambat kinerja Enzim Hidrogenase (Madigan, 2006).
• Genus Enterobacter, Fakultatif Anaerob- Termasuk Bakteri Coliform, Kemungkinan Bersifat Enteropatogenik atauToksigenik (Ferdiaz, 1993).Toksigenik (Ferdiaz, 1993).
• Selain Strain Tunggal, Kultur Campuran dapat juga
menghasilkan H2 (Maintinguer et al., 2008; Patel et al.,
2010; Singh et al., 2010)
Apakah kultur campuran yang digunakan dapat menghasilkan biohidrogensecara fermentatif dengan menggunakan glukosa sebagai substrat
Penelitian ini bertujuan untuk mengatasi kelemahan bakteri penghasil hidrogenseperti Clostridium dan Enterobacter dengan menggunakan kultur campurandan mengetahui jumlah biohidrogen yang dihasilkan secara fermentatif dengan menggunakan substrat glukosa
• Pembuatan Media Padat dan Cair• Regenerasi Kultur Campuran• Pewarnaan Gram dan Uji Morfologi• Penentuan Kurva Pertumbuhan• Produksi Biohidrogen Secara Fermentatif dengan Kultur Campuran• Analisis Gas Hasil Fermentasi• Analisis Gula Pereduksi dan Jumlah Sel
Prosedur Kerja
Alat
Nutrient Agar (Oxoid), Glukosa p.a (Merck), Ekstrak Ragi (Oxoid),FeSO4·7H2O p.a (Merck), NaOH, Metilen Blue, Asam 3,5-Dinitrosalisilat(Sigma Aldrich), Na-K tartat (Merck), Na-Metabisulfit (Merck), GasNitrogen, Aquades Steril dan Alkohol Teknis 70%.
Bahan
Botol, Tabung Reaksi, Pipet ukur, Magnetic stirrer, Hotplate strirrer,microtube, Thermoshaker, Mikroskop, Sentrifuge Hermle, Vortex,Spektrofotometer, Neraca analitik, Autoclave, Hydrogen bag, Hydrogensensor, Kromatografi Gas
Alat
Pembuatan Media Padat dan Cair1
• Nutrien Agar 2 g• Aquades 100 mL
Yeast Extract 0,5 % (w/v)
Glukosa 2 % (w/v)
Diautoclave pada 121 C selama15 menit
Media padat sterildan diinkubasi 1 hari dg posisi miring
Media Cair Sterildidinginkan kemudian
dicampur secara aseptisdlm Laminary Flow
Regenerasi Kultur Campuran2
Proses ini dilakukan dalam Laminary
flow dengan teknik aseptik
Diambil 1 ose dan di goreskan secara
zigzag pada media padat steril
Strain KulturCampuran
Diinkubasi dalam inkubator selama
24 jamHasil regenerasidisimpan dalam
lemari es
Pewarnaan Gram Sederhana dan Uji Morfologi3
Proses ini dilakukan dalam Laminary
flow dengan teknik aseptik
Dibilas dengan Aquades steril
Diambil 1 ose dan digoreskan pada
kaca preparat
Kaca preparat
Difiksasi diatasapi
Kaca preparatSteril
Ditetesi Metilen Blue pada goresan
Digoyang hinggamerata dan kering
Dibilas sedikit dgn alkoholo 96%
Penentuan Kurva Pertumbuhan4
Proses ini dilakukan dalam Laminary
flow dengan teknik aseptik
Diambil 1 ose
30 mL media cairatau (10% v/v)
FeSO •7H O
Di shaker selama 14 jam dengan suhu
40°C kec. 125 rpm Hasil inkubasidiinokulasikan
lagiDiambil 1 ose
dan diinokulasi kedalam media
FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v)
Media 270 mLatau 90% (v/v)+ FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v)
Di shaker pada suhu40°C kec. 125 rpm dan diambil sampel
tiap jamDiukur
absorbansinyapada λ = 600 nm
Produksi Biohidrogen secara Fermentasi menggunakanKultur campuran5
Proses ini dilakukan dalam Laminary
flow dengan teknik aseptik
FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v)
dan magnetic
stirrer steril
• Tahap pembuatan inokulum
Dialiri gas nitrogen selama 1 menit
Media CairSteril 500 mL
5 mL
45 mL
stirrer steril
Diambil 1 ose dan diinokulasi kedalam media
Diinkubasi dan di stirerselama 14 jam, suhu40°C dg kec.125 rpm
Diinokulasi kedalammedia 45 mL yang
sblmnya dipreparasiseperti diatas
Kemudian diinkubasi
Produksi Biohidrogen secara Fermentasi menggunakanKultur campuran5
• Tahap fermentasi
FeSO4•7H2O 0,03 % (w/v)
dan magnetic
stirrer steril
Dialiri gas nitrogen selama 1 menit
media 450 mL
50 mL media inokulum
Rangkaian
Alat
pH dimonitor dan diatur 6-5 dengan
NaOH, Suhu 40°C, kec. 125 rpm
Diambil sampelmedia tiap 6 jam
Hasil dianalisis
Rangkaian Alat Fermentasi Sistem Batch denganPengadukan☺
Termometer Selang Poliuretan
Hydrogen Bag
Sumbat Karet
Indikator Gas berisiAquades steril
Hotplate stirrer Magnetic stirrer
�
Metode Analisis6
A. Analisis Gas Gas yang dihasilkan
Uji KuantitatifUji KualitatifVolume
3
1
3
2
4
Hidrogen bag
Botol berisi air vol. 1L dimodifikasidengan infus
Gelas ukur
GC - TCD
Hydrogen sensor
Metode Analisis6
B. Analisis Jumlah sel
SampelFermentasi
- diambil sampel tiap 6 jam sebanyak 1,5 mL- dimasukkan dalam microtube- disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 8000 rpm- dipisahkan secara dekantasi dan dimasukkan kedalam tabung
Biomassa Supernatan
−biomassa dalam microtube ditambahkan aquades steril hingga 1,5 mL−disuspensikan dengan vortex−dituang ke dalam tabung berisi 3 mL aquades steril−disuspensikan dengan vortex−diukur absorbansi dengan panjang gelombang 600 nm
Hasil
Metode Analisis6
C. Analisis Gula Pereduksi – Kurva Standar Glukosa
Laruta Glukosa Stok 0,2 M
Laruta Glukosa Konsentrasi 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1 M
-Diambil sebanyak 1; 2; 3; 4; dan 5 mL-Diencerkan dengan aquades sampai 10 mL
-Diambil masing-masing 0,2 mL dan ditambah 1,8 mLaquades-Ditambahkan 3 mL reagen DNS-Dipanaskan ke dalam air mendidih selama 10 menit-Didinginkan pada air dingin selama 10 menit-Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm-Dibuat kurva standar glukosa (Cglukosa vs A)
Hasil
Metode Analisis6
C. Analisis Gula Pereduksi
Supernatan
-Diambil masing-masing 0,2 mL dan ditambah 1,8 mLaquades-Ditambahkan 3 mL reagen DNS-Dipanaskan ke dalam air mendidih selama 10 menit-Didinginkan pada air dingin selama 10 menit-Didinginkan pada air dingin selama 10 menit-Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm
Hasil
Gambar 1. Hasil Regenerasi KulturCampuran pada Media Padat
Menunjukkan Koloni kultur campuran berwarna putih, permukaanrata.
Dari hasil Foto mikroskopik dengan perbesaran 1000x,menunjukkan bahwa bakteri tersebut berbentuk batang atau bacildengan ukuran yang berbeda, panjang dan pendek. Hal inimenunjukkan bahwa terbukti kultur campuran.
Gambar 2. Bentuk Morfologi Kultur Campuran
Lab. Mikrobiologi ITS
Bacillus cereus :Gram Positif, Fakultatif Anaerob
Actinobacillus sp. :Gram Negatif, Fakultatif Anaerob
Lab. Mikrobiologi Unair
Bacillus subtilis:Gram Positif, Fakultatif Anaerob
Pseudomonas fluorescence :Gram Negatif, AerobGram Negatif, Fakultatif Anaerob Gram Negatif, Aerob
Hasil tersebut sesuai dengan (Holt et al., 1994)
• Hasil tersebut belum dapat ditentukan kebenarannya, sehingga harusditeliti secara biomolekular dengan Metode 16S RNA• Berdasarkan data tersebut, yang memungkinkan berpotensi penghasilhidrogen adalah golongan Bacillus sp. yaitu Bacillus cereus (Patel et al.,2010, Kotay dan Das, 206)
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
De
nsi
tas
Op
tik
(n
m)
Fase log Fase stasioner Fase kematian
0
0.05
0.1
0.15
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
De
nsi
tas
Op
tik
(n
m)
Waktu (jam)
Adanya pertumbuhan sel selama fermentasi menunjukkan substrat yang digunakan tidak dikonversikan menjadi H2 secara maksimal
Gambar 4. Kurva Pertumbuhan selama Fermentasi
Fase log Fase stasioner Fase kematian
• Metabolisme Pemecahan Glukosa
• Berdasarkan data identifikasi strain, Golongan Bacillus sp.Seperti Bacillus cereus, Bacillus subtilis dan Actinobacillus sp.melakukan pemecahan glukosa melalui jalur EMP (Embden-Mayerhoff). Sedangkan dan Pseudomonas fluorescencemelakukan pemecahan glukosa melalui jalur ED (Entner-Doudoroff) (Kim dan Gad, 2008).
• Bakteri penghasil H biasanya bersifat fakultatif anaerob, sehingga• Bakteri penghasil H2 biasanya bersifat fakultatif anaerob, sehinggadata identifikasi dari ITS yang digunakan dalam penelitian ini.
• Reaksi produksi H2 :Piruvat + CoA + 2Fd(oks) → Asetil-CoA + 2Fd(red) + CO2 2H+ + 2Fd(red) + enzim hidrogenase → H2 + Fd(oks)
• Produk akhir :C6H12O6 + 2 H2O → 2 CH3COOH + 2 CO2 + 4 H2C6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + 2 CO2 + 2 H2
• Produksi Gas
• Produksi gas dimulai pada jam ke- 13 dan optimum pada jam ke-20 dengan jumlah gelembung pada indikator mencapai 11x/menit
• pH akhir sebesar 4. Hal ini disebabkan terbentuknya asam-asamorganik
• Volume gas yang dihasilkan sebanyak 970 ml • Uji kualitatif dengan Hydrogen sensor terbukti bahwa terbentuk gas H2
Gambar 5. Kondisi media dan indikator saat terbentuknya gas
• Hasil Analisis H2
Hidrogen muncul pada waktu retensi 1,08 menit dengan luas peak 2,22x10-4
. Kadar H2 yang dihasilkan yaitu sebesar 13,3 % sehingga H2kumulatif sebanyak 148,41 mL.
Gambar 6. Kromatogram hasil analisis H2
• Kultur campuran yang digunakan dapat menghasilkanbiohidrogen.
• Uji kuantitatif dengan GC-TCD, kadar H2 yang dihasilkanyaitu sebesar 13,3 % sehingga H2 kumulatif sebanyak148,41 mL.
• Strain yang berpengaruh dalam produksi H2 adalah Bacillus cereus.
2Bacillus cereus.
TERIMA KASIHTERIMA KASIH