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Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques
Contribution à la recherche de nouveaux
agents antibactériens actifs sur les
biofilms de P. aeruginosa
Carole NAGANT
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Biomédicales et Pharmaceutiques Promoteur et co-promoteur : Jean-Paul DEHAYE (Laboratoire de Chimie biologique et médicale et de Microbiologie pharmaceutique) Michel VANDENBRANDEN (Structure et Fonction des Membranes Biologiques)
Composition du jury : Véronique MATHIEU (Présidente) Véronique FONTAINE (Secrétaire) Stéphanie POCHET Franck MEYER Philippe COURTOIS (Faculté de Médecine, Université libre de Bruxelles) Thierry BERNARDI (Membre du groupe européen de recherche COATIM)
2013
Faculté de Pharmacie
Remerciements
REMERCIEMENTS
Avant tout, je tiens particulièrement à remercier le Professeur Jean-Paul Dehaye qui,
par sa grande compétence scientifique, ses précieux conseils et son implication assidue m’a
aidée et soutenue tout au long de ce travail de recherche. Je le remercie très sincèrement pour
son immense disponibilité, son dynamisme et son écoute constante, attentive et constructive.
Je remercie le Professeur Michel Devleeschouwer et le Docteur Marie Tré-Hardy de
m’avoir initiée à l’étude des biofilms lors de la réalisation de mon mémoire de fin d’études.
Ils m’ont transmis leur enthousiasme, leur curiosité et m’ont convaincue de poursuivre la
recherche sur les biofilms, prometteuse dans le développement de voies thérapeutiques
innovatrices.
J’exprime vivement mes remerciements au Professeur Michel Vandenbranden pour
ses conseils et sa contribution à l’analyse des spectres infrarouges. Je le remercie ainsi que le
Professeur Philippe Courtois, pour l’intérêt qu’ils ont manifesté tout au long de ce travail
comme membres du comité d’accompagnement.
Mes remerciements s’adressent également à tous les membres du Département de
Biopharmacie, dont le Laboratoire de Chimie Biologique Médicale et de Microbiologie
Pharmaceutique, qui ont contribué au cadre de travail agréable dans lequel j’ai pu effectuer
ma thèse. Je remercie en particulier Malika, Michèle, Catherine, Jean-Marie et Anar pour le
partage de moments conviviaux et pour nos fructueux échanges durant la réalisation des
expérimentations. Merci également à Sara, Naïma, Delphine et Charaf pour leur aide et leur
sympathie.
Toute ma gratitude va au Professeur Philip S. Stewart et à Betsey Pitts pour m’avoir
accueillie au sein de leur laboratoire, lors d’un séjour au Center for Biofilm Engineering à
Bozeman (Montana, Etats-Unis). Je les remercie vivement pour leur accueil très chaleureux,
Remerciements
les nombreux échanges scientifiques et le partage de leur expertise technique en microscopie
confocale.
Je remercie le Fonds de la Recherche Scientifique (FRS-FNRS) pour son soutien
financier et la Fédération Wallonie-Bruxelles pour m’avoir nommée lauréate du Concours de
Bourse de Voyage qui m’a permis d’effectuer le séjour de trois mois aux Etats-Unis.
J’adresse mes remerciements au Docteur Olivier Denis de l’Hôpital Erasme et au
Docteur Mario Vaneechoutte de l’Université de Gent pour les souches cliniques de P.
aeruginosa. Je remercie également vivement le Professeur Stéphanie Pochet pour m’avoir
fourni les cellules HUVEC.
J’exprime aussi toute ma gratitude et mes remerciements, et non des moindres, à
l’ensemble du corps professoral et scientifique de la Faculté de Pharmacie de l’Université
libre de Bruxelles pour la qualité de l’enseignement et de la formation au cours du master en
sciences pharmaceutiques.
À titre plus personnel, j’adresse d’immenses remerciements à mes parents et mes
soeurs qui m’ont toujours soutenue et qui étaient d’une aide plus que précieuse tout au long de
ce parcours.
Enfin, toutes mes pensées vont à Clément que je remercie pour le bonheur et le soutien
qu’il m’apporte au quotidien.
Résumé
RESUME
Les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose sont colonisées par de
nombreux pathogènes, parmi lesquels la bactérie P. aeruginosa est prédominante. Après des
épisodes répétés d’infections du tractus respiratoire principalement liées à P. aeruginosa, les
patients développent une insuffisance pulmonaire associée à un déclin du statut clinique et à
une aggravation du pronostic puisqu’elle est souvent responsable du décès de ces patients. Les
infections chroniques à P. aeruginosa affectent 80 à 90 % des patients atteints de
mucoviscidose et, une fois ces infections installées, les associations actuelles d’antibiotiques
sont incapables d’éradiquer la bactérie des voies aériennes de ces patients. La chronicité des
infections est liée au développement de la bactérie sous un mode de vie particulier, le biofilm.
Les bactéries s’assemblent en communautés complexes et organisées, entourées par la
sécrétion d’une matrice extracellulaire polymérique. Ce mode de vie procure aux bactéries
présentes dans le biofilm un environnement dense et protecteur, augmentant la résistance du
pathogène au système immunitaire de l’hôte et aux antibiotiques conventionnels.
Dans la première partie de notre travail, nous avons caractérisé différentes souches de
P. aeruginosa, comprenant des souches de référence et des souches cliniques isolées des
expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Les propriétés d’adhésion, de
développement des biofilms, de mobilité, de production de rhamnolipides, l’activité
protéolytique et la production d’acylhomosérine lactones se sont avérées très différentes au
sein des souches. De plus, les caractéristiques phénotypiques des souches ne constituaient pas
une valeur prédictive de la sensibilité des bactéries à un antibiotique, soulignant la nécessité
d’étudier un panel large de souches pour caractériser l’effet d’un agent antimicrobien.
Dans la lutte pour combattre les infections et l’apparition de souches multirésistantes,
de nouvelles stratégies thérapeutiques sont développées. Les céragenines sont une famille de
molécules synthétisées dans le but de mimer la structure amphipatique des peptides
antimicrobiens responsable de leur activité bactéricide importante. Contrairement à ces
derniers, les céragenines maintiennent leur activité dans des conditions physiologiques.
Résumé
Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié l’effet d’un composé
antimicrobien appartenant à la famille des céragenines, le CSA-13, sur les différentes souches
de P. aeruginosa. Nous avons confirmé le potentiel bactéricide du CSA-13 sur des cultures
planctoniques de P. aeruginosa. Nous avons démontré qu’une concentration très faible et non
cytotoxique de CSA-13 (10 fois inférieure à la CMI), inhibait la formation d’un biofilm de 3
souches de P. aeruginosa sur les 8 testées. L’étude du potentiel zêta des souches nous a
permis de proposer un mécanisme basé sur des interactions électrostatiques pour expliquer
l’action préventive du CSA-13 sur le développement du biofilm. Une concentration plus
importante de CSA-13 a éradiqué l’entièreté d’un biofilm âgé de 24 h pour 7 des 8 souches
étudiées. Six souches ont été évaluées dans un biofilm mature et toutes ont répondu au
composé avec des concentrations croissantes ou un temps d’exposition du composé au biofilm
plus important. Aucune résistance au CSA-13 n’est apparue durant le traitement. L’usage de
la microscopie confocale à balayage laser a confirmé la rapidité et l’efficacité d’action du
CSA-13 sur un biofilm robuste et complexe de P. aeruginosa par visualisation dans le temps
et dans l’espace de l’effet du CSA-13 sur le biofilm. L’ensemble des observations de ce
travail nous a permis de conclure que 7 sur les 8 souches de P. aeruginosa étaient sensibles au
CSA-13, soit à un stade initial de la formation du biofilm, soit après maturation du biofilm.
Ces résultats soulignent le potentiel thérapeutique important, envers tous les stades de
formation et de développement du biofilm, de composés à structure amphiphile comme le
CSA-13, avec une face cationique favorisant les interactions avec les membranes bactériennes
chargées négativement et une face hydrophobe contribuant à la perturbation de ces
membranes.
Le traitement de référence actuel envers les infections à P. aeruginosa, chez les
patients souffrant de mucoviscidose, consiste en l’administration par inhalation de
tobramycine commercialisée sous le médicament TOBI®
. Nous avons investigué l’intérêt
d’une administration combinée de l’aminoglycoside avec le CSA-13. Un bénéfice évident de
la combinaison de CSA-13 et de tobramycine est apparu dans cette étude aussi bien sur
biofilm jeune que mature. Dans certaines conditions, le CSA-13 semblait même prévenir la
résistance à la tobramycine. Il sera cependant indispensable de concevoir des expériences in
vivo pour confirmer l’intérêt du CSA-13 ou d’une co-administration de CSA-13 et de la
tobramycine dans le traitement d’infections chroniques à P. aeruginosa chez des patients
atteints de mucoviscidose.
Résumé
Nos études in vitro sur cellules eucaryotes humaines ont mis en évidence une toxicité
membranaire et mitochondriale provoquée par le CSA-13 lors de l’administration de
concentrations importantes. L’association du CSA-13 avec l’acide pluronique F-127 a permis
de réduire significativement la toxicité du composé sur les membranes. Cependant,
l’association n’a pas diminué les effets délétères exercés par le CSA-13 sur l’activité
mitochondriale. Les études devront donc se poursuivre afin d’affiner la compréhension du
mécanisme d’action des céragenines et de pouvoir déceler des dérivés moins toxiques.
L’évaluation de l’activité in vivo du composé devrait nous éclairer quant à la fenêtre
thérapeutique utilisable en clinique.
Dans la troisième partie de ce travail, nous avons investigué le potentiel anti-
Pseudomonas du peptide antimicrobien LL-37, appartenant à la famille des cathélicidines. Les
peptides antimicrobiens partagent quelques caractéristiques communes ; leur cationicité, une
structure amphiphile et un nombre de résidus compris entre 10 et 50. L’intérêt pour ces
peptides dans le but de combattre les infections s’est fortement développé ces dernières
années face à l’émergence fulgurante de souches multirésistantes à l’antibiothérapie
conventionnelle. En effet, ces peptides possèdent un très large spectre antimicrobien et sont
très peu susceptibles d’induire une résistance. Malgré le haut pouvoir antibactérien du peptide
LL-37, l’utilisation clinique de ce peptide doit contourner certains inconvénients majeurs
avant de tirer pleinement profit de la molécule. Dans ce but, nous avons étudié une librairie de
fragments dérivés du peptide initial pour leur activité sur les différents stades de
développement du pathogène. Dans ce travail, nous avons caractérisé de plus petits fragments,
notamment les peptides LL7-37 et LL7-31, possédant une activité antibactérienne et
antibiofilm considérable sur P. aeruginosa. Ils inhibaient la croissance de cultures
planctoniques du pathogène et prévenaient le développement d’un biofilm par cette souche.
Cette étude est également la première à avoir investigué l’activité des différents fragments
dérivés du LL-37 sur un biofilm préformé de P. aeruginosa : nous avons ainsi souligné
l’efficacité de ces peptides sur des biofilms préformés avec une architecture tridimensionnelle
complexe. Nous avons également mis en évidence un avantage essentiel à l’utilisation de ces
deux dérivés : leur toxicité réduite sur les cellules eucaryotes. Des études de spectroscopie
infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée ont identifié une structure
secondaire en hélice-α pour les peptides actifs sur P. aeruginosa. La liaison des peptides aux
lipopolysaccharides de P. aeruginosa pour exercer leur activité, a également été proposée
dans ce travail. Le mécanisme d’action complet de ces peptides antimicrobiens n’est pas
Résumé
encore entièrement élucidé et semble impliquer différentes cibles, comme souligné par nos
expérimentations de perméabilisation des membranes internes et externes des bactéries.
L’expérimentation in vivo sera indispensable pour concrétiser le potentiel de ces dérivés
peptidiques.
En conclusion, ce travail démontre que les stéroïdes cationiques antimicrobiens
dérivés de l’acide cholique ainsi que les fragments LL7-37 et LL7-31 dérivés de la
cathélicidine humaine, offrent de nouvelles perspectives pour l’éradication de souches
résistantes de P. aeruginosa se développant dans un biofilm. Ils sont un modèle de composés
prometteurs aussi bien pour le traitement d’infections aiguës que pour le traitement
d’infections chroniques provoquées par ce pathogène et qui sont si fréquentes et souvent
fatales chez les patients souffrant de mucoviscidose.
Abréviations
LISTE DES ABREVIATIONS
3-oxo-C12-HSL : N-(3-oxododecanoyl)-L-
homosérine lactone
A. tumefaciens : Agrobacterium
tumefaciens
A. xylosoxidans : Achromobacter
xylosoxidans
AB : Agrobacterium
ABC : ATP Binding cassette
ADN : acide désoxyribonucléique
ADP : adénosine diphosphate
aGM1 : récepteur asialoGM1
AHL : acylhomosérine lactone
AMPc : adénosine 5’-monophosphate
cyclique
ANOVA : analyse de variance
ARN : acide ribonucléique
ASTM : American Society for Testing and
Materials
ATCC : American Type Culture
Collection
ATP : adénosine 5’-triphosphate
ATR-FTIR : spectroscopie infrarouge à
transformée de Fourier à réflexion totale
atténuée
B. cepacia : Burkholderia cepacia
B. pseudomallei : Burkholderia
pseudomallei
B. thailandis : Burkholderia thailandis
BBM : Bouillon Biofilm Modifié
BFRT® : Biofilm Ring Test
®
BHI : Brain Heart Infusion
BM2 : Biofilm Modifié
C. albicans : Candida albicans
C4-HSL : N-butyryl-L-homosérine lactone
CAMHB : Mueller Hinton Broth ajusté en
ions Ca2+
et Mg2+
CAMP : Cathelicidin Antimicrobial
peptide
CCM : chromatographie sur couche mince
CDC : Center for Disease Control
CFF : Cystic Fibrosis Foundation
CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrane
Conductance Regulator
CLSI : Clinical and Laboratory Standards
Institute
CMB : concentration minimale bactéricide
CMI : concentration minimale inhibitrice
CSA : Cationic Steroid Antibiotics
CV : cristal violet
DDAO : 7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-
dimethylacridin-2-one)
DMSO : diméthylsulfoxide
DO : densité optique
E. coli : Escherichia coli
ECR : élastine congo rouge
EDTA : acide éthylène diamine
tétraacétique
EGM : Endothelial Growth Medium
EGTA : acide éthylène glycol-bis(2-
aminoéthyléther)-N,N,N’,N’-tétraacétique
ENaC : Epithelial Na+ Channel
ExoS : exoenzyme S
ExoT : exoenzyme T
ExoU : exoenzyme U
ExoY : exoenzyme Y
F. novicida : Francisella novicida
FDA : Food and Drug Administration
FPRL-1 : Formyl Peptide Receptor Like-1
FTIR : spectroscopie infrarouge à
transformée de Fourier
GFP : green fluorescent protein
H. influenzae : Haemophilus influenzae
H. pylori : Helicobacter pylori
hBD : β-défensine humaine
hCAP18 : human cationic antimicrobial
peptide
HDP : host defence peptide
hEGF : facteur de croissance épidermique
humain
HEPES : acide N-[2-hydroxyéthyl]
pipérazine-N’-[2-éthanesulfonique]
HIV : Human Immunodeficiency Virus
HNP : Human Neutrophil Peptide
Abréviations
HPLC : chromatographie en phase liquide
à haute performance
HSL : homosérine lactone
HSV : Herpes Simplex Virus
HUVEC : Human Umbilical Vein
Endothelial Cells
IFB : indice de formation du biofilm
IFN : interféron
IL : interleukine
IP : iodure de propidium
K. pneumoniae : Klebsiella pneumoniae
L. monocytogenes : Listeria
monocytogenes
LB : Luria Bertani
LDH : lactate déshydrogénase
LPO : lactoperoxydase
LPS : lipopolysaccharides
LRP : LDL receptor-related protein
MCBL : microscopie confocale à balayage
laser
MCT : mercure cadium tellure
MDR-PA : P. aeruginosa multirésistant
MH : Mueller Hinton
MRSA : S. aureus résistant à la
méthicilline
MS : Mineral Salt
MTT : bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-
2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium
MU : 4-méthylumbelliférone
MUG : 4-méthy-lumbelliféryl β-D-
galactopyranoside
N. gonorrhoeae : Neisseria gonorrhoeae
NADH/NAD+ : nicotinamide adénine
dinucléotide réduit/oxydé
NDA : New Drug Application
NIH : National Institute of Health
NO : monoxyde d’azote
NPN : 1-N-phénylnaphtylamine
ONP : o-nitrophénol
ONPG : orthonitrophényl-β-galactoside
ORCC : Outward rectifying Cl- Channel
P. aeruginosa : Pseudomonas aeruginosa
P. mirabilis : Proteus mirabilis
PAM : peptide(s) antimicrobien(s)
PB : Pseudomonas Broth
pb: paires de base
PBS : tampon phosphate salin
PC : Lα-Phosphatidylcholine
PCR : réaction en chaîne par polymérase
PKA : protéine kinase AMPc dépendante
PM : poids moléculaire
PMB : polymyxine B
POPG : Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-
[Phospho-rac-(1-glycerol)]
PPGAS : Proteose Peptone-Glucose-
Ammonium Salts
PQS : Pseudomonas quinolone signal
QS : quorum sensing
R2 : coefficient de corrélation
RFP : red fluorescent protein
RMN : résonance magnétique nucléaire
ROS : espèces réactives de l’oxygène
S. aureus : Staphylococcus aureus
S. epidermidis : Staphylococcus
epidermidis
S. maltophilia : Stenotrophomonas
maltophilia
S. pyogenes : Streptococcus pyogenes
S. typhimurium : Salmonella typhimurium
SBI : solution bactérienne initiale
SD : déviation standard
SEM : écart étalon de la moyenne
SEP : substrat extracellulaire polymérique
SIC : inhibiteur streptococcique du
complément
SP-A : protéine A du surfactant
pulmonaire
t1/2 : temps de demi-vie
TCA : acide trichloroacétique
TFA : trifluoroacétate
TMRE : tétraméthylrhodamine éthyl ester
TNF : facteur de nécrose tumorale
tpm : tours par minute
TRIS : tris(hydroxyméthyl)-aminométhane
TSA : Tryptic Soy Agar
TSB : Tryptic Soy Broth
TTSS : système de sécrétion de type III
u.a. : unités d’absorbance
u.a.f. : unités arbitraires de fluorescence
ufc : unité formant colonies
V. fischeri : Vibrio fischeri
X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-
galactopyranoside
Table des matières
1
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION
I. LA MUCOVISCIDOSE .............................................................................................................................. 6
I.1 ASPECTS GENETIQUES ............................................................................................................................ 6 I.2 LA PROTEINE CFTR ................................................................................................................................... 7 I.3 PREDISPOSITION AUX INFECTIONS RESPIRATOIRES....................................................................... 8 I.4 COLONISATION BACTERIENNE DES POUMONS .............................................................................. 10 I.5 PATHOGENESE DU DECLIN PULMONAIRE PAR P. AERUGINOSA .................................................. 11 I.6 PRISE EN CHARGE ACTUELLE DE LA MUCOVISCIDOSE ................................................................ 16
II. PSEUDOMONAS AERUGINOSA ............................................................................................................ 18
II.1 MICROBIOLOGIE GENERALE .............................................................................................................. 18 II.2 PATHOGENICITE DE P. AERUGINOSA ................................................................................................ 19
II.2.1 Facteurs de virulence cellulaires ....................................................................................................... 19 II.2.2 Facteurs de virulence sécrétés ........................................................................................................... 21
II.3 LE QUORUM SENSING .......................................................................................................................... 25 II.3.1 Quorum sensing de type LuxI/LuxR ................................................................................................... 25 II.3.2 Quorum sensing chez P. aeruginosa .................................................................................................. 26
III. LE BIOFILM ................................................................................................................................................ 29
III.1 LE BIOFILM : UN MODE DE VIE PARTICULIER ............................................................................... 29 III.2 LA MATRICE DU BIOFILM DE P. AERUGINOSA ............................................................................... 30 III.3 LES ETAPES DE LA FORMATION DU BIOFILM DE P. AERUGINOSA ............................................ 31 III.4 LES MECANISMES DE RESISTANCE DU BIOFILM DE P. AERUGINOSA ...................................... 35
III.4.1 La résistance du biofilm envers les agents antimicrobiens ............................................................... 35 III.4.2 La résistance du biofilm envers les défenses de l’hôte ..................................................................... 38
IV. LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS .................................................................................................... 40
IV.1 DES PEPTIDES COMME NOUVELLES STRATEGIES THERAPEUTIQUES ................................... 40 IV.2 LL-37, UN PEPTIDE ANTIMICROBIEN HUMAIN .............................................................................. 40 IV.3 MECANISMES D’ACTION ANTIMICROBIENNE DES PAM ............................................................ 42
IV.3.1 Attraction peptide-membrane ........................................................................................................... 43 IV.3.2 Liaison peptide-membrane ................................................................................................................ 43 IV.3.3 Interaction peptide-membrane .......................................................................................................... 44 IV.3.4 Cibles intracellulaires ....................................................................................................................... 46 IV.3.5 Mécanismes d’action antimicrobienne du LL-37 .............................................................................. 46 IV.3.6 Sélectivité cellulaire .......................................................................................................................... 49
IV.4 DES PEPTIDES QUI CONTOURNENT LA RESISTANCE BACTERIENNE ...................................... 49 IV.5 DES PEPTIDES MULTIFONCTIONNELS ............................................................................................ 51 IV.6 MECANISMES DE RESISTANCE AUX PAM ...................................................................................... 53
IV.6.1 Protéases ........................................................................................................................................... 54
IV.6.2 Molécules extracellulaires liant les PAM ......................................................................................... 54 IV.6.3 Pompes à efflux ................................................................................................................................. 54 IV.6.4 Altération des propriétés de la surface cellulaire ............................................................................. 55
IV.7 APPLICATION CLINIQUE DES PAM : OBSTACLES ET AVANCEES ............................................. 56 IV.7.1 Coût de la production ....................................................................................................................... 56 IV.7.2 Sensibilité aux conditions physiologiques et aux protéases .............................................................. 57 IV.7.3 Profil toxicologique .......................................................................................................................... 60
Table des matières
2
IV.7.4 Développement clinique actuel des PAM .......................................................................................... 61
V. LES CERAGENINES ............................................................................................................................... 62
V.1 PROPRIETES ANTIBACTERIENNES DU CSA-13 ............................................................................... 62 V.2 CSA-13 ET MUCOVISCIDOSE ............................................................................................................... 63
BUT DU TRAVAIL
MATERIEL ET METHODES
I. MATERIEL ............................................................................................................................................... 68
I.1 SOUCHES BACTERIENNES .................................................................................................................... 68 I.2 AGENTS ANTIBACTERIENS .................................................................................................................. 69
II. METHODES .............................................................................................................................................. 70
II.1 FORMATION DES BIOFILMS ................................................................................................................ 70 II.1.1 Formation des biofilms par le BFRT
® ............................................................................................... 70
II.1.2 Formation des biofilms par coloration au cristal violet (CV) ............................................................ 71 II.1.3 Formation des biofilms par dénombrement ....................................................................................... 71
II.2 MOTILITE DES SOUCHES ..................................................................................................................... 72 II.3 PRODUCTION DE RHAMNOLIPIDES .................................................................................................. 72 II.4 SENSIBILITE A UN ANTIBIOTIQUE .................................................................................................... 73 II.5 ACTIVITE PROTEOLYTIQUE................................................................................................................ 73 II.6 ACTIVITE ELASTOLYTIQUE ................................................................................................................ 74 II.7 PRODUCTION D’AHL............................................................................................................................. 75
II.7.1 Production des Cn≥6-HSL ................................................................................................................... 75 II.7.2 Production des C4-HSL ...................................................................................................................... 78 II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS ........................................................................................ 79
II.8 POTENTIEL ZETA ................................................................................................................................... 80 II.9 ETUDE SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES .............................................................................. 81
II.9.1 Détermination de la CMI et de la CMB ............................................................................................. 81 II.9.2 Essai de viabilité par perméabilisation au 1-N-phénylnaphtylamine (NPN) ................................... 161 II.9.3 Interaction du CSA-119 avec P. aeruginosa ...................................................................................... 82 II.9.4 Essai de viabilité par dénombrement ................................................................................................. 83 II.9.5 Essai de viabilité par perméabilisation à l’iodure de propidium (IP) ............................................... 83
II.10 ETUDE SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM ................................................................................. 84 II.11 ETUDE SUR UN BIOFILM PREFORME .............................................................................................. 84
II.11.1 Etude par dénombrement sur un biofilm préformé .......................................................................... 84 II.11.2 Etude par MCBL sur un biofilm préformé ....................................................................................... 86
II.12 TOXICITE SUR CELLULES EUCARYOTES (HUVEC) ...................................................................... 90 II.12.1 Evaluation de la libération de la lactate déshydrogénase (LDH) .................................................... 90 II.12.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium .......................................................................... 181 II.12.3 Evaluation de l’activité mitochondriale (test MTT) ......................................................................... 92 II.12.4 Evaluation du potentiel de membrane mitochondrial ...................................................................... 93
II.13 ETUDE DES STRUCTURES SECONDAIRES DES PEPTIDES A L’AIDE DE LA SPECTROSCOPIE
INFRAROUGE A TRANSFORMEE DE FOURIER A REFLEXION TOTALE ATTENUEE (ATR-FTIR) 94 II.13.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls........................................................................ 94 II.13.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes ......................................... 95
II.14 FIXATION DES PEPTIDES AUX LPS .................................................................................................. 96 II.14.1 Synthèse de la dansyl-PMB .............................................................................................................. 96 II.14.2 Dosage de la dansyl-PMB par dinitrophénylation........................................................................... 97 II.14.3 Effet des peptides sur la fixation de la dansyl-PMB aux LPS .......................................................... 97
II.15 PERMEABILISATION DES MEMBRANES DE E. COLI ML-35P ...................................................... 98 II.16 ANALYSES STATISTIQUES ................................................................................................................ 99
Table des matières
3
CHAPITRE I : CARACTERISATION PHENOTYPIQUE DES
SOUCHES
I. INTRODUCTION ................................................................................................................................... 101
II. RESULTATS ........................................................................................................................................... 102
II.1 FORMATION DES BIOFILMS .............................................................................................................. 102 II.1.1 Formation des biofilms par le BFRT
® ............................................................................................. 102
II.1.2 Formation des biofilms par coloration au CV ................................................................................. 103 II.1.3 Formation des biofilms par dénombrement ..................................................................................... 104
II.2 MOTILITE DES SOUCHES ................................................................................................................... 105 II.3 PRODUCTION DE RHAMNOLIPIDES ................................................................................................ 106 II.4 SENSIBILITE A UN ANTIBIOTIQUE .................................................................................................. 106 II.5 ACTIVITE PROTEOLYTIQUE.............................................................................................................. 107 II.6 ACTIVITE ELASTOLYTIQUE .............................................................................................................. 107 II.7 PRODUCTION D’AHL........................................................................................................................... 108
II.7.1 Production des Cn≥6-HSL ................................................................................................................. 108 II.7.2 Production des C4-HSL .................................................................................................................... 110 II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS ...................................................................................... 110
II.8 CORRELATIONS ENTRE LA PRODUCTION D’AHL ET DES CARACTERISTIQUES
PHENOTYPIQUES ....................................................................................................................................... 112
III. DISCUSSION ........................................................................................................................................... 113
CHAPITRE II : ETUDE DU CSA-13
I. INTRODUCTION ................................................................................................................................... 122
II. RESULTATS ........................................................................................................................................... 124
II.1 EFFET DU CSA-13 SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES ......................................................... 124 II.1.1 Détermination de la CMI et de la CMB ........................................................................................... 124 II.1.2 Effet du CSA-13 sur la perméabilité au NPN................................................................................... 124
II.2 EFFET DU CSA-13 SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM .............................................................. 125 II.2.1 Effet d’une faible concentration en CSA-13 sur la formation d’un biofilm ..................................... 125 II.2.2 Etude de la cinétique d’interaction du CSA-119 avec 8 souches de P. aeruginosa ......................... 126 II.2.3 Effet du CSA-13 sur la production de rhamnolipides ...................................................................... 127 II.2.4 Etude du potentiel zêta ..................................................................................................................... 128
II.3 EFFET DU CSA-13 SUR UN BIOFILM PREFORME ........................................................................... 130 II.3.1 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé – étude par dénombrement ............................................. 130 II.3.2 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé – étude par MCBL .......................................................... 135
II.4 TOXICITE DU CSA-13 SUR CELLULES EUCARYOTES .................................................................. 138 II.4.1 Evaluation de la libération de la LDH ............................................................................................. 138 II.4.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium ............................................................................ 138
II.5 EFFET DE L’ASSOCIATION CSA-13 ET ACIDE PLURONIQUE F-127 ........................................... 139 II.5.1 Activité antibactérienne de l’association CSA-13 et acide pluronique F-127 ................................. 139 II.5.2 Toxicité de l’association CSA-13 et acide pluronique F-127 sur cellules eucaryotes ..................... 140
III. DISCUSSION ........................................................................................................................................... 143
Table des matières
4
CHAPITRE III : ETUDE DU PEPTIDE LL-37 ET DE SES
DERIVES
I. INTRODUCTION ................................................................................................................................... 157
II. RESULTATS ........................................................................................................................................... 158
II.1 SEQUENCES ET CARACTERISTIQUES DES PEPTIDES .................................................................. 158 II.2 EFFET DES PEPTIDES SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES ................................................... 159
II.2.1 Determination de la CMI et de la CMB ........................................................................................... 159 II.2.2 Effet des peptides sur la perméabilité à l’IP .................................................................................... 159 II.2.3 Relation entre perméabilité membranaire et mort cellulaire ........................................................... 161
II.3 EFFET DES PEPTIDES SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM ........................................................ 162 II.4 EFFET DES PEPTIDES SUR UN BIOFILM PREFORME – ETUDE PAR MCBL ............................... 163
II.4.1 Effet des peptides sur un biofilm préformé dans une microplaque .................................................. 163 II.4.2 Effet des peptides sur un biofilm préformé dans un réacteur CDC ................................................. 165
II.5 ETUDE DES STRUCTURES SECONDAIRES DES PEPTIDES A L’AIDE DE LA SPECTROSCOPIE
INFRAROUGE A TRANSFORMEE DE FOURIER A REFLEXION TOTALE ATTENUEE (ATR-FTIR) 170 II.5.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls........................................................................ 170 II.5.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes ......................................... 172
II.6 FIXATION DES PEPTIDES AUX LPS .................................................................................................. 173 II.6.1 Synthèse de la dansyl-PMB .............................................................................................................. 173 II.6.2 Dosage de la dansyl-PMB par dinitrophénylation........................................................................... 173 II.6.3 Effet des peptides sur la fixation de la dansyl-PMB aux LPS .......................................................... 174
II.7 EFFET DES PEPTIDES SUR LA PERMEABILISATION DES MEMBRANES DE E. COLI ML-35P 175 II.8 TOXICITE DES PEPTIDES SUR CELLULES EUCARYOTES ............................................................ 176
II.8.1 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium ............................................................................ 176 II.8.2 Evaluation de la libération de la LDH ............................................................................................. 177 II.8.3 Evaluation de l’activité mitochondriale ........................................................................................... 177
III. DISCUSSION ........................................................................................................................................... 178
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
LISTE BIBLIOGRAPHIQUE
ANNEXES
Introduction
5
INTRODUCTION
Figure 1 : Classification des mutations du gène CFTR
Classe I : absence de synthèse de la protéine ou arrêt prématuré menant à la production d’une
protéine aberrante, tronquée ; Classe II : maturation défectueuse de la protéine et dégradation
prématurée de la protéine malformée dans le système réticulo-endoplasmique – appareil de
Golgi ; Classe III : mutation affectant la régulation de la protéine CFTR notamment au niveau
des interactions entre l’ATP et les sites de fixation des nucléotides ; Classe IV : altération de
la conduction ionique par une ouverture du canal défectueuse diminuant la perméabilité au
chlore ; Classe V : réduction de la synthèse de CFTR due à une anomalie de l’épissage du
transcrit ; Classe VI : transfert acceléré de la surface cellulaire vers le cytoplasme réduisant
l’expression membranaire du canal CFTR ou sa stabilité (Boyle et De Boeck, 2013).
Introduction
6
I. LA MUCOVISCIDOSE
La mucoviscidose est la plus fréquente des maladies génétiques graves dans les
populations d’origine caucasienne. Elle touche approximativement 1 sur 3500 naissances aux
Etats-Unis (Cystic Fibrosis Foundation, 2010). L’affection héréditaire est présente sur
l’entièreté du globe, mais sa prévalence varie en fonction des régions du monde. L’incidence
est beaucoup plus faible en Afrique et en Asie.
I.1 ASPECTS GENETIQUES
La mucoviscidose est une maladie à transmission autosomique récessive causée par le
dysfonctionnement d’un seul gène, le gène CFTR, codant pour la protéine transmembranaire
CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) (Riordan et al., 1989). Le
gène CFTR comprend environ 180000 paires de bases (pb) situées sur le bras long du
chromosome 7 et est exprimé dans de nombreuses cellules épithéliales et sanguines. La
protéine CFTR, de 1480 acides aminés, appartient à la famille des transporteurs ABC (ATP
Binding Cassette) et fonctionne principalement comme un canal chlore à la membrane apicale
de cellules épithéliales des organes cibles (poumon, intestin et glandes sudoripares). A ce
jour, plus de 1900 mutations distinctes du gène CFTR associées à la maladie ont été décrites.
Les mutations peuvent être classées en 6 catégories sur base du mécanisme par lequel elles
affectent la protéine CFTR (atteinte de la synthèse, du transport, de la fonction ou de la
stabilité du canal CFTR) (Rowe et al., 2005 ; Amaral et Kunzelmann, 2007 ; Boyle et De
Boeck, 2013). Les conséquences fonctionnelles de toutes les mutations recensées ne sont pas
clairement établies et la majorité de ces mutations sont rares (The Cystic Fibrosis Mutation
Database). Les mutations des classes I, II et III auraient des conséquences phénotypiques plus
importantes liées à une maladie plus sévère. La mutation la plus fréquente est la mutation
ΔF508 (mutation de classe II) qui correspond à la délétion de la phénylalanine en position 508
de la protéine due à une délétion de 3 nucléotides au niveau du gène. Elle touche plus de 80 %
des patients. Sept % des patients sont victimes des mutations de classe I et 3 % des mutations
de classe III. Les classes IV et V sont liées à un taux de mortalité plus faible et à un phénotype
clinique plus doux (McKone et al., 2003).
Figure 2 : Modèle de la structure de la protéine CFTR
La protéine CFTR est composée de deux motifs répétés, formés chacun de 6 domaines
transmembranaires (TM1 et TM2) et d’un site de fixation aux nucléotides (SFN1 et SFN2),
séparés par un domaine régulateur (R). Les domaines TM forment un pore dans la cellule. Le
pore est maintenu fermé par le domaine R sous sa forme non phosphorylée. La
phosphorylation par une protéine kinase AMPc dépendante (PKA) permet un changement
morphologique et l’interaction entre les SFNs et l’ATP. Cette phosphorylation est nécessaire
pour l’ouverture du pore. L’ouverture du pore requiert l’hydrolyse de l’ATP après la
phosphorylation du domaine R. Adapté d’après Davidson et Dorin, 2001.
Introduction
7
I.2 LA PROTEINE CFTR
La protéine CFTR est exprimée principalement au niveau du pôle apical de l’ensemble
des cellules épithéliales de l’organisme recouvrant notamment les voies aériennes, le tractus
digestif, l’appareil génital et les glandes sudoripares. La protéine est également exprimée dans
d’autres types cellulaires comme les lymphocytes, les polynucléaires ou les macrophages
(McDonald et al., 1992 ; Yoshimura et al., 1991 ; Di et al., 2006). Il s’agit d’un canal ionique
dont la fonction principale est de permettre le passage des ions chlore (Bear et al., 1992) et qui
est régulé par l’AMPc et l’ATP. La protéine agit également comme régulateur des canaux
sodium ENaC (Epithelial Na+ Channel) et potassium. La protéine CFTR possède deux
segments transmembranaires (TM1 et TM2) composés chacun de six régions
transmembranaires, deux sites de fixation des nucléotides (SFN1 et SFN2) et un domaine
régulateur cytoplasmique (R). L’interaction de l’ATP avec le domaine régulateur entraîne sa
phosphorylation par l’intermédiaire d’une protéine kinase AMPc dépendante (PKA). L’ATP
se fixe au SFN1 et, après hydrolyse, modifie la conformation de la protéine ce qui provoque
l’ouverture du canal chlore (Cheng et al., 1991 ; Hwang et al., 1994 ; Zeltwanger et al., 1999).
La sortie des ions chlore entraîne un gradient électrochimique. S’ensuit la déphosphorylation
et l’interaction de l’ATP avec le SFN2 qui conduit à la fermeture du canal chlore.
Chez les patients souffrant de mucoviscidose, le dysfonctionnement du canal CFTR
entraîne une perturbation du transport des ions. Les anomalies de la sécrétion d’eau et d’ions
affectent principalement l’arbre trachéo-bronchique et les canaux de différents organes dont
ceux du pancréas exocrine, de l’intestin, des tubes séminifères et des glandes sudoripares. Au
niveau pulmonaire, les cellules épithéliales expriment les protéines CFTR et ORCC (Outward
Rectifying Cl- Channel), responsables du flux des ions chlore, et des canaux sodiques ENaC
intervenant dans le transport transépithélial du sodium. Dans le poumon, la protéine CFTR
active indirectement l’ouverture du canal ORCC qui permet la sortie des ions chlore et inhibe
le canal ENaC, qui permet l’entrée des ions sodium (Stutts et al., 1997). Chez les patients
atteints de mucoviscidose, le dysfonctionnement ou l’absence de la protéine CFTR, entraîne
une absorption excessive de sodium par le canal sodium épithélial. Le chlore accompagne le
sodium non pas via le CFTR mais plutôt par voie paracellulaire. L'augmentation du gradient
transépithélial de chlorure de sodium contribue à une réabsorption importante d'eau avec la
formation d’un mucus visqueux et épais tapissant l’arbre trachéo-bronchique. La
Figure 3 : « Hypothèse du faible volume »
Figure A : Illustration de l’ « hypothèse du faible volume » avec un transport des électrolytes
et un volume de liquide de surface des voies aériennes normal chez les sujets sains (gauche)
en contraste avec une déplétion du volume du liquide de surface suite à une altération du
transport des électrolytes chez les sujets malades (droite) (Wine, 1999). Figure B :
Représentation de la déplétion de volume du liquide des voies aériennes observée chez les
sujets sains (gauche) et atteints de mucoviscidose (droite). Chez les sujets sains les cils des
cellules épithéliales éliminent efficacement les particules ou les microorganismes qui sont
piégés dans le mucus fin et fluide (un processus appelé clairance mucociliaire). Chez les
patients atteints de mucoviscidose, les cils ne sont plus capables d’éliminer la couche de
mucus visqueux et déshydraté ; il en résulte la colonisation par des bactéries comme P.
aeruginosa (Matsui et al., 1998).
Introduction
8
déshydratation des sécrétions et du mucus est responsable de l’obstruction progressive des
bronches et de l’apparition de l’infection et de l’inflammation conduisant à une insuffisance
respiratoire. Au niveau des glandes sudoripares, on retrouve une concentration en sel élevée
dans la sueur chez les patients atteints de mucoviscidose. Cette caractéristique est à l’origine
du « test à la sueur », pratiqué dans le dépistage de la mucoviscidose.
I.3 PREDISPOSITION AUX INFECTIONS RESPIRATOIRES
Le mécanisme exact liant le dysfonctionnement de la protéine CFTR à la maladie
clinique reste incertain. Plusieurs mécanismes sont proposés pour expliquer la prédisposition
des patients atteints de mucoviscidose aux infections respiratoires (Davies, 2002 ; Hiemstra,
2007 ; Hauser et al., 2011).
(1) L’hypothèse la plus acceptée pour expliquer comment les mutations au niveau de la
protéine CFTR mènent à la colonisation des voies respiratoires par les bactéries est
l’« hypothèse du faible volume » (Sequeiros et Jarad, 2013).
La clairance mécanique du mucus est considérée comme un mécanisme de défense
inné primordial dans les voies respiratoires (Knowles et Boucher, 2002). Le mucus
recouvre l’épithélium respiratoire et constitue, avec la présence des cils à la surface de
l’épithélium, un mécanisme essentiel de défense de l’hôte par son rôle de piège des
bactéries et des particules. L’action des cils permet ensuite leur expulsion. La
clairance mucociliaire requiert un système fonctionnel à deux couches de mucus
composé d’une couche de liquide périciliaire de faible viscosité et d’une couche
superficielle de mucus. Ces deux couches forment le liquide de surface des voies
respiratoires. Le fluide périciliaire fournit un environnement aqueux qui permet le
battement des cils et la propulsion du mucus loin vers les voies aériennes supérieures.
La clairance appropriée de l'appareil respiratoire nécessite une interaction coordonnée
du mucus et de la couche de liquide périciliaire ainsi qu’une hydratation adéquate de
la surface des voies respiratoires.
L’« hypothèse du faible volume » a été avancée par Matsui et ses collègues. Dans ce
modèle la diminution du transport des ions chlore, liée à une protéine CFTR absente
ou altérée, entraîne l’hyperabsorption de sodium (augmentation de l’activité du canal
Figure 4 : Hypothèses expliquant la prédilection de P. aeruginosa dans les voies
respiratoires des patients atteints de mucoviscidose
(1) La clairance mucociliaire entravée liée au mucus épais et visqueux et à la déshydratation
de la surface des voies respiratoires ; (2) La forte teneur en sel du liquide de surface des voies
respiratoires entraînant l’inhibition de l’activité des PAM ; (3) L’augmentation de la
disponibilité des récepteurs de surface liant le pathogène (aGM1 = asialoGM1) ; (4)
L’internalisation défectueuse de P. aeruginosa par les cellules épithéliales ; (5) Les taux
faibles de molécules de défense comme le NO, le glutathion et la LPO (Davies, 2002).
Introduction
9
ENaC) et d’eau et réduit ainsi le volume du liquide périciliaire à la surface des cellules
épithéliales des voies respiratoires. Le battement des cils et, par conséquent, la
clairance mucociliaire y sont entravés. Ce modèle favorise le contact du pathogène
avec les cellules épithéliales (Matsui et al., 1998).
(2) La stérilité des voies aériennes inférieures est rendue possible par un mécanisme de
défense efficace impliquant la clairance mécanique mais aussi la sécrétion de
molécules effectrices du système immunitaire inné. Les peptides antimicrobiens
(PAM) et les protéines sont des composants essentiels de ce système immunitaire. Les
classes principales de PAM produites par les poumons sont les β-défensines et les
cathélicidines (LL-37) (Hiemstra, 2007). L’activité de ces médiateurs antimicrobiens
est limitée en présence de fortes concentrations en sel.
Par opposition au modèle « du faible volume », Smith et ses collègues proposent
l’ « hypothèse de la forte teneur en sel ». D’après ces auteurs, le liquide de surface des
voies respiratoires présente une concentration en sel élevée liée à une réabsorption
restreinte des ions chlore et par conséquent une rétention des ions sodium dans le
liquide de surface des voies respiratoires (Smith et al., 1996 ; Zabner et al., 1998). Ce
niveau élevé en sel est responsable de l’inhibition de l’activité des PAM, dont les β-
défensines et le peptide LL-37/hCAP-18, qui ne parviennent plus à tuer le pathogène
(Goldman et al., 1997 ; Bals et al., 1998a et 1998b).
D’autres hypothèses expliquent la susceptibilité augmentée aux infections chez les
patients atteints de mucoviscidose liée à une fonction inadéquate des médiateurs
antimicrobiens. La présence dans les poumons des patients souffrant de mucoviscidose de
concentrations importantes de protéases est responsable de la dégradation des PAM et
contribue à leur inactivation (Taggart et al., 2003). Bucki et ses collègues ont montré la
présence dans les expectorations de molécules comme l’ADN et la F-actine, qui se lient aux
PAM et entraînent leur inhibition (Bucki et al., 2007a).
(3) Les récepteurs asialoGM1 lient le pathogène P. aeruginosa. Chez les patients atteints
de mucoviscidose, on a montré une augmentation de leur expression à la surface des
cellules épithéliales des voies respiratoires. Ceci accroît la liaison de la bactérie à la
surface épithéliale contribuant à la colonisation bactérienne (Saiman et Prince, 1993).
Figure 5 : Prévalence en fonction de l’âge de plusieurs pathogènes respiratoires
dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose
Rapport des données annuelles de la CFF (Cystic Fibrosis Foundation, 2010). MRSA = S.
aureus résistant à la méthicilline ; MDR-PA = P. aeruginosa multirésistant.
Introduction
10
(4) Chez les sujets sains, la protéine CFTR joue un rôle de récepteur pour P. aeruginosa
au niveau des cellules épithéliales. La liaison de P. aeruginosa sur CFTR provoque
son internalisation et sa clairance du tractus respiratoire, participant à la défense
pulmonaire de l’hôte. Dans les cellules épithéliales pulmonaires exprimant un canal
CFTR muté, ces fonctions sont défectueuses et la clairance du pathogène entravée
(Pier et al., 1996 ; Pier et al., 1997).
(5) Le dysfonctionnement de la protéine CFTR entraîne une diminution de la production
de la NO synthase chez les patients souffrant de mucoviscidose. Le monoxyde d’azote
(NO) possédant des propriétés antibactériennes, son absence prédispose à la
colonisation bactérienne pulmonaire (Kelley et Drumm, 1998). La sécrétion de
glutathion, aux propriétés antioxydantes, est également défectueuse chez les patients
atteints de mucoviscidose (Gao et al., 1999).
La lactoperoxidase (LPO) intervient dans les mécanismes de défense de l’hôte des
voies aériennes. L’enzyme utilise l’H2O2 pour catalyser l’oxydation du thiocyanate
(SCN-) en produit antibactérien (OSCN
-). Chez les sujets sains, la protéine CFTR
entraîne l’efflux de SCN- à la surface apicale des cellules épithéliales. Chez les sujets
atteints de mucoviscidose, le dysfonctionnement de la protéine CFTR empêche
l’accumulation de SCN- et altère l’activité antibactérienne de la LPO (Conner et al.,
2007).
I.4 COLONISATION BACTERIENNE DES POUMONS
La prédisposition à une infection par un pathogène spécifique change avec l’âge pour
les patients atteints de mucoviscidose. Chez les enfants et les adolescents, S. aureus est le
pathogène le plus fréquemment isolé, bien que P. aeruginosa et H. influenzae soient aussi
prévalents. La fréquence de cultures positives pour P. aeruginosa augmente avec l’âge.
D’après le Registre des Patients du CFF, environ la moitié des patients en dessous de 18 ans
sont colonisés par P. aeruginosa et à la fin de la vingtaine, le pathogène est isolé chez 80 %
des patients malades (Cystic Fibrosis Foundation, 2010). B. cepacia est moins fréquent mais
colonise malgré tout les poumons d’une minorité substantielle d’adultes. D’autres
microorganismes comme A. xylosoxidans et S. maltophilia sont représentés avec des
Introduction
11
fréquences plus élevées que B. cepacia (Razvi et al., 2009 ; Millar et al., 2009). Mais ce sont
les infections à P. aeruginosa et B. cepacia qui sont associées à un déclin de la fonction
pulmonaire et une morbidité et mortalité importantes chez les patients atteints de
mucoviscidose (Emerson et al., 2002 ; Nixon et al., 2001 ; Courtney et al., 2007). Les
infections pulmonaires chroniques à P. aeruginosa sont celles qui causent les obstructions les
plus prononcées des voies respiratoires et consistent en des processus critiques dans la
détérioration de la fonction pulmonaire chez les patients adultes atteints de mucoviscidose
(Lopes et al., 2012).
I.5 PATHOGENESE DU DECLIN PULMONAIRE PAR P. AERUGINOSA
Bien que le mécanisme précis de prédisposition à une infection ne soit pas clairement
établi, il est évident que certains microorganismes sont capables d’infecter les voies
respiratoires des patients atteints de mucoviscidose menant à un déclin de la fonction
pulmonaire. La bactérie P. aeruginosa est le pathogène le plus fréquemment identifié dans les
sécrétions des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose. Le processus menant
à la détérioration pulmonaire lors de cette infection a été l’objet de recherche intense.
Acquisition de P. aeruginosa
La première étape dans le développement d’une infection à P. aeruginosa dans les
voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose est l’acquisition du pathogène. Des
analyses génétiques ont montré que les souches initiales de la colonisation bactérienne
proviennent de réservoirs environnementaux (Burns et al., 2001). Le pathogène est
omniprésent dans les sols humides, les lacs, les ruisseaux et sur les légumes et un contact avec
ces sources environnementales naturelles peut induire l’acquisition de la bactérie (Römling et
al., 2005). La transmission de P. aeruginosa à partir d’autres personnes infectées ou par
d’autres patients atteints de mucoviscidose est également possible.
Adhésion
L’entrée du pathogène dans l’organisme hôte est suivie de l’infection. Les bactéries
colonisent d’abord les voies respiratoires supérieures puis, atteignent les voies respiratoires
inférieures (Mainz et al., 2009). Chez les patients atteints de mucoviscidose, la clairance
Introduction
12
mucociliaire, responsable de l’élimination bactérienne chez les sujets sains, est entravée. La
couche épaisse et visqueuse limite le mouvement ciliaire des cellules de l’épithélium
pulmonaire empêchant l’évacuation des particules et des bactéries vers le nasopharynx. Les
bactéries peuvent alors adhérer au mucus épais des bronches et coloniser le poumon. Chez P.
aeruginosa, le processus d’adhésion à l’hôte fait intervenir des interactions spécifiques de la
bactérie avec les mucines des sécrétions pulmonaires. Le flagelle et les pili de type IV de P.
aeruginosa participent également aux interactions initiales avec la surface de l’épithélium
bronchique, notamment par leur liaison aux récepteurs asialoGM1 (Feldman et al., 1998 ;
Saiman et Prince, 1993 ; Gupta et al., 1994). Il a également été suggéré que le pathogène se
lie préférentiellement au mucus pulmonaire plutôt qu’aux cellules épithéliales (Worlitzsch et
al., 2002 ; Hall-Stoodley et Stoodley, 2009) et que les mucines stimulent l’agrégation et la
formation du biofilm (Landry et al., 2006).
Infection précoce ou transitoire
Lors des stades précoces de l’infection, celle-ci est généralement transitoire et son
éradication est possible par un traitement antibiotique agressif et une réponse importante de la
défense immunitaire de l’hôte (Rosenfeld et al., 2001). A ce stade, les souches isolées des
expectorations des patients atteints de mucoviscidose sont acquises de sources
environnementales. Le succès du traitement de l’infection est lié à la faible densité
bactérienne, au phénotype non mucoïde des souches et à leur faible résistance aux
antibiotiques (Burns et al., 2001). Le patient peut être négatif pour P. aeruginosa pendant
plusieurs années, l’infection chronique étant généralement acquise dans la fin de la vingtaine
(Folkesson et al., 2012).
Infection chronique
Les infections chroniques et persistantes de P. aeruginosa sont associées à un déclin
important de la fonction pulmonaire et du pronostic vital. L’installation de la chronicité de
l’infection est associée à de nombreux changements génétiques et phénotypiques de la
bactérie (Spencer et al., 2003 ; Smith et al., 2006). La plupart de ces changements sont liés à
la colonisation bactérienne dans un environnement « stressant ». Cet environnement stressant
est créé dans les poumons des patients atteints de mucoviscidose, par le stress oxydatif et la
présence d’antibiotiques, auxquels le pathogène doit faire face. Dans ces conditions, une
modification importante de l’expression des gènes apparaît et le taux de mutations des
Figure 7 : Souche mucoïde de P. aeruginosa
La croissance d’une souche de P. aeruginosa de phénotype mucoïde est fortement associée au
diagnostic de la mucoviscidose (Pritt et al., 2007).
Introduction
13
bactéries augmente (Folkesson et al., 2012). Les souches cliniques isolées de patients
chroniquement infectés sont typiquement caractérisées par une croissance lente, une
résistance aux antibiotiques, une perte de la mobilité et une surproduction d’alginate. Ces
changements sont avantageux pour la bactérie (processus adaptatif) et lui permettent de
survivre dans l’environnement pulmonaire des malades.
L’établissement de l’infection chronique est corrélé avec la transition de la bactérie
vers un phénotype mucoïde résultant en la production excessive et constitutive du
polysaccharide extracellulaire alginate (Govan et Deretic, 1996). Cette transition est
également corrélée avec une perte de la mobilité des souches mucoïdes, par perte du flagelle
(Garrett et al., 1999). Les bactéries motiles de l’environnement pénètrent dans la zone
hypoxique du mucus épais et échappent ainsi aux polynucléaires neutrophiles et aux
macrophages alvéolaires. Le micro-environnement anaérobique présent dans le mucus des
patients atteints de mucoviscidose entraîne la production d’alginate dans lequel P. aeruginosa
est intégré. La formation du biofilm commence alors (Worlitzsch et al., 2002). L’organisation
des bactéries sous forme d’un biofilm est un caractère phénotypique particulièrement
important dans la persistance de la colonisation bactérienne par P. aeruginosa chez les
patients atteints de mucoviscidose et chroniquement infectés (Bjarnsholt et al., 2009). Dans ce
mode de vie, les bactéries sont très résistantes aux antibiotiques (Xu et al., 2000) et à
l’éradication par le système immunitaire de l’hôte (Meluleni et al., 1995 ; Leid, 2009).
Les infections à P. aeruginosa et la destruction du tissu pulmonaire sont liées à
l’apparition de bactéries mucoïdes se développant en agrégats (biofilms). L’observation
microscopique de ces structures révèle la présence de leucocytes polynucléaires entourant le
biofilm mucoïde (Bjarnsholt et al., 2009). Les rhamnolipides et la matrice riche en alginate
(Hentzer et al., 2001) des biofilms mucoïdes contribuent à la résistance des bactéries à la
phagocytose. Les biofilms de P. aeruginosa entraînent la nécrose des polynucléaires qui sont
un élément majeur de la première ligne de défense de l'hôte. Cette nécrose est provoquée par
les rhamnolipides dont la production est contrôlée par le système de quorum sensing (QS)
(Jensen et al., 2007 ; Christensen et al., 2008). En accord avec ce modèle, Bjarnsholt et ses
collègues observent de nombreux polynucléaires dans les tissus entourant le biofilm mucoïde
de P. aeruginosa alors qu’aucun polynucléaire n’est détecté à l’intérieur du biofilm
Introduction
14
(Bjarnsholt et al., 2009). P. aeruginosa s’adapte donc au système de défense immunitaire du
tractus respiratoire par la formation de biofilms mucoïdes (Høiby et al., 2011).
Il a été souligné que les lésions tissulaires et la diminution de la fonction pulmonaire
observées dans des stades plus avancés de la colonisation par P. aeruginosa ne sont pas
provoquées par les toxines et enzymes bactériennes mais plutôt par un cycle inflammatoire
prononcé, dominé par les polynucléaires qui entourent le biofilm (Goldstein et Döring, 1986;
Lyczak et al., 2000). Après l’entrée de la bactérie dans l’hôte, une réponse inflammatoire
accrue est observée dans les voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose en
comparaison avec un poumon normal (Dakin et al., 2002). La pathogenèse des dommages
tissulaires est liée à l’inflammation provoquée par les complexes immuns présents dans
l’arbre trachéo-bronchique. Ils activent la voie du complément et donc le chimiotactisme et
l’inflammation. Le recrutement et la présence prolongée des polynucléaires neutrophiles
résultent en des lésions significatives du tissu pulmonaire et en une diminution de la fonction
pulmonaire. Des taux importants de cytokines et autres facteurs pro-inflammatoires (TNF-α,
IL-1, IL-6, IL-8), avec des taux diminués en cytokine anti-inflammatoire IL-10, ont été
détectés à des stades précoces de la colonisation dans les voies respiratoires de l’épithélium
des patients malades (Rosenfeld et al., 2001; Bonfield et al., 1999; Kirchner et al., 1996).
L’inflammation intense est caractérisée par la séquestration des polynucléaires neutrophiles
dans les voies aériennes. Ces polynucléaires neutrophiles libèrent de nombreux composés pro-
inflammatoires et notamment des protéases qui, exprimées à des taux aberrants, peuvent
causer des dégâts. La libération par les polynucléaires neutrophiles d’élastase (Birrer et al.,
1994), de collagénase et d’agents oxydants (radicaux hydroxyles, ion superoxyde) provoque
la dégradation de la matrice extracellulaire et de l’élasticité des bronches et des bronchioles.
Les protéases, et en particulier les sérines protéases comme l’élastase du polynucléaire
neutrophile, peuvent exacerber l’inflammation, dégrader des protéines structurales et
provoquer des dommages tissulaires (bronchiectasies) (Quinn et al., 2010 ; Weldon et al.,
2009 ; Jensen et al., 2010). Le résultat est une augmentation de l’expression d’IL-8 et un
influx additionnel de neutrophiles créant un cycle inflammatoire. La persistance de
l’accumulation des polynucléaires neutrophiles implique également la libération par les
neutrophiles nécrotiques d’ADN et d’actine responsables de l’augmentation de la viscosité du
mucus. L’enrichissement des expectorations en ADN et en actine est impliqué dans la
Figure 8 : La cascade physiopathologique de la mucoviscidose
D’après Boas et McColley (2007).
Introduction
15
pathogenèse de la maladie pulmonaire (Perks et Shute, 2000) en favorisant également la
formation initiale de biofilm à P. aeruginosa (Walker et al., 2005; Parks et al., 2009). L’effet
nuisible des facteurs dérivés des neutrophiles est aggravé par la production de composés
toxiques par P. aeruginosa. L’élastase de P. aeruginosa clive des facteurs antimicrobiens
(lysozyme, surfactant, transferrine). P. aeruginosa échappe à son éradication et atteint des
densités cellulaires importantes (Haase et al., 2004). Récemment, Bomberger et ses collègues
ont mis en évidence une toxine sécrétée par P. aeruginosa, Cif, qui réduit la sécrétion des ions
chlore liée au canal CFTR par les cellules épithéliales des voies aériennes, une force motrice
essentielle à la clairance mucociliaire. En contribuant à l’inhibition de la clairance
mucociliaire, le pathogène échappe à son éradication (Bomberger et al., 2011).
En résumé, un véritable cercle vicieux (obstruction-infection-inflammation) s’installe
dans les poumons, associé à une réponse inflammatoire inefficace et exubérante (Cohen et
Prince, 2012 ; Hänsch, 2012). Le défaut génétique de la protéine CFTR permet la persistance
de P. aeruginosa. La présence bactérienne permanente dans les voies respiratoires provoque
une augmentation de l’inflammation, par stimulation de façon permanente des mécanismes de
défense, qui à son tour mène à une augmentation de la densité bactérienne (Moss, 2009). La
spirale inflammatoire perpétuelle mène progressivement à des lésions pulmonaires
irréversibles. Les voies aériennes se dilatent et l’apparition de bronchiectasies aggrave le
phénomène. Une majorité des personnes malades décèdent d’infections respiratoires.
Figure 9 : Augmentation de l’âge médian de survie au cours des années
chez les patients atteints de mucoviscidose
D’après Davis, 2006.
Introduction
16
I.6 PRISE EN CHARGE ACTUELLE DE LA MUCOVISCIDOSE
Le traitement de la mucoviscidose distingue les tentatives de traitement curatives de la
maladie et les traitements symptomatiques réduisant l’obstruction, l’inflammation ou
l’infection. Bien que des progrès soient réalisés dans le développement de petites molécules
ciblant le défaut de la protéine CFTR, connues sous le nom de modulateurs de CFTR, aucun
agent ciblant les mutations génétiques (thérapie génique) n’est actuellement disponible
(Davies et Alton, 2010 ; Rogan et al., 2011 ; Kotzamanis et al., 2013). Les modulateurs de
CFTR, développés lors de ces dix dernières années, ciblent des génotypes de CFTR
spécifiques sur base du mécanisme de dysfonctionnement de la protéine. Ils sont un exemple
typique de médecine personnalisée où seuls les patients porteurs d’une mutation spécifique
pourront être traités avec le médicament (Derichs, 2013 ; Wilschanski, 2013). Dans cette voie,
le modulateur de CFTR ivacaftor offre des résultats encourageants (Boyle et De Boeck, 2013 ;
Hoffman et Ramsey, 2013).
Actuellement, le traitement proposé est symptomatique et implique une prise en charge
multidisciplinaire. Des progrès liés à l’évolution de l’antibiothérapie et à la prise en charge de
la maladie (nutrition et physiothérapie) ont permis d’augmenter considérablement l’espérance
de vie des patients au cours de ces deux dernières décennies. En 1974, l'âge médian de survie
international prédisait 8 ans. En 2010 il est proche des 40 ans (Cystic Fibrosis Foundation,
2010) et on s’attend à ce que les nouveaux-nés atteints de mucoviscdose au 21ème
siècle vivent
au-delà de 50 ans (Simmonds, 2010).
L’amélioration du diagnostic, par la mise en œuvre de protocoles de laboratoire de
microbiologie standardisés permettant une meilleure isolation et identification des pathogènes
respiratoires, a également contribué à une augmentation de l’âge médian de survie (Zhou et
al., 2006). Des stratégies prophylactiques pour prévenir les infections initiales ou pour
retarder les infections chroniques de P. aeruginosa peuvent également améliorer l’état
clinique du patient (Rajan et Saiman, 2002). Elles consistent en une administration de très
fortes doses d’antibiotiques pour une éradication agressive de la colonisation initiale par des
souches non mucoïdes de P. aeruginosa afin de prévenir la progression vers une infection
chronique impliquant la formation du biofilm (Döring et Høiby, 2004 ; Hansen et al., 2008).
Introduction
17
Les stratégies actuelles de traitement incluent la prise en charge respiratoire avec des
antibiotiques, le drainage bronchique, l’oxygénothérapie, la physiothérapie, la greffe
pulmonaire et la prise en charge de l’atteinte digestive par une adaptation nutritionnelle
(apport d’extraits pancréatiques et régime alimentaire hypercalorique). Le traitement de
l’atteinte des voies respiratoires a pour objectif de contrôler l’infection (antibiothérapie et
agents anti-inflammatoires) et d’aider à la clairance mucociliaire. Pour ce dernier objectif, les
patients ont recours à l’aérosolthérapie (administration de fluidifiants mucolytiques et de
Dnase recombinante (Pulmozyme®)) et à la kinésithérapie respiratoire. Les techniques de
clairance des voies aériennes sont indispensables pour réduire l’épaisseur de la couche de
mucus encombrant les poumons des patients et pour liquéfier et hydrater les sécrétions (Cystic
Fibrosis Foundation, 2010). La kinésithérapie fait ainsi partie du quotidien des patients et a
pour rôle de faciliter l’évacuation des sécrétions visqueuses et épaisses qui obstruent les
bronches. Elle permet également un entretien global de la condition physique du patient. Les
cures antibiotiques sont un aspect fondamental dans le traitement palliatif et symptomatique
des patients atteints de mucoviscidose. Une fois que l’infection chronique est établie, la seule
thérapie efficace est une thérapie d’entretien avec une administration systémique et nébulisée
régulière d’antibiotiques anti-Pseudomonas afin d’améliorer l’état respiratoire et, à long
terme, d’augmenter la survie du patient (Döring et Høiby, 2004). L’analyse microbiologique
quantitative et qualitative des expectorations des patients permet d’évaluer la bactérie
principale en cause et l’importance de la colonisation bactérienne. Des tests de susceptibilité
aux antibiotiques sont entrepris pour caractériser les phénotypes de résistance et aider au
choix de l’antibiothérapie. Les cures antibiotiques consistent en l’administration parentérale
de β-lactames ou l’administration orale de macrolides comme l’azithromycine. Dernièrement,
l’administration d’antibiotiques par inhalation a été recommandée pour accompagner les
traitements oraux ou intraveineux. Le traitement actuel de référence par aérosol pour les
infections pulmonaires chroniques à P. aeruginosa est une administration locale de
tobramycine commercialisée sous le nom TOBI®
(Varaigne et Hubert, 2004) permettant de
minimiser l’exposition systémique et le risque d’ototoxicité et de néphrotoxicité de
l’antibiotique (Wood et Swanson, 2007). Les antibiotiques administrés par aérosol atteignent
principalement la zone de conduction (bronches) des voies respiratoires inférieures de l’arbre
trachéo-bronchique et seules des concentrations faibles du médicament sont détectées dans la
zone respiratoire (alvéoles et bronchioles) des voies respiratoires inférieures. Au contraire,
l’administration intraveineuse ou orale permet d’atteindre des concentrations importantes dans
Introduction
18
la zone respiratoire car l’antibiotique est transporté directement par le sang vers les capillaires
alvéolaires. Comme les deux zones sont infectées par P. aeruginosa, l’utilisation combinée
d’antibiotiques par voie systémique et inhalée est évidente (Høiby, 2011). Des progrès récents
ont permis aux inhalateurs de poudre sèche de délivrer des particules plus petites que les
nébuliseurs traditionnels, ce qui permet une pénétration plus profonde dans les poumons avec
un minimum d'équipement spécialisé (Heijerman et al., 2009 ; Geller et al., 2011). Un
développement particulièrement intéressant dans le traitement des infections impliquant un
biofilm chez les patients atteints de mucoviscidose est l’administation par inhalation d’une co-
formulation de Pulmozyme® avec la ciprofloxacine (Yang et al., 2010) permettant la
dégradation de la matrice du biofilm pour améliorer la délivrance de l’antibiotique. Ce type
d'approche thérapeutique peut être particulièrement utile avec une formulation plus diversifiée
d’enzymes et d’antibiotiques (Ranall et al., 2012).
Cependant l’éradication bactérienne reste actuellement difficile, malgré la prise en
charge précoce de l’infection par une antibiothérapie adaptée. L’action répétée de
l’antibiothérapie est responsable de l’émergence de souches de P. aeruginosa multirésistantes.
II. PSEUDOMONAS AERUGINOSA
II.1 MICROBIOLOGIE GENERALE
Le Pseudomonas aeruginosa ou bacille pyocyanique est une bactérie à Gram négatif
appartenant au genre Pseudomonas et à la famille Pseudomonadaceae. Elle se présente sous
forme de bacilles fins, droits ou légèrement courbés et très mobiles grâce à la présence d’un
flagelle monotriche polaire. P. aeruginosa est caractérisé par une versatilité métabolique lui
permettant d’utiliser une large variété de substrats comme source de carbone (sucres simples
et complexes, alcools, acides aminés). Le pathogène est classé comme aérobie strict avec un
métabolisme oxydatif utilisant l’oxygène comme accepteur final d’électrons. Cependant la
survie de la bactérie est observée dans des conditions anaérobies, expliquée par sa capacité à
métaboliser l’arginine (Vander Wauven et al., 1984) et le pyruvate (Eschbach et al., 2004) ou
par utilisation des nitrates comme accepteur final d’électrons (Filiatrault et al., 2005). P.
aeruginosa est capable de se développer dans un spectre de températures compris entre 4 et
Introduction
19
41 °C ; sa température optimale de croissance se situe entre 30 et 37 °C. Ces différentes
caractéristiques font de ce pathogène un microorganisme ubiquitaire retrouvé dans l’eau, les
sols, les marais, les plantes et les mammifères. La versatilité et l’adaptabilité extraordinaire du
pathogène se marque aussi par son nombre important de gènes. P. aeruginosa possède le plus
large génome bactérien séquencé. Ce génome englobe 6,3 millions de pb (Stover et al., 2000).
De nombreux gènes impliqués dans des fonctions métaboliques permettent à la bactérie de se
développer dans différents environnements, parfois très pauvres en nutriments et en font un
colonisateur redoutable. P. aeruginosa est un pathogène opportuniste capable d’infecter de
nombreux hôtes et particulièrement lors d’une diminution des défenses immunitaires, comme
en cas de brûlures ou de plaies ouvertes. Chez l’homme, P. aeruginosa peut coloniser de
nombreux tissus, notamment le tissu cutané et osseux, et des dispositifs médicaux, tels les
valves cardiaques. Il est aussi responsable d’infections ophtalmiques, du tractus urinaire et des
poumons. C’est également le pathogène le plus fréquemment responsable du décès des
patients atteints de mucoviscidose (Zemanick et al., 2011).
II.2 PATHOGENICITE DE P. AERUGINOSA
L’importante pathogénicité de P. aeruginosa est liée aux nombreux facteurs de
virulence qu’il possède. Ces facteurs de virulence sont impliqués dans les différentes étapes
du processus d'infection, dans l’attachement et la mobilité, et permettent à P. aeruginosa de
coloniser son hôte. On distingue les facteurs de virulence associés à la bactérie et les
nombreux facteurs de virulence sécrétés ou extracellulaires, dont les rôles sont
complémentaires (de Bentzmann et Plésiat, 2011).
II.2.1 Facteurs de virulence cellulaires
P. aeruginosa possède des attributs cellulaires associés à la virulence du pathogène
tels les structures impliquées dans l’adhérence et la mobilité : les flagelles, les pili de type IV
et les lipopolysaccharides (LPS).
Figure 10 : Pseudomonas aeruginosa
La bactérie P. aeruginosa possède de nombreux facteurs de virulence associés à sa
pathogénicité. Le flagelle et les pili de type IV font partie des attributs cellulaires impliqués
dans la pathogénicité de P. aeruginosa. D’après Kwangshin Kim/science photo library (figure
de gauche) et Hurlbert, R.E. (1999) (figure de droite).
Introduction
20
Les lipopolysaccharides
Les LPS sont une composante majeure de la membrane externe des bactéries à Gram
négatif. Ils sont constitués d’un lipide A, une région hydrophobe insérée dans la bicouche
phospholipidique de la membrane externe, d’un noyau oligosaccharidique et de l’antigène O,
une partie polysaccharidique variable faisant surface à la membrane externe. Les LPS de P.
aeruginosa sont un facteur de virulence majeur dans la pathogénicité de la bactérie et jouent
également un rôle clé dans l’initiation de la réponse inflammatoire et dans les interactions
avec les tissus hôtes (Pier, 2007). Les LPS de P. aeruginosa protègent le pathogène de la mort
entraînée par le complément et, durant les infections pulmonaires chroniques, les LPS aident
le pathogène à échapper aux mécanismes de défense de l’hôte (Goldberg et Pler, 1996). Le
lipide A ou endotoxine est responsable d'une stimulation excessive du système immunitaire
pouvant provoquer un choc septique et conduire à la mort (Lynn et Golenbock, 1992 ; Bricha
et al., 2009).
Le flagelle
Le flagelle, polaire chez le P. aeruginosa, permet à la bactérie de se mouvoir en
fonction des variations de l’environnement et ainsi de répondre aux signaux
environnementaux (chimiotaxie). La mobilité de la bactérie est primordiale dans le processus
de colonisation et d’infection. Le flagelle est responsable de la mobilité de type swimming et
swarming du pathogène et intervient, avec les pili de type IV, dans les stades initiaux de la
formation du biofilm (O'Toole et Kolter, 1998a ; Köhler et al., 2000). Le flagelle permet
également à la bactérie d’acquérir les nutriments (Shapiro, 1995). Il est important dans
l’établissement des infections du tractus respiratoire et peut agir dans les interactions initiales
avec la surface de l’épithélium bronchique (Feldman et al., 1998). Le flagelle intervient
notamment dans la liaison de P. aeruginosa aux mucines de la surface des cellules épithéliales
(Lillehoj et al., 2002) et se lie aux récepteurs asialoGM1 des cellules épithéliales (Feldman et
al., 1998).
Les pili de type IV
Chez P. aeruginosa, les pili de type IV ont un rôle dans les interactions cellulaires
entre la bactérie et l’hôte et, par leurs propriétés rétractiles, permettent l’attachement et la
colonisation de P. aeruginosa aux surfaces hôtes. Ils sont impliqués dans la mobilité de type
Introduction
21
twitching qui permet à la bactérie de se déplacer le long d’une surface (Mattick, 2002). Les
pili de P. aeruginosa se lient aux récepteurs asialoGM1 dont l’expression est augmentée à la
surface des cellules épithéliales chez les patients atteints de mucoviscidose (Saiman et Prince,
1993 ; Gupta et al., 1994).
II.2.2 Facteurs de virulence sécrétés
P. aeruginosa est pathogène par les nombreux facteurs de virulence qu’il sécrète : les
toxines (exotoxine A, exoenzymes S, T, Y et U), les enzymes protéolytiques (élastase LasB,
élastase LasA ou staphylolysine, protéase IV et protéase alcaline), les enzymes lipolytiques
(lipase, estérase, phopholipase C), les rhamnolipides et les chélateurs de fer ou sidérophores.
Les toxines
L’exotoxine A est une des protéines les plus cytotoxiques produites par P. aeruginosa
responsable d’infections sévères chez la souris (Miyazaki et al., 1995). L’exotoxine A est
composée d’un domaine A et d’un domaine B ; ce dernier interagit au niveau du LDL
receptor-related protein (LRP) présent à la surface de la cellule hôte. L’interaction induit
l’internalisation du domaine possédant une activité ADP-ribosyltransférase ce qui mène à la
perturbation de la synthèse protéique de la cellule infectée (Iglewski et Kabat, 1975).
L’exotoxine A cible le facteur d’élongation E2 entraînant la mort cellulaire par nécrose
(Iglewski et al., 1977 ; Wick et al., 1990). La toxine détériore également les mécanismes de
défense de l’hôte (Schultz et al., 2001) et est responsable en partie de la destruction du tissu
des voies respiratoires lors d’infections à P. aeruginosa (Baker, 1982).
La virulence de P. aeruginosa implique la sécrétion d’exotoxines via un complexe
protéique, le système de sécrétion de type III (TTSS), qui libère dans la cellule hôte les
exoenzymes ExoS, ExoT, ExoU et ExoY (Berthelot et al., 2003). La synthèse de ces
protéines effectrices est stimulée par le contact de la bactérie avec les cellules eucaryotes,
ainsi que par des signaux environnementaux (Hornef et al., 2000). Les protéines secrétées
sont transloquées dans le cytosol de la cellule hôte (Cornelis, 2006). L’ExoS est un facteur de
virulence essentiel au développement des infections aigües à P. aeruginosa. L’ExoS et l’ExoT
possèdent toutes deux une activité ADP-ribosyltransférase indispensable pour l’induction de
Introduction
22
l’apoptose dans la cellule hôte (Kaufman et al., 2000). L’ExoU possède une activité
phospholipase lui permettant de dégrader les composants de la membrane de la cellule cible
(Sato et al., 2003) et d’induire la perméabilité des cellules mammifères dont les cellules
épithéliales, les macrophages et les fibroblastes (Finck-Barbancon et al., 1997). L’activité
enzymatique de l’ExoY, une adenylate cyclase, provoque l’accumulation d’AMPc dans la
cellule cible qui induit indirectement des changements morphologiques de la cellule (Yahr et
al., 1998).
Les protéases
La présence de protéases dans les expectorations durant les exacerbations infectieuses
chez les patients atteints de mucoviscidose et chroniquement porteurs de P. aeruginosa a été
démontrée (Jaffar-Bandjee et al., 1995). Ces protéases agissent ensemble entraînant des
dommages significatifs des tissus hôtes.
L’élastase LasB de P. aeruginosa est un des facteurs les plus virulents parmi les
toxines sécrétées par la bactérie pendant une infection. Elle endommage la matrice
extracellulaire des voies respiratoires et des tissus conjonctifs en dégradant des composants de
la matrice comme l’élastine pulmonaire. L’élastine confère aux tissus (pulmonaire, vasculaire,
oculaire) des propriétés élastiques nécessaires à leurs fonctions physiologiques. Les lésions
provoquées par l’élastase mènent à des ulcérations des voies respiratoires (de Bentzmann et
al., 2000). L’enzyme perturbe les jonctions serrées des cellules de l’épithélium des alvéoles
pulmonaires (Azghani, 1996). L’élastase LasB cible également des composants du système
immunitaire notamment des composants du complément, des immunoglobulines, des
cytokines, dont le TNF-α, l’IFN-γ et certaines IL (Horvat et al., 1989 ; Theander et al., 1988 ;
Parmely et al., 1990 ; Kevin et al., 2003). Elle dégrade la protéine A du surfactant pulmonaire
(SP-A), un composant important du système immunitaire pulmonaire et de l’opsonisation,
permettant à la bactérie d’échapper à la phagocytose (Kuang et al., 2011).
L’élastase LasA dégrade l’élastine pulmonaire, potentialisant l’activité élastolytique
de l’élastase LasB et entraînant la destruction du tissu pulmonaire (Kessler et al., 1997 ; Peters
et Galloway, 1990). Les élastases LasA et LasB sont impliquées dans l’invasion par P.
aeruginosa des cellules épithéliales (Cowell et al., 2003). La protéase extracellulaire LasA
possède également une activité staphylolytique (Kessler et al., 1993), résultant en un clivage
Introduction
23
des liens des chaînes peptidoglycanes adjacentes de la paroi cellulaire de S. aureus. Cette
activité favorise l’émergence de P. aeruginosa dans les poumons des patients atteints de
mucoviscidose.
La protéase alcaline est responsable de l’évasion du pathogène du système de défense
de l’hôte par blocage de la phagocytose de P. aeruginosa par les neutrophiles humains. Elle
est également capable de supprimer la réponse immunitaire de l’hôte par inactivation de
l’IFN-γ, de TNF-α et d’autres cytokines, et par inhibition de l’activation de composants du
complément (Horvat et Parmely, 1988 ; Parmely et al., 1990 ; Hong et Ghebrehiwet., 1992 ;
Laarman et al., 2012).
La protéase IV est une enzyme impliquée dans la dégradation des protéines du
surfactant pulmonaire. Le surfactant pulmonaire a deux rôles distincts : la réduction de la
tension de surface à l’interface air-liquide et la participation à la défense immunitaire innée de
l’hôte. Par la dégradation du surfactant pulmonaire, la protéase IV inhibe les fonctions
biophysiques du surfactant et la réponse de l’hôte (Malloy et al., 2005).
Phospholipase C
P. aeruginosa sécrète des phospholipases C extracellulaires, dont une phospholipase C
possédant une activité hémolytique, PlcH, et une non hémolytique, PlcN (Ostroff et al., 1990).
Au niveau des poumons, PlcH participe à la dégradation du surfactant pulmonaire, riche en
phosphatidylcholine, favorisant la colonisation bactérienne. L’implication directe de PlcH
dans l’altération de la fonction du poumon de l’hôte a été récemment démontrée (Wargo et al.,
2011).
Les rhamnolipides
Les rhamnolipides sont des glycolipides extracellulaires amphiphiles produits par P.
aeruginosa et utilisés par cette bactérie comme facteur de virulence (Favre-Bonté et al.,
2003). Ils sont composés de rhamnose et d’acides gras hydrophobes. Ils sont produits lors de
la formation du biofilm et sous le contrôle du QS (Pearson et al., 1997). Leur rôle
physiologique consiste au maintien de l’architecture du biofilm et particulièrement des canaux
aqueux traversant la structure (Davey et al., 2003). Ils possèdent un pouvoir détergent sur les
phospholipides du surfactant pulmonaire les rendant ainsi plus accessibles aux phospholipases
Figure 11 : Facteurs de virulence de P. aeruginosa
La pathogénicité de P. aeruginosa est multifactorielle et implique des facteurs cellulaires
associés à la mobilité et à l’adhésion de la bactérie. De nombreux facteurs extracellulaires
sécrétés par la bactérie contribuent à la survie du pathogène et aux lésions tissulaires. Adapté
d’après Van Delden et Iglewski, 1998.
Introduction
24
bactériennes. Ils altèrent la jonction entre les cellules épithéliales des voies respiratoires et
favorisent l’infiltration des épithéliums humains des voies aériennes par P. aeruginosa
(Zulianello et al., 2006). Ils ont également un rôle dans la résistance du biofilm de P.
aeruginosa à la défense de l’hôte. On a mis récemment en évidence une activité
antibactérienne envers S. aureus et K. pneumoniae des rhamnolipides produits par P.
aeruginosa OBP1, une souche isolée à partir de boues de pétrole. Les rhamnolipides altèrent
l’enveloppe bactérienne provoquant des dommages cellulaires et augmentant la perméabilité
membranaire (Bharali et al., 2013). La capacité des bactéries à produire des biosurfactants
avec des propriétés antimicrobiennes pourrait être une stratégie de survie dans un
environnement en compétition.
Autres facteurs de virulence
Le P. aeruginosa est responsable de la production de deux pigments qui diffusent dans
le milieu de culture: la pyocyanine (pigment bleu) et la pyoverdine (pigment jaune-vert).
Cette dernière est un sidérophore permettant la capture et le transport du fer, élément essentiel
à la survie et à la persistance bactérienne à l’intérieur de l’hôte (Takase et al., 2000). L’apport
en fer favorise la production de radicaux toxiques à action bactéricide envers d’autres espèces.
P. aeruginosa favorise ainsi son émergence parmi les autres souches. La pyocyanine est
abondamment sécrétée dans les expectorations des patients atteints de mucoviscidose infectés
par P. aeruginosa. La cytotoxicité de la pyocyanine sur cellules humaines résulte entre autres
de ses propriétés oxydoréductrices. Le pigment oxyde le glutathion réduit qui perd alors son
rôle d’antioxydant cellulaire. Ces altérations entraînent des lésions au niveau des cellules
épithéliales liées au stress oxydatif (O’Malley et al., 2004). La survie de la bactérie est aussi
liée à la répression de la réponse inflammatoire de l’hôte par la pyocyanine. Le pigment
accélère et induit l’apoptose des neutrophiles (Allen et al., 2005).
Figure 12 : Système de QS de type LuxI/LuxR
Les molécules auto-inductrices AHL (cercles bleus) sont produites par la protéine synthase
LuxI et forment un complexe avec la protéine régulatrice LuxR pour activer l’expression de
gènes cibles. Figure A : En présence d’une densité cellulaire faible, la concentration en AHL
intra- et extracellulaire est faible, et l’activation de LuxR minimale. Figure B : En présence
d’une densité bactérienne importante, les AHLs se lient à LuxR et entraînent l’expression des
gènes cibles (Jayaraman et Wood, 2008).
A B
Introduction
25
II.3 LE QUORUM SENSING
Le QS est un mécanisme de communication cellulaire complexe entre les cellules
dépendant de la densité bactérienne. Le système repose généralement sur la synthèse, la
diffusion, la détection et la réponse à de petites molécules signal détectées par la bactérie et
responsables de l’adaptation et de la régulation de nombreuses fonctions physiologiques.
II.3.1 Quorum sensing de type LuxI/LuxR
Le phénomène de QS a été décrit pour la première fois chez la bactérie
bioluminescente V. fischeri. Depuis, il a été identifié chez des espèces bactériennes à Gram
positif et négatif. Le système de QS utilisé chez les bactéries à Gram négatif repose
typiquement sur le système d’homologues de type LuxI/LuxR, utilisant généralement des
auto-inducteurs acylhomosérine lactone (AHL) comme molécules signal. Les AHLs produits
par une bactérie diffèrent par la longueur et la substitution de leurs chaînes d’acide gras
(Favre-Bonté et al., 2003). Ils sont produits en grande quantité et s’accumulent dans
l’environnement quand la densité de la population bactérienne est élevée (Schaber et al.,
2007). En réponse à l’augmentation de la concentration locale des AHL, la bactérie modifie
l’expression de certains gènes.
Dans les systèmes de QS de type LuxI/LuxR, l’homologue LuxI est une synthase
responsable de la production de la molécule auto-inductrice AHL. En présence de
concentrations importantes en AHL, les molécules se lient au facteur de transcription
cytoplasmique LuxR et permettent la liaison du complexe à l’ADN et la transcription des
gènes cibles. Généralement, le complexe AHL/LuxR active également l’expression de luxI
résultant en une amplification du système par auto-induction.
Figure 13 : Structures des molécules auto-inductrices exploitées par les
systèmes de QS de P. aeruginosa
P. aeruginosa possède deux systèmes de QS majeurs impliquant la diffusion des
acylhomosérines lactones 3-oxo-C12-HSL et C4-HSL, pour les systèmes las et rhl
respectivement. Un troisième système de QS chez P. aeruginosa exploite le PQS.
Introduction
26
II.3.2 Quorum sensing chez P. aeruginosa
Le QS est donc un mécanisme d’adaptation et de régulation de la pathogénicité du P.
aeruginosa. L’expression, la production et/ou la sécrétion de nombreux facteurs de virulence
extracellulaires de P. aeruginosa sont contrôlées par le système de signal intercellulaire QS
(Favre-Bonté et al., 2003). Les deux principales molécules d’AHLs connues chez le
pathogène, le N-(3-oxododecanoyl)-L-homosérine lactone (3-oxo-C12-HSL) et le N-butyryl-
L-homosérine lactone (C4-HSL) ont la propriété de diffuser d’une bactérie à l’autre et de
traverser facilement les membranes bactériennes. D’autres molécules d’AHL ont également
été découvertes en très faibles quantités (Ruimy et Andremont, 2004). Un troisième signal
intercellulaire a été mis en évidence chez P. aeruginosa qui n’appartient pas à la classe des
homosérines lactones, mais qui est une quinolone, le Pseudomonas quinolone signal (PQS)
(Pesci et al., 1999).
Trois systèmes de QS sont présents chez P. aeruginosa : deux circuits de QS de type
LuxI/LuxR, le système las (LasI/LasR) et le système rhl (RhlI/RhlR), et un troisième circuit
de type non- LuxI/LuxR appelé le Pseudomonas quinolone signal (PQS) (Rutherford et
Bassler, 2012).
Dans le système las, le gène lasR code pour une protéine régulatrice LasR, homologue
de LuxR, et le gène lasI code pour une enzyme auto-inducteur synthase LasI, homologue de
LuxI, nécessaire à la synthèse d’un type d’AHL: le 3-oxo-C12-HSL. Au cours de la croissance
bactérienne, on observe une augmentation de la synthèse des AHL. Lorsque la quantité de ces
molécules dépasse un seuil donné, témoin d’une densité bactérienne élevée, les AHLs se lient
à la protéine régulatrice et activent la transcription de plusieurs facteurs de virulence et ce de
manière synchrone dans toute la population bactérienne. Cette activation permet donc
d’amplifier et de synchroniser la virulence à l’ensemble de la population bactérienne. Le 3-
oxo-C12-HSL forme un complexe activateur avec la protéine LasR permettant d’amplifier et
de coordonner l’expression de gènes de virulence par activation de leur transcription. La
protéine régulatrice contient deux domaines fonctionnels. Le premier, situé au niveau de la
région N-terminale de la protéine, est la région de liaison à la molécule auto-inductrice. La
portion C-terminale est responsable de la liaison de la protéine aux promoteurs cibles (Choi et
Greenberg, 1991). Après liaison à la molécule signal, LasR se dimérise, se lie à l’ADN et
active la transcription (Kiratisin et al., 2002; Schuster et al., 2004). Le complexe 3-oxo-C12-
Introduction
27
HSL/LasR active notamment la transcription des gènes lasB, lasA, aprA, codant
respectivement pour la synthèse de deux élastases et d’une protéase alcaline, et toxA codant
pour une exotoxine. Le complexe cible également le gène lasI, ce qui induit une amplification
du système par auto-induction (Seed et al., 1995), et le gène rhlI (Pesci et al., 1997).
Récemment, de multiples fonctions de 3-oxo-C12-HSL, en plus de son effet de
régulateur de gènes, ont été suggérées par l’interaction de la molécule auto-inductrice avec
des cellules de l’hôte (Davis et al., 2010). Ces fonctions interviennent dans la persistance du
pathogène dans les poumons de l’hôte et affectent la réponse immunitaire de l’hôte, par
augmentation de la régulation de gènes inflammatoires, exacerbant la maladie et l’infection
liée à P. aeruginosa (Jahoor et al., 2008). Ainsi l’homosérine lactone 3-oxo-C12 stimule la
production d’IL-8 dans les voies aériennes (Smith et al., 2001). Elle modifie la fonction et
induit l’apoptose des mastocytes (Li et al., 2009), des macrophages et des neutrophiles
(Tateda et al., 2003). De plus, la molécule auto-inductrice provoque des perturbations au
niveau des mitochondries et du réticulum endoplasmique des macrophages alvéolaires et des
cellules épithéliales des bronches. Elle active l’apoptose de cellules épithéliales des voies
aériennes (Schwarzer et al., 2012). La molécule 3-oxo-C12-HSL augmente également la
sécrétion des ions chlore et de fluides par la protéine CFTR des cellules épithéliales de l’arbre
trachéo-bronchique. Lors de l’absence ou d’un défaut du canal CFTR, 3-oxo-C12-HSL ne peut
affecter la sécrétion des ions chlore et des fluides et compromet la capacité de l’hôte à
éliminer rapidement la bactérie des voies aériennes (Schwarzer et al., 2010).
Dans le système rhl, l’enzyme auto-inducteur synthase impliquée dans la synthèse du
C4-HSL, est la protéine Rh1I codée par le gène rhlI. Le système rhl comprend également une
protéine régulatrice, RhlR, qui lorsqu’elle est associée au C4-HSL contrôle la transcription des
gènes lasB, lasA, aprA, pyc, rhlI et rhlAB. Ces deux derniers sont impliqués dans la
production des rhamnolipides qui ont un rôle dans la pathogénicité de la bactérie. Le gène pyc
code pour la production de pyocyanine (Ruimy et Andremont, 2004). Parmi les cibles du
complexe C4-HSL/RhlR, le gène rhlI mène à une auto-induction du circuit (Rutherford et
Bassler, 2012).
Un homologue à LasR-RhlR, QscR, pour lequel il n’y a pas de partenaire homologue à
LuxI, a également été mis en évidence chez P. aeruginosa (Lequette et al., 2006 ; Oinuma et
Figure 14 : Les systèmes de QS de P. aeruginosa
Les trois synthases, LasI, RhlI et PqsABCDH, produisent respectivement les molécules auto-
inductrices 3-oxo-C12-HSL, C4-HSL et PQS. Les molécules de signalisation sont détectées par
les facteurs de transcription cytoplasmique, LasR, RhlR et PqsR, respectivement. Chaque
facteur de transcription régule l’expression de sa synthase correspondante ainsi que des cibles
supplémentaires indiquées par les flèches (Rutherford et Bassler, 2012).
Introduction
28
Greenberg, 2011). Bien que cette protéine ne soit pas associée à une auto-inducteur synthase,
il a été montré qu’elle pouvait répondre à des signaux AHL notamment l’AHL générée par
LasI (3-oxo-C12-HSL). La protéine QscR est un régulateur clé d’un sous-ensemble de gènes
contrôlés par le QS (Lequette et al., 2006).
P. aeruginosa utilise un système additionnel, de type non LuxI/LuxR pour contrôler
l’expression des gènes de facteurs de virulence. Le signal a été identifié comme le composé 2-
heptyl-3-hydroxy-4-quinolone et désigné le Pseudomonas quinolone signal (PQS) (Pesci et
al., 1999). PQS est détecté par le régulateur PqsR (Rutherford et Bassler, 2012). La synthèse
de PQS requiert de nombreux gènes (PqsABCDH). La synthèse de PQS est en réalité sous la
dépendance des systèmes LasI/R (effet positif) et RhlI/R (effet négatif) qui contrôlent
l’expression du gène pqsR (Wade et al., 2005). Le signal PQS contrôle l’expression de
multiples gènes impliqués dans la virulence (élastase, rhamnolipides et pyocyanine) et
fonctionne comme régulateur entre les deux premiers systèmes de QS. Le complexe PqsR-
PQS auto-induit la synthèse de PQS et active l’expression de rhlI et rhlR (Diggle et al., 2007).
Les gènes lasB et rhlI sont régulés coopérativement par PQS et C4-HSL (McKnight et al.,
2000).
La hiérarchisation du système QS a souvent positionné le système las au sommet
(Pesci et al., 1997). Cependant hiérarchiser le QS semble beaucoup plus complexe (Dekimpe
et Déziel, 2009). Il a été démontré que le système rhl peut être activé indépendamment du
système las (Diggle et al., 2007). RhlR est en effet capable de surmonter l’absence de las par
l’activation de fonctions spécifiques contrôlées par LasR, incluant la production de 3-oxo-C12-
HSL et de PQS. P. aeruginosa est ainsi capable de contourner un déficit dans un système de
QS en permettant à un autre système de prendre la relève (Dekimpe et Déziel, 2009).
Figure 15 : Maladies infectieuses humaines provoquées par des biofilms bactériens
(1) Sinusite chronique ; (2) Infection de shunt cérébral ; (3) Kératite associée aux lentilles de
contact ; (4) Otite moyenne chronique ; (5) Infection d’implant cochléaire ; (6) Infection de
brûlure ; (7) Infection de cathéter intravasculaire ; (8) Infection de valve artificielle
cardiaque ; (9) Infection de pacemaker ; (10) Infection de matériel électrophysiologique
cardiaque ; (11) Infection de cathéter biliaire ; (12) Infection de cathéter de dialyse
péritonéale ; (13) Infection de prothèse articulaire ; (14) Infection de cathéter urinaire ; (15)
Infection de stent intravasculaire ; (16) Infection pulmonaire chez les patients atteints de
mucoviscidose ; (17) Pneumopathie liée à la ventilation artificielle ; (18) Infection d’implant
mammaire (del Pozo et Patel, 2007).
Introduction
29
III. LE BIOFILM
III.1 LE BIOFILM : UN MODE DE VIE PARTICULIER
La notion de biofilm a été avancée pour la première fois par Costerton, par
l’observation d’agrégats bactériens présents sur les roches d’un courant alpin (Geesey et al.,
1977) et par Høiby qui observe des agglomérats de bactéries dans les expectorations de
patients atteints de mucoviscidose (Høiby, 1977). Ils sont les premiers à percevoir l’impact de
ce comportement bactérien dans les infections (Bjarnsholt et al., 2012).
La formation d’un biofilm est un mode commun de développement bactérien dans la
nature (Ikuma et al., 2013). La présence des biofilms affecte de nombreux aspects de notre vie
et il a été estimé que 99 % de l’ensemble des bactéries dans un environnement naturel existent
sous forme d’un biofilm ou au moins résident sur une surface (Costerton et al., 1987). Le
biofilm consiste en une communauté de microorganismes adhérant entre eux et enrobés par la
sécrétion d’une matrice aux propriétés adhésives et protectrices. L’impact des biofilms est
négatif dans de nombreux domaines et particulièrement pour les biofilms associés aux aspects
médicaux. Les biofilms sont ainsi impliqués dans le développement d’infections chroniques
de différents tissus notamment au niveau du tractus digestif, respiratoire et urinaire. Les
problèmes liés aux implants médicaux sont également une préoccupation importante pour la
santé. Les biofilms se développent à la surface des cathéters et des lentilles de contact. Ils se
forment sur des pacemakers, des valves cardiaques, des prothèses articulaires et autres
implants chirurgicaux. Le Center for Disease Control (CDC) estime que 65 % des infections
nosocomiales sont causées par un biofilm. D’après le United States National Institute of
Health (NIH), 80 % des infections chroniques sont liées à la formation d’un biofilm (Monroe,
2007).
Figure 16 : Biofilm de Pseudomonas aeruginosa
Représentation d’un biofilm de P. aeruginosa au microscope électronique à balayage. Les
bactéries sont colorées en brun, la matrice extracellulaire en bleu-vert. La bactérie est un
pathogène opportuniste fréquemment rencontré dans les infections nosocomiales (Lal et
Berry, 2012). P. aeruginosa colonise les poumons des patients atteints de mucoviscidose sous
la forme de biofilms conférant à la bactérie une grande résistance aux antibiotiques et aux
mécanismes de défense immunitaire de l’hôte (CDC and Prevention's Public Health Image
Library #10043).
Introduction
30
Les unités structurelles de base du biofilm sont les micro-colonies. En fonction de
l’espèce impliquée, la micro-colonie peut être composée entre 10 à 25 % de cellules et entre
75 à 90 % d’une matrice d’exopolysaccharides (Tenke et al., 2006). La matrice renforce la
structure du biofilm, elle fixe les cellules au sein du biofilm, tout en lui conférant une grande
élasticité et procure aux organismes un environnement dense et protecteur, permettant aux
bactéries y résidant d’interagir et de coopérer. La formation de biofilms multi-espèces
participe à la complexité de ce mode de développement. Les biofilms de la plaque dentaire
peuvent ainsi enfermer des centaines d’espèces différentes formant un biofilm extrêmement
complexe à la surface des dents et des gencives (Wall-Manning, 2012).
III.2 LA MATRICE DU BIOFILM DE P. AERUGINOSA
Chez P. aeruginosa, la matrice représente 85 % du volume total du biofilm. Les
bactéries élaborent une matrice gélatineuse composée d’eau, d’exopolysaccharides, de
protéines, de lipides et d’acides nucléiques (ADN extracellulaire) (Jahn et Nielsen, 1998).
Lors du développement et de la croissance du biofilm, les bactéries présentent des
comportements différents. Les bactéries situées plus profondément dans le biofilm cessent de
produire les exopolysaccharides et adoptent un état quasi dormant. Au contraire, les bactéries
situées en périphérie de la structure croissent à plus grande vitesse et sont responsables de la
production d’une grande quantité d’exopolysaccharides.
Trois exopolysaccharides majeurs sécrétés par P. aeruginosa contribuent à
l’architecture du biofilm (Ghafoor et al., 2011). L’alginate, un polymère d’acide
mannuronique et d’acide guluronique (Evans et Linker, 1973), est le composant principal de
la matrice du biofilm formé par P. aeruginosa (Parsek et Tolker-Nielsen, 2008). Il favorise
l’adhérence des bactéries aux cellules épithéliales et aux mucines et les protège du système
immunitaire (Kukavica-Ibrulj, 2007). Le polysaccharide visqueux représente un facteur de
virulence de la bactérie par le caractère mucoïde qu’il lui confère. On observe dans les
infections pulmonaires chroniques de patients atteints de mucoviscidose, une transition de P.
aeruginosa d’un phénotype non mucoïde vers un phénotype mucoïde (surproduction
d’alginate), correspondant à une détérioration clinique significative du patient (Govan et
Deretic, 1996). Des souches déficientes dans la synthèse d’alginate développent un biofilm
avec une proportion plus faible de cellules vivantes, soulignant un rôle de l’alginate dans la
Figure 17 : ADN extracellulaire dans la matrice du biofilm de P. aeruginosa
Les images représentent des sections horizontales d’un biofilm de la souche ATCC PAO1
exprimant la GFP (A), l’ADN extracellulaire rouge marqué par l’agent fluorescent DDAO [7-
hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one)] (B) et une superposition des deux
images (C) (Allesen-Holm et al., 2006).
Introduction
31
viabilité cellulaire au sein du biofilm (Ghafoor et al., 2011). Deux autres polysaccharides ont
une contribution importante dans la matrice du biofilm de P. aeruginosa, le Psl et le Pel
(Lembre et al., 2012). Le Psl est riche en mannose et est produit durant le mode planctonique
où il intervient dans l’étape d’attachement initial des souches et la formation des micro-
colonies. Il contribue également au maintien de la structure du biofilm à des stades de
développement plus avancés en maintenant les cellules sous forme d’agrégats (Ma et al.,
2009). En plus de ses fonctions majeures dans la structure du biofilm, le Psl agit comme un
signal pour stimuler davantage de production de polysaccharide (Irie et al., 2012). Le Pel est
également important pour le maintien de la structure du biofilm mature (Parsek et Tolker-
Nielsen, 2008). Le polysaccharide est riche en glucose et joue un rôle dans la densité
cellulaire du biofilm et/ou de la compacité du biofilm (Ghafoor et al., 2011). Il intervient dans
les interactions entre cellules en fournissant un échafaudage pour la communauté dans les
premiers stades de la formation du biofilm.
L’ADN extracellulaire est également un composant majeur de la matrice du biofilm de
P. aeruginosa dans lequel il a un rôle de connecteur intercellulaire et est requis pour maintenir
l’intégrité du biofilm (Flemming et Wingender, 2010). Chez P. aeruginosa, l’ADN
extracellulaire provient de la lyse d’une population bactérienne, sous le contrôle du QS
(Montanaro et al., 2011). L’adhésion des bactéries ou la formation du biofilm de P.
aeruginosa peut ainsi être inhibée par une DNase (Swartjes et al., 2013 ; Whitchurch et al.,
2002). Des biofilms matures formés par des souches cliniques de P. aeruginosa sont
également dissous après traitement par une DNase corroborant l’importance de l’ADN
extracellulaire dans le biofilm de P. aeruginosa (Nemoto et al., 2003).
III.3 LES ETAPES DE LA FORMATION DU BIOFILM DE P. AERUGINOSA
Ces dernières années, la modélisation de l'infection par biofilm in vitro a conduit à
l'identification des déterminants microbiens qui régissent le développement du biofilm. Le
mécanisme de la formation du biofilm de P. aeruginosa peut être décrit comme un processus
dynamique impliquant 5 stades successifs (Sauer et al., 2002 ; Renner et Weibel, 2011 ; Kim
et al., 2012). Le développement du biofilm est initié par l’attachement réversible de cellules
planctoniques à une surface. La seconde étape est une adhésion irréversible des souches dans
Figure 18 : Modèle des étapes de la formation du biofilm
La première étape correspond à l’attachement réversible puis irréversible des cellules
bactériennes à la surface. Cette étape est suivie d’une multiplication bactérienne accompagnée
de la production de polymères extracellulaires. La production de polymères extracellulaires
s’amplifie et les cellules perdent une partie des appendices de mobilité. Enfin, la maturation
complète du biofilm est atteinte marquée par une architecture complexe. Une surexpression de
la motilité, débutant dans le centre du biofilm, aide à la dispersion. Lors de la phase de
dispersion, les cellules individuelles mobiles s’échappent de la micro-colonie (Sauer, 2003).
Introduction
32
les heures suivantes et ensuite la multiplication des bactéries. Les bactéries commencent à
s’entourer d’une matrice polymérique qu’elles produisent et forment des micro-colonies. Par
une production supplémentaire de substances polymériques, par motilité cellulaire et par
différentiation phénotypique, les bactéries élaborent un biofilm mature, épais et structuré. Une
phase suit où des régions du biofilm se dissolvent et les cellules libérées se dispersent pouvant
ainsi coloniser de nouvelles surfaces. Actuellement nous manquons cependant d'informations
pour savoir si les mécanismes de formation de biofilm identifiés in vitro sont pertinents pour
le développement in vivo (Joo et Otto, 2012).
Adhésion réversible
L’étape initiale de la formation du biofilm est une adhésion réversible des bactéries
planctoniques à une surface naturelle (minérale, végétale, animale) ou artificielle en réponse à
des signaux environnementaux ou nutritionnels (Filloux et Vallet, 2003). A ce stade, P.
aeruginosa est transitoirement fixé au substrat et est capable de se détacher librement (Sauer
et al., 2002). Les bactéries planctoniques s’approchent des surfaces par l’intervention de la
mobilité bactérienne ou sous l’influence des forces physiques comme les forces d’attraction
de van der Waals, les charges électrostatiques de surfaces et des interactions hydrophobes
(Donlan, 2002 ; Kim et al., 2012). Le flagelle de P. aeruginosa s’avère très important dans
l’étape de l’approche au support (O'Toole et Kolter, 1998a). Il confère à la bactérie la capacité
de se déplacer selon une mobilité de type swimming et swarming (Köhler et al., 2000).
L’adhésion initiale des bactéries à la surface fait également intervenir des adhésines dont les
facteurs d’attachement de type fimbriae. Cependant, les étapes initiales de la formation d’un
biofilm in vivo ne sont pas encore claires. Les biofilms peuvent facilement se former sans
attachement initial à une surface solide et de nombreuses infections chroniques se
développent en absence d’une surface (Bjarnsholt et al., 2012).
Adhésion irréversible
Après une adhésion transitoire des bactéries, l’intervention des pili de type IV permet
une adhésion permanente avec la surface ou avec d’autres microorganismes. Les pili de type
IV sont des structures fibrillaires présentes chez certaines bactéries à Gram négatif dont le P.
aeruginosa et sont impliqués dans un type particulier de mobilité associée à la surface, la
mobilité de type twitching, caractérisée par l’extension et la rétraction du pilus. Cette fonction
permet aux pili de type IV l’approche et la colonisation de la surface (O'Toole et Kolter,
Introduction
33
1998a). Ainsi différents organites extracellulaires, le flagelle, les pili de type IV et les
fimbriae, sont essentiels à la formation du biofilm et ce, plus particulièrement dans sa phase
initiale. L’attachement des bactéries déclenche la régulation génétique à induire la formation
du biofilm et est caractérisé par l'expression des substrats extracellulaires polymériques (SEP)
(Renner et Weibel, 2011).
Maturation primaire
Après l’étape de colonisation de la surface, on observe une prolifération des bactéries
qui donne lieu à la formation des micro-colonies. La formation des micro-colonies est un
mécanisme d’agrégation cellulaire qui nécessite une mobilité bactérienne obtenue par les pili
de type IV. Les bactéries secrètent une matrice d’exopolymères dans laquelle elles
s’encapsulent et qui forme une barrière physique entre la communauté et l’environnement
extracellulaire (Renner et Weibel, 2011).
Maturation secondaire
Les micro-colonies se différencient et permettent la maturation du biofilm par les
cellules qui se répliquent et les SEP qui s’accumulent. Ainsi les bactéries se multiplient
imbibées dans une matrice d'exopolysaccharides. Ce stade implique l’intervention du QS
(production de rhamnolipides), la production d’exopolysaccharides ainsi que la répression de
l’expression des différents appendices de mobilité (flagelle et pili de type IV) (Kukavica-
Ibrulj, 2007 ; Ruimy et Andremont, 2004). Les bactéries émettent des signaux moléculaires
propres au QS. Lorsque la concentration de ces signaux atteint une valeur seuil, la
transcription des gènes codant pour les protéines impliquées dans la production de
rhamnolipides et d’exopolysaccharides est activée. La synthèse des exopolysaccharides est
indispensable au « cimentage » de l’adhésion des bactéries aux surfaces et aux autres cellules
bactériennes dans le biofilm en développement (facteurs d’adhésion). Les souches de P.
aeruginosa déficientes en un système de QS fonctionnel sont moins virulentes que les souches
sauvages et forment des biofilms plats, moins stables et indifférenciés (Davies et al., 1998).
Bien que le QS coordonne la différentiation et la maturation des biofilms in vitro, un type
sauvage de P. aeruginosa déficient en système de QS a formé des biofilms similaires in vivo
(Schaber et al., 2007).
Introduction
34
Le rôle de la migration cellulaire dans la formation des biofilms a notamment été
étudié par Parsek et ses collègues. Ils constatent qu’une population bactérienne à grande
mobilité de surface forme un biofilm plat, horizontal et homogène, tandis qu’une population
ayant rapidement cessé de migrer forme un biofilm caractérisé par des agrégats. En réalité,
après l’attachement des bactéries à la surface, la communauté bactérienne se divise en deux
sous-populations: l’une non mobile et l’autre mobile, via son flagelle et ses pili de type IV.
Les premières micro-colonies sont formées par des cellules non mobiles qui prolifèrent à des
positions fixes et forment la base du biofilm. La sous-population mobile migre alors, à l’aide
des flagelles et pili de type IV, et colonise la base du biofilm pour former la périphérie de la
structure (Parsek et Tolker-Nielsen, 2008).
Lors de la maturation secondaire, les biofilms atteignent leur épaisseur maximale.
L’architecture du biofilm est variable et peut correspondre à un biofilm plat (une couche
homogène de cellules) ou à un biofilm hautement organisé avec une structure en champignon
contenant des canaux qui semblent essentiels pour fournir des nutriments aux cellules dans les
couches profondes du biofilm (Wimpenny et al., 2000). Cette structure indique qu’en plus des
facteurs d’adhésion (composants de la matrice qui interviennent dans l’agrégation), la
maturation du biofilm requiert des facteurs pertubateurs (par exemple, les rhamnolipides) (Joo
et Otto, 2012).
La structure tridimensionnelle du biofilm est influencée par des conditions physiques,
comme la vitesse du flux du milieu dans lequel le biofilm se développe, et des facteurs
biologiques (sources nutritives, mobilité bactérienne, surfactants) (Karatan et Watnick, 2009).
Dans le but de trouver une nouvelle source de nutriments, les micro-colonies s’organisent en
rangs horizontaux et forment des biofilms minces. La source en carbone du milieu influence
également l’architecture du biofilm. La souche ATCC PAO1 développe un biofilm plat et
compact lorsqu’elle est en présence de citrate et de casaminoacides comme source de carbone,
alors qu’elle forme un biofilm irrégulier avec une structure en champignon lorsque le glucose
est utilisé comme source de carbone (Klausen et al., 2003).
Détachement
Après 9 à 12 jours de formation du biofilm, une phase de dispersion des bactéries à
l’état planctonique est possible en réponse à des perturbations externes comme des forces de
Introduction
35
frottement provenant de l’écoulement d’un fluide (Choi et Morgenroth, 2003). Cette étape
implique la dispersion de cellules individuelles de la matrice du biofilm et le détachement du
film par érosion (Kim et al., 2012). Cependant Sauer et ses collègues suggèrent qu’il pourrait
s’agir d’un processus actif pour lequel le biofilm est programmé, permettant la colonisation de
nouvelles niches par les bactéries libérées. Les bactéries au sein des micro-colonies
s'éloignent en effet activement de la partie intérieure des amas cellulaires (Sauer et al., 2002).
A côté du processus d’une dispersion passive du biofilm par des paramètres hydrodynamiques
(force de frottement), une dispersion active du biofilm existe impliquant un réseau complexe
de signaux et régulateurs qui induisent l’activation concertée de la mobilité (pili de type IV et
rhamnolipides) et de la dégradation de la matrice. Le processus actif permet aux bactéries qui
n’ont plus accès aux nutriments ou souffrent d’une accumulation de déchets d’échapper au
micro-environnement devenu défavorable (Karatan et Watnick, 2009). Lors du mécanisme de
détachement, les bactéries récupèrent leur motilité, produisent des surfactants (Boles et al.,
2005) et sécrètent des protéases qui digèrent la matrice du biofilm, libérant les bactéries qui
peuvent initier la formation de nouvelles colonies à de nouvelles localisations (Monds et
O'Toole 2009 ; Karatan et Watnick, 2009). Ces bactéries individualisées dans le milieu
externe sont facilement phagocytées par les cellules inflammatoires qui entourent la micro-
colonie et sont sensibles aux antibiotiques, tandis qu’elles sont protégées dans le biofilm.
III.4 LES MECANISMES DE RESISTANCE DU BIOFILM DE P.
AERUGINOSA
Le biofilm confère aux bactéries un environnement micro-protecteur les protégeant
des antibiotiques et des mécanismes de défense de l’hôte.
III.4.1 La résistance du biofilm envers les agents antimicrobiens
La résistance conférée par le biofilm est multifactorielle. Différents mécanismes
contribuent à la résistance du biofilm envers les agents antimicrobiens (Høiby et al., 2010b).
La production d’une matrice d’exopolysaccharides, lors du développement des micro-
colonies, a souvent été considérée comme une barrière physique difficile à franchir limitant la
pénétration de certains agents antimicrobiens à travers la structure du biofilm et donc le
Figure 19 : Mécanismes de résistance du biofilm de P. aeruginosa
Les mécanismes de résistance peuvent inclure une pénétration et diffusion limitées de l’agent
antibactérien dans la matrice organique du biofilm. Les bactéries dans le biofilm peuvent
également sécréter des β-lactamases dans le milieu environnant et/ou augmenter l'expression
de pompes à efflux. L'activation des systèmes de QS ainsi que les différents gradients de
concentration en nutriments, oxygène et déchets métaboliques apportent également une
contribution à la tolérance aux antibiotiques. La présence de bactéries persistantes qui sont
résistantes à la destruction par tous les antibiotiques sont aussi responsables d'infections
récalcitrantes (Dufour et al., 2012).
Introduction
36
contact des bactéries avec les agents antimicrobiens (Costerton, 2001). Les polymères
extracellulaires diminuent la vitesse de transport de la molécule vers la bactérie ou
interagissent avec l’agent antimicrobien et inhibent son action. Cependant malgré que l’échec
de certains antibiotiques à pénétrer dans le biofilm ait souvent été avancé comme une
explication pour la résistance des biofilms à la thérapie antimicrobienne (Drenkard, 2003 ;
Donlan et Costerton, 2002), des mesures directes de pénétration des antibiotiques
(daptomycine et nisine) ne supportent pas cette hypothèse (Stewart et al., 2009 ; Davison et
al., 2010).
Costerton et ses collaborateurs ont mis en évidence la présence de niches au niveau du
biofilm où les bactéries existent à l’état dormant et protégé (Costerton, 1999 ; Costerton et al.,
1999). Au sein du biofilm, les micro-colonies sont séparées par un réseau de canaux
permettant, d’une part, d’acheminer l’oxygène et les nutriments à l’intérieur du biofilm et,
d’autre part, d’évacuer les déchets. Ainsi un gradient en nutriments et en oxygène se
développe du sommet à la base du biofilm et affecte la vitesse de croissance et l’activité
métabolique des bactéries. L’accessibilité restreinte aux substances nutritives et à l’oxygène
des bactéries se trouvant à la base du biofilm forme ainsi une sous-population
métaboliquement non active et non multiplicative. Comme la plupart des antibiotiques ciblent
principalement des cellules métaboliquement actives, il a été suggéré que l’hétérogénéité
métabolique des bactéries dans le biofilm mène à des différences de susceptibilité aux agents
antimicrobiens (Aaron et al., 2002 ; Parsek et Tolker-Nielsen, 2008). De plus, les bactéries au
centre du biofilm entrent dans une phase stationnaire-dormante (avec une croissance ralentie
ou une absence de croissance). Les bactéries avec un taux de croissance ralenti diminuent
également la susceptibilité du biofilm aux agents antimicrobiens. Des taux de croissance très
faibles de biofilm de P. aeruginosa ont en effet été mesurés dans les expectorations de
patients atteints de mucoviscidose (Yang et al., 2008).
Les cellules persistantes représentent une petite sous-population de cellules qui entrent
spontanément dans un état-dormant et ne se divisent pas. Ces bactéries persistantes sont très
tolérantes aux antibiotiques : même lorsque les biofilms sont traités pendant des temps
prolongés ou avec des concentrations élevées en agent antimicrobien, une petite fraction de
population persiste (Lewis, 2012). Des souches de P. aeruginosa persistantes ont été
sélectionnées chez des patients atteints de mucoviscidose et suggèrent qu’un lien existe entre
Introduction
37
ces cellules et les infections récalcitrantes chez ces patients (Mulcahy et al., 2010).
Les conditions environnementales fournies par le biofilm induisent également
l’apparition de variants phénotypiques contribuant à la résistance des bactéries envers les
agents thérapeutiques. Dès les premiers stades de l’adhésion des bactéries à un support, celles-
ci sont soumises à des modifications de l’expression des gènes (Costerton et al., 1999). Sauer
et ses collègues observent chez P. aeruginosa une modification de l’expression de
nombreuses protéines lors du passage de la bactérie de l’état planctonique à celui du biofilm
(Sauer et al., 2002). Certains gènes nouvellement activés sont responsables d’une
modification du profil des protéines composant la membrane externe (Tenke et al., 2006).
Hancock et Speert observent chez P. aeruginosa une résistance intrinsèque résultant d’une
perméabilité restreinte de la membrane externe (Hancock et Speert, 2000). La proximité des
bactéries dans la structure leur permet le transfert d’informations génétiques (transfert
horizontal de gènes) au sein du biofilm à des fréquences très élevées avec pour conséquence
un taux de mutation plus important que chez les bactéries isogéniques en mode planctonique
(Molin et Tolker-Nielsen, 2003 ; Driffield et al., 2008). On parle de phénotype hypermutable.
L’augmentation de stress oxydatif dans les biofilms, provoquée par un déséquilibre entre la
production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de facteurs de défense antioxydants est
une cause d’augmentation de la mutabilité dans les biofilms. Le stress oxydatif endogène dans
les biofilms favorise la résistance aux agents antimicrobiens (Boles et Singh, 2008 ; Høiby et
al., 2010b ; Paraje, 2011). Des souches hypermutantes ont en effet été observées dans les
poumons de patients atteints de mucoviscidose et colonisés par P. aeruginosa, et un lien entre
le taux élevé de mutations et l’évolution vers la résistance aux agents antimicrobiens a été
proposé (Oliver et al., 2000). Les bactéries dans le biofilm peuvent ainsi induire
simultanément des modifications au niveau de la régulation de la mobilité, produire des
enzymes contribuant à dégrader les antibiotiques, et surexprimer des pompes à efflux (Høiby
et al., 2010a). L’augmentation de la production de β-lactamases dans les souches cliniques de
P. aeruginosa est un mécanisme majeur de résistance aux antibiotiques β-lactames
(Giwercman et al., 1990). Les systèmes de pompes réalisent un efflux actif (énergie-
dépendant) ayant pour rôle d’expulser les agents antimicrobiens hors de la cellule (Aires et
al., 1999). P. aeruginosa possède plusieurs systèmes de pompes à efflux dont les systèmes
MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXY-OprM, MexJK-OprM et MexVW-
OprM (Fernandez et Hancock, 2012). Les pompes sont caractérisées par une organisation
Introduction
38
commune composée de 3 parties distinctes: une protéine transporteuse exportant les
substances à travers la membrane interne ; une protéine de fusion membranaire périplasmique
qui lie la pompe cytoplasmique à la protéine de la membrane externe ; une protéine de la
membrane externe facilitant le passage des substance à travers cette membrane externe (Sobel
et al., 2003 ; Nikaido, 1994 ; Zhao et al., 1998 ; Nehme et Poole, 2005). La résistance à la
tobramycine est liée à une surexpression de MexXY-OprM (Islam et al., 2009). Le système de
pompe contribue également à la résistance de P. aeruginosa envers d’autres agents
antimicrobiens tels l’érythromycine, les fluoroquinolones, les β-lactames, la tétracycline, le
chloramphénicol (Li et al., 1994 ; Mine et al., 1999 ; Aeschlimann, 2003 ; Lomovskaya et al.,
2001).
L’augmentation de la densité cellulaire dans la formation des biofilms active le
système du QS. Il a été démontré que le QS détermine la tolérance des biofilms de P.
aeruginosa à la thérapie antibiotique (Høiby et al., 2010b). Les bactéries du biofilm dans
lequel le QS est bloqué, soit par mutation ou par l'administration de médicaments inhibiteurs
de QS, sont sensibles au traitement par la tobramycine et l’H2O2 contrairement aux bactéries
avec un système de QS fonctionnel (Bjarnsholt et al., 2005 ).
III.4.2 La résistance du biofilm envers les défenses de l’hôte
La capacité des bactéries dans un biofilm à résister à la réponse immunitaire de l’hôte
favorise l’installation des infections chroniques et persistantes (Hall-Stoodley et Stoodley,
2009). Les biofilms de P. aeruginosa possèdent de nombreux moyens pour contre-attaquer le
système immunitaire. Les mécanismes incluent la pénétration limitée des polynucléaires
neutrophiles dans le biofilm, l’intervention du QS et la diminution de la capacité des cellules
hôtes à phagocyter les bactéries du biofilm (Leid, 2009 ; Hänsch, 2012).
La phagocytose « frustrée » est un phénomène rencontré lorsque les bactéries se
développent sous forme d’un biofilm. Les macrophages et les neutrophiles sont responsables
de l’engloutissement et de la mort des bactéries, un mécanisme clé dominant la réponse
immunitaire dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose. Ces cellules libèrent
également des radicaux de l’oxygène (anion superoxyde) et des enzymes comme la
lactoferrine et les lysozymes impliqués dans la mort du pathogène. Ce système est très
Figure 20 : Le réseau polysaccharidique d’alginate protège le biofilm de la
phagocytose par les macrophages de l’hôte
L’alginate des biofilms de P. aeruginosa protège les bactéries de la phagocytose par les
macrophages. Les bactéries d’un biofilm pauvre en alginate peuvent être engouffrées et tuées
par les macrophages. Lors de la transition des bactéries du biofilm vers un phénotype
mucoïde, où l’alginate est présent, les macrophages ne sont plus capables de détruire le
microorganisme (Leid, 2009).
Introduction
39
efficace envers les pathogènes en mode planctonique, mais l’est beaucoup moins en présence
d’un biofilm (Leid, 2009). Les polynucléaires neutrophiles sont immobilisés dans la matrice
d’exopolysaccharides de P. aeruginosa, ont un potentiel oxydatif (génération de peroxyde
d’hydrogène) diminué et peu ou pas d’activité antibactérienne (Jesaitis et al., 2003). La
résistance des biofilms à la phagocytose par les polynucléaires neutrophiles et au H2O2 est un
phénomène dépendant du QS (Bjarnsholt et al., 2005).
On observe également la lyse des neutrophiles qui peut entraîner la libération
d’enzymes protéolytiques dégradant les tissus hôtes. Jensen et ses collègues ont montré que
l’effet nécrotique sur les polynucléaires neutrophiles est causé par les rhamnolipides de P.
aeruginosa dont la production dépend du système du QS (Jensen et al., 2007). La synthèse
des rhamnolipides est augmentée en présence de polynucléaires neutrophiles (Alhede et al.,
2009). Les rhamnolipides entourent les bactéries du biofilm et éliminent les polynucléaires
neutrophiles menant à la persistance de la bactérie (van Gennip et al., 2009 ; van Gennip et
al., 2012). Les rhamnolipides contribuent donc à l’invasion du tissu pulmonaire par P.
aeruginosa (Kownatzki et al., 1987).
L’alginate participe également à la résistance des bactéries dans le biofilm au système
immunitaire. Il diminue le chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles (Hänsch et al.,
2008), inhibe l’activation du complément et diminue la phagocytose par les macrophages et
les neutrophiles (Leid et al., 2005). L’alginate peut également influencer la production de
cytokines et par exemple augmenter l’expression d’IL-12 et de TNF-α par les lymphocytes T.
La molécule auto-inductrice 3-oxo-C12-HSL du QS, en plus de son effet de régulateur
de gènes, exerce une fonction immunomodulatrice par interaction avec des cellules de l’hôte
(activation des lymphocytes T, induction de l’apoptose des macrophages et neutrophiles, etc)
afin que le pathogène échappe aux défenses de l'hôte (Chhabra et al., 2003 ; Tateda et al.,
2003 ; Cooley et al., 2008) (voir plus haut). L’interaction de 3-oxo-C12-HSL avec les cellules
mammifères n’est cependant pas encore claire et reste sujette à controverse (Hänsch, 2012).
Figure 21 : Nouveaux antibiotiques à usage systémique approuvés
par la Food and Drug Administration (FDA) (Etats-Unis) de 1983 à 2011
D’après Kuehn, 2011.
Introduction
40
IV. LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS
IV.1 DES PEPTIDES COMME NOUVELLES STRATEGIES
THERAPEUTIQUES
Lors de ces dernières décennies, une diminution progressive de l'efficacité d'un grand
nombre d'antibiotiques qui avaient été jusqu’alors utilisés avec succès contre plusieurs types
d'infections bactériennes a été observée. L'accumulation rapide de mutations par les bactéries
et l'utilisation continue et parfois inadéquate des antibiotiques ont abouti à l'émergence
croissante de souches multirésistantes à l’échelle mondiale. Le développement de nouvelles
classes d'agents antimicrobiens est donc devenu impératif. Cependant, durant ces dernières
années, seules quelques classes d'antibiotiques sont entrées sur le marché, principalement
actives contre les bactéries à Gram positif (Silva et al., 2013).
La découverte et l'enregistrement de nouveaux composés à usage thérapeutique est
donc primordiale afin d'assurer un contrôle approprié des maladies infectieuses. Parmi ces
composés, les PAM semblent être d'excellents candidats pour le développement de nouveaux
agents antimicrobiens (Marshall et Arenas, 2003). Les PAM sont largement distribués dans la
nature, provenant de sources diverses, et possèdent une diversité de séquence énorme
(Zasloff, 2002). Leur large spectre d’activité et leur faible capacité à induire une résistance en
font des candidats potentiels. Ils peuvent notamment servir de schéma de base pour le
développement de nouveaux composés anti-infectieux, par des modifications physico-
chimiques afin d’optimaliser leurs performances (Jorge et al., 2012).
IV.2 LL-37, UN PEPTIDE ANTIMICROBIEN HUMAIN
Les PAM sont largement distribués dans la nature (environ 1700 peptides d’après une
liste database, http://aps.unmc.edu/AP/), proviennent de sources animales ou végétales et
possèdent une grande diversité de séquence (Zasloff, 2002). Malgré tout ils partagent
certaines caractéristiques communes : une longueur de 10 à 50 résidus, une charge nette
positive (charge de +2 à +9) et une structure amphiphile, où les acides aminés hydrophobes et
Figure 22 : Représentation du traitement typique d'une cathélicidine
D’après Vandamme et al., 2012.
Figure 23 : Structure du gène et de la pré-pro-protéine,
et séquence du peptide LL-37
D’après Seil, 2011.
Introduction
41
cationiques sont spatialement organisés en secteurs séparés, importante pour leur activité
antimicrobienne (Hancock et Lehrer, 1998 ; Zasloff, 2002 ; Yeaman et Yount, 2003). Les
PAM peuvent adopter différentes structures secondaires bien qu’ils soient généralement
classés en deux groupes prédominants : les peptides formant des feuillets-β ou des hélices-α.
Les hommes produisent deux classes de PAM : les défensines et les cathélicidines. Les
cathélicidines sont un groupe de PAM décrits à la fois chez des espèces invertébrées (myxine)
et vertébrées dont les oiseaux, les grenouilles, les poissons, les serpents et les mammifères.
Chez ces derniers, on retrouve des cathélicidines chez la souris, les bovins, le porc et le lapin
(Kosciuczuk et al., 2012). Les cathélicidines partagent une structure similaire comportant un
domaine N-terminal hautement conservé (domaine catheline-like) d’une longueur d’environ
100 acides aminés (pro-région). Cette pro-région possède une activité inhibitrice de la
cystéine protéase cathepsine L, d’où elle tient son nom (cathepsin L inhibitor). Le domaine N-
terminal est précédé sur le flanc N-terminal d’un peptide signal d’une trentaine de résidus
(pré-région). Le peptide signal est clivé lorsqu’il a rempli son rôle de cibler la cathélicidine
vers des granules de stockage ou vers l’extérieur de la cellule. La structure primaire et
secondaire de la partie C-terminale diffère fortement d’une espèce à l’autre ; cette partie est
responsable de l’activité antimicrobienne et immunomodulatrice du peptide. Le peptide C-
terminal est libéré par clivage de la pré-pro région.
Chez l’homme, une seule cathélicidine a été identifée. Il s’agit de la cathélicidine
hCAP18 (Larrick et al., 1995). L’expression de la cathélicidine hCAP18 est codée par le gène
CAMP (Cathelicidin Antimicrobial Peptide). Le gène CAMP (1963 pb) se trouve au niveau du
chromosome 3 et comporte 4 exons. Les 3 premiers exons codent pour la séquence signal et le
domaine catheline-like et l’exon 4 code pour le PAM (Larrick et al., 1996). Le clivage de
hCAP18 libère la partie C-terminale de 37 résidus, le peptide LL-37.
La protéine hCAP18 est exprimée dans de nombreux types cellulaires, notamment des
cellules immunitaires telles les lymphocytes (Agerberth et al., 2000), les monocytes, les
neutrophiles (Sorensen et al., 1997), les cellules dendritiques (Sigurdardottir et al., 2012) et
certains macrophages (Sonawane et al., 2011). Le précurseur (la pré-pro-protéine inactive) est
stocké en grande concentration dans des granules. La sérine protéinase 3 est la seule protéase
dérivée des neutrophiles responsable du clivage de hCAP18 pour libérer le peptide actif
Introduction
42
LL-37. L’enzyme est stockée dans des granules séparés de hCAP18. Le clivage a lieu dans le
compartiment extracellulaire, lors de la dégranulation (Sorensen et al., 2001). La cathélicidine
humaine est également exprimée dans des cellules en contact avec l’environnement : les
cellules épithéliales de la peau (Frohm et al., 1997 ; Kim et al., 2009), du tractus
gastrointestinal (Hase et al., 2002), respiratoire (Bals et al., 1998b), urinaire, génital (Frohm et
al., 1999) et de la surface oculaire. L’expression du LL-37 peut être constitutive ou induite
(van der Does et al., 2012). En général, l’expression est affectée par la présence de médiateurs
de l’inflammation et de produits microbiens (LPS, IL-6 et IL-1α) et varie en fonction du type
cellulaire (Nell et al., 2004 ; Schauber et al., 2006). Les mécanismes précis de l’expression de
hCAP18 ne sont pas encore totalement déterminés, cependant, des études récentes ont
clairement montré l’importance du métabolite actif de la vitamine D3 comme inducteur de
l’expression de LL-37 au niveau des kératinocytes (Wang et al., 2004).
Des procédures alternatives de clivage de la pré-pro-protéine hCAP18 libérant des
composés distincts du peptide LL-37, ont été mises en évidence chez l’homme. Dans le
liquide séminal, hCAP18 est clivée par la gastricsine, une protéase prostatique. Celle-ci libère
un peptide de 38 résidus, ALL-38, lorsque le pH correspond au pH vaginal (Sorensen et al.,
2003). Après sécrétion du peptide LL-37 sur la surface de la peau (Yamasaki et al., 2006) ou
dans la sueur (Murakami et al., 2004), un processus protéolytique par différentes sérines
protéases de la famille des kallikréines génère de nouveaux PAM (KR-20, KS-30, RK-31,
LL-29 et KS-22).
IV.3 MECANISMES D’ACTION ANTIMICROBIENNE DES PAM
Les mécanismes d’action antimicrobienne des PAM ont fait l’objet d’importantes études
lors de ces trois dernières décennies. Malgré l’importance du travail réalisé dans le domaine,
les aspects de l’interaction PAM-bactérie létaux pour la cellule ne sont pas encore clairement
établis. Cependant, des preuves convaincantes suggèrent que de nombreux PAM fonctionnent
en se liant à la surface des membranes et en perturbant l'organisation des lipides de manière
non spécifique (Condé et al., 2012). Les PAM provoquent la formation de pores
transmembranaires et de canaux ioniques qui engendrent, par fuite d’ions, une dissipation du
potentiel de membrane ce qui peut mener à la mort de la cellule bactérienne.
Introduction
43
Une autre possibilité est la lyse osmotique de la cellule provoquée par une augmentation
sélective de la perméabilité à l’eau. Une troisième explication pouvant être responsable de la
mort bactérienne est la déstructuration physique étendue de la structure membranaire
entraînant la perte de métabolites et de protéines. Les cibles intracellulaires des PAM sont
également associées à la mort de la bactérie (Wimley et Hristova, 2011).
IV.3.1 Attraction peptide-membrane
Les propriétés cationiques des PAM contribuent aux attractions électrostatiques
responsables des interactions initiales des peptides avec les membranes bactériennes. Les
groupements phosphates au niveau des LPS chez les bactéries à Gram négatif ou les
groupements anioniques des acides teichoïques chez les bactéries à Gram positif confèrent
une charge globale négative à la membrane bactérienne. Ces charges négatives facilitent les
interactions électrostatiques initiales avec les PAM chargés positivement. Une corrélation
importante entre la charge du peptide et l’attachement à la membrane a ainsi déjà été
démontrée (Vaz Gomes et al., 1993 ; Dathe et al., 2001).
IV.3.2 Liaison peptide-membrane
Dans une seconde étape, les PAM s’associent à la membrane bactérienne par liaison
aux LPS des bactéries à Gram négatif ou aux acides teichoïques des bactéries à Gram positif.
Avant d’atteindre la membrane cytoplasmique, les PAM doivent traverser la paroi externe. Ce
mécanisme est principalement décrit pour les bactéries à Gram négatif. Hancock et ses
collègues proposent une captation auto-induite (self promoted uptake) (Piers et al., 1994 ;
Hancock et al., 1997). Par leur haute affinité pour les LPS, les PAM peuvent déplacer via un
mécanisme de compétition les cations Ca2+
et Mg2+
, importants dans la stabilité de la
membrane microbienne. Les PAM se lient alors aux sites de liaison des cations divalents. La
liaison des PAM aux LPS implique généralement des interactions électrostatiques entre les
acides aminés cationiques du peptide et les groupements de tête des LPS. Le complexe est
stabilisé par des interactions hydrophobes entre les acides aminés hydrophobes du peptide et
les chaînes acyles des LPS. La taille volumineuse des PAM contribue à engendrer une
Figure 24 : Trois modèles types de l’action antimicrobienne des PAM sur les membranes
(A) Le modèle « en douve de tonneaux » (Barrel stave) ; (B) Le modèle « des pores
toroïdaux » (Aggregate channel) ; (C) Le modèle « tapis » (Carpet-like). D’après Park et al.,
2011.
Introduction
44
perturbation de la structure de la membrane externe et sa perméabilisation, permettant le
passage de diverses molécules et favorisant le transport du peptide lui-même à travers la
membrane endommagée (Hancock et Chapple, 1999). Le peptide atteint alors la membrane
cytoplasmique constituée d’une bicouche lipidique.
IV.3.3 Interaction peptide-membrane
Les interactions des PAM avec la membrane cytoplasmique bactérienne ne sont pas
encore complètement définies : plusieurs mécanismes sont proposés. On distingue les
modèles qui impliquent la formation d’un pore transmembranaire et les mécanismes qui
n’engendrent pas de pore.
Le modèle « en douve de tonneaux » (Barrel stave)
Le modèle « en douve de tonneaux » implique la formation de canaux
transmembranaires par des regroupements de peptides. Un tel mécanisme a été décrit pour la
pardaxine (Rapaport et Shai, 1991) et l’alaméthicine (Yang et al., 2001). Les peptides se lient
à la surface membranaire, s’assemblent et s’insèrent dans la membrane pour initier la
formation d’un pore aqueux. Les faces hydrophobes du peptide s’alignent et font face à la
partie lipidique de la membrane alors que les régions hydrophiles du peptide sont impliquées
dans la formation du pore et sont positionnées vers l’intérieur de la région du pore remplie
d’eau. Des peptides additionnels sont progressivement recrutés menant à une augmentation
régulière de la taille du pore, qui est liée à l’étendue de l’agrégation des peptides dans la
membrane. En conséquence, des composés cellulaires essentiels s’échappent au travers du
pore entraînant la mort de la cellule (Oren et Shai, 1998).
Le modèle « des pores toroïdaux » (Aggregate channel)
Après liaison des peptides aux groupements des phospholipides membranaires, les
peptides s’intègrent dans la membrane et forment des agrégats non structurés qui traversent la
membrane. Ils affectent de façon coopérative la courbure locale de la membrane et forcent les
phospholipides membranaires à se plier de manière à constituer un pore dont les parois sont
formées par les parties polaires des peptides insérés dans la membrane et les groupements
Introduction
45
polaires des phospholipides de la membrane. Un pore continu, du sommet à la base de la
bicouche lipidique, est formé par une forte courbure des phospholipides afin de connecter les
deux feuillets de la membrane à la manière d’un trou toroïdal (Brogden, 2005). Ce modèle
implique la formation dynamique de trous transmembranaires pour une courte durée
permettant la fuite de composés intracellulaires et le passage du peptide à travers la membrane
sans provoquer de dépolarisation membranaire importante. Le peptide peut ensuite agir par
exemple sur des cibles intracellulaires (Zhao, 2003). Ce modèle a été décrit pour la première
fois pour les pores induits par la magainine (Ludtke et al., 1996). L’activité de la mellitine sur
la membrane bactérienne suppose également le modèle de pores toroïdaux (Park et al., 2006 ;
Allende et al., 2005).
Le modèle « tapis » (Carpet-like)
Le modèle en tapis a été décrit pour la première fois pour détailler le mécanisme
d’action de la dermaseptine S (Pouny et al., 1992) et n’implique pas la formation de pore.
Dans ce modèle, les peptides ne s’insèrent pas dans la membrane lipidique mais ils s’agrègent
parallèlement à la surface membranaire au niveau des groupements phosphates des lipides,
par des interactions électrostatiques, et forment un tapis. L’orientation parallèle permet un
contact constant des acides aminés chargés positivement avec les groupements phosphates de
la membrane durant le processus de perméabilisation. En présence d’une concentration élevée
en peptides, ceux-ci perméabilisent la membrane par un mécanisme détergent pouvant
éventuellement mener à la formation de micelles. Les peptides exercent des forces
destructrices sur la membrane menant à la perturbation de la courbure des couches de
membranes. Des pores transitoires sont formés. Finalement la bicouche lipidique se désintègre
et forme des micelles (Oren et Shai, 1998). Dans ce modèle, ainsi que dans le modèle « en
douve de tonneaux », la disparition de l’intégrité membranaire s’accompagne d’une
dissipation du potentiel de membrane. La cecropine P1 agit sur les membranes bactériennes
via ce mécanisme (Gazit et al., 1996).
Introduction
46
IV.3.4 Cibles intracellulaires
L’accumulation de certains PAM au sein des cellules bactériennes affectant des
fonctions intracellulaires a été rapportée soulignant l’existence de mécanismes autres que le
dysfonctionnement membranaire. Le peptide Bac7 est responsable d’une diminution
importante de la viabilité bactérienne mais ne perméabilise pas la membrane de la bactérie. La
pleurocidine et la dermaseptine inhibent la synthèse de l'ADN bactérien tandis que la buforine
II et la tachyplésine se lient aux acides nucléiques en général (Yonezawa et al., 1992). Des
PAM riches en proline, comme la drosocine et l’apidaecine, ciblent une protéine bactérienne
(DnaK) pour exercer leur activité antibactérienne (Otvos et al., 2000).
L’activité antibactérienne de certains PAM peut aussi être attribuée à leur double
fonction de perméabilisation de la membrane bactérienne accompagnée d’une action
intracellulaire avec pour cible par exemple la synthèse d’ADN, d’enzymes ou de composants
de la paroi bactérienne (Otvos, 2005 ; Nicolas, 2009 ; Jorge et al., 2012).
IV.3.5 Mécanismes d’action antimicrobienne du LL-37
Le mécanisme d’action par lequel le peptide LL-37 reconnaît et inhibe les bactéries
reste incomplètement élucidé. Les études ont souvent impliqué la liaison du LL-37 aux LPS
comme interaction initiale avec les bactéries à Gram négatif (Yount et Yeaman, 2013 ; Junkes
et al., 2011). Dans ces modèles, le peptide cationique est attiré électrostatiquement à la
surface anionique riche en LPS de la bactérie à Gram négatif avant de s’accumuler à la
surface. Les mécanismes de résistance aux peptides cationiques bien documentés dans les
bactéries à Gram negatif soutiennent cette hypothèse. Dans ces organismes, la résistance aux
PAM est conférée par l'activation de systèmes de régulation à deux composantes, qui
conduisent à l'incorporation accrue aux LPS de sous-unités d’aminoarabinose chargées
positivement (Yeaman et Yount, 2003).
Récemment, une étude démontre l’existence d’une protéine de la membrane externe de P.
aeruginosa, OprI, responsable de la sensibilité de la bactérie aux PAM cationiques avec une
structure en hélice-α, notamment le peptide LL-37. Les auteurs suggèrent que OprI sert de
Introduction
47
récepteur aux peptides et soulignent un nouveau mécanisme antimicrobien pour ces PAM
(Lin et al., 2010).
Différentes études impliquant des techniques de dichroïsme linéaire et circulaire
(Zhang et al., 2010 ; Lee et al., 2011), de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier
(FTIR) (Oren et al., 1999) et de spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN)
(Henzler Wildman et al., 2003 ; Thennarasu et al., 2010) démontrent la contribution d’une
hélice-α orientée parallèlement au plan de la bicouche lipidique dans l’activité du LL-37. Ces
études suggèrent que le peptide LL-37 agit via un mécanisme de pores toroïdaux en tapis
(toroidal pore carpet-like) (Vandamme et al., 2012). Le peptide LL-37 atteint la membrane
externe sous forme d’oligomère et/ou de monomère et en couvre la surface. Il se lie
parallèlement à la surface avec ses acides aminés chargés positivement en contact avec les
groupements des phospholipides. L’accumulation du peptide et l’atteinte d’une concentration
seuil entraîne une courbure significative de la membrane, le peptide maintenant le contact
avec les phospholipides (Burton et Steel, 2009), jusqu’à la translocation de monomères de la
membrane externe vers le compartiment périplasmique et la surface de la membrane interne.
Le peptide LL-37 est donc responsable de la formation de pores toroïdaux transmembranaires
dans la bicouche lipidique (Henzler Wildman et al., 2003 ; Lee et al., 2011). La biogenèse de
la membrane bactérienne externe serait également perturbée (Sochacki et al., 2011). Des
micelles ou petites vésicules ne sont pas formées en présence du LL-37 ce qui exclut donc un
mécanisme d’action détergent (Henzler Wildman et al., 2003).
Par la suite, le modèle tapis (carpet like) est le plus plausible. La membrane interne est
recouverte et perturbée par le peptide se liant à la surface lipidique (Burton et Steel, 2009 ;
Henzler Wildman et al., 2003 ; Oren et al., 1999) permettant l’accès du peptide aux cibles
intracellulaires comme l’ADN.
Au niveau de l’épithélium bronchique humain, le peptide LL-37 augmente la rigidité
membranaire accompagnée d’une diminution de la perméabilité membranaire ayant pour
conséquence un effet antibactérien indirect par diminution de la captation de P. aeruginosa et
par prévention de son invasion (Byfield et al., 2011).
Introduction
48
Mécanisme antibiofilm du LL-37
La cathélicidine LL-37, active sur des biofilms de P. aeruginosa, semble agir à
l’intérieur des cellules bactériennes, par modulation de l’expression de gènes essentiels au
développement du biofilm (Overhage et al., 2008 ; Dean et al., 2011). En présence de
concentrations sub-inhibitrices de LL-37, les bactéries du biofilm modifient l’expression de
presque 800 gènes, notamment des gènes impliqués dans l’assemblage du flagelle et dans le
QS (Overhage et al., 2008). Un nouveau peptide cationique synthétique de 9 résidus, dérivé
du LL-37, inhibe la formation d’un biofilm de P. aeruginosa par réduction des motilités
swimming et swarming, par stimulation de la motilité twitching et par la suppression de
l’expression de nombreux gènes impliqués dans la formation du biofilm (de la Fuente-Nunez
et al., 2012). Il convient cependant de mentionner que ce peptide (KRFRIRVRV) n'est pas un
fragment du LL-37 (séquence des résidus différente) ce qui rend la comparaison entre les
résultats obtenus avec ce peptide et l’activité du LL-37 moins pertinente. Les propriétés
antibiofilms des PAM peuvent aussi être attribuées à leurs propriétés de fixation de l’ADN
extracellulaire. L’ADN extracellulaire peut être impliqué dans l’attachement des cellules à
une surface et dans l’agrégation cellulaire (Das et al., 2010). La liaison des peptides
cationiques à l’ADN peut ainsi faciliter le détachement ou la désintégration du biofilm (Hale
et Hancock, 2007).
Figure 25 : Les bases de la sélectivité membranaire des PAM
D'après Zasloff, 2002.
Introduction
49
IV.3.6 Sélectivité cellulaire
Les approches pour explorer la spécificité cellulaire du LL-37 et la compréhension
moléculaire de l’interaction des PAM avec les membranes impliquent généralement une
modélisation de la membrane bactérienne et eucaryote (Wimley et Hristova, 2011). L’étude
de la sélectivité cellulaire des PAM est un concept complexe qui nécessite la considération de
divers facteurs dont la charge, la composition et la distribution lipidique et la rigidité (stérols)
de la membrane (Sevcsik et al., 2008 ; Alba et al., 2012). Les LPS (Gram négatif) et les acides
teïchoiques (Gram positif) chargés négativement contribuent à l’interaction favorable du
peptide cationique avec la membrane bactérienne par opposition aux membranes humaines
qui sont généralement non chargées ou composées de lipides zwitterioniques comme la
phosphatidylcholine et les sphingolipides. La présence de cholestérol dans les membranes
eucaryotes, qui a pour fonction de stabiliser la membrane, protège les membranes humaines
de l’attaque par le LL-37 (Sood et Kinnunen, 2008). Le potentiel de membrane (potentiel
transmembranaire) des bactéries est significativement plus négatif (-130 à -150 mV) que celui
de cellules mammifères (-90 à -110 mV) et peut contribuer à une plus grande affinité des
PAM pour ces membranes (Yeaman et Yount, 2003).
Malgré les études sur bicouches lipidiques en faveur d’une préférence du LL-37 pour
les membranes bactériennes (Neville et al., 2006 ; Zhang et al., 2010), la spécificité du LL-37
à distinguer les cellules eucaryotes et bactériennes est relativement faible (Vandamme et al.,
2012). Le peptide LL-37 peut donc aussi être toxique sur les cellules eucaryotes. Cependant
les concentrations cytotoxiques sont généralement plus élevées que les concentrations
requises pour éliminer le pathogène (Kai-Larsen et Agerberth, 2008).
IV.4 DES PEPTIDES QUI CONTOURNENT LA RESISTANCE
BACTERIENNE
Les antibiotiques modernes sont sujets à de sévères et croissants problèmes de
résistance (Falconer et al., 2011 ; Fabbretti et al., 2011). Face à l’apparition de souches
multirésistantes aux antibiotiques conventionnels, les PAM suscitent un intérêt majeur, une de
leur principale force étant de contourner la résistance aux antibiotiques conventionnels.
Malgré quelques moyens mis en jeu par les bactéries pour résister à l’attaque par les PAM, de
Introduction
50
nombreuses études soulignent la difficulté pour la bactérie de développer une résistance à
long terme envers ces derniers.
Leur potentiel à surmonter la résistance bactérienne repose sur le fait qu’ils sont
d’anciens composants des espèces vivantes et leurs voies d’induction dans tous les
organismes sont conservées (Shai, 2002). Vraisemblablement, les bactéries ont été exposées
aux PAM pendant des millions d'années et, à l'exception de quelques espèces comme
Burkholderia spp (Loutet et Valvano, 2011), aucune résistance généralisée n’a été signalée.
Ceci explique que ces peptides sont potentiellement des points de départ rationnels pour la
conception de médicaments (Fjell et al., 2012). Contrairement aux PAM, les antibiotiques
conventionnels n’endommagent pas la membrane bactérienne directement mais pénètrent au
niveau de l’organisme cible et agissent sur des cibles spécifiques, comme l’inhibition de la
synthèse du peptidoglycane membranaire, l’induction d’autolysines intrinsèques, la cassure de
l’ADN suite à l’inhibition de l’ADN gyrase, l’arrêt de la division cellulaire etc. (Hancock et
Rozek, 2002). Dans de telles conditions, la morphologie bactérienne est préservée et les
bactéries sont capables de développer un mécanisme de résistance. Au contraire, la plupart
des PAM interagissent avec le pathogène par un mécanisme non spécifique via des structures
physiologiques fondamentales peu susceptibles de développer une résistance. Ils perturbent,
perméabilisent et infligent des dommages difficiles à réparer au niveau de la membrane de la
cellule cible, une structure hautement conservée à travers les générations. Pour développer
une résistance envers les PAM, la bactérie devrait entreprendre un changement en profondeur
de sa structure membranaire. Ce profond changement serait l’objet d’un trop long processus et
a peu de chances d’apparaître (Lai et Gallo, 2009 ; Vandamme et al., 2012). De plus,
contrairement aux antibiotiques modernes qui ont un nombre très limité de cibles, les PAM
exercent leur pouvoir antimicrobien via de multiples cibles réduisant les chances pour le
pathogène de développer une résistance. Ainsi, une mutation qui supprimerait une cible
d’action, laisserait encore la possibilité au peptide de tuer la bactérie par les autres voies
d’action (Yeung et al., 2011 ; Jorge et al., 2012).
Les études de développement de la résistance bactérienne sont en accord avec ces
observations. Des souches cliniques de P. aeruginosa ont été exposées pendant 30 passages
en présence de PAM ; la CMI pour la plupart des peptides n’était que 2 à 4 fois plus
importante que la CMI initiale suggérant le faible potentiel de développement de résistance
Introduction
51
envers ces PAM et le rôle intéressant des peptides dans le traitement des infections chez les
patients atteints de mucoviscidose (Zhang et al., 2005). Steinberg et ses collègues démontrent
que la résistance de la protégrine-1 est plus difficile à sélectionner que la résistance aux
antibiotiques classiques comme la norfloxacine et la gentamicine (Steinberg et al., 1997).
Navon-Venezia et ses collaborateurs démontrent que l'exposition répétée de bactéries à Gram
positif à différents PAM dérivés de la dermaseptine n'a pas modifié la CMI de manière
significative après plusieurs passages bactériens contrairement aux antibiotiques
commerciaux (Navon-Venezia et al., 2002).
Il faut également souligner que les infections persistantes sont liées à la formation
d’un biofilm dont l’éradication est un procédé plus difficile principalement à cause de la
matrice d’exopolysaccharides entourant les cellules. De plus, les bactéries au sein du biofilm
adoptent un état de croissance lent et deviennent métaboliquement non actives. La plupart des
antibiotiques conventionnels ne seront donc pas actifs sur les cellules du biofilm, leur cible
primaire étant les cellules métaboliquement actives (Chau, 2010). Par leur mécanisme
d’action non spécifique sur la membrane, les PAM sont capables d’agir sur ces cellules
métaboliquement non actives et à croissance lente.
IV.5 DES PEPTIDES MULTIFONCTIONNELS
L’intérêt suscité par les PAM comme nouvelle approche thérapeutique contre les
infections bactériennes est en partie attribué à leur double rôle biologique. Les PAM
possèdent des propriétés antimicrobiennes importantes mais sont également des composés
immunomodulateurs, deux actions complémentaires pour certains PAM.
L’activité antibactérienne des cathélicidines a été établie peu après la découverte de
cette classe. Ces peptides fournissent une protection envers une large variété de pathogènes
comprenant des bactéries à Gram positif et négatif (Bucki et al., 2010 ; Vandamme et al.,
2012). Le peptide LL-37 possède entre autres une activité puissante envers E. coli (Smeianov
et al., 2000), K. pneumoniae (Smeianov et al., 2000), P. aeruginosa (Travis et al., 2000), S.
aureus (Travis et al., 2000), S. typhimurium (Turner et al., 1998), les streptocoques du groupe
A (Döring et al., 2001) et N. gonorrhoeae (Bergman et al., 2005). Contrairement aux
Figure 26 : Propriétés fonctionnelles des PAM
Les PAM peuvent interagir directement avec les bactéries et conduire à la mort cellulaire par
déstabilisation membranaire et fuite cytoplasmique ou par pénétration dans la cellule et action
sur des cibles cytoplasmiques. Parmi les effets létaux intracellulaires des PAM figurent (a) la
liaison des peptides à l'ADN et l'inhibition du métabolisme de l'ADN, (b) l'inhibition de la
synthèse des protéines, (c) l'inhibition de la synthèse de la paroi cellulaire, et (d) l'activation
d’enzymes autolytiques. Les PAM sont également d’importants immunomodulateurs et
promoteurs de la réparation des plaies et de l'angiogenèse contribuant à la résolution de
l'infection ou des dommages et au maintien de l'homéostasie (Alba et al., 2012). Les PAM
sont d’ailleurs également appelés host defence peptides (HDP) pour leurs propriétés de
modulation de la réponse immune.
Introduction
52
antibiotiques conventionnels ciblant uniquement les infections bactériennes et ayant souvent
un spectre restreint, les PAM sont pourvus d’un spectre d’action très large avec des propriétés
antivirales et/ou antifongiques. Ainsi, l’activité antifongique de la cathélicidine LL-37 sur C.
albicans a été démontrée (Lopez-Garcia et al., 2005 ; Wong et al., 2011b). Les fragments du
peptide LL-37 secrétés au niveau de la peau (KR-20, KS-30 et RK-31) constituent un
mécanisme de protection topique également par leurs propriétés antifongiques (Murakami et
al., 2004). En outre, la cathélicidine humaine possède une activité antivirale et cible
notamment le virus influenza (Barlow et al., 2011 ; Tripathi et al., 2012), le virus de la
vaccine (Howell et al., 2004), le HSV (Galdiero et al., 2013) et l’HIV-1 (Wong et al., 2011a).
Ces peptides bioactifs ne se contentent pas d’agir comme agents antimicrobiens
directs, mais représentent également d'importants effecteurs et régulateurs du système
immunitaire qui sont en mesure de moduler profondément la réponse immunitaire. Ainsi on
pense actuellement que les cathélicidines contribuent à la protection envers les infections et à
leur résolution principalement par leur rôle dans l’immunité (Choi et Mookherjee, 2012). Une
diminution de l’expression de la cathélicidine humaine est associée entre autres à une
augmentation de la sensibilité aux infections de la peau et à de fréquentes infections buccales
(Bowdish et al., 2005). Les peptides sont capables de signaler un dommage tissulaire et
cellulaire et de stimuler l’immunité afin de supprimer ou de prévenir une infection. Le peptide
LL-37 exerce un effet chémoattracteur direct par activation d’un récepteur pour le peptide
fMLP, le Formyl Peptide Receptor Like-1 (FPRL-1) induisant le recrutement de cellules
immunitaires comme les monocytes, les neutrophiles, les cellules dendritiques et les
lymphocytes, vers le site de l’infection (Agerberth et al., 2000 ; Niyonsaba et al., 2002 ;
Tjabringa et al., 2006). FPRL-1 est le seul récepteur qui active une migration directe des
cellules immunitaires (Kai-Larsen et Agerberth, 2008). Par son rôle dans le recrutement de
leucocytes, la cathélicidine humaine aide aussi à la phagocytose pour améliorer la clairance
des agents pathogènes. Le peptide LL-37 est aussi responsable de la stimulation et la
modulation de la libération de chémokines par certaines cellules et exerce ainsi un effet
chémoattracteur indirect des leucocytes. Il promeut la synthèse ou la libération d’IL-1β, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18 et IL-31 (Yoshioka et al., 2008 ; Montreekachon et al., 2011 ;
Niyonsaba et al., 2010). Le LL-37 régule aussi positivement l'expression de récepteurs de
cytokines dans les macrophages (Scott et al., 2002). Le peptide établit des connexions entre la
réponse immunitaire innée et adaptative en influençant l’activation de cellules dendritiques et
la polarisation des lymphocytes T (Davidson et al., 2004).
Introduction
53
Outre son activité antimicrobienne et ses fonctions de régulateur de l’immunité, le
peptide LL-37 contribue au processus de réparation du tissu épithélial endommagé par la
bactérie ou par l’action du système immunitaire (Heilborn et al., 2003). Il a un rôle important
dans le processus de croissance cellulaire et d’angiogenèse. La réparation des dommages
tissulaires peut impliquer la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Le peptide LL-37 est
impliqué dans l’initiation de l’angiogenèse par recrutement des cellules progénitrices
endothéliales au site endommagé et par induction de leur prolifération (Koczulla et al., 2003 ;
Pfosser et al., 2010). Le peptide induit la réparation de la plaie, la prolifération et la migration
des cellules épithéliales des voies respiratoires, indiquant qu’il est impliqué dans la régulation
de l’homéostasie du tissu des voies aériennes (Shaykhiev et al., 2005).
Les PAM peuvent également avoir une fonction anti-endotoxique suite à la liaison des
peptides aux LPS (Kai-Larsen et Agerberth, 2008). Les LPS, aussi connus comme les
endotoxines, servent de barrière et de couche protectrice entre la bactérie et son
environnement. Les LPS sont considérés comme un facteur de virulence important car ils
stimulent la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires qui induisent la réponse immunitaire
de l'hôte et aboutissent à un choc septique. Le peptide LL-37, ainsi que de nombreux autres
PAM, se lie avec une haute affinité aux LPS et peut donc limiter ses propriétés endotoxiques
ainsi que la cascade de signalisation immunitaire en découlant (Larrick et al., 1994 ; Turner et
al., 1998 ; Rosenfeld et al., 2006).
IV.6 MECANISMES DE RESISTANCE AUX PAM
La résistance bactérienne face aux antibiotiques conventionnels est un phénomène
préoccupant nécessitant le développement de nouveaux agents antibactériens pour combattre
la résistance des souches bactériennes. La compréhension des mécanismes de résistance
envers les PAM peut fournir des indications précieuses dans la recherche de nouveaux
antibiotiques (Vandamme et al., 2012). Les bactéries sont moins susceptibles de développer
une résistance envers les PAM qui utilisent généralement simultanément différents
mécanismes d’actions antimicrobiens contrairement aux antibiotiques conventionnels
(Peschel et Sahl, 2006).
Introduction
54
IV.6.1 Protéases
Un des inconvénients majeurs à l’utilisation des PAM en usage thérapeutique est leur
sensibilité aux protéases et peptidases. De nombreuses enzymes sont décrites. La cathélicidine
LL-37 est sensible à la protéase V8 et à l’auréolysine sécrétées par S. aureus. P. aeruginosa
sécréte une élastase responsable de la dégradation protéolytique du peptide LL-37
(Sieprawska-Lupa et al., 2004). Une métalloprotéase extracellulaire sécrétée par P. mirabilis,
ZapA, dégrade et inactive les fonctions anti-infectieuses de la β-défensine humaine 1 (hBD1)
et du peptide LL-37 (Belas et al., 2004).
IV.6.2 Molécules extracellulaires liant les PAM
Certaines bactéries produisent des molécules extracellulaires capables de se lier aux
PAM et d’inhiber leurs fonctions. S. pyogenes se protège de l’action antimicrobienne du LL-
37 par sécrétion d’une protéine capable de neutraliser le peptide (Frick et al., 2003). S. aureus
produit une exoprotéine, la staphylokinase, pouvant se lier aux α-défensines et inhiber leur
activité bactéricide (Jin et al., 2004). En outre, l'inhibiteur streptococcique du complément
(SIC), produit par certains streptocoques très virulents, interagit avec le peptide LL-37, une
défensine α Human Neutrophil Peptide 1 (HNP-1) et hBD 1-3 conduisant à l'inactivation de
leur activité antibactérienne (Fernie-King et al., 2006).
IV.6.3 Pompes à efflux
Des structures protéiques ont été développées par les bactéries afin d’expulser
activement certains peptides. Le système Sap de S. typhimurium est responsable de la
résistance à la mellitine et à la protamine par transport actif de ces peptides dans le
cytoplasme afin de contourner les propriétés de rupture membranaire des peptides (Parra-
Lopez et al., 1993). Le système d'efflux Mtr de N. gonorrhoeae régule l’activité de la
protégrine-1 et du LL-37 par expulsion de ces derniers à l'extérieur de la membrane (Shafer et
al., 1998).
Introduction
55
IV.6.4 Altération des propriétés de la surface cellulaire
Les interactions préférentielles bactéries-peptides reposent sur les propriétés, la
structure et l’organisation de la membrane de la bactérie. La membrane bactérienne est une
structure hautement conservée au cours des générations et il semble peu concevable que la
composition et l’architecture des membranes, également essentielle au pathogène, puisse
fondamentalement changer (Lai et Gallo, 2009). Cependant les bactéries ont adopté d’autres
stratégies pour se défendre des interactions avec les PAM. La modification des propriétés
électronégatives à la surface des bactéries à Gram positif et négatif engendre une diminution
de la sensibilité des bactéries aux PAM.
Bactéries à Gram positif
Les bactéries à Gram positif contiennent une paroi épaisse riche en peptidoglycane et
en polymères d’acides teichoïques ou lipoteichoïques anioniques, par les groupements
phosphate, conférant une charge nette négative de la surface bactérienne. La diminution de la
charge globale négative à la surface membranaire par incorporation de D-alanine est un
moyen adopté par certaines bactéries pour limiter leur interaction avec les peptides
cationiques. La D-alanine est couplée via un lien ester à la chaîne d’acide teichoïque exposant
le groupement amine chargé positivement. La D-alanylation est le résultat de l’expression de
l’opéron dltABCD comportant 4 gènes (Neuhaus et Baddiley, 2003). Ce mécanisme est
retrouvé chez plusieurs bactéries à Gram positif dont S. pyogenes (Kristian et al., 2005), L.
monocytogenes (Abachin et al., 2002), S. epidermidis et S. aureus où le phosphatidylglycérol
membranaire est substitué par une lysine (Peschel et al., 2001). Récemment Saar-dover et al.
(2012) ont suggéré que la protection conférée par la D-alanylation des acides lipoteichoïques
a pour conséquence une diminution de la flexibilité de la paroi bactérienne liée à une
augmentation de la densité et de la rigidité de la paroi.
Bactéries à Gram négatif
Les bactéries à Gram négatif, dont P. aeruginosa, ont développé un mécanisme de
résistance aux PAM par modification du lipide A des LPS membranaires. Le caractère
anionique du lipide A est altéré par l’addition de 4-aminoarabinose ce qui provoque une
différence structurelle et une diminution des charges négatives de la membrane entravant
l’interaction entre la membrane bactérienne et les PAM (Gooderham et Hancock, 2009). La
Introduction
56
modification dans la structure des LPS chez P. aeruginosa est secondaire à l’activation de
l’opéron arn BCADTEF (McPhee et al., 2006).
IV.7 APPLICATION CLINIQUE DES PAM : OBSTACLES ET AVANCEES
Malgré les nombreux avantages conférés par les PAM, leur usage thérapeutique est
limité et doit contourner des inconvénients majeurs tels leur dégradation protéolytique, leur
coût et leur toxicité systémique inconnue avant de tirer pleinement profit de ces molécules
(Bell, 2011). Différentes pistes sont envisagées pour optimaliser l’usage clinique des PAM.
IV.7.1 Coût de la production
Le développement des PAM à échelle industrielle implique des coûts très élevés liés
principalement aux processus d’extraction, d’isolation et de purification (Jorge et al., 2012 ;
Parachin et al., 2012). La masse moléculaire importante et la structure complexe des PAM
rend leur synthèse chimique également onéreuse (Parachin et al., 2012). La production de 1 g
de PAM peut couter de 50 à 400 US$ alors que la production d’antibiotiques conventionnels
ne dépasse pas 1 US$ (Marr et al., 2006).
Les stratégies proposées pour réduire les coûts de production sont multiples. La
conception et la synthèse de dérivés de plus petite taille et de composition plus simple
semblent une première option à envisager (Wimley et Hristova, 2011). Des procédés de
fabrication utilisant de l’ADN recombinant sont actuellement en développement pour
optimalisation et sont considérés comme très efficaces pour augmenter la production des
PAM (Parachin et al., 2012). Exploiter les propriétés immunomodulatrices des PAM dans un
but thérapeutique permettrait de réduire la dose requise du composé dans le traitement des
infections. Pour réduire la dose, une administration locale des peptides au niveau du site
d’action est également à envisager. L’administration par aérosol permet d’atteindre les
poumons et de combattre les infections pulmonaires persistantes et résistantes à
l’antibiothérapie conventionnelle souvent administrée par voie parentérale (Hancock et Sahl,
2006).
Introduction
57
IV.7.2 Sensibilité aux conditions physiologiques et aux protéases
L’activité des PAM peut être significativement réduite dans des conditions
physiologiques. L’activité du peptide LL-37 diminue en présence de fortes teneurs en sel
(Turner et al., 1998) ou dans un milieu complexe (Bowdish et al., 2005). En présence de NaCl
100 mM, l’activité antimicrobienne du LL-37 sur S. aureus, P. mirabilis et C. albicans est
inhibée alors que le peptide est actif sur ces mêmes espèces dans un milieu pauvre en sel. Le
peptide conserve cependant son activité sur P. aeruginosa, S. typhimurium, E. coli, L.
monocytogenes, S. epidermidis, S. aureus et sur les entérocoques résistants à la vancomycine
(Turner et al., 1998). L’environnement riche en sel des sécrétions broncho-pulmonaires chez
les patients atteints de mucoviscidose (Zabner et al., 1998) pourrait donc inhiber l’efficacité
antimicrobienne des PAM à la surface des voies respiratoires (Goldman et al., 1997 ; Bals et
al., 1998a ; Bals et al., 1998b). Les cations divalents présents dans les expectorations, le
liquide de surface des voies respiratoires et le sérum peuvent également être responsables
d’une diminution de l’efficacité des PAM (Lehrer et al., 1988 ; Turner et al., 1998). Des
facteurs microbiologiques comme certains polysaccharides libérés par des pathogènes
pulmonaires antagonisent l’activité des peptides (Benincasa et al., 2009). Ainsi des complexes
moléculaires peuvent se former entre les exopolysaccharides de P. aeruginosa et la
cathélicidine LL-37 avec pour conséquence une inhibition de l’activité du peptide (Foschiatti
et al., 2009). La présence de composés anioniques dans certains fluides biologiques pouvant
interagir avec les PAM peut être responsable d’une diminution de l’efficacité
antimicrobienne. La présence d’ADN et d’actine-F libérée par les neutrophiles morts et autres
cellules lysées au niveau des expectorations des patients atteints de mucovsicidose, limite
l’utilisation du peptide LL-37. Une concentration importante des PAM, normalement
solubles, se retrouve séquestrée à la surface des filaments polyanioniques aboutissant à la
formation d’agrégats denses et stables qui inhibent l’activité bactéricide du peptide LL-37
(Bucki et al., 2007a). L’action du peptide LL-37 est réduite in vitro dans les fluides en
présence de concentrations importantes de glycosaminoglycans mais aussi en présence
d’héparine dans le plasma. L’interaction peptide-glycosaminoglycans peut être bloquée par
des polymères cationiques comme le DEAE-dextran et le chitosan (Baranska-Rybak et al.,
2006). Dans le plasma, LL-37 se lie à une apolipoprotéine-I, réduisant la concentration libre
du peptide et donc inhibant son activité cytotoxique. L’activité antimicrobienne du peptide est
également entravée (Wang et al., 1998).
Introduction
58
Des efforts considérables dans la recherche et la conception d’analogues stables et
résistants aux conditions physiologiques sont entrepris. Des légères modifications de
l’hydrophobicité, l’amphipaticité, la charge et le degré d’hélice-α, peuvent considérablement
modifier l’activité des peptides et leur résistance au sel (Friedrich et al., 1999). Shin et al.
(2002) ont synthétisé un peptide cationique avec une hélice-α possédant des propriétés
antibactériennes, dépourvu de cytotoxicité, résistant à la présence de concentrations élevées
en NaCl, CaCl2 et MgCl2. Murakami et ses collègues ont mis en évidence des fragments
dérivés du LL-37, les peptides KR-20, RK-31 et KS-30, avec une sensibilité moindre aux sels
et une activité antimicrobienne maintenue (Murakami et al., 2004). Les clavanines, un groupe
de PAM riches en histidine et avec une structure en hélice-α, ont une activité antimicrobienne
dans un milieu normal et riche en NaCl (Lee et al., 1997). Récemment, Yu et al. (2011) ont
proposé une stratégie permettant d’améliorer la résistance aux sels des PAM par substitution
des résidus tryptophane ou histidine par des groupements volumineux, tels que la β-
naphthylalanine ou la β-(4,4’-biphényl)alanine.
Un autre inconvénient majeur des PAM est leur labilité métabolique. La sensibilité des
PAM aux protéases procaryotes et eucaryotes est responsable d’une diminution de la
biodisponibilité des molécules et donc de leur profil pharmacocinétique non favorable. In
vivo, des protéases intestinales, des tissus et du sérum sont responsables de la dégradation des
peptides (Park et al., 2011). Différentes stratégies sont développées afin d’optimaliser
l’activité biologique des PAM. La substitution des acides aminés naturels de la série L par des
acides aminés non naturels ou par des acides aminés de la série D et la cyclisation des
peptides, sont des stratégies bien connues pour améliorer la stabilité des peptides.
La substitution d’un acide aminé L par un acide aminé D préserve l’activité antifongique du
peptide [Pro3]TL, un dérivé issu de la peau de grenouille, sans exercer d’effets toxiques sur
les cellules humaines (Grieco et al., 2013). Wang et al. (2010) développent plusieurs PAM par
substitution des acides aminés L par des acides aminés D et démontrent que ces peptides ont
une sélectivité cellulaire favorable, une meilleure stabilité face aux protéases et une activité
anti-inflammatoire améliorée. L’équivalence de l’activité antibactérienne et antibiofilm sur P.
aeruginosa de l’énantiomère D-LL-37 comparée au L-LL-37 a été montrée (Dean et al.,
2011). Les deux peptides réduisent la formation du biofilm et diminuent la biomasse du
biofilm pré-existant. De plus, le dérivé D-LL-37 est résistant à la trypsine suggérant que ce
Introduction
59
peptide est une avancée importante dans le développement de nouveaux traitements pour les
infections à P. aeruginosa (Dean et al., 2011).
La cyclisation des PAM est une approche alternative pour surmonter le clivage protéolytique.
La fixation des extrémités de la molécule qui sont normalement mobiles résulte en des
contraintes conformationnelles qui rendent plus difficile la reconnaissance par les protéases et
favorisent donc la stabilité du peptide. La cyclisation peut parfois aussi améliorer la
spécificité cellulaire (Matsuzaki, 2009 ; Rozek et al., 2003). Dartois et al. (2005) démontrent
l’efficacité in vivo de peptides cycliques et soulignent leur potentiel pour une administration
systémique dans le traitement d’infections résistantes à l’antibiothérapie conventionnelle. Le
remplacement par des acides aminés D et la cyclisation du peptide CATH-2, une cathélicidine
issue du cochon, ont permis d’augmenter sa stabilité dans le sérum humain (résistance à la
protéolyse par la trypsine et par les protéases bactériennes) et de diminuer sa cytotoxicité sans
influencer l’activité antibactérienne du peptide sous des conditions physiologiques (Molhoek
et al., 2011).
La substitution de 4 résidus par du tryptophane du peptide EFK17 (LL16-32) dérivé du LL-37
a pour conséquences une amélioration de ses performances antimicrobiennes et une réduction
de sa sensibilité aux protéases (Strömstedt et al., 2009). La fluorination des acides aminés de
la buforine et de la magainine induit une meilleure stabilité de ces peptides face aux protéases
et maintient une activité antimicrobienne significative (Meng et Kumar, 2007).
Parmi les stratégies envisagées pour contourner certains effets biologiques
indésirables, le développement de molécules peptido-mimétiques a suscité un grand intérêt
(Wipf et al., 2009 ; Chongsiriwatana et al., 2008). Le CSA-13, un composé synthétique de la
famille de céragenines a été synthétisé pour contourner certains inconvénients rencontrés avec
les PAM naturels (Epand et al., 2008).
D’autre part, l’utilisation de formulations appropriées peut contribuer à une diminution
de la susceptibilité des PAM aux protéases. La dégradation du peptide LL-37 par l’élastase de
P. aeruginoa est bloquée par des inhibiteurs de métalloprotéases (par exemple, GM6001) et la
co-administration est une option de traitement à évaluer (Schmidtchen et al., 2002). La
formulation des PAM avec des liposomes est également décrite (voir paragraphe suivant).
Introduction
60
Cependant, malgré le faible temps de demi-vie (t1/2) de nombreux PAM, évalué en
minutes ou en heures, le t1/2 du peptide LL-37 mesuré après injection intraveineuse de 100 µg
de LL-37 est de 3,4 jours dans le sérum de la souris (Bals et al., 1999).
IV.7.3 Profil toxicologique
Les PAM ont attiré une attention considérable pour leur large spectre d'activité
antimicrobienne et pour leur tendance réduite à induire une résistance bactérienne. De
nouvelles préoccupations sur leur cytotoxicité pourraient cependant finalement compromettre
leur développement en tant que médicament.
Diverses approches ont été employées pour optimaliser la séquence initiale des PAM
dans le but d’améliorer les effets antimicrobiens tout en réduisant les effets cytotoxiques
indésirables sur les cellules de mammifères (Hilpert et al., 2006 ; Chou et al., 2008 ; Park et
al., 2009). Récemment, Liu et ses collègues ont synthétisé des peptides hybrides avec feuillet-
β en épingle à cheveux avec une sélectivité cellulaire améliorée pour un grand nombre de
bactéries à Gram positif et négatif (Liu et al., 2013). Des modifications du peptide LL13-31
(IG-19, un dérivé du LL-37) ont permis d’augmenter la sélectivité cellulaire procaryote versus
eucaryote du peptide et sa stabilité face aux protéases : la substitution des acides aminés 4, 10,
14, 15 et 18 de IG-19 par 4 résidus lysines et 1 résidu tryptophane, le remplacement des
résidus-L par des résidus-D et les analogues diastéréomériques ou énantiomériques permettent
une activité antibactérienne sélective, sans toxicité mammalienne et avec une stabilité
augmentée (Nan et al., 2012a ; Nan et al., 2012b).
Les effets cytotoxiques des PAM in vivo peuvent être atténués par liaison avec des
composants retrouvés dans le sérum comme les apolipoprotéines-I (Wang et al., 1998 ;
Sorensen et al., 1999). L’équipe de Sorensen suggère un rôle de réservoir conféré par les
lipoprotéines qui lient la cathélicidine hCAP18 (Sorensen et al., 1999).
L’utilisation de formulations appropriées, comme le développement de liposomes
permettant de piéger puis de libérer les PAM, peut représenter une alternative à l’application
directe de ces substances et donc limiter leur toxicité (Hancock et Sahl, 2006 ; Desai et al.,
2002). Plusieurs groupes mettent en évidence des nanostructures lipidiques comme outil
prometteur d’encapsulation et de libération des peptides (Brandelli, 2012 ; Urban et al., 2012).
Tableau 1 : Peptides antimicrobiens et développement des médicaments
D’après Fjell et al., 2012.
Introduction
61
Afin de contourner la toxicité systémique, l’application topique des PAM est
exploitée. Dans cette approche, des méthodes de délivrance locale des PAM, par
immobilisation et libération des PAM à partir d’implants, sont explorées (Chau, 2010). La
libération locale de PAM à partir de structures nanotubulaires en TiO2 a montré une grande
activité antibactérienne dans les infections péri-implants (Ma et al., 2011). L’administration
locale des PAM dans le tractus respiratoire par aérosol semble particulièrement intéressante
pour le traitement des infections pulmonaires (Hancock et Sahl, 2006). L’administration
locale par inhalation de peptides et de protéines a déjà des applications thérapeutiques comme
la DNase (Pulmozyme®, Genentech, San Francisco, CA, USA) administrée chez les patients
atteints de mucoviscidose pour diminuer la viscosité des expectorations.
IV.7.4 Développement clinique actuel des PAM
Actuellement au moins 15 peptides ou mimétiques sont dans (ou ont complété) les
études cliniques comme agents antimicrobiens ou immunomodulateurs (voir Tableau 1).
L’omiganan, un peptide cationique de défense de l’hôte dérivé de l’indolicidine, est en phase
II des essais cliniques pour son efficacité dans la prévention des infections associées aux
cathéters. Le pexiganan, un analogue synthétique de la magainine dérivée de la peau de
grenouille, a complété la phase III des essais cliniques et cible la prévention des ulcères du
pied diabétique, ainsi que l’iseganan, un dérivé synthétique de la protégrine-1, pour la
prévention de la mucosité buccale chez les patients subissant une radiothérapie. Ces produits
n’ont cependant pas obtenu l’approbation de la New Drug Application (NDA) pour cause de
non capacité à démontrer un avantage par rapport aux traitements existants (Yeung et al.,
2011 ; Ranall et al., 2012 ; Fjell et al., 2012). La plectasine, une défensine fongique, est en
phase préclinique pour son activité envers des bactéries résistantes, comme celles
responsables de pneumonies. Le peptide possède une efficacité importante dans des infections
systémiques (Zaiou, 2007 ; Schneider et al., 2010).
Dans l'ensemble, les peptides qui sont actuellement en études cliniques offrent des
alternatives intéressantes aux traitements standards et soulignent que les PAM synthétiques
sont un domaine actif et prometteur de la recherche scientifique (Fjell et al., 2012).
Figure 27 : CSA-13
Introduction
62
V. LES CERAGENINES
Une des cibles fréquemment étudiées pour le développement de nouveaux
médicaments est la membrane bactérienne. Celle-ci est une cible intéressante étant donné que
les éléments structurels qui la composent sont pour la plupart conservés. Les perturbations et
la perméabilisation provoquées au niveau des membranes bactériennes infligent des
dommages généralement trop difficiles à réparer pour la bactérie. De nombreux agents actifs
au niveau de la membrane bactérienne, dont les PAM, possèdent des caractéristiques
communes : ces agents sont des molécules cationiques et amphiphiles (Chin et al., 2008).
La recherche d’analogues aux PAM a débuté et dans ce but, Li et ses collaborateurs
ont exploré des dérivés de l’acide cholique (Li et al., 1999). La synthèse de dérivés de l’acide
cholique avec des groupements aminoalkyls ajoutés aux groupements hydroxyles a permis
d’aboutir à une classe de composés appelés « céragenines ». Les groupements amines sont
protonés à pH neutre, d’où le nom de Cationic Steroid Antibiotics (CSA) également donné à
ces molécules (Epand et al., 2008). Comme les groupements hydroxyles des acides biliaires
sont orientés sur une face de la molécule, ces composés sont facialement amphiphiles avec un
côté hydrophobe formé par le noyau stérane et les charges positives des groupements amines
formant la face hydrophile de la molécule. De cette manière, les céragenines ressemblent aux
hélices amphiphiles formées par les PAM et possèdent des activités antibactériennes
comparables à celles des PAM (Chin et al., 2007 ; Ding et al., 2002). Le CSA-13 est le plus
actif des dérivés de l’acide cholique.
V.1 PROPRIETES ANTIBACTERIENNES DU CSA-13
La classe des composés céragenines (stéroïdes cationiques) agit par un mécanisme
comparable aux PAM (Ding et al., 2002). Dans des conditions physiologiques, les dérivés de
l’acide cholique portent de multiples charges positives et s’associent préférentiellement aux
membranes bactériennes chargées négativement (Li et al., 1999). Par sa haute affinité pour
ces dernières, le CSA-13 est capable de perturber rapidement l’intégrité de la membrane
ciblée et d’aboutir à la mort cellulaire (Savage et al., 2002). L’efficacité des céragenines est
fortement liée à la composition lipidique de la membrane et à la haute affinité des céragenines
Introduction
63
pour les lipides A, constituants de la membrane externe des bactéries à Gram négatif (Ding et
al., 2004). Cette propriété est à la base de la sélectivité pour les cellules procaryotes versus
eucaryotes et pour les bactéries à Gram négatif versus Gram positif (Ding et al., 2002 ; Epand
et al., 2007).
Par ailleurs, on reconnaît aux agents antibactériens cationiques des fonctions anti-
inflammatoires. Les épisodes inflammatoires répétés caractérisent les poumons de patients
atteints de mucoviscidose et exacerbent l’état pathologique de ces patients. Le CSA-13,
comme le peptide LL-37, fixe les LPS, composants de la membrane bactérienne. Une
conséquence potentiellement bénéfique de cette interaction est la suppression de
l’inflammation provoquée par les composants de la membrane bactérienne (Bucki et al.,
2007b).
V.2 CSA-13 ET MUCOVISCIDOSE
Différentes études ont comparé les avantages du stéroïde cationique CSA-13 par
rapport au peptide cationique antibactérien LL-37 pour leur action bactéricide dans le
traitement des infections chroniques de patients atteints de mucoviscidose.
La présence d’ADN et d’actine-F en grandes concentrations au niveau des
expectorations des patients malades limite l’utilisation du peptide LL-37. Le CSA-13 offre
l’avantage d’être moins sensible à l’inactivation par l’ADN ou l’actine-F. Ce phénomène
s’explique par des différences structurelles entre les deux molécules. Le CSA-13 est une
molécule de taille plus petite que le peptide LL-37, avec une charge nette positive plus faible
et une distribution de la densité de charge différente. Les deux molécules diffèrent également
par leur conformation. L’activité du CSA-13 étant moins compromise par l’ADN et l’actine-
F, la molécule peut interagir avec les charges de la membrane bactérienne.
L’activité antibactérienne du peptide LL-37 est également inhibée par les mucines
salivaires, contrairement au CSA-13 qui conserve la plupart de ses fonctions (Bucki et al.,
2008). Les mucines salivaires sont constituées de chaînes polypeptidiques et glucidiques, qui
Introduction
64
donnent à la salive sa viscosité. La mucoviscidose se caractérise notamment par une
hypersécrétion de mucines salivaires (Carnoy, 1991).
En outre, la nature non peptidique du CSA-13 permet d’accroître sa stabilité envers la
protéolyse par les enzymes des cellules de l’inflammation (Bucki et al., 2007b).
La classe des céragenines offre dès lors un potentiel thérapeutique dans le traitement
des infections par P. aeruginosa des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose.
But du travail
65
BUT DU TRAVAIL
But du travail
66
Le but de ce travail a été d’étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques dirigées
contre les infections pulmonaires à P. aeruginosa impliquant la formation d’un biofilm chez
les patients atteints de mucoviscidose afin de contourner l’émergence de la résistance face aux
antibiotiques conventionnels.
Ce travail nous a dans un premier temps amenés à caractériser plusieurs souches de P.
aeruginosa, comprenant des souches de référence et des souches cliniques isolées des
expectorations de patients atteints de mucoviscidose, notamment pour leur capacité à adhérer
à une surface et à développer un biofilm.
Nous nous sommes ensuite intéressés à l’étude d’un nouvel antibiotique potentiel, le
CSA-13, sur les biofilms formés par les souches cliniques de P. aeruginosa. L’objectif était
d’investiguer l’ensemble des propriétés du composé sur les différents modes de vie de P.
aeruginosa (culture planctonique, formation du biofilm et biofilm préétabli) ainsi que
d’établir l’intérêt d’une co-administration du CSA-13 avec la tobramycine, un antibiotique
utilisé actuellement chez les patients atteints de mucoviscidose. Nous avons également
exploré la toxicité du composé et avons tenté de minimaliser les effets toxiques du CSA-13
par association de la molécule à l’acide pluronique.
Notre travail a aussi consisté à identifier les séquences essentielles à l’effet
antimicrobien et antibiofilm du peptide LL-37, la seule cathélicidine humaine, afin
d’optimaliser les propriétés du peptide dans le combat contre P. aeruginosa. Par utilisation
d’une librairie de fragments dérivés du LL-37, nous avons tenté d’identifier les fragments
peptidiques présentant une efficacité antibactérienne et antibiofilm importante accompagnée
d’une toxicité réduite. Nous nous sommes également intéressés à certaines propriétés des
différents fragments, comme leur structure secondaire ou leur capacité à fixer des LPS,
fonction de leur activité antimicrobienne.
Ce travail devrait donc contribuer au développement de nouvelles thérapeutiques dans
la prévention ou le traitement des infections pulmonaires chez les patients atteints de
mucoviscidose.
Matériel et Méthodes
67
MATERIEL ET
METHODES
Matériel et Méthodes
68
I. MATERIEL
I.1 SOUCHES BACTERIENNES
Le travail s’est porté sur l’étude de différentes souches de P. aeruginosa. Parmi elles,
3 souches de référence : les souches ATCC 15692 PAO1, ATCC 9027 et ATCC 15442. Les
souches cliniques proviennent des expectorations de patients atteints de mucoviscidose ; les
souches P. aeruginosa PYO1, PYO2 sont fournies par le centre de la mucoviscidose de
l’Hôpital Erasme et les souches MC75-450457, MC099-450467 et MC093-450507
proviennent de l’Université de Gent. Quatre de ces souches sont de phénotype mucoïde : les
souches PYO2, MC75-450457, MC099-450467 et MC093-450507. Des cultures bactériennes
sont stockées à -20 °C dans du glycérol. Avant utilisation, les colonies bactériennes sont
étalées sur un milieu Mueller Hinton (MH) solide et incubées à 37 °C pendant 24 h. Après
incubation, l’identification des souches est confirmée à l’aide d’une galerie API 20NE
(bioMérieux Marcy-l’Etoile, France). Les bactéries sont repiquées maximum 3 fois sur gélose
MH.
Les souches de P. aeruginosa PAO1 exprimant la Green Fluorescent Protein (GFP),
PAO1 (pMF230) (Nivens et al., 2001) et la Red Fluorescent Protein (RFP), PAO1 (pMF440)
(non publié) utilisées dans les expériences de microscopie confocale à balayage laser (MCBL)
ont été fournies par le Pr M.J. Franklin (Center for Biofilm Engineering, Montana, Etats-
Unis). Les deux plasmides contiennent un marqueur de résistance à la carbénicilline. La
souche donneuse de E. coli portant le plasmide mobilisable pMF230 (Nivens et al., 2001) et la
souche mobilisatrice de E. coli (helper strain) portant le plasmide conjugatif pRK2013
(Figurski et Helinski, 1979) ont également été fournies par le Pr M.J. Franklin. Le plasmide
de ces 2 souches leur confère une résistance à la kanamycine.
Les souches P. aeruginosa CGMCC 1.860 et A. tumefaciens NTL4(pZLR4) ont été
fournies par le Dr J.J. Zhong (East China University of Science and Technology, Shangai,
Chine) et par le Pr S. Farrand (University of Illinois, Urbana-Champagne, Etats-Unis)
respectivement. Ces 2 souches ont été génétiquement modifiées afin d’être utilisées comme
souches biorapporteurs pour C4-HSL (Yong et Zhong, 2009) et Cn≥6-HSL (Cha et al., 1998)
respectivement.
Matériel et Méthodes
69
La souche E. coli ML-35p provient du laboratoire du Pr R.I. Lehrer (UCLA-Center for
the Health Sciences, Los Angeles, Etats-Unis) et a été créée spécifiquement pour étudier la
perméabilisation de la membrane externe et interne d’une même souche.
Préparation de la suspension bactérienne initiale (SBI)
Les souches de P. aeruginosa sont incubées 18 à 24 heures à 37 °C sur gélose MH de façon à
obtenir des colonies isolées. Après cette incubation, quelques colonies sont prélevées,
transférées dans 10 mL de milieu de culture et incubées sous agitation orbitale à 37 °C
pendant une nuit (Gallenkamp Orbital Incubator, Sanyo, Pocklington, UK). Le lendemain, la
densité optique (DO) 600 nm est ajustée de 0,010 à 1,000 en fonction de la sensibilité de la
manipulation à effectuer.
I.2 AGENTS ANTIBACTERIENS
Préparation de l’association CSA-13 et acide pluronique F-127
Le CSA-13 a été fourni par le Pr P.B. Savage (Brigham Young University, Utah, Etats-Unis).
L’acide pluronique F-127 est un hydrogel thermoréversible formant une solution à faible
température et un gel à température corporelle (lorsque la concentration en acide pluronique
F-127 est supérieure à 15 %). L’acide pluronique F-127 est ajouté à l’eau afin d’atteindre une
concentration de 30 % et le mélange est chauffé à 60 °C (formation d’un gel). Le mélange est
ensuite refroidi à 4 °C afin d’obtenir une solution. Les étapes de chauffage et de
refroidissement sont répétées jusqu’à l’obtention d’une solution homogène. La solution de
CSA-13 est ajoutée à la solution aqueuse d’acide pluronique F-127 à 30 % à 4 °C afin
d’atteindre la concentration désirée en composé stéroïdien.
Peptides
La synthèse du peptide LL-37 et des différents fragments a été réalisée par l’équipe du Pr J.G.
Bolscher (University of Amsterdam and VU University Amsterdam, Amsterdam, Pays-Bas)
comme décrit précédemment (den Hertog et al., 2006).
B
Figure 28 : Formation du biofilm par le BFRT®
Figure A : Absence de biofilm. Lorsque les bactéries ne forment pas de biofilm, les billes
présentes dans le puits sont totalement mobiles et forment un spot au centre du puits après
application d’un champ magnétique. L’indice de formation du biofilm (IFB) est supérieur à 7.
Figure B : Biofilm en développement. Quand un biofilm se développe à la surface du fond du
puits, les particules sont progressivement immobilisées, et sont moins nombreuses à réagir
sous l’influence du champ magnétique. On observe une atténuation du spot. L’IFB est
compris entre 7 et 2. Figure C : Biofilm couvrant toute la surface du puits. En présence d’un
biofilm totalement formé, toutes les particules sont immobilisées. On n’observe plus de spot
suite à l’application du champ magnétique. L’IFB se stabilise autour de 1,5 (BioFilm
Control®, 2010).
A
C
Matériel et Méthodes
70
II. METHODES
II.1 FORMATION DES BIOFILMS
II.1.1 Formation des biofilms par le BFRT®
Principe
La technique de formation du biofilm par la technique du BioFilm Ring Test®
(BFRT®) est réalisée dans une microplaque. Les bactéries sont incubées en présence de billes
magnétisables de la taille des bactéries. L’exposition des billes à un champ magnétique induit
leur agrégation dans le centre du puits et un spot visible se forme. Les billes qui sont piégées
dans le biofilm ne sont pas capables de s’agréger en réponse à un champ magnétique et aucun
spot visible n’est observé. La taille du spot peut être utilisée comme une mesure de la mobilité
des billes (Chavant et al., 2007).
Protocole expérimental
La formation du biofilm est évaluée par la méthode du BFRT®
selon la technique
décrite par Chavant et al. (2007). Après 1 min d’homogénéisation, une solution de billes
magnétiques (Toner) est ajoutée à la SBI préparée dans un milieu BHI (essai test) ou au
milieu BHI (essai contrôle) à une concentration finale de 10 µL/mL. Deux cents µL de ce
mélange sont ajoutés dans les puits d’une microplaque stérile organisée en 12 barrettes Strip
Well MSW002B de polystyrène individuelles de 8 puits. Chaque souche est étudiée en
triplicat. Deux puits servent de contrôle négatif et le mélange BHI-Toner y est ajouté. Les
puits sont ensuite couverts et la plaque transférée dans une atmosphère humide pour une
incubation à 37 °C. Les étapes initiales de la formation du biofilm sont évaluées après 0, 10,
20, 30, 45, 60 et 90 min d’incubation. Cent µL de liquide de contraste sont alors ajoutés aux
différents puits. Cette huile opaque et inerte est non toxique et permet la lecture de la plaque
par un lecteur à plaques spécialement conçu pour le test (BFRT®
). Après avoir scanné une
première image, la plaque est soumise à un champ magnétique pendant 1 min et une seconde
image est scannée. Le programme calcule l’IFB pour chaque puits, en se basant sur la
comparaison des 2 images, selon le logiciel BioFilm Control® Software.
Matériel et Méthodes
71
II.1.2 Formation des biofilms par coloration au cristal violet (CV)
L’étude cinétique de la formation du biofilm s’inspire de la technique décrite par
Stepanovic et al. (2000) et est basée sur la mesure colorimétrique de l’incorporation du CV
par les cellules sessiles. Les barrettes stériles Strip Well MSW002B en polystyrène, fournies
par BioFilm Control®, sont inoculées par 200 µL de la SBI préparée dans un milieu BHI. Un
contrôle négatif est réalisé par ajout dans les puits de 200 µL de BHI stérile. Les barrettes sont
recouvertes et incubées en chambre humide à 37°C. Différents temps d’incubation sont
étudiés (de 1 à 48 h). Le milieu de culture est ensuite aspiré et les puits sont lavés 3 fois à
l’aide de 200 µL d’eau distillée afin d’éliminer les cellules non adhérentes. Après séchage à
l’air pendant 45 min, les cellules adhérentes sont colorées par une solution de CV 0,1 %
(m/V) et le colorant est laissé en contact avec les puits pendant 45 min. Ensuite, l’excès de
colorant est éliminé et les puits sont lavés 3 fois à l’aide de 300 µL d’eau distillée. Le CV est
dissous à l’aide d’une solution d’acide acétique glacial à 33 % et l’absorbance de chaque puits
est lue à 540 nm (Synergy HT; Bio-Tek, Winooski, VT, USA). Les résultats sont exprimés en
ΔDO 540 nm (DO 540 nm échantillon – DO 540 nm contrôle).
II.1.3 Formation des biofilms par dénombrement
La formation du biofilm est réalisée dans les barrettes Strip Well MSW002B fournies
par BioFilm Control® par inoculation des puits avec 200 µL de la SBI. Un contrôle est réalisé
par ajout de milieu BHI stérile uniquement. Les barrettes sont ensuite incubées à 37 °C en
atmosphère humide pendant différents temps (de 10 à 60 min). Après incubation, le milieu est
aspiré et les puits sont rincés à l’aide d’un tampon phosphate de potassium 10 mM (pH 7,5) et
rendu isotonique par ajout de 0,9 % NaCl afin d’éliminer les cellules non attachées (Tré-
Hardy et al., 2008). Du milieu BHI frais est ajouté aux puits. Les barrettes sont scellées et
sonifiées à 25 °C pendant 5 min afin de mettre en suspension les cellules formant le biofilm.
Le dénombrement des bactéries est réalisé en prélevant des aliquots de ces suspensions
bactériennes et en les étalant sur des boîtes de Petri contenant un milieu Tryptic Soy Agar
(TSA) solide. Après incubation pendant 48 h à 32-34 °C, la lecture du nombre d’unité
formant colonie (ufc) est réalisée.
Figure 29 : Principaux rhamnolipides de P. aeruginosa
Matériel et Méthodes
72
II.2 MOTILITE DES SOUCHES
Deux types de motilité de la bactérie sont étudiés selon le protocole décrit par Wilhelm
et al. (2007) : la mobilité de type swimming (nage en milieu liquide) et swarming (essaimage
sur une surface). La motilité de P. aeruginosa est évaluée sur des boîtes d’agar Proteose
Peptone-Glucose-Ammonium Salts (PPGAS). Le contenu en agar varie en fonction de la
motilité étudiée : 0,5 % pour le swarming et 0,3 % pour le swimming. Les boîtes pour le
swarming contiennent 0,05 % de glutamate au lieu du chlorure d’ammonium. Pour l’étude du
swimming, 2 µL de la SBI préparée dans un bouillon Luria Bertani (LB) sont déposés en
surface de l’agar et incubés pendant 1 nuit (16 h) à température ambiante. Pour l’étude du
swarming, 2 µL de la SBI sont déposés en surface de l’agar et incubés pendant 1 nuit (16 h) à
30 °C. Le lendemain, le diamètre de motilité des souches est mesuré à l’aide du ChemDoc
XRS+ et le software Image Lab™ 3.0 (Bio Rad Laboratories, Nazareth, Belgique), et les
résultats sont exprimés en surface (mm²).
II.3 PRODUCTION DE RHAMNOLIPIDES
Principe
Les rhamnolipides contiennent 1 ou 2 molécules de rhamnose liées à 1 ou 2 molécules
d’acide β-hydroxyalcanoïque (principalement en C10). Parmi les méthodes d’analyse des
rhamnolipides, on retrouve les méthodes colorimétriques à l’anthrone, à l’acide phénol-
sulfurique et à l’orcinol. Ces méthodes impliquent l’extraction dans un solvant organique des
rhamnolipides de l’échantillon aqueux, suivie d’une hydrolyse acide pour séparer le rhamnose
(3-deoxy-hexose) de la portion lipidique de la molécule. Le sucre est ensuite quantifié par
spectrophotométrie après réaction avec l’anthrone, le phénol ou l’orcinol (Pinzon et Ju, 2009).
Nous avons réalisé un dosage à l’orcinol afin de quantifier les rhamnolipides dans le
surnageant du milieu de culture.
Protocole expérimental
La SBI est obtenue après 48 h d’incubation à 30 °C de quelques colonies suspendues
dans 20 mL de milieu PPGAS. Le milieu de culture est collecté et les rhamnolipides
quantifiés par le dosage du rhamnose (3-deoxy-hexose) dans le milieu de culture. Le sucre est
dosé par la méthode de coloration à l’orcinol en milieu acide (Wilhelm et al., 2007). Trois
Matériel et Méthodes
73
cent µL de surnageant sont prélevés et extraits 2 fois avec 600 µL de diéthyléther. Les 2
extraits sont rassemblés et évaporés à sec (Speedvac – Eppendorf Concentrator 5301). Le
résidu est dissous dans 100 µL d’eau distillée et mélangé à 100 µL d’orcinol 1,6 % et 800 µL
d’acide sulfurique 60 %. Après chauffage à 80 °C pendant 30 min, l’absorbance est lue à 421
nm. Les absorbances obtenues avec les échantillons sont comparées à une courbe standard
établie avec des concentrations croissantes en rhamnose et les résultats exprimés en
équivalents rhamnose (µg de rhamnose/mL de milieu de culture).
II.4 SENSIBILITE A UN ANTIBIOTIQUE
Les 8 souches de P. aeruginosa sont incubées pendant 24 h à 37 °C dans les puits
d’une microplaque (Nunc MicroWell Plates ; Nalge Nunc International Corp. Rochester, NY)
comme décrit précédemment (Moskowitz et al., 2004). Brièvement, les plaques sont couvertes
d’un couvercle présentant 96 pointes immergées dans les puits et sur lesquelles le biofilm se
développe. Après cette incubation, les pointes du couvercle sont lavées, le couvercle transféré
sur une nouvelle plaque et les pointes sont plongées dans les puits remplis d’un nouveau
milieu, en absence ou en présence de 4 mg/L de tobramycine. Les biofilms jeunes sont
exposés pendant 24 h au composé avant le dénombrement des bactéries afin de déterminer la
quantité d’ufc sur les pointes. Les résultats sont exprimés en diminution logarithmique du
nombre d’ufc/mL.
II.5 ACTIVITE PROTEOLYTIQUE
Principe
La méthode de détermination de l’activité protéolytique est une méthode
colorimétrique utilisant l’azocaséine comme substrat. Cette protéine est composée de caséine
(protéine du lait) et d’un groupement azo. Après contact du substrat avec les protéases,
l’azocaséine est clivée et libère le groupement azo (indicateur coloré). L’ajout d’acide
trichloroacétique (TCA) permet la précipitation de l’azocaséine non hydrolysée. L'absorbance
du groupement azo libéré par protéolyse est lue à 405 nm sur le surnageant et reflète l’activité
protéolytique (Perez Fabiel, 2009).
Matériel et Méthodes
74
Protocole expérimental
L’activité protéolytique des différentes souches de P. aeruginosa est évaluée selon le
protocole décrit par Nicodème et al. (2005). Les souches sont incubées pendant 48 h dans 10
mL de milieu Mineral Salt (MS) supplémenté en lait. Le mélange réactionnel contient 500 µL
de surnageant de culture bactérienne et 100 µL d’une solution d’azocaséine à 30 mg/mL. Un
contrôle négatif est réalisé en parallèle contenant uniquement du milieu MS et l’azocaséine.
Le mélange réactionnel est incubé à 37 °C pendant 3 h. A la fin de l’incubation, la réaction est
arrêtée par ajout de 100 µL de TCA 20 % (m/V) et les échantillons sont maintenus à
température ambiante pendant 10 min. Le mélange réactionnel est centrifugé à 6000 tpm
pendant 10 min. L’absorbance du surnageant est lue à 405 nm à l’aide de notre lecteur à
plaques.
II.6 ACTIVITE ELASTOLYTIQUE
Principe
L’élastine congo rouge (ECR) est un produit insoluble. L’activité enzymatique de
l’élastase permet le clivage du substrat ECR et la libération d’un produit soluble qui peut être
quantifié par mesure de l’absorbance. L’activité optimale de l’élastase est observée à une
température de 37 °C.
Figure 30 : Essai biorapporteur avec la souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4)
(production des Cn≥6-HSL)
Adapté d’après Steindler et Venturi, 2007.
Figure 31 : Hydrolyse de X-Gal par la β-Galactosidase
traG traR lacZ
Matériel et Méthodes
75
Protocole expérimental
L’activité de l’élastase des différentes souches de P. aeruginosa est mesurée selon le
protocole décrit par Bosgelmez-Tinaz et Ulusoy (2008). Un petit volume (1,5 mL) de la SBI
est prélevé et centrifugé à 6000 tpm pendant 5 min. Cent µL du surnageant sont ajoutés à 900
µL de tampon ECR (100 mM TRIS-HCl ; 1 mM CaCl2 ; pH 7,5) contenant 20 mg de ECR. Le
mélange est incubé à 37 °C pendant 3 h sous agitation. L’ECR insoluble est éliminé par
centrifugation et la DO du surnageant est lue à 495 nm. Un contrôle négatif par ajout
uniquement de milieu LB est incorporé dans l’expérience.
II.7 PRODUCTION D’AHL
II.7.1 Production des Cn≥6-HSL
II.7.1.2 Etude sur boîte de Petri
Principe
La souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4) conçue par Cha et al. (1998) est utilisée
comme souche biorapporteur pour détecter Cn≥6-HSL. Il s’agit d’une souche mutante de A.
tumefaciens dépourvue du plasmide Ti habituellement hébergé par A. tumefaciens et sur
lequel est localisé le gène codant pour TraR, homologue de LuxR et récepteur des HSL. Cette
souche est incapable de synthétiser des HSL car son gène traI a été inactivé. Par contre le
plasmide pZLR4 a été inséré dans la souche. Ce plasmide confère à la bactérie une résistance
à la gentamicine. D’autres gènes sur pZLR4 incluent la fusion traG::lacZ et traR. Le gène
traG a été muté (interrompu) par l’insertion d’un gène lacZ (codant pour la β-galactosidase).
Ce gène (traG::lacZ) requiert l’activateur de transcription TraR et une AHL pour son
expression. Des AHL exogènes peuvent dès lors induire l’expression du gène rapporteur
traG::lacZ et l’activité de la β-galactosidase peut être utilisée comme indicateur de la
présence d’AHL (Szenthe et Page, 2003). La β-galactosidase hydrolyse le dérivé 5-bromo-4-
chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) incolore introduit dans le milieu provoquant
la formation d’un halot d’une coloration bleue visible à l'oeil nu (précipité bleu du dérivé 5,5’-
dibromo-4,4’-dichloroindigo). TraR répond à différentes AHL avec un groupement acyle plus
long que 4 carbones (Cha et al., 1998).
Figure 32 : Hydrolyse de MUG par la β-Galactosidase
Matériel et Méthodes
76
Protocole expérimental
L’étude de la production des AHL par les différentes souches de P. aeruginosa est
réalisée selon le protocole détaillé de Szenthe et Page (2003). La souche biorapporteur A.
tumefaciens NTL4(pZLR4) est cultivée dans un milieu Agrobacterium (AB) contenant 30
mg/L de gentamicine, pendant une nuit à 28 °C et 150 tpm. Après incubation, la suspension
bactérienne est ajustée à une DO 600 nm finale de 0,240 ± 0,005. Dix mL de milieu AB
contenant 40 mg/L du dérivé X-Gal et 1,5 % d’agar sont coulés dans des boîtes de Petri
laissées au repos jusqu’à solidification. Cinq mL de la souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4)
incubée une nuit sont ajoutés à 5 mL de milieu AB contenant 1,5 % d’agar. Le mélange est
homogénéisé prudemment (concentration finale en agar 0,75 %). Ce mélange est
immédiatement versé dans la boîte de Petri préalablement préparée et contenant le substrat X-
Gal. Lorsque la couche d’agar est solidifiée, 10 µL de la SBI des différentes cultures de P.
aeruginosa sont piquées dans l’agar. Les boîtes sont ensuite incubées à 28 °C pendant 48 h.
L’activité de la β-galactosidase est détectée par la formation d’un spot de couleur bleue. Ceci
indique une réaction positive avec hydrolyse du substrat X-Gal. La surface du spot est
mesurée par le ChemDoc XRS+ et le software Image Lab™ 3.0.
II.7.1.3 Etude sur microplaque
Principe
L’expérimentation repose sur un principe semblable au précédent. La souche A.
tumefaciens NTL4(pZLR4) permet la détection des AHL produites par P. aeruginosa par
mesure de l’activité de la β-galactosidase. L’activité de l’enzyme est évaluée par simple ajout
d’un substrat fluorogène : le 4-méthy-lumbelliféryl β-D-galactopyranoside (MUG).
L’hydrolyse du substrat par la β-galactosidase produit un dérivé fluorescent, le 4-
méthylumbelliférone (MU).
Protocole expérimental
La production de Cn≥6-HSL est quantifiée selon la technique décrite par Vidal-Aroca et
al. (2006) après extraction des HSL selon le protocole modifié de Nakagami et al. (2011). Les
HSL extraites et concentrées sont mises en présence de la souche biorapporteur A.
tumefaciens NTL4(pZLR4) et l’activité de la β-galactosidase induite par les HSL est dosée.
Les SBI de P. aeruginosa sont centrifugées et 700 µL de surnageant sont prélevés. Dans un
Matériel et Méthodes
77
tube Eppendorf, 700 µL d’acétate d’éthyle sont ajoutés aux 700 µL de surnageant. Les tubes
sont agités pendant 10 min. La phase supérieure est prélevée et une deuxième extraction est
effectuée. Les extraits sont alors réunis et 300 µL de la phase organique sont évaporés à l’aide
du Speedvac. Le résidu est mis en suspension dans 10 µL d’HCl 10 mM. Dans une plaque 96-
puits, 2 µL de chaque échantillon sont mis en présence de 100 µL d’une culture de A.
tumefaciens NTL4(pZLR4) dans du milieu AB pour la quantification des HSL. Un contrôle
est réalisé contenant uniquement la culture de A. tumefaciens NTL4(pZLR4). La plaque est
incubée 18 h à 28 °C. Après incubation, 20 µL de chaque culture sont transférés dans une
nouvelle plaque 96-puits contenant 80 µL de tampon Z (Na2HPO4.7H2O 0,06 M ;
NaH2PO4.H2O 0,04 M ; KCl 0,01 M ; MgSO4 0,001 M ; β-mercaptoéthanol 0,05M ; pH 7,0).
Vingt-cinq µL de 4-méthy-lumbelliféryl β-D-galactopyranoside (MUG) à 1 mg/mL dans du
diméthylsulfoxide (DMSO) sont ajoutés à chaque puits et la fluorescence générée par
l’hydrolyse de MUG (suite à l’action de la β-galactosidase) est quantifiée dans un fluorimètre
à microplaques. Une cinétique de l’augmentation de la fluorescence après ajout du MUG est
réalisée pendant 30 min (λ excitation = 360 nm, λ émission = 460 nm). Les résultats sont
exprimés en vitesse de l’augmentation de la fluorescence.
II.7.1.4 Etude par chromatographie sur couche mince (CCM)
Une CCM permettant de caractériser les Cn≥6-HSL produits par les différentes souches
est réalisée comme décrit par Shaw et al. (1997). La souche A. tumefaciens NTL4(pZLR4) est
cultivée à 28 °C dans un milieu AB minimal liquide contenant 0,4 % de mannitol. Cinq mL
des SBI de P. aeruginosa sont centrifugés et les surnageants extraits deux fois à l’aide de
volumes égaux en acétate d’éthyle HPLC-grade. Les extraits sont rassemblés, séchés sur du
sulfate de magnésium anhydre, filtrés et évaporés à sec sous un flux d’azote. Le résidu est
concentré dans 50 µL d’acétate d’éthyle HPLC-grade. Les AHL présents dans les extraits sont
séparés à l’aide d’une chromatographie sur couche mince C18 en phase inversée (CCM Gel de
silice 60 RP-18 F254S, 10 x 20 cm, Merck, Darmstadt, Germany) à l’aide d’une phase mobile
composée de méthanol/eau (60 : 40, V/V). Les extraits (4 μL) sont appliqués sur la plaque C18
en phase inversée. Des dépôts de standards sont également réalisés (4 µL) : 0,9 nmoles de C6-
HSL, 30 pmoles de C8-HSL, 60 pmoles de 3-oxo-C8-HSL, 300 pmoles de C10-HSL
(Cayman Bio-Connect, Huissen, Pays-Bas) (Shaw et al., 1997). Après migration, la plaque est
séchée à l’air libre. Elle est ensuite transférée dans une boîte en Plexiglas et couverte par la
Figure 33 : Essai biorapporteur avec la souche P. aeruginosa CGMCC 1.860
(production des C4-HSL)
D’après Yong et Zhong, 2009.
Matériel et Méthodes
78
souche biorapporteur préparée dans un milieu AB maintenu à 45 °C contenant 0,4 % de
mannitol, 0,7 % d’agar et 60 mg/L X-Gal. Le mélange d’agar et de la souche biorapporteur
(150 mL) forme une fine pellicule (environ 3 mm) recouvrant la plaque de silice. Après
solidification, la boîte est incubée pendant 48 h à 28 °C. Durant cette incubation, des taches
bleues se développent aux endroits de migration des AHL. Une image digitale de la plaque est
analysée par le ChemDoc XRS+ et le software Image Lab™ 3.0. Les résultats sont représentés
par mesure du Rf pour chaque tache.
II.7.2 Production des C4-HSL
Principe
La production des C4-HSL par les différentes souches de P. aeruginosa est évaluée à
l’aide d’une souche biorapporteur dérivée de la souche P. aeruginosa CGMCC 1.860. Cette
souche a été isolée à partir de déchets de caoutchouc. Elle est capable de dégrader des dérivés
du benzène. En réponse à C4-HSL, elle produit un pigment bleu-vert. La production de C4-
HSL par cette souche est supprimée par introduction d’un plasmide suicide pYC2000∆rhlIR
et donc par délétion d’un fragment du gène rhlIR (rhlI-rhlR
-). Par ailleurs, le récepteur des C4-
HSL, RhlR, est surexprimé par insertion d’un plasmide multi-copies pYC-rhlR au niveau de
∆rhlIR. Ces modifications permettent donc d’obtenir la souche P. aeruginosa CGMCC 1.860
∆rhlIR / pYC-rhlR (rhlI-rhlR
++), une souche qui, en présence de C4-HSL, exprime les gènes
codant pour les enzymes participant à la voie de synthèse d’un pigment bleu-vert dont la
production peut être mesurée par lecture de l’absorbance (Yong et Zhong, 2009).
Protocole expérimental
Préparation des extraits
Les extraits de C4-HSL sont préparés à partir de 5 mL de surnageant des SBI des 8
souches (centrifugation à 3000 tpm pendant 10 min). Les surnageants sont alors extraits 3 fois
avec 5 mL d’acétate d’éthyle. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur du sulfate
de magnésium anhydre, filtrées et évaporées à sec. Les résidus sont dissous dans 1 mL
d’acétonitrile HPLC-grade et le résidu est conservé à -80 °C jusqu’à la réalisation de l’essai
biorapporteur.
Tableau 2 : Amorces utilisées pour séquencer lasI, lasR, rhlI et rhlR
Nom du
gène et n°
GenBank
Séquence amorce (5’-3’) Position dans le
génome
Taille
du gène
lasI Sens : ATGATCGTACAAATTGGTCGGC 1559254-1559275 607 bp
PA1432 Antisens : GTCATGAAACCGCCAGTCG 1559842-1559860
lasR Sens : ATGGCCTTGGTTGACGGTT 1558171-1558189 726 bp
PA1430 Antisens : GCAAGATCAGAGAGTAATAAGACCCA 1558871-1558896
rhlI Sens : ACGGCTGACGACCTCACAC 3889126-3889144 626 bp
PA3476 Antisens : CTTGGTCATGATCGAATTGCTC 3889730-3889751
rhlR Sens : GCTTCAGATGAGACCCAGC 3889922-3889940 731 bp
PA3477 Antisens : CAATGAGGAATGACGGAGGC 3890633-3890652
Matériel et Méthodes
79
Essai biorapporteur
Dix µL de nos échantillons sont pipetés dans le fond d’un tube (10 μL d’acétonitrile
HPLC-grade sont utilisés comme contrôle négatif). Après élimination du solvant par
évaporation, 1 mL de la souche biorapporteur incubée une nuit (DO 600 nm de 0,050 ± 0,005
dans un milieu Pseudomonas Broth (PB) avec ampicilline (100 mg/L) et tétracycline (250
mg/L)) est ajouté au tube test. Après mélange des tubes, ceux-ci sont incubés sous agitation à
30 °C pendant 24 h. Le surnageant (centrifugation à 3000 tpm pendant 10 min) est extrait 2
fois avec 0,5 mL de chloroforme. Les deux extraits de chloroforme sont rassemblés, évaporés
sous flux d’air et dissous dans 500 µL de méthanol. Cent cinquante µL de cette solution sont
transférés dans les puits d’une microplaque UV star (Greiner Bio-One, Wemmel, Begium) et
l’absorbance est mesurée à 299 nm avec un lecteur à plaques. Une courbe dose-réponse de C4-
HSL est réalisée en parallèle par utilisation de dilutions d’un standard préparées dans de
l’acétonitrile HPLC-grade.
II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS
L’ADN génomique est libéré avec un tampon de lyse et extrait à l’aide du GenElute
bacterial genomic DNA kit (Sigma, St Louis, MO) selon les instructions du fournisseur. Pour
déterminer la séquence de lasI, lasR, rhlI et rhlR, les 4 gènes sont amplifiés par utilisation des
oligonucléotides décrits par Schaber et al. (2004). Le protocole suivant est utilisé pour la
PCR : dénaturation à 94 °C pendant 30 sec, fixation des amorces à 50 °C (lasI et lasR) et à 55
°C (rhlI et rhlR) pendant 30 sec et élongation à 72 °C pendant 120 sec. Trente-quatre cycles
sont réalisés. Les produits de la PCR sont examinés par électrophorèse sur un gel d’agarose à
2 %. Après coloration de l’ADN à l’aide de GelRed, l’ADN est visualisé avec la lampe UV
d’un appareil ChemiDoc XRS+. La taille des fragments amplifiés est estimée par comparaison
avec l’échelle du standard GeneRuler 100-bp plus DNA. L’expérience est réalisée 3 fois. Les
produits obtenus après la PCR sont nettoyés par utilisation de la trousse DNA Clean-
Concentrator-5 kit (ZymoResearch, Bruxelles, Belgique) et séquencés par le laboratoire
Eurofins DNA (Ebersberg, Germany). La comparaison des 4 gènes avec les génomes publiés
de différents P. aeruginosa est réalisée par une recherche blast multigénique dans une
bibliothèque de souches de référence. La souche de référence avec le meilleur score pour la
souche étudiée est utilisée comme référence pour cette souche et chaque gène est comparé
avec la séquence trouvée dans le génome de la souche de référence sélectionnée. L’analyse est
Figure 34 : Cellule capillaire
D’après Zetasizer Nano Series, 2004.
Matériel et Méthodes
80
réalisée par utilisation des séquences obtenues avec les 2 amorces (sens et antisens). La
comparaison entre les séquences de la protéine de la souche de référence et de la souche testée
est réalisée par utilisation du logiciel SIM alignment tool (ExPASy, Switzerland).
II.8 POTENTIEL ZETA
Principe
Le principe de la mesure du potentiel zêta des bactéries est basé sur la dispersion
électrophorétique de la lumière. La suspension bactérienne est placée à l’intérieur d’une
cellule capillaire. Un laser est utilisé pour fournir une source de lumière aux particules au sein
de l’échantillon. La lumière incidente passe à travers le centre de la cellule contenant
l’échantillon et la lumière diffusée est détectée à un angle de 17°. La mobilité
électrophorétique des particules est évaluée par la mesure de la fluctuation de l’intensité de la
lumière diffusée. En effet, lorsqu’un champ électrique est appliqué à travers la cellule, les
particules au sein de la suspension vont migrer vers l’électrode de charge opposée avec une
vitesse proportionnelle à l’intensité de leur potentiel zêta. Les particules en mouvement vont
induire une fluctuation de la lumière détectée avec une fréquence dépendante de la vitesse de
la particule. Le détecteur envoie les informations au processeur de signal digital. Cette
information est ensuite traitée par un ordinateur où le logiciel Zetasizer Nano réalise un
spectre des fréquences à partir duquel la mobilité électrophorétique, et donc le potentiel zêta,
est calculé.
Protocole expérimental
Les mesures du potentiel zêta sont réalisées à 25 °C sur un instrument Malvern
Nanosizer ZS (Malvern, Worcestershire, UK). La DO des SBI est ajustée à l’aide d’un
tampon phosphate 10 mM (pH 7,0). La suspension bactérienne est ensuite transférée dans une
cellule capillaire destinée à la mesure du potentiel zêta (Zetasizer Nano Series, Malvern) et
maintenue à 25 °C. La sélection du voltage et de la durée de la mesure est effectuée
automatiquement par la machine. La qualité de la mesure est évaluée en examinant la courbe
représentant la variation de phase au cours du temps. Les mesures sont réalisées trois fois
avec deux dilutions de chaque souche. Trois lots différents de chaque souche sont étudiés.
Matériel et Méthodes
81
II.9 ETUDE SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES
II.9.1 Détermination de la CMI et de la CMB
La détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est effectuée dans des
microplaques par la technique de microdilution de 2 en 2 en bouillon Mueller Hinton Broth
ajusté en ions Ca2+
et Mg2+
(CAMHB), conformément au protocole du CLSI (Clinical and
Laboratory Standards Institute, 2003). Les puits contiennent 100 µL de chaque concentration
de produit à tester par dilution de 2 en 2 à partir du puits initial. Les puits de la microplaque
sont inoculés par 100 µL de la SBI. Deux puits contenant le bouillon de culture sont inclus
dans le test. L’un des puits est inoculé avec le microorganisme testé (témoin positif) et l’autre
contient uniquement 200 µL de CAMHB et sert de témoin négatif afin de valider la stérilité
du milieu. Les résultats sont lus, après une incubation de la microplaque à l’étuve à 35 °C
pendant 24 h, par observation visuelle de l’absence de turbidité en comparaison avec le
contrôle négatif. Afin de déterminer la concentration minimale bactéricide (CMB), les puits
clairs de cette même microplaque sont repiqués à l’aide d’anses stériles de 10 µL, ensuite
étalés sur milieu MH solide et incubés 24 h à 35 °C avant la lecture des résultats.
II.9.2 Essai de viabilité par perméabilisation au 1-N-phénylnaphtylamine
(NPN)
Principe
La molécule de NPN émet une fluorescence importante lorsqu’elle passe d’un
environnement polaire, par exemple le milieu de culture, vers un compartiment hydrophobe,
par exemple la membrane externe de la bactérie. La mesure d’une augmentation de la
fluorescence reflète ainsi la perturbation de la membrane liée à l’insertion du composé dans la
membrane.
Protocole expérimental
L’étude de la perméabilisation membranaire de P. aeruginosa au NPN est basée sur
une technique décrite précédemment (Loh et al., 1984) et est étudiée sur les souches ATCC
PAO1, MC093-450507 et PYO1. Les SBI sont centrifugées à 3000 tpm pendant 10 min et les
Matériel et Méthodes
82
cellules sont suspendues dans un tampon HEPES 5 mM (pH 7,35) contenant 10 mM d’azide
de sodium afin d’atteindre une DO 600 nm de 0,5. Cette nouvelle suspension cellulaire est
laissée au repos pendant 30 à 60 min à température ambiante avant l’ajout des réactifs. Une
solution stock de NPN est préparée par solubilisation du réactif dans de l’acétone. Une
microplaque à fond noir (96F Nunclon Delta Black Microwell SI) est inoculée avec la
suspension de cellules et le NPN est ajouté à une concentration finale de 10 µM. Différentes
concentrations de CSA-13 sont ajoutées aux puits et l’augmentation de l’intensité de la
fluorescence émise par le NPN est suivie pendant 10 min à 30 °C. Les échantillons sont
soumis à une lumière d’excitation dont la longueur d’onde est de 310 nm et la lumière émise
est lue à une longueur d’onde de 460 nm à des intervalles de temps de 15 sec. A la fin de la
mesure, une solution de Triton X-100 à 1 % (V/V) est ajoutée afin d’estimer l’insertion
maximale du NPN dans la membrane bactérienne et les résultats sont calculés en prenant cette
valeur comme référence. Les résultats sont exprimés comme variation de la fluorescence ±
SEM après 10 min d’exposition au CSA-13. Les résultats sont ajustés à l’aide de l’équation
d’une hyperbole à une composante.
II.9.3 Interaction du CSA-119 avec P. aeruginosa
L’interaction membranaire du CSA-13 avec les différentes souches de P. aeruginosa
est étudiée à l’aide du CSA-119, un analogue fluorescent du CSA-13 ou le dérivé dansyl-
CSA-13. Les spectres d’émission et d’excitation du CSA-119 dans un tampon phosphate salin
(PBS) sont enregistrés à l’aide d’un fluorimètre (Photon Technology International,
Birmingham, NJ, Etats-Unis). Un spectre d’émission de la molécule en présence et en absence
de la souche de référence ATCC PAO1 est également réalisé afin de mettre en évidence la
spécificité de l’interaction. L’étude de la sensibilité des 8 souches au CSA-119 est effectuée
par mesure de l’augmentation de la fluorescence liée à l’interaction du CSA-119 avec la
membrane bactérienne. Deux cents µL de la SBI dans un tampon PBS sont transférés dans les
puits d’une plaque 96-puits. La lumière émise à 495 nm après excitation des puits à 345 nm
est mesurée toutes les 40 sec à l’aide de notre lecteur de microplaques. Trois min après le
début de l’essai, 1 à 5 µL de CSA-119 (concentrations finales 1 ; 2 ; 5 et 6 mg/L) sont ajoutés
aux puits et la fluorescence est lue pendant 15 min. La microplaque est agitée avant chaque
mesure. La photodégradation du fluorophore au cours du dosage est estimée à l’aide de puits
Matériel et Méthodes
83
contrôles (puits contenant uniquement la sonde fluorescente et du tampon PBS sans
bactéries).
II.9.4 Essai de viabilité par dénombrement
Cent µL de la SBI de la souche ATCC PAO1 sont déposés dans les puits d’une
microplaque. A chaque puits, 100 µL du produit à tester (CSA-13, association CSA-13/acide
pluronique 5% ou LL-37) sont ajoutés afin d’atteindre un volume final de 200 µL/puits. Un
contrôle négatif, contenant uniquement du milieu de culture, ainsi qu’un contrôle positif,
contenant la suspension bactérienne sans le produit à tester, sont inclus dans l’essai. La plaque
est incubée à 37 °C pendant 3 et 24 h (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique 5 %) ou
1 h (LL-37). Un dénombrement bactérien est ensuite réalisé : 10 µL de chaque puits sont
prélevés et dilués. Chaque dilution est étalée sur gélose TSA et incubée pendant 48 h à 32-34
°C. Les colonies sont comptées et les résultats exprimés en ufc/mL.
II.9.5 Essai de viabilité par perméabilisation à l’iodure de propidium (IP)
Principe
L’IP est un agent fluorescent imperméable aux membranes et donc exclu des cellules
vivantes. Le fluorophore est utilisé pour détecter les cellules mortes. Il s’intercale dans les
deux brins de l’ADN et de l’ARN des cellules mortes. Lorsqu’il est lié aux acides nucléiques
sa fluorescence augmente de 20 à 30 fois.
Protocole expérimental
Différentes concentrations des produits à tester (CSA-13, association CSA-13/acide
pluronique ou peptides) sont ajoutées aux puits d’une microplaque à fond noir. On ajoute dans
chaque puits 100 µL de la SBI contenant l’IP (concentration finale 10 µM) afin d’atteindre un
volume final de 200 µL par puits (milieu de culture pour l’étude du CSA-13 et de l’acide
pluronique F-127 : tampon de phosphate de potassium 1 mM pH 7 ; milieu de culture pour
l’étude des peptides : BBM complémenté de 0,5 % de casaminoacides). L’intensité de la
fluorescence est lue pendant 1 h à l’aide d’un lecteur à microplaque à des longueurs d’onde
d’excitation et d’émission de 540 nm et 590 nm.
Figure 35 : Etude de l’effet du CSA-13 sur la formation d’un biofilm par la
technique de coloration au CV
D’après Stepanovic et al., 2000.
Matériel et Méthodes
84
II.10 ETUDE SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM
La formation du biofilm est réalisée selon la méthode décrite par Stepanovic et al.
(2000) par la technique de coloration au CV.
CSA-13 : Les puits d’une microplaque sont inoculés par 200 µL de la SBI (milieu
BHI), en présence ou en absence de 20 µL de CSA-13 à une concentration finale de 1 mg/L,
et incubés à 37 °C dans une atmosphère humide pendant 24 et 48 h.
Peptides : Les puits d’une microplaque sont inoculés par 90 µL de la SBI (milieu BM2
contenant 0,5 % de casaminoacides). Dix µL des peptides, à différentes concentrations, sont
ajoutés aux bactéries. La microplaque est incubée à 37 °C dans une atmosphère humide
pendant 18 h.
Un contrôle positif (suspension bactérienne sans le produit à tester) et négatif
(uniquement le milieu de culture) sont inclus dans l’expérience. L’évaluation de la formation
de biofilm est réalisée par mesure colorimétrique de l’incorporation du CV par les cellules
ayant adhéré aux puits et de la coloration des autres composants de la matrice. Le milieu des
puits est aspiré et les puits sont lavés 3 fois à l’aide de 200 µL d’eau distillée. Après séchage
des puits pendant 45 min à l’air libre, 200 µL d’une solution à 0,1 % (m/V) de CV sont
ajoutés. Le colorant est laissé pendant 45 min en contact avec les puits avant d’être aspiré. Les
puits sont rincés 3 fois à l’aide de 300 µL d’eau distillée, ensuite le colorant est dissous à
l’aide d’une solution d’acide acétique à 33 %. L’absorbance de chaque puits est lue à 540 nm
à l’aide de notre lecteur de microplaques. Les résultats sont exprimés en ΔDO 540 nm (DO 540 nm
échantillon – DO 540 nm contrôle).
II.11 ETUDE SUR UN BIOFILM PREFORME
II.11.1 Etude par dénombrement sur un biofilm préformé
II.11.1.1 Formation in vitro du biofilm
La formation des biofilms est réalisée selon la technique décrite par Tré-Hardy et al.
(2008). Les puits d’une microplaque Nunc Micro Wells Plates®
(Nunc MicroWell Plates;
Nalge Nunc International Corp. Rochester, NY) sont ensemencés par 100 µL de la SBI
Figure 36 : Formation d’un biofilm sur les pointes d’un couvercle d’une
microplaque
Matériel et Méthodes
85
préparée dans un milieu CAMHB. Un témoin négatif, contenant uniquement du milieu de
culture CAMHB sans ajout de germes, est réalisé de manière à valider la stérilité du milieu.
La microplaque est ensuite recouverte d’un couvercle contenant 96 pointes (Nunc TSP,
Transferable Solid Phase Screening System; Nalge Nunc International) sur lesquelles le
biofilm peut se former. La microplaque contenant l’inoculum et munie de son couvercle est
incubée sous agitation orbitale à 37 °C pendant 24 h à 30 tpm (Unitron; Infors AG,
Bottmingen, Switzerland). Le biofilm formé (biofilm jeune de 24 h) est ensuite exposé aux
agents antibactériens.
La formation de biofilm de 12 jours est étudiée selon un principe identique. Après 24 h
d’incubation, une nouvelle microplaque contenant uniquement 100 µL de milieu CAMHB
dans chaque puits est préparée afin de servir de nouveau milieu pour la formation du biofilm.
Le couvercle de la plaque précédente, sur lequel le biofilm s’est développé, est alors transféré
sur cette nouvelle plaque et incubé sous agitation orbitale à 37 °C pendant 24 h. L’opération
de mise en contact des pointes avec un nouveau milieu est répétée quotidiennement sur une
durée de 12 jours. Après 12 jours de formation, le biofilm qui est « mûr » est exposé aux
agents antibactériens.
II.11.1.2 Effet du CSA-13, seul ou en combinaison avec la tobramycine à 4 mg/L,
sur un biofilm jeune et mature
Après formation d’un biofilm jeune de 24 h, le couvercle de la plaque multipuits est
retiré et les pointes sont immergées dans une nouvelle microplaque contenant différentes
concentrations de CSA-13 seul ou en association avec de la tobramycine à 4 mg/L. Après 24 h
d’incubation à 37 °C, l’activité des agents antibactériens est déterminée.
Après formation d’un biofilm mature de 12 jours, le couvercle de la plaque multipuits
est retiré et les pointes sont immergées 2 fois par jour dans une nouvelle microplaque
contenant différentes concentrations de CSA-13 seul ou en association avec de la tobramycine
à 4 mg/L. L’effet des agents antibactériens est évalué après 1 (administration unique), 2 et 9
jours. L’effet antibactérien est étudié sur 8 souches pour les biofilms jeunes (ATCC PAO1,
ATCC 9027, ATCC 15442, PYO1, PYO2, MC75-450457, MC093-450507, MC099-450467),
Matériel et Méthodes
86
et sur 6 souches pour les biofilms matures (ATCC PAO1, PYO1, PYO2, MC75-450457,
MC093-450507, MC099-450467).
L’activité des agents antibactériens est évaluée par un dénombrement des germes (Tré-
Hardy et al., 2008). Les pointes sont rincées à l’aide d’un tampon phosphate de potassium 10
mM (pH 7,5) isotonique afin d’éliminer les cellules non fixées au biofilm. Après rinçage, le
biofilm est mis en contact avec un nouveau milieu CAMHB. La microplaque est placée dans
un bain à ultrasons à 25 °C pendant 5 min dans le but de décrocher les bactéries présentes au
niveau du biofilm. Un dénombrement des bactéries persistantes, avant et après traitement, est
réalisé. Des aliquots sont prélevés, dilués, et répartis dans des boîtes de Petri. Une gélose TSA
fraîchement préparée est coulée dans les boîtes et, après solidification, celles-ci sont incubées
à 32-34 °C pendant 48 h. La diminution logarithmique en ufc des biofilms traités est calculée
par la formule suivante : diminution logarithmique = log(ufccontrôle positif)−log(ufcx), où x
correspond à la concentration testée de l’agent antimicrobien seul ou en combinaison.
Les courbes dose-réponse du CSA-13 sont ajustées à l’équation : variation des log(ufc)
= variation maximale des log(ufc) * [CSA-13]/ (KD + [CSA-13]) par ajustement de deux
paramètres (variation maximale des ufc/mL et KD) avec une contrainte (diminution maximale
inférieure à 7). La qualité de l’ajustement est évaluée par mesure du coefficient de
détermination (r2) qui est une estimation de la qualité de l’ajustement.
II.11.2 Etude par MCBL sur un biofilm préformé
II.11.2.1 Expression de la GFP
Pour visualiser les souches cliniques de P. aeruginosa à l’aide de la MCBL, un
plasmide (pMF230) exprimant de manière constitutive la GFP est introduit dans chaque
souche de P. aeruginosa par croisement triparental. Le plasmide pMF230 contient le gène
GFPmut2 (Cormack et al., 1996) et un marqueur de résistance à la carbénicilline.
L’appariement triparental est une forme de conjugaison bactérienne où un plasmide conjugatif
présent dans une souche bactérienne aide à transférer un plasmide mobilisable présent dans
une deuxième souche bactérienne vers une troisième.
Matériel et Méthodes
87
Dans notre cas, la conjugaison triparentale fait intervenir les 3 souches bactériennes suivantes:
- une souche receveuse de P. aeruginosa (souche clinique) dans laquelle on souhaite
introduire le plasmide mobilisable (pMF230),
- une souche donneuse de E. coli portant le plasmide mobilisable pMF230 et qui peut
utiliser les fonctions de transfert du plasmide conjugatif (Nivens et al., 2001),
- une souche mobilisatrice de E. coli (helper strain) portant le plasmide conjugatif
pRK2013 codant pour les gènes requis dans la conjugaison et le transfert de l’ADN
(Figurski et Helinski, 1979).
Les cultures bactériennes de E. coli pMF230 et E. coli pRK2013 sont obtenues après
une nuit d’incubation à 37 °C sous agitation dans un milieu LB contenant 300 mg/L de
kanamycine. Deux cent cinquante µL d’une culture bactérienne de la souche clinique de P.
aeruginosa incubée une nuit sont ajoutés dans 25 mL de Tryptic Soy Broth (TSB) et cultivés
pendant 5 h à 42 °C et 150 tpm. Après incubation, une strie de cette suspension bactérienne
est ensemencée sur une boîte de gélose LB. La souche clinique est mise en contact avec une
strie d’une culture bactérienne de E. coli comprenant le plasmide pMF230 et une strie d’une
culture bactérienne de E. coli comprenant le plasmide pRK2013. Les 3 stries se croisent en un
même point sur la gélose. Après une nuit d’incubation de la gélose à 37 °C, quelques colonies
au niveau du croisement des 3 stries sont prélevées et incubées sur une gélose Pseudomonas
agar contenant 150 mg/L de carbénicilline afin de sélectionner les clones de P. aeruginosa
contenant le plasmide pMF230.
II.11.2.2 Etude sur un biofilm préformé dans une microplaque
Les biofilms sont formés dans une plaque 96-puits en polystyrène avec une base
µclear (Greiner Bio-One, France).
CSA-13 : Deux cent cinquante µL de la SBI préparée dans un bouillon TSB sont
ajoutés dans les puits de la microplaque et incubés à 37 ºC et 30 tpm. Après 1 h d’adhésion, le
milieu est renouvelé afin d’éliminer les cellules non adhérentes. Après 24 h de formation du
biofilm, les puits sont rincés et exposés à différentes concentrations de CSA-13 (0, 20, 50 et
100 mg/L) pendant 1 h. Les puits sont ensuite rincés et marqués par 200 µL du kit de
coloration BacLight™ Live/Dead®
(concentration finale en Syto9 et en IP : 30 µM et 120 µM
respectivement) pendant 25 min.
Matériel et Méthodes
88
Peptides : L’effet de 6 peptides (LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31, LL-19) sur
les biofilms préformés par 6 souches de P. aeruginosa (les souches ATCC PAO1, MC099-
450467, MC093-450507, PYO1, PYO2 et MC75-450457) est également étudié par MCBL.
Dans cette expérimentation, les bactéries utilisées expriment la GFP et sont mises en culture
dans un milieu TSB contenant 150 mg/L de carbénicilline pour maintenir le plasmide
pMF230. La SBI est obtenue par dilution de la suspension bactérienne dans un milieu BBM
supplémenté de casaminoacides 0,5 % (m/V). Deux cent cinquante µL de la SBI sont ajoutés
dans les puits de la microplaque et incubés à 37 ºC et 30 tpm. Après 1 h d’adhésion, le milieu
est renouvelé afin d’éliminer les cellules non adhérentes. Après 24 h de formation du biofilm,
les puits sont rincés et traités par différentes concentrations des peptides (0, 20, 50 ou 100
µM) en présence de 10 µM d’IP, pendant 25 min.
Les biofilms sont rincés et observés par MCBL à l’aide d’un Leica SP5 (Leica
Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Les biofilms sont scannés à une fréquence de 600 Hz
à l’aide d’un objectif à immersion dans l’eau (63 X/ouverture numérique 1,2). Un faisceau de
laser à Argon à 488 nm et un faisceau laser à diode 561 nm sont utilisés pour l’excitation. La
fluorescence émise est collectée entre 500 nm et 550 nm et entre 570 et 700 nm. Les séries
d’images collectées à l’aide du MCBL sont analysées par le logiciel Imaris software
(Bitplane, Zurich, Switzerland).
De plus, une étude cinétique de l’effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans une
microplaque est réalisée sur la souche ATCC PAO1 exprimant la GFP. Après 24 h de
formation du biofilm, 100 µL d’une solution de CSA-13 (concentration finale 100 mg/L) sont
ajoutés aux puits en présence d’IP (concentration finale 60 µM). Des séries d’images sont
scannées pendant 30 min à intervalle de 5 min à l’aide du microscope confocal. Un contrôle
est réalisé sans ajout de CSA-13.
II.11.2.3 Etude sur un un biofilm préformé dans un réacteur CDC
Principe
Les réacteurs CDC (Biosurface Technologies Inc., Bozeman, MT) sont développés par
le Center for Disease Control and Prevention et acceptés comme méthode standard par The
American Society for Testing and Materials afin de développer de manière reproductible des
Figure 37 : Réacteur CDC
A B C
Figures A et B : Photographies du montage du réacteur CDC. Le bidon contenant le milieu
nutritif stérile est relié au bécher par un tube en silicone. Une pompe péristaltique permet
l’apport du milieu à un flux constant. Un agitateur magnétique entraîne l’application de forces
de frottement à la surface du biofilm formé sur les coupons en verre. L’excès de milieu est
déversé via la goulotte dans le bidon de vidange. Figure C : Représentation schématique d’un
réacteur CDC. Les biofilms se développent à la surface interne des coupons exposés aux
forces de frottement du milieu par agitation magnétique (Williams et al., 2011).
Matériel et Méthodes
89
biofilms de P. aeruginosa (ASTM, 2012). Il s’agit d’une méthode utilisée en routine pour
étudier la formation de biofilms exposés aux frottements et à un apport continu de milieu,
pouvant être adaptée à l’étude de différents microorganismes (Goeres et al., 2005). Les
réacteurs comportent 8 porteurs de coupons en polypropylène suspendus à partir d’un
couvercle. Les supports en polypropylène sont capables de porter 3 coupons chacun d’un
diamètre de 0,9 cm sur lequel le biofilm peut se développer. Le couvercle avec les détenteurs
de coupons est monté dans un récipient en verre d’une capacité de 1 L et muni d’une goulotte
de vidange de façon à ce que le volume final du contenant soit maintenu à environ 350 mL.
Le milieu de culture stérile, maintenu dans un récipient de 20 L, est apporté par un tube en
silicone vers le bécher à l’aide d’une pompe péristaltique. La rotation d’une palette dans le
bécher, par agitation magnétique, permet le mélange constant du milieu et l’application d’une
force de frottement uniforme à la surface du coupon. Le biofilm se développe sur la face
intérieure du coupon exposée aux forces de frottement. L’excès de milieu est déversé par la
goulotte dans un bidon de vidange.
Protocole expérimental
Quelques colonies isolées sont prélevées d’une culture solide et incorporées dans 100
mL de milieu TSB dilué 100 fois (300 mg/L). Pour les souches exprimant la GFP ou la RFP,
150 mg/L de carbénicilline sont ajoutés. La culture est incubée une nuit à 37 ºC et 120 tpm.
Le lendemain, 1 mL de la culture est prélevé et transvasé stérilement dans le réacteur
contenant 500 mL de milieu TSB (300 mg/L) et 150 mg/L de carbénicilline pour les souches
GFP ou RFP. Le réacteur est incubé pendant 24 h à température ambiante et à 120 tpm. Après
24 h, le bidon contenant 20 L de milieu TSB à une concentration finale de 100 mg /L est relié
au réacteur afin de permettre l’apport en débit continu des nutriments. La pompe est
enclenchée pour atteindre un taux de flux de 12 mL/min. Le réacteur est également connecté à
un bidon de vidange permettant d’éviter le débordement et ainsi de maintenir dans le réacteur
un volume constant de 350 mL de bouillon. Après 24 h de formation du biofilm, les coupons
de verre sont soigneusement détachés de leur support et traités.
Biofilm ATCC PAO1-GFP : Les biofilms formés sur la face interne du coupon sont
rincés à l’aide d’eau distillée et exposés à 100 µL du produit à tester (CSA-13 ou
peptides) et 100 µL d’IP (concentration finale 60 µM) pendant 25 min.
Biofilm ATCC 15442 : Les biofilms sont exposés à 100 µL du produit à tester (CSA-
13 ou peptides) pendant 25 min. A la fin du traitement, les coupons sont rincés et
Matériel et Méthodes
90
marqués par 100 µL du kit de coloration BacLight™ Live/Dead®
(concentration finale
en Syto9 et IP : 15 µM et 60 µM respectivement) pendant 25 min.
Biofilm ATCC PAO1-RFP : Les biofilms sont exposés pendant 25 min à 150 µL d’un
analogue fluorescent du CSA-13, le CSA-13 marqué avec 1 % de Bodipy.
Après traitement, les coupons sont rincés et observés à l’aide d’un objectif à immersion dans
l’eau (63x/ouverture numérique 0,9).
II.12 TOXICITE SUR CELLULES EUCARYOTES (HUVEC)
II.12.1 Evaluation de la libération de la lactate déshydrogénase (LDH)
Principe
La LDH est une enzyme cytoplasmique d’environ 135 kDa qui catalyse l’oxydation du
lactate en pyruvate. La réaction s’accompagne de la réduction du NAD+ (accepteur
d’électrons) en NADH et est réversible. L’enzyme intracellulaire est présente dans
pratiquement toutes les cellules eucaryotes. Le pH optimal de la réaction d’oxydation du
lactate en pyruvate est de 8,8 à 9,8 ; celui de la réaction inverse est de 7,4 à 7,8. La
température optimale est comprise entre 30 et 37 °C.
La cytotoxicité d’une molécule peut être évaluée par dosage de l'activité enzymatique
de la LDH dans le surnageant cellulaire d'une suspension de cellules exposées à la molécule.
La présence de la LDH dans le milieu extracellulaire témoigne de la destruction des
membranes plasmiques et donc d’une perturbation de l’intégrité cellulaire. L’essai de la
libération de la LDH s’inspire de la méthode développée par la Scandinavian Society for
Clinical Chemistry and Clinical Physiology (1974). L'activité enzymatique est mesurée par
suivi de la cinétique d’absorbance à 340 nm, pH 7,4 et 30 °C, après ajout dans le milieu
extracellulaire de NADH et de pyruvate. Dans ces conditions l’enzyme réduit le pyruvate en
lactate et la réaction est accompagnée de l’oxydation du NADH en NAD+. Une diminution
d'absorbance au cours du temps indique la consommation de NADH (le NADH absorbe la
lumière à 340 nm) et donc une souffrance cellulaire.
Matériel et Méthodes
91
Protocole expérimental
Les cellules Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) sont cultivées dans
des flasques T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de CO2. Les cellules sont
détachées par 10 % de trypsine-EDTA et incubées dans une plaque 96-puits à une
concentration de 1.106 cellules/mL en présence de 100 µL de milieu Endothelial
Growth Medium (EGM) pendant minimum 12 h. Le lendemain, le milieu est aspiré et 90 µL
de milieu E-Total (NaCl 147 mM ; KCl 2 mM ; HEPES 10 mM ; glucose 12 mM ; MgCl2 1
mM ; CaCl2 2 mM ; pH 7,4) sont ajoutés aux puits. Dix µL de différentes concentrations du
produit à tester (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique 3 % ou peptides) sont ajoutés
aux puits. Après 10 min d’incubation à 37 °C, la plaque est centrifugée pendant 10 min à
1200 tpm et 30 µL de surnageant sont collectés et transférés dans une nouvelle microplaque.
Le contenu en LDH du surnageant est dosé selon Métioui et al. (1994). Une solution de
NADH (TRIS 56 mM ; EGTA 5,6 mM ; β-NADH 170 µM) est ajoutée aux puits de la
seconde plaque. Juste avant le début du dosage, une solution de pyruvate à 1,22 mM
(concentration finale) est ajoutée aux puits. L’activité de la LDH est mesurée à 30 °C pendant
20 min en suivant l’absorbance à 340 nm. Les témoins négatifs sont obtenus par utilisation du
surnageant de cellules non traitées (après centrifugation). L’activité maximale de la LDH est
mesurée de la même manière, après cytolyse des HUVEC par sonication. Pour chaque essai,
les résultats sont obtenus par calcul du taux de diminution de l’absorbance provoquée par
l’oxydation du NADH (partie linéaire de la courbe). Chaque valeur est ensuite corrigée par la
soustraction des valeurs du témoin négatif et la libération de la LDH est exprimée comme
pourcentage du contenu cellulaire total.
II.12.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium
Principe
Le bromure d’éthidium est une molécule de 394 Da incapable de traverser la
membrane des cellules eucaryotes saines. Lors d’une perturbation de la membrane plasmique,
le dérivé fluorescent entre dans la cellule. Au sein de la cellule, la molécule se lie aux acides
nucléiques doubles brins où, lorsqu’elle est exposée à des rayons de lumière visible, elle émet
un signal fluorescent pouvant être détecté et mesuré. Ainsi, la perméabilisation de la
membrane cellulaire est mise en évidence par mesure de l’augmentation de la fluorescence.
Figure 38 : Réduction du MTT en formazan par la succinate déshydrogénase
mitochondriale
Matériel et Méthodes
92
Protocole expérimental
Les résultats de la toxicité cellulaire du CSA-13 sont affinés par un essai de la
perméabilité de la membrane au bromure d’éthidium (Di Virgilio et al., 1989). Les cellules
HUVEC sont cultivées dans des flasques T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de
CO2. Les cellules sont détachées par 10 % de trypsine-EDTA et incubées à une concentration
de 1.106 cellules/mL dans une plaque 96-puits à fond noir dans leur milieu de culture pendant
minimum 12 h. Dix min avant le début de la lecture, le milieu est aspiré et une solution de
bromure d’éthidium est ajoutée aux puits à une concentration finale de 10 mg/L. L’intensité
de la lumière émise à 590 nm, après excitation à 540 nm, est mesurée à 37 °C et à intervalles
de temps de 15 sec. Cinq min après le début de l’essai, les cellules sont exposées à des
concentrations croissantes en produit à tester (CSA-13, association CSA-13/acide pluronique
3 % ou peptides). L’augmentation de l’intensité de la fluorescence est lue pendant 50 min. Les
cellules sont ensuite perméabilisées par une solution de Triton X-100 à 0,5 % et la lecture
poursuivie afin de mesurer la captation maximale de bromure d’éhidium.
II.12.3 Evaluation de l’activité mitochondriale (test MTT)
Principe
L’ajout d’un sel de tétrazolium, le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-
diphényl tétrazolium (MTT), dans le milieu de culture permet de quantifier l’activité
mitochondriale des cellules et donc d’estimer la viabilité cellulaire. Lors d’une activité
mitochondriale efficace, l’enzyme mitochondriale succinate déshydrogénase réduit le MTT
soluble en cristaux de formazan insolubles en milieu aqueux. La quantification de cristaux de
formazan, par mesure de l’absorbance, est proportionnelle au nombre de cellules
métaboliquement actives.
Protocole expérimental
La toxicité mitochondriale des produits à tester (CSA-13, seul ou en présence d’acide
pluronique F-127 6 % et peptides) est évaluée par un test colorimétrique MTT. Les cellules
HUVEC sont cultivées dans des flasques T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de
CO2. Les cellules sont détachées par 10 % de trypsine-EDTA et incubées une nuit à une
concentration de 1.106 cellules/mL dans une plaque 96-puits dans leur milieu de culture. Le
lendemain, le milieu est écarté et les cellules sont exposées à différentes concentrations de
Matériel et Méthodes
93
produit à tester. Les cellules sont incubées pendant 20 min à 37 °C. Après incubation, le
milieu est écarté et les puits sont remplis par 100 µL d’une solution de MTT à 1 mg/mL. La
plaque est incubée à 37 °C pendant 3 h 30. Les cristaux de formazan formés par les cellules
sont solubilisés à l’aide de DMSO et l’absorbance est lue dans notre lecteur de microplaques à
540 nm. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l’absorbance mesurée dans les
conditions contrôles (absence des produits à tester).
II.12.4 Evaluation du potentiel de membrane mitochondrial
Principe
Le tétraméthylrhodamine éthyl ester (TMRE) est un agent fluorescent s’accumulant au
sein des mitochondries intactes selon le potentiel électrique de la membrane mitochondriale
interne. Le potentiel de membrane mitochondrial est un composant important de la force
promotrice responsable de la synthèse d’ATP par la mitochondrie. Les cellules possédant un
potentiel de membrane mitochondrial négatif et incubées en présence de TMRE accumulent
ce dernier dans leurs mitochondries intactes (Scaduto et Grotyohann, 1999) et une
augmentation de la fluorescence est détectée. En cas de dissipation du potentiel de membrane
mitochondrial, l’accumulation de TMRE dans la mitochondrie est entravée et on observe une
diminution de la fluorescence cellulaire.
Protocole expérimental
La mesure du potentiel de membrane mitochondrial après traitement par le CSA-13,
seul ou en présence du dérivé pluronique F-127, est évaluée sur les cellules HUVEC selon le
protocole décrit par Date et al. (2005). Les cellules HUVEC sont cultivées dans des flasques
T75 à 37 °C sous une atmosphère humide de 5 % de CO2. Les cellules sont détachées par 10
% de trypsine-EDTA et incubées une nuit dans une plaque 24-puits à une confluence de 50 à
60 %. Le lendemain, le milieu de culture est aspiré et les cellules adhérentes sont mises en
présence de 1 mL des différentes concentrations en CSA-13, seul ou en association avec le
dérivé pluronique F-127 à 5 %, pendant 1 h à 37 °C. Le CSA-13 et l’acide pluronique F-127
sont dilués dans un tampon PBS à différents pH (pH 6, 7 et 8) afin d’étudier l’influence du pH
sur l’effet du CSA-13. A la fin de l’incubation, le milieu est aspiré et les cellules sont
exposées à 200 nM de TMRE pendant 1 h à 37 °C. Les cellules sont ensuite lavées 2 fois avec
un tampon PBS. Un mL de Triton X-100 1 % (V/V) est ajouté aux puits afin de lyser les
Matériel et Méthodes
94
cellules. Deux cent µL sont prélevés et mis en plaque 96-puits à fond noir. La fluorescence est
lue à l’aide de notre lecteur de microplaques aux longueurs d’ondes d’excitation et d’émission
de 544 nm et 590 nm respectivement.
II.13 ETUDE DES STRUCTURES SECONDAIRES DES PEPTIDES A
L’AIDE DE LA SPECTROSCOPIE INFRAROUGE A TRANSFORMEE DE
FOURIER A REFLEXION TOTALE ATTENUEE (ATR-FTIR)
II.13.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls
Préparation de la solution des peptides
La synthèse des peptides est suivie d’une étape de purification des peptides par
chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse à l’aide d’un
gradient d’acétonitrile contenant 0,1 % d’acide trifluoroacétique (den Hertog et al., 2006).
Des traces de trifluoroacetate (CF3COO- ou TFA) peuvent alors être présentes dans les
peptides (résidu de purification). Il est essentiel de pouvoir éliminer ces traces de TFA car ce
dernier présente une forte bande d’absorption à 1673 cm-1
qui peut chevaucher ou même
masquer la bande de l’amide I du peptide (Zhang et al., 1995). Afin d’éliminer toute trace de
TFA ou d’acétonitrile susceptible d’interférer avec le spectre, les différents peptides subissent
une mise en solution dans 100 µL d’HCl 10 mM suivie d’une congélation et enfin une
lyophilisation (Andrushchenko et al., 2007). L’acide chlorhydrique permet d’éliminer les
contre-ions de TFA- auxquels le peptide est lié à la fin de la synthèse. L’acide chlorhydrique
permet le passage des ions carboxylates en acides carboxyliques (CF3COOH) qui passent en
phase gazeuse et sont éliminés. Ce cycle est opéré 2 fois. Les peptides sont ensuite suspendus
dans 3 à 6 µL d’un tampon HEPES 1 mM à pH 7,3 à une concentration finale de 1 µM.
Enregistrement des spectres en présence d’eau d’hydratation
Un µL de la solution de peptide est étalé sur le cristal de diamant, l’excès d’eau est
rapidement évaporé sous flux d’azote sec et le spectre est analysé comme décrit par Vigano et
al. (2000). Les spectres sont obtenus à l’aide d’un spectrophotomètre Bruker IFS 55 FTIR
(Bruker, Ettlingen, Allemagne), équipé d’un détecteur mercure cadmium tellure (MCT)
refroidi par de l’azote liquide, à une résolution de 2 cm-1
. Les spectres de la vapeur d’eau
résiduelle contribuant au signal sont soustraits.
Matériel et Méthodes
95
Enregistrement des spectres après échange H2O/D2O « deutération »
L’échange hydrogène/deutérium (H/D) est réalisé comme décrit par Vigano et al.
(2000). L’échantillon est soumis à un courant d’azote saturé en vapeur de D2O à température
ambiante. L’échange est observé par la diminution de l’intensité du pic de l’amide II autour
de 1550 cm-1
qui est sensible à l’échange H/D en comparaison avec l’aire du pic de l’amide I
(région 1600-1700 cm-1
) pris comme référence. Des temps de deutération assez courts sont
généralement suffisants pour déplacer les composants non structurés de l’amide I, tandis que
prolonger la deutération, affectant les composants des structures ordonnées, ne modifie pas
significativement la position de leurs constituants (Goormaghtigh et al., 1994a – 1994b).
Enregistrement des spectres après reconstitution dans une solution de D2O
Des expériences similaires sont réalisées après reconstitution des peptides dans une
solution de D2O. Pour ce faire, après lyophilisation des peptides ceux-ci sont solubilisés à
l’aide d’une solution de D2O pendant 1 h afin que l’échange H/D soit pratiquement total à
l'exception des groupes difficilement échangeables. Un µL des peptides saturés en D2O est
déposé sur le cristal de diamant. Les spectres sont obtenus après élimination rapide de l'excès
de D2O sous flux d'azote sec avant d'être soumis à un équilibrage avec de l'azote saturé en
vapeur de D2O à température ambiante.
II.13.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes
Préparation des liposomes
Les liposomes sont préparés comme suit : 1,4 mg de Lα-Phosphatidylcholine (PC) et
0,6 mg de Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)] (POPG) sont dissous
dans 500 µL de chloroforme et séchés sous un flux léger d’azote. Lorsque l’échantillon est
sec, il est placé sous vide afin d’éliminer toute trace de solvant. Après scellage sous azote,
l’échantillon est conservé à -20 °C. Le jour de la prise des spectres, le mélange de lipides est
dispersé dans un tampon HEPES 1 mM (pH 7,3) à une concentration finale de 2 mg/mL soit
~3 mM (PM ~700 g/mol).
Enregistrement des spectres après reconstitution dans une solution de D2O
Les spectres sont enregistrés après reconstitution des peptides et lipides dans une
solution de D2O. Pour ce faire, après lyophilisation du peptide ou séchage du mélange de
Figure 39 : Liaison de la dansyl-PMB aux LPS et déplacement par la PMB
Représentation schématique du mécanisme de liaison de la dansyl-PMB à des micelles de
LPS. Le faible rendement de fluorescence de la fraction dansyle dans un environnement
polaire est considérablement accru en milieu apolaire, comme lorsqu'elle est liée. La réduction
de la fluorescence lors de l'addition d'un ligand de compétition cationique (comme la PMB)
est secondaire au déplacement de la dansyl-PMB. Ce déplacement peut être interprété pour
décrire l’affinité de liaison à un ligand compétiteur (Soon et al., 2011).
Matériel et Méthodes
96
lipides, le résidu sec est reconstitué dans une solution de D2O pendant 1 h afin que l’échange
H/D soit optimal. Après dépôt sur le cristal de diamant et élimination de l’excès de D2O sous
flux d'azote sec, l’échantillon est soumis à un équilibrage avec de l'azote saturé en vapeur de
D2O à température ambiante et les spectres sont enregistrés.
II.14 FIXATION DES PEPTIDES AUX LPS
Principe
La polymyxine B (PMB) est un antibiotique peptidique cyclique et cationique qui se
lie aux lipides anioniques. La PMB se lie aux LPS, des composants de la membrane externe
des bactéries à Gram négatif. La dansyl-polymyxine B (dansyl-PMB), dont la fluorescence est
faible lorsqu’elle est en solution, devient fortement fluorescente lorsqu’elle se lie aux LPS. La
liaison de la dansyl-PMB aux LPS peut être déplacée par de nombreux antibiotiques
cationiques. Des études de compétition de la liaison de la dansyl-PMB peuvent donc être
réalisées afin d’évaluer la liaison de composés, comme les PAM cationiques, aux LPS.
II.14.1 Synthèse de la dansyl-PMB
La PMB dansylée est synthétisée à partir de sulfate de PMB et de chlorure de dansyle
selon le protocole décrit par Schindler et Teuber (1975). Quarante mg de sulfate de PMB sont
dissous dans 1,2 mL de NaHCO3 0,1 M et 10 mg de chlorure de dansyle dans 0,8 mL
d’acétone. Le sulfate de PMB est ajouté au chlorure de dansyle et le mélange est laissé au
repos pendant 90 min à l’abri de la lumière et à température ambiante. Le dérivé dansyle
réagit avec une amine primaire des résidus d’acide diaminobutyrique de la PMB pour former
un dérivé mono-N-dansylPMB (Schindler et Teuber, 1975). Après incubation, le mélange est
injecté dans une colonne Sephadex G50 (50 x 2,5 cm) équilibrée avec un tampon phosphate
10 mM (pH 7,1) contenant 0,145 M de NaCl. Des fractions de 5 à 6 mL sont collectées. La
dansyl-PMB sort de la colonne dans un pic assez large avant le pic du chlorure de dansyle
n’ayant pas réagi. On peut rechercher la PMB dansylée par maintien d’une lampe à UV sur les
fractions et par observation de la fluorescence. La fluorescence de la PMB dansylée est jaune
tandis que celle du chlorure de dansyle qui n’a pas réagi est bleue-verte. Les fractions
contenant la PMB dansylée sont extraites dans environ un demi-volume de butanol. Le
Matériel et Méthodes
97
butanol est ensuite évaporé à 37 °C. Le résidu de dansyl-PMB est dissous dans 3 mL de
tampon HEPES 5 mM (pH 7,0) et aliquoté à -20 °C. La concentration en dansyl-PMB est
déterminée par dinitrophénylation.
II.14.2 Dosage de la dansyl-PMB par dinitrophénylation
Afin de quantifier la dansyl-PMB synthétisée, celle-ci est dinitrophénylée d’après le
protocole détaillé décrit par Bader et Teuber (1973). Une courbe standard de PMB est
effectuée à partir d’une solution stock à 100 mg/mL. Des dilutions sont effectuées pour
obtenir des solutions de 8 ; 6 ; 4 ; 2 ; 1 ; 0,8 ; 0,6 ; 0,4 ; 0,2 et 0,1 mg/mL. Cinquante µL de
ces solutions sont utilisés auxquels 200 µL d’une solution de borate de sodium décahydraté
(Na2B4O7.10 H2O) 1,0 % et 25 µL d’une solution de 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène 100 mM
sont ajoutés. Le mélange est incubé pendant 1 h à 37 °C. Ensuite 1 mL d’HCl 2 M, puis 1 mL
de butanol sont ajoutés. Les tubes sont vortexés et centrifugés pendant 2 min à 2500 tpm. La
phase butanol est lue à une DO 420 nm.
II.14.3 Effet des peptides sur la fixation de la dansyl-PMB aux LPS
Dans un premier temps, l’augmentation de la fluorescence suite à la liaison de la
dansyl-PMB aux LPS de P. aeruginosa (LPS Pseudomonas aeruginosa ATCC27316, Sigma
catalog ref. 7018) est mesurée à l’aide d’un fluorimètre. La fluorescence est évaluée après
ajout de dansyl-PMB (concentration finale 0,55 µM) à 2 mL de LPS (3 µg/mL) dans un
tampon HEPES 5 mM (pH 7,2) dans une cuvette en polystyrène (Tsubery et al., 2000). La
fluorescence est mesurée à une longueur d’onde d’excitation et d’émission de 360 et 485 nm
respectivement. L’expérience est répétée en présence du tampon uniquement, sans les LPS,
afin de vérifier la spécificité de la fluorescence.
Ensuite, l’effet du peptide LL-37 et de ses fragments sur la fixation aux LPS est
évalué. L’essai est réalisé dans les puits d’une plaque 96-puits à fond noir contenant 180 µL
de tampon HEPES 5 mM (pH 7,2) et 10 µL de LPS (concentration finale 25 µg/mL). Les
différents peptides dérivés du LL-37 (concentration finale 10 µM) sont ajoutés aux puits à
raison de 10 µL par puits. La fluorescence est lue à une longueur d’onde d’excitation et
Figure 40 : Nitrocéfine et ONPG
Figure 41 : Essai de la perméabilisation des membranes de E. coli ML-35p
Adapté d’après Eriksson et al., 2002.
Matériel et Méthodes
98
d’émission de respectivement 360 et 485 nm. Ensuite 10 µL de dansyl-PMB (concentration
finale 13 µM équivalent PMB) sont ajoutés et la fluorescence des puits est mesurée une
deuxième fois. La fixation non-spécifique de la dansyl-PMB est estimée en réalisant le dosage
en présence d'une concentration de PMB 250 fois plus élevée que celle de la dansyl-PMB. On
suppose que dans ces conditions les LPS fixent la PMB plutôt que la dansyl-PMB. Cette
valeur est prise comme « blanc ». La PMB n'est pas ajoutée dans des puits « contrôles ». La
fluorescence mesurée dans ces puits est considérée comme la capacité maximum de fixation
de la dansyl-PMB. Après avoir soustrait le « blanc » de tous les résultats, la fluorescence
mesurée en présence des peptides est exprimée en pourcentage de la fixation dans les
conditions « contrôles » (LPS et dansyl-PMB, absence de PMB ou de peptide).
II.15 PERMEABILISATION DES MEMBRANES DE E. COLI ML-35P
Principe
L’activité des peptides sur la perméabilisation des membranes bactériennes est étudiée
à l’aide de la souche E. coli ML-35p. Cette souche a été créée spécifiquement pour étudier la
perméabilisation de la membrane externe et interne d’une même souche (Lehrer et al., 1988).
Elle est constitutive pour la β-galactosidase cytoplasmique, dépourvue de lactose perméase et
exprime une β-lactamase périplasmique (plasmide pBR322). Deux molécules
chromogéniques incapables de traverser les membranes externe et interne de la bactérie sont
utilisées afin de suivre l’activité de la β-lactamase périplasmique et de la β-galactosidase
cytoplasmique et ainsi de mesurer la perméabilisation des membranes externe et interne
respectivement. Ne pouvant traverser la membrane externe, la nitrocéfine est exclue de
l’espace périplasmique. Lors d’une perméabilisation de la membrane externe, la molécule
peut entrer dans le périplasme et être clivée par la β-lactamase. L’hydrolyse du lien amide
dans l’anneau β-lactame de la nitrocéfine produit un changement de couleur du jaune au
rouge. L’absence de lactose perméase dans la souche E. coli ML-35p entrave l’entrée
d’orthonitrophényl-β-galactoside (ONPG) à travers la membrane interne. S’il y a
perméabilisation de la membrane interne, l’ONPG peut être clivé par la β-galactosidase
cytoplasmique en o-nitrophénol (ONP). Ce clivage produit un changement de couleur (jaune)
qui peut être mesuré par spectrophotométrie (Epand et al., 2010).
Matériel et Méthodes
99
Protocole expérimental
Quelques colonies de la souche E. coli ML-35p sont prélevées et mises en culture dans
un milieu TSB contenant 100 µg/mL d’ampicilline pendant une nuit à 37 °C. Le lendemain, la
suspension est lavée 3 fois dans un tampon phosphate pH 7,4 (tampon phosphate 10 mM et
NaCl 0,1 M). La culture bactérienne est ensuite diluée à une DO 600 nm de 0,100 ± 0,005 dans
un tampon d’incubation (tampon phosphate pH 7,4 contenant 300 μg/mL TSB). Cent µL
d’une solution de peptide (concentration finale 10 µM) et 90 µL de la suspension bactérienne
sont déposés dans les puits d’une microplaque. Afin de mesurer la perméabilisation de la
membrane externe, 10 µL de nitrocéfine (concentration finale 30 µM) ou 10 µL tampon
phosphate (conditions contrôles) sont ajoutés aux puits. L’absorbance des puits, sous agitation
à 37 °C, est lue à 486 nm pendant 100 min, avec des mesures effectuées toutes les 2 min.
L’étude de la perméabilisation de la membrane interne est réalisée par ajout de 10 µL
d’ONPG (concentration finale 2,5 mM) ou 10 µL de DMSO (conditions contrôles) et
l’absorbance est lue à 420 nm dans les mêmes conditions.
II.16 ANALYSES STATISTIQUES
Les comparaisons statistiques de plus de 3 groupes indépendants sont effectuées à
l’aide d’une analyse de variance à 1 voie (ANOVA) suivie d’un post-test de Bonferroni à
comparaisons multiples. La comparaison de l’activité du CSA-13 et de l’association CSA-
13/acide pluronique F-127 est analysée par une ANOVA à deux voies suivie d’un post-test de
Bonferroni à comparaisons multiples. Un test non paramétrique de Mann-Whitney est
effectué pour comparer 2 groupes indépendants (souches mucoïdes versus non mucoïdes ou
souches de référence versus souches cliniques). La recherche d’une corrélation entre la
production d’AHL et les caractéristiques phénotypiques des 8 souches est analysée
statistiquement par réalisation d’une corrélation de Pearson. Toutes les analyses statistiques
sont effectuées par le logiciel GraphPad 4.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).
* P < 0,05 ; ** P < 0,01 ; *** P < 0,001 ; non significatif P > 0,05.
Caractérisation phénotypique des souches
100
CHAPITRE I
CARACTERISATION
PHENOTYPIQUE
DES SOUCHES
Caractérisation phénotypique des souches
101
I. INTRODUCTION
Les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose sont colonisées par de
nombreux pathogènes, parmi lesquels la bactérie P. aeruginosa est prédominante (Hassett et
al., 2009). Après des épisodes répétés d’infections du tractus respiratoire principalement liées
à P. aeruginosa, les patients commencent à développer une insuffisance pulmonaire associée
à un déclin du statut clinique et un pronostic aggravé qui sont finalement responsables de la
mort des patients atteints de mucoviscidose (Ramsey et al., 1999). Les infections chroniques à
P. aeruginosa affectent 80 à 90 % des patients atteints de mucoviscidose et, une fois ces
infections établies, les associations actuelles d’antibiotiques sont incapables d’éradiquer la
bactérie des voies respiratoires de ces patients (Römling et al., 1994). La chronicité de ces
infections est liée au développement de la bactérie sous un mode de vie particulier, le biofilm
(Bjarnsholt et al., 2009). Les bactéries s’assemblent en communautés complexes et
organisées, entourées par la sécrétion d’une matrice extracellulaire polymérique. Ce mode de
vie confère aux bactéries présentes dans le biofilm un environnement dense et protecteur
augmentant la résistance du pathogène au système immunitaire de l’hôte et aux antibiotiques
conventionnels.
Dans un premier temps, nos travaux se sont concentrés sur la caractérisation de
différentes souches de P. aeruginosa, comprenant 5 souches cliniques isolées des
expectorations de patients atteints de mucoviscidose et 3 souches de référence. Nous avons
exploité la capacité de ces souches à adhérer à une surface et à former un biofilm, une
structure essentielle à la virulence du pathogène. Différentes techniques ont été utilisées et
comparées. Nous nous sommes aussi intéressés à la mobilité des souches, leurs propriétés
protéolytiques, leur sensibilité à la tobramycine et leur production d’AHL.
Figure 42 : Cinétique de l’immobilisation des billes magnétiques dans le BFRT®
Souches non mucoïdes
0 30 60 900
5
10
15
20
25
PAO1
PYO1
ATCC 15442
ATCC 9027
***ns
*** *******
*********
A
Temps (min)
IFB
Souches mucoïdes
0 30 60 900
5
10
15
20
25
MC093
MC099
MC75
PYO2
**
***
B
Temps (min)
IFB
L’adhésion de 4 souches non mucoïdes (figure A) et 4 souches mucoïdes (figure B) est
étudiée à l’aide du BFRT® à différents temps d’incubation. Les résultats sont exprimés en IFB
et sont la moyenne ± SEM de 3 à 5 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3 à
5). * P < 0,05 ; ** P < 0,01 ; *** P < 0,001.
Figure 43 : Adhésion des souches par le BFRT®
ATC
C 1
5442
PYO1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO2
MC75
MC09
3
MC09
90
5
10
15
20
25Souches
mucoïdes
Souches
non mucoïdes
Souches de référence
Souches cliniques
n =
3
3 33
3
3
4 4
IFB
Les 8 souches de P. aeruginosa sont incubées pendant 1 h en présence de billes magnétiques.
Les puits sont ensuite exposés à un aimant magnétique et la capacité des billes à former un
spot au centre du puits est estimée par la technique du BFRT®. Les résultats sont exprimés en
IFB. Ils sont la moyenne ± SEM de 3 à 4 expériences indépendantes (n = 3 à 4).
Caractérisation phénotypique des souches
102
II. RESULTATS
II.1 FORMATION DES BIOFILMS
II.1.1 Formation des biofilms par le BFRT®
En l’absence de bactéries dans le puits (contrôle négatif), l’exposition des billes
magnétiques à un champ magnétique provoque l’apparition d’un spot au centre du puits. Ce
spot n’est pas observé dans les puits sans billes (blanc). Ce résultat confirme que le spot et
l’augmentation de l’absorbance qu’il provoque sont secondaires à l’agglutination des billes.
L’IFB est calculé dans les puits contrôles comme décrit par Chavant et al. (2007). Cet IFB
atteint une moyenne de 16,1 ± 0,4 (n = 5). Quand les bactéries sont présentes dans les puits, la
formation du spot après exposition à un champ magnétique varie d’une souche à l’autre et en
fonction du temps d’incubation. La souche ATCC PAO1 provoque le plus rapidement une
diminution de l’IFB : après 30 min l’IFB a déjà diminué de 15 ± 1 à 10 ± 2 et jusqu’à 4 ± 1
après 45 min (n = 4 ; P < 0,001) (figure 42). Après 90 min d’incubation, l’IFB atteint sa
valeur la plus faible (1,49 ± 0,03 ; n = 5 ; P < 0,001) suggérant que les billes sont
complètement bloquées et ne peuvent plus bouger lorsqu’elles sont soumises à un champ
magnétique. Trois autres souches donnent des résultats similaires et provoquent une
diminution significative de l’IFB après 45 min (ATCC 9027) ou 60 min (MC093-450507 et
ATCC 15442) d’incubation. L’IFB ne change pas de manière significative après 90 min pour
les 4 autres souches (MC75-450457, PYO1, PYO2 et MC099-450467).
L’adhérence aux puits est significativement plus importante pour les souches non
mucoïdes que pour les souches mucoïdes (P = 0,0037 après 30 min et P = 0,0009 après 90
min).
L’étude de la mobilisation des billes par le BFRT® permet ainsi de caractériser les
premières étapes du développement du biofilm (l’adhésion des bactéries à une surface) à des
temps très courts. La figure 43 présente les caractéristiques d’adhésion des souches à la
surface des puits (après 60 min, ATCC PAO1 = ATCC 9027 > ATCC 15442 > MC093-
450507 >> MC75-450457 = PYO1 = PYO2 = MC099-450467).
Figure 44 : Cinétique de la formation du biofilm
par la technique de coloration au CV
Souches
non mucoïdes
0 1 2 3 4 5 60.0
0.5
1.0
PAO1
PYO1
ATCC15442
ATCC9027
A
Temps (h)
DO
54
0 n
m
Souches
non mucoïdes
0 12 24 36 480
1
2
3
4
5
PAO1
PYO1
ATCC15442
ATCC9027
B
Temps (h)
DO
54
0 n
m
Souches
mucoïdes
0 1 2 3 4 5 60.0
0.5
1.0
MC093
MC099
MC75
PYO2
C
Temps (h)
DO
54
0 n
m
Souches
mucoïdes
0 12 24 36 480
1
2
3
4
5
MC093
MC099
MC75
PYO2
D
Temps (h)
DO
54
0 n
m
La formation du biofilm par 4 souches non mucoïdes (figures A et B) et 4 souches mucoïdes
(figures C et D) est étudiée par la technique de coloration au CV à différents temps
d’incubation ; entre 0 et 6 h (figures A et C) et jusqu’à 48 h (figures B et D). Les résultats sont
la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).
Caractérisation phénotypique des souches
103
II.1.2 Formation des biofilms par coloration au CV
Aucune augmentation importante de l’absorbance n’est mesurée avant 4 h de
formation du biofilm (de 0,02 ± 0,01 à 0,10 ± 0,02 ; n = 3 pour ATCC PAO1). Après 6 h
d’incubation, l’absorbance est augmentée de manière importante pour 4 souches (ATCC
15442, ATCC 9027, ATCC PAO1 et MC093-450507). La figure 45 représente la formation
du biofilm par les 8 souches après 6 h. Deux groupes se distinguent après 6 h : les souches
formant « rapidement » un biofilm et celles formant « lentement » un biofilm. La différence
de coloration par le CV entre ces 2 groupes est significative (P = 0,0006). Les souches
adhérant aux puits après 6 h sont les mêmes que celles s’attachant rapidement aux puits du
BFRT®. Après 24 et 48 h de formation de biofilm, l’absorbance augmente pour toutes les
souches, cependant après 48 h l’augmentation est significativement plus importante pour les 4
souches mucoïdes que pour les 4 souches non mucoïdes (P = 0,019). Ceci s’explique par
l’augmentation rapide et soutenue de l’absorbance après 24 h pour les souches mucoïdes
tandis que l’absorbance augmente à une échelle beaucoup plus lente avec les souches non
mucoïdes (figure 44 B et D). La technique de coloration au CV donne ainsi une bonne
estimation de la formation des biofilms à des temps plus longs.
Figure 45 : Formation du biofilm par la technique de coloration au CV
ATC
C 1
5442
PYO1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO2
MC75
MC09
3
MC09
90.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Souches
non mucoïdes
Souches
mucoïdesD
O5
40
nm
Les 8 souches de P. aeruginosa sont incubées pendant 6 h dans les puits d’une microplaque.
La formation du biofilm est mesurée par la coloration au CV. Les résultats sont exprimés
comme variation de l’absorbance mesurée à 540 nm. Ils sont la moyenne ± SEM de 3
expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).
Figure 46 : Cinétique de la formation du biofilm par dénombrement
0 10 20 30 40 50 60 700
***
***
*500
1.000
1.500
2.000
2.500
Temps (min)
No
mb
re d
e b
ac
téri
es
ad
hé
ren
tes
(x 1
03 u
fc/m
L)
Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée dans les puits d’une
microplaque. A différents temps d’incubation le milieu est aspiré et les bactéries attachées au
fond du puits sont comptées par la technique du dénombrement. Les résultats sont exprimés
en nombre de bactéries adhérentes en ufc/mL. Ils sont la moyenne ± SEM de 3 expériences (n
= 3). * P < 0,05 ; *** P < 0,001.
Caractérisation phénotypique des souches
104
II.1.3 Formation des biofilms par dénombrement
L’adhérence de la souche de référence ATCC PAO1 au fond des puits est évaluée par
un dénombrement bactérien. Le nombre de cellules adhérant à la surface augmente de façon
significative après 30 min d’incubation (de 1,2 ± 0,2 % après 10 min à 3,5 ± 0,8 % par rapport
à la SBI prise comme référence ; n = 3 ; P < 0,05). Après 45 et 60 min d’incubation, la
quantité de bactéries adhérentes augmente encore (11 ± 1 % après 45 min et 18 ± 1 % après
60 min ; n = 3 ; P < 0,001).
Figure 47 : Etude de la motilité des 8 souches de P. aeruginosa
Swimming
PAO1
ATC
C 9
027
ATC
C 1
5442
MC09
3
PYO2
MC09
9
PYO1
MC75
0
10
20
30
100
A**
Su
rfa
ce
(m
m²)
Swarming
PAO1
PYO2
MC09
9
ATC
C 1
5442
ATC
C 9
027
PYO1
MC09
3
MC75
0
10
20
30
40
50
100
B *
Su
rfa
ce
(m
m²)
La mobilité de type swimming (figure A) et de type swarming (figure B) des différentes
souches est mesurée comme décrit dans la partie Matériel et Méthodes. Les résultats sont
exprimés en surface (mm2) couverte par les colonies et sont la moyenne ± SEM de 5
expériences (n = 5). * P < 0,05 ; ** P < 0,01.
Figure 48 : Mobilité de type swimming de la souche ATCC PAO1
Caractérisation phénotypique des souches
105
II.2 MOTILITE DES SOUCHES
Deux types de motilité du P. aeruginosa sont investigués.
Le flagelle est l’organe principal pour le mode de motilité swimming du P. aeruginosa.
La mobilité de type swimming est différente au sein des 8 souches : la souche ATCC PAO1 a
la motilité swimming la plus importante et la souche MC75-450456 présente la motilité
swimming la plus faible (ATCC PAO1 >>> ATCC 9027 > ATCC 15442 > MC093-450507 >
PYO2 > MC099-450467 > PYO1 > MC75-450456) (figure 47 A).
Le swarming est un type de mobilité qui ne dépend pas uniquement du flagelle mais
aussi des pili de type IV et des rhamnolipides. Sur les boîtes d’agar, ATCC PAO1 est la seule
souche qui forme les ramifications irrégulières et en expansion caractéristiques de ce mode
particulier de motilité. Les autres souches restent près de leur point d’inoculation. Les souches
sont classées par ordre de taille du spot : ATCC PAO1 >>> PYO2 > MC099-450467 > ATCC
15442 > ATCC 9027 > PYO1 > MC093-450507 > MC75-450457 (figure 47 B).
Figure 49 : Etude de la production de rhamnolipides par les 8 souches de P. aeruginosa
ATC
C 1
5442
PYO1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO2
MC75
MC09
3
MC09
9
0
10
20
30
Souches
mucoïdes
Souches
non mucoïdes
n =
3
3
3
3
3
3
2
2
Co
nc
en
tra
tio
n e
n r
ha
mn
os
e
(µg
/mL
)
La capacité des différentes souches à produire et sécréter des rhamnolipides est évaluée par la
mesure de la concentration en rhamnose dans un extrait de diéthyléther du milieu de culture
(méthode à l’orcinol en milieu acide). Les résultats sont exprimés en µg de rhamnose/mL de
milieu de culture. Ils sont la moyenne ± SD de 2 à 3 expériences indépendantes réalisées en
triplicat (n = 2 à 3).
Figure 50 : Sensibilité à la tobramycine
ATC
C 1
5442
PYO1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO2
MC75
MC09
3
MC09
90
2
4
6
8Souches
non mucoïdes
Souches
mucoïdes
- L
og
ufc
/mL
Les 8 souches de P. aeruginosa sont incubées pendant 24 h dans les puits d’une microplaque
avec un couvercle. Après cette incubation, les pointes du couvercle sont lavées et le couvercle
transféré sur une nouvelle plaque. Les pointes sont plongées dans les puits avec un nouveau
milieu, en absence ou en présence de 4 mg/L de tobramycine. Après 24 h la quantité d’ufc sur
les pointes est déterminée. Les résultats sont exprimés en variations du nombre d’ufc/mL en
présence de tobramycine. Ils sont la moyenne ± SD de 2 expériences (n = 2).
Caractérisation phénotypique des souches
106
II.3 PRODUCTION DE RHAMNOLIPIDES
Comme le montre la figure 49, la production de rhamnose est très différente parmi les
8 souches. Trois souches (ATCC 9027, ATCC 15442 et MC099-450467) ne produisent pas de
rhamnose. L’hexose est détecté dans le surnageant pour les 5 autres souches. La souche
MC093-450507 est la plus grande productrice de rhamnose (28 ± 2 µg de rhamnose/mL ; n =
2) suivie par la souche ATCC PAO1 (21 ± 3 µg de rhamnose/mL ; n = 3) (MC093-450507 >
ATCC PAO1 > MC75-450456 > PYO2 > PYO1).
II.4 SENSIBILITE A UN ANTIBIOTIQUE
La tobramycine est un antibiotique spécialement actif envers P. aeruginosa. L’effet de
l’antibiotique est évalué à une concentration de 4 mg/L. Les 4 souches non mucoïdes sont très
sensibles au composé (PYO1 > ATCC PAO1 > ATCC 15442 > ATCC 9027). La diminution
des ufc après 24 h de traitement des souches non mucoïdes varie de 3,5 log ufc/mL (ATCC
9027) à 6,1 log ufc/mL (PYO1). Les 4 souches mucoïdes sont beaucoup moins sensibles au
composé. La quantité d’ufc/mL diminue seulement de 2,0 log pour la souche MC75-450457,
la souche mucoïde la plus sensible à la tobramycine. La souche MC093-450507 est
complètement résistante à l’aminoglycoside. La différence de sensibilité à la tobramycine
entre les souches mucoïdes et non mucoïdes est significative (P = 0,03).
Figure 51 : Activité protéolytique dans le milieu de culture
ATC
C 1
5442
PYO1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO2
MC75
MC09
3
MC09
90.0
0.1
0.2
0.3
Souches
mucoïdes
Souches
non mucoïdes
DO
40
5 n
m
Le milieu de culture de P. aeruginosa est centrifugé. L’activité des protéases dans le
surnageant est mesurée avec l’azocaséine comme décrit dans le chapitre Matériel et
Méthodes. L’absorbance mesurée à 405 nm est utilisée comme index de l’activité
protéolytique. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3).
Figure 52 : Activité élastolytique dans le milieu de culture
ATC
C 1
5442
PYO1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO2
MC75
MC09
3
MC09
9
Contr
ôle0.0
0.1
0.2
0.3
0.4Souches
non mucoïdes
Souches
mucoïdes
DO
49
5 n
m
Le milieu de culture de P. aeruginosa est centrifugé. L’activité des élastases dans le
surnageant est mesurée avec un tampon ECR comme décrit dans le chapitre Matériel et
Méthodes. L’absorbance mesurée à 495 nm est utilisée comme index de l’activité
élastolytique. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes (n = 3).
Caractérisation phénotypique des souches
107
II.5 ACTIVITE PROTEOLYTIQUE
L’activité protéolytique de P. aeruginosa est étudiée par utilisation de l’azocaséine
comme substrat et par mesure de l’absorbance. L’activité protéolytique diffère au sein des 8
souches étudiées (figure 51). Les 2 souches secrétant la plus grande quantité de protéases sont
les souches mucoïdes MC75-450457 et MC093-450507. Pour trois souches (PYO1, PYO2 et
MC099-450467) aucune activité protéolytique n’est détectée (MC75-450457 > MC093-
450507 = ATCC PAO1 > ATCC 9027 = ATCC 15442 >> PYO2 > MC099-450467 = PYO1).
II.6 ACTIVITE ELASTOLYTIQUE
L’activité élastolytique de P. aeruginosa est étudiée par utilisation de l’ECR comme
substrat et par mesure de l’absorbance. L’activité élastolytique diffère au sein des 8 souches
étudiées (figure 52). Les 2 souches secrétant la plus grande quantité de protéases sont les
souches mucoïdes MC75-450457 et ATCC PAO1. Pour les autres souches pratiquement
aucune activité élastolytique n’est détectée.
Figure 53 : Etude sur boîte de Petri de la production des Cn≥6-HSL
A
ATC
C 1
5442
PYO1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO2
MC75
MC09
3
MC09
90
300
600
900
1200
4
4
4
2
4
4
4
4
Souches
mucoïdesSouches
non mucoïdes
n=
Su
rface
(m
m2)
B
Figure A : La souche biorapporteur est coulée sur boîte de Petri contenant le substrat X-Gal.
Cinq µL de chacune des 8 souches sont inoculés sur la couche d’agar et les boîtes de Petri
sont incubées à 28 °C pendant 48 h. La surface bleue autour de chaque spot d’inoculation est
évaluée. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 2 à 4 expériences indépendantes (n = 2 à 4).
Figure B : Photographie des spots indicateurs de la production de Cn≥6-HSL après incubation
de A. tumefaciens NTL4(pZLR4) en présence de P. aeruginosa PYO2 (gauche) et ATCC
15442 (droite).
Caractérisation phénotypique des souches
108
II.7 PRODUCTION D’AHL
II.7.1 Production des Cn≥6-HSL
II.7.1.1 Etude sur boîte de Petri
La synthèse de la libération de Cn≥6-HSL est étudiée à l’aide de la souche
biorapporteur A. tumefaciens NTL4(pZLR4). L’expression de lacZ par la souche
biorapporteur secondairement à l’interaction entre TraR et Cn≥6-HSL varie avec les extraits
des 8 souches. Un spot bleu, lié à la libération de l’anneau indole de X-Gal par la β-
galactosidase, apparaît au point d’inoculation de toutes les souches excepté pour la souche
mucoïde MC099-450467 et la souche non mucoïde ATCC 9027. Ces résultats indiquent que
ces deux souches ne sécrètent pas d’AHL capables d’interagir significativement avec le
facteur de transcription TraR et d’augmenter l’expression de lacZ. La surface formée par
chaque spot autour du point d’inoculation pour les 6 autres souches est estimée et utilisée
comme index de production et de libération d’AHL par ces souches. La production d’AHL
varie au sein des 8 souches étudiées : PYO2 > MC75-450457 > ATCC 15442 > MC093-
450507 > ATCC PAO1 > PYO1 >>> MC099-450467 = ATCC 9027 (figure 53 A).
Une gamme de concentrations est évaluée pour chaque souche indiquant que la
détection des AHL est dose-dépendante. En effet, la taille du spot varie en fonction de la
concentration de P. aeruginosa injectée dans la boîte de Petri (résultats non montrés).
Figure 54 : Etude sur microplaque de la production de Cn≥6-HSL
ATC
C 1
5442
PYO
1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO
2
MC75
MC09
3
MC09
90
4000
8000
12000
16000Souches
mucoïdes
Souches
non mucoïdes
Ac
tiv
ité
-ga
lac
tos
ida
se
(u
.a.f
.)
La souche biorapporteur est transférée dans les puits d’une plaque 96-puits. Deux µL d’un
extrait d’acétate d’éthyle du milieu de culture de chaque souche sont ajoutés aux puits. Après
18 h d’incubation à 28 °C, 20 µL du milieu de culture sont transférés dans les puits d’une
nouvelle plaque et incubés en présence de 25 µL d’une solution MUG à 1 mg/mL. La
fluorescence de chaque puits émise à 460 nm après excitation à 360 nm est mesurée toutes les
2 min pendant 30 min. Les résultats sont exprimés en vitesse d’augmentation de la
fluorescence. Ils sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat
(n = 3).
Tableau 3 : Chromatographie sur couche mince des Cn≥6-HSL
Chaîne
acyle des
standards
Shaw et
al.
(1997)
Notre
étude
Souches mucoïdes Souches non mucoïdes
PY
O2
MC
75-
450457
MC
099-
450467
MC
093-
450507
PY
O1
AT
CC
PA
O1
AT
CC
9027
AT
CC
15442
C6 0,43 0,42
3-oxo-C8 0,41 0,34 0,33 0,33 0,32 0,33 0,33
C8 0,23 0,24
3-oxo-C10 0,18 N.D. 0,15 0,15 0,18 0,15 0,14
C10 0,09 0,08
3-oxo-C12 0,07 N.D. 0,04 0,05 0,03 0,04 0,04
C12 0,02 N.D.
Le milieu de culture de 8 souches est extrait avec de l’acétate d’éthyle et 4 µL des extraits
sont déposés sur une plaque à phase inverse. La plaque est développée avec une solution de
méthanol/eau et les Cn≥6-HSL sont révélées par la superposition d’une couche d’agar
contenant la souche biorapporteur et le substrat X-Gal. La migration des différentes AHL est
mesurée à l’aide du logiciel Image Lab 3.0 du système ChemiDoc XRS+. La moyenne des
résultats de 2 à 3 expériences indépendantes est présentée dans le tableau (n = 2 à 3). N.D. =
non déterminé.
Caractérisation phénotypique des souches
109
II.7.1.2 Etude sur microplaque
Une expérience similaire, à l’aide d’un essai sur microplaque, est réalisée pour évaluer
la production des Cn≥6-HSL par les différentes souches. Les AHL sont extraits à l’aide
d’acétate d’éthyle et incubés en présence de A. tumefaciens NTL4(pZLR4) pendant 18 h.
L’expression de lacZ varie entre les souches: PYO2 > MC75-45057 > ATCC 15442 >
MC093-450507 > ATCC PAO1 > PYO1 > MC099-450467 = ATCC 9027 (figure 54). Ces
résultats sont en accord avec ceux observés lors des co-cultures dans une couche de soft agar
(essai sur boîte de Petri).
II.7.1.3 Etude par CCM
Une CCM est réalisée afin de séparer les Cn≥6-HSL produites par les souches et les
spots sont détectés par recouvrement à l’aide de la souche biorapporteur A. tumefaciens
NTL4(pZLR4). La migration des AHL produites par P. aeruginosa est comparée avec la
migration des standards. En accord avec Cha et al. (1998), la souche biorapporteur permet la
détection de plusieurs AHL avec des chaînes acyles de 6 à 12 carbones. Aucun spot n’est
observé pour 3 souches (MC099-450467, PYO1 et ATCC 9027). Trois spots sont détectés
dans le milieu de culture des 5 autres souches (PYO2, MC75-45057, ATCC 15442, MC093-
450507 et ATCC PAO1). Ces spots migrent avec un Rf compatible avec 3-oxo-C8-HSL, 3-
oxo-C10-HSL et 3-oxo-C12-HSL.
Figure 55 : Etude de la production des C4-HSL
ATC
C 1
5442
PYO
1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO
2
MC07
5
MC09
3
MC09
90.0
0.3
0.6
0.9
1.2 Souches
non mucoïdes
Souches
mucoïdesD
O2
99
nm
Un extrait d’acétate d’éthyle est incubé en présence de la souche biorapporteur P. aeruginosa
CGMCC 1.860 pendant 24 h. Le surnageant est extrait par du chloroforme, le solvant
organique évaporé et le résidu dissous dans 500 µL de méthanol. La DO 299 nm de la solution
méthanolique est mesurée à l’aide d’un lecteur à plaques. Les résultats sont la moyenne ±
SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).
Caractérisation phénotypique des souches
110
II.7.2 Production des C4-HSL
La production de C4-HSL par les 8 souches de P. aeruginosa est évaluée à l’aide de la
souche biorapporteur P. aeruginosa CGMCC 1.860. Trois souches mucoïdes (PYO2, MC75-
450457 et MC093-450507) et une souche non mucoïde (ATCC PAO1) produisent la quantité
la plus importante de C4-HSL. Les 4 autres souches produisent une quantité intermédiaire
comparable de C4-HSL (figure 55).
II.7.3 Détection et séquençage de 4 gènes du QS
Considérant que des mutations spontanées des gènes du QS, particulièrement lasR,
sont fréquentes (Sandoz et al., 2007), nous avons séquencé les 4 gènes après amplification par
PCR. Pour toutes les souches, le fragment amplifié correspond à l’amplicon attendu pour rhlI
(606 pb) et pour rhlR (727 pb). Pour les 2 autres gènes, lasI et lasR, les amplicons ont les
tailles attendues pour 7 souches. La souche ATCC PAO1 est la seule exception: lasI a la taille
correcte mais 2 fragments sont amplifiés pour lasR. Un de ces fragments a la taille attendue
(726 pb) et le deuxième est plus petit, d’environ 600 pb.
Après leur extraction et leur purification, les fragments amplifiés sont séquencés. Pour
chaque souche une recherche blast est effectuée en utilisant une combinaison des séquences
des 4 gènes. Le meilleur score pour la souche ATCC PAO1 est obtenu avec les souches de
référence suivantes: ATCC PAO1 (4384) > LESB58 (4323) > M18 (4312). Cet ordre est
différent pour les autres souches (LESB58 > M18 > ATCC PAO1) sauf pour la souche PYO1
(LESB58 > ATCC PAO1 > M18). Il faut remarquer que les scores obtenus en comparant les 8
souches étudiées avec les souches LESB58, ATCC PAO1 et M18 ne sont jamais très
différents (moins de 2 %). Les séquences des 4 gènes de toutes les souches (excepté la souche
ATCC PAO1) sont donc comparées au génome de la souche LESB58. Les séquences des
protéines sont comparées à l’aide du logiciel SIM, un logiciel permettant l’alignement de
séquences de protéines (Expasy, Switzerland).
Comme présenté dans le tableau 4, seules des mutations silencieuses sont détectées
dans les gènes lasI, rhlI et rhlR. Les souches MC099-450467 et PYO1 présentent les
mutations de lasR les plus significatives. Dans la souche MC099-450467, la mutation G584A
Figure 56 : Détection de 4 gènes du QS dans le génôme
Après extraction de l’ADN des 8 souches, les gènes lasI et lasR (figure A) et les gènes rhlI et
rhlR (figure B) sont amplifiés. Colonnes 1 et 2 : ATCC PAO1 ; colonnes 3 et 4 : MC099-
450467 ; colonnes 5 et 6 : MC093-450507 ; colonnes 7 et 8 : MC75-450457 ; colonnes 9 et 10
: PYO1 ; colonnes 11 et 12 : PYO2 ; colonnes 13 et 14 : ATCC 9027 ; colonnes 15 et 16 :
ATCC 15442. La taille des amplicons est estimée par comparaison avec le GeneRuler 100-bp
plus DNA ladder de part et d’autre du gel. Les gels sont représentatifs de 3 expériences
indépendantes (n = 3).
A
B
Caractérisation phénotypique des souches
111
introduit un codon STOP prématuré en position 195 ce qui tronque le domaine C-terminal de
la protéine (résidus 195 à 237). Dans la souche PYO1, la délétion de 2 pb provoque une
modification du cadre de lecture ce qui induit des changements majeurs dans la structure
primaire de la protéine (modification de la séquence de la protéine après l’acide aminé R122).
Trois souches ont une mutation ponctuelle modifiant le résidu 208 pour la souche MC093-
450507 (V208M) et modifiant le résidu 212 pour les souches ATCC 9027 et ATCC 15442
(M212T pour ATCC 9027 et M212V pour ATCC 15442).
Deux séquences sont obtenues pour la souche ATCC PAO1. Une de ces séquences est
identique à la séquence du gène lasR de cette souche. La deuxième séquence a une délétion
majeure entre les résidus 49 à 145 ce qui explique la taille plus petite du deuxième amplicon
observé sur le gel effectué après la PCR (628 bp au lieu de 726 bp).
Tableau 4 : Mutations des gènes lasI, lasR, rhlI et rhlR
LasI LasR RhlI RhlR
Souches Gène Protéine Gène Protéine Gène Protéine Gène Protéine
MC099-
450467 T.S. T.S. G584A W195
Stop T.S. T.S.
T147C
T364C
C396T
T.S.
MC093-
450507
G264C
G279A T.S. G622A V208M T.S. T.S.
T364C
C453A T.S.
MC75-
450457
G279A
G264C T.S. T.S. T.S. T.S. T.S.
T364C
C453A T.S.
PYO1 T150C
C441G
C531T
T.S.
G108C
C366del
C367del
Décalage
du cadre
de lecture
T.S. T.S.
T147C
T364C
C591T
T.S.
PYO2
T.S. T.S. T.S. T.S. T.S. T.S.
C258T
C453A
G567C
T.S.
ATCC
9027 T.S. T.S. T635C M212T T207C T.S.
T147C
T364C
C591T
T.S.
ATCC
15442 T.S. T.S. A634G M212V T207C T.S.
T147C
T364C
C591T
T.S.
Les séquences des 4 gènes dans 7 souches de P. aeruginosa sont comparées avec les
séquences de ces gènes chez P. aeruginosa LESB58. T.S. = Type sauvage
Figure 57 : Corrélations entre la production d’AHL et les caractéristiques
phénotypiques
C12-HSL et rhamnolipides
2500 5000 7500 100000
10
20
30
r = 0,291
Production de C12-HSL
Pro
du
cti
on
de
rh
am
no
lip
ide
s
C4-HSL et rhamnolipides
0.2 0.4 0.6 0.80
10
20
30
r = 0,787
Production de C 4-HSL
Pro
du
cti
on
de
rh
am
no
lip
ide
s
C12-HSL et protéases
0 2500 5000 7500 100000.0
0.1
0.2
0.3
r = 0,377
Production de C12-HSL
Ac
tiv
ité
pro
téo
lytiq
ue
C4-HSL et protéases
0.0 0.2 0.4 0.6 0.80.0
0.1
0.2
0.3
r = 0,021
Production de C4-HSL
Ac
tiv
ité
pro
téo
lytiq
ue
C12-HSL et formation du biofilm
0 2500 5000 7500 100000
1
2
3
r = 0,338
Production de C12-HSL
Cri
sta
l v
iole
t
C4-HSL et formation du biofilm
0.0 0.2 0.4 0.6 0.80
1
2
3
r = 0,787
Production de C4-HSL
Cri
sta
l vio
let
C12-HSL et BFRT ®
0 2500 5000 7500 100000
5
10
15
20
r = 0,111
Production de C12-HSL
BF
RT
®
C4-HSL et BFRT ®
0.0 0.2 0.4 0.6 0.80
5
10
15
20
r = 0,172
Production de C4-HSL
BF
RT
®
C12-HSL et sensibilité à la tobramycine
0 2500 5000 7500 100000
2
4
6r = 0,364
Production de C12-HSL
- L
og
(u
fc/m
L)
C4-HSL et sensibilité à la tobramycine
0.0 0.2 0.4 0.6 0.80
2
4
6r = - 0,285
Production de C 4-HSL
- L
og
(u
fc/m
L)
La production de Cn≥6-HSL (figures de gauche) et de C4-HSL (figures de droite) est comparée
à la production de rhamnolipides, l’adhésion, la formation du biofilm, la production de
protéases et la sensibilité à la tobramycine. La corrélation est mentionnée sur chaque
graphique.
Caractérisation phénotypique des souches
112
II.8 CORRELATIONS ENTRE LA PRODUCTION D’AHL ET DES
CARACTERISTIQUES PHENOTYPIQUES
La production de C4-HSL est significativement corrélée à la production de
rhamnolipides (n = 8 ; P = 0,017) ou à la formation du biofilm (n = 8 ; P = 0,017) par les
différentes souches (figure 57). Le coefficient de corrélation (coefficient de Pearson) est
proche de 1 pour ces deux corrélations (r = 0,787). Il n’y a pas d’autre corrélation
significative entre une caractéristique phénotypique des souches et leur production d’AHL.
Pour la clarté des résultats, un tableau récapitulatif de l’ensemble des propriétés des
souches est repris en annexe (annexe 1).
Caractérisation phénotypique des souches
113
III. DISCUSSION
Adhésion et formation du biofilm
Nous avons étudié la cinétique d’adhésion et de formation du biofilm par 8 souches de
P. aeruginosa à l’aide de deux méthodes, la technique du BFRT®
et la technique de coloration
par le CV.
Nos résultats indiquent que la technique du CV détecte le développement du biofilm
des 8 souches mais à des temps différents. Quatre souches développent un biofilm après 6 h.
Les 4 autres souches développent un biofilm après 24 h. Après cette phase initiale,
l’absorbance du CV augmente avec le temps et après 48 h toutes les souches montrent une
forte coloration par le CV. Ces observations sont cohérentes avec la vision actuelle que les
bactéries en général, et P. aeruginosa en particulier, résident de manière prédominante sous la
forme d’un biofilm (Costerton, 2001).
Nous n’avons pas observé de relation entre l’importance du biofilm après 48 h et la
capacité des souches à former un biofilm après 6 h : la souche PYO2 qui a une absorbance
faible après 6 h forme un des biofilms les plus importants après 48 h. A l’opposé, les souches
ATCC 9027 et ATCC 15442 adhèrent fortement à la surface du puits après 6 h mais ne
forment pas de biofilm important après 48 h. Ces résultats confirment également que le
développement d’un biofilm procède par différentes étapes distinctes (O’Toole et al., 2000).
Après 6 h nous n’avons pas observé de relation entre le caractère mucoïde ou non
mucoïde des souches et leur capacité à initier rapidement le développement d’un biofilm :
seule une des 4 souches mucoïdes (MC093-450507) est fortement colorée par le CV après 6
h. Ces résultats sont en accord avec Hay et ses collaborateurs qui ont montré que durant la
phase initiale d’attachement, la souche non mucoïde PAO1 a une adhésion plus importante
que toutes les souches mucoïdes testées (Hay et al., 2009). Après ce stade initial, la vitesse de
formation du biofilm est significativement plus importante pour les souches mucoïdes que
pour les souches non mucoïdes. Ce résultat confirme l’augmentation de la production
d’exopolysaccharides par P. aeruginosa durant la formation du biofilm (Hoyle et al., 1993).
La cinétique d’adhésion des bactéries au fond du puits, étudiée par la technique du
BFRT®, souligne également l’hétérogénéité au sein des 8 souches de P. aeruginosa. Quatre
Caractérisation phénotypique des souches
114
souches immobilisent complètement les billes en moins de 90 min. Les 4 autres souches
n’adhèrent pas aux puits après 90 min. La souche ATCC PAO1 est la souche qui s’est
attachée le plus rapidement au fond du puits et qui peut immobiliser les billes de manière
significative après 45 min seulement. Le dénombrement des bactéries adhérentes de la souche
ATCC PAO1 a révélé que 3 fois plus de bactéries sont attachées au fond du puits après 30
min en comparaison avec le nombre de bactéries attachées après 10 min.
Macé et al. (2008) et Tré-Hardy et al. (2009) ont également suggéré que les cinétiques
de formation du biofilm par P. aeruginosa varient parmi les souches mais que toutes les
souches sont capables de former un biofilm après une incubation plus longue.
Dans ce travail, nous avons comparé la capacité de 8 souches de P. aeruginosa à
adhérer à une surface et à former un biofilm par deux techniques basées sur la culture des
bactéries en microplaque. La technique du CV est une méthode assez laborieuse et la
procédure longue et non standardisée (nombre d’étapes de lavages, conditions de lavage,
durée de coloration, concentration en CV, …). Par ailleurs cette technique ne mesure pas la
viabilité cellulaire dans le biofilm mais la quantité de biomasse car aussi bien les cellules
(vivantes ou non) que la matrice sont colorées par le CV (Pitts et al., 2003). Cette technique a
été décrite pour la première fois par Christensen et al. (1985), améliorée par Stepanovic et al.
(2000) et est actuellement la plus utilisée pour quantifier l’adhésion bactérienne et la
formation de la biomasse. D’après nos résultats, la méthode du BFRT® semble aussi efficace
que le dénombrement classique des bactéries pour étudier l’adhésion des bactéries et la
formation rapide du biofilm. Les deux populations de souches (formant rapidement et
lentement un biofilm) déterminées avec le BFRT® sont similaires au groupe caractérisé par la
technique de coloration au CV après 6 h. La cohérence dans les résultats obtenus avec les
deux méthodes confirme que toutes les deux mesurent la phase initiale réversible de
l’adhésion. Une bonne corrélation entre le BFRT® et le CV a également été avancée par
Crémet et ses collaborateurs dans l’étude de la production du biofilm par différentes souches
cliniques de E. coli (Crémet et al., 2013). La technique du BFRT®
donne des résultats
significatifs plus rapidement que la méthode basée sur la coloration des bactéries et de la
matrice organique par le CV qui n’a pas montré de biofilm avant 4 h. Récemment, Liesse
Iyamba (2012) indique que la méthode du BFRT® est plus efficace et plus indiquée pour une
évaluation rapide de l’adhésion bactérienne par différentes souches de S. aureus en
comparaison avec la technique de coloration au CV qui nécessite des temps d’incubation plus
Caractérisation phénotypique des souches
115
longs pour observer une augmentation significative de l’absorbance. La technique du BFRT®
nous semble dès lors plus sensible que la technique de coloration au CV pour la détection de
l’adhésion des bactéries et des stades initiaux de la formation du biofilm. La différence de
sensibilité des deux méthodes et la meilleure sensibilité du BFRT®
peut être expliquée par
l’absence des étapes de lavage dans cette procédure et par le fait que cette méthode requiert
peu de manipulation. Le BFRT® semble donc être une méthode simple et rapide spécialement
adaptée à la détermination de la capacité de P. aeruginosa à initier la formation du biofilm.
Elle a été utilisée avec succès dans l’étude de la formation des biofilms par des bactéries
(Chavant et al., 2007), des microalgues (Badel et al., 2011) et même pour étudier des
polysaccharides (Badel et al., 2008).
Cependant, pour étudier des biofilms plus importants et à des stades plus avancés, la
technique de coloration au CV est préférée. Malgré les avantages du BFRT®, cette méthode
est rapidement saturée et ne peut donner une estimation précise de biofilms importants. Cette
conclusion rejoint celle de Liesse Iyamba et al. (2011).
En outre, nous rencontrons certains inconvénients lors de l’utilisation de la technique
du BFRT®. L’étude de l’effet d’un composé antimicrobien sur la formation du biofilm par le
BFRT® nécessite un contrôle préalable de l’effet de cet agent sur les billes magnétiques. En
absence d’effet sur la mobilité des billes, le BFRT®
permet l’étude de l’activité de divers
composés sur la formation du biofilm. Nous avons cependant mis en évidence une interaction
entre les billes magnétiques chargées positivement et négativement et le CSA-13 ou les PAM
dérivés du LL-37 rendant l’incorporation de ces composés dans l’étude sur la formation du
biofilm impossible (données non montrées). Ces interactions entre les billes et les peptides ont
été observées même à de très faibles concentrations en LL-37 (inférieures à 1 µM). Les forces
électrostatiques entre les billes chargées et le composé (CSA-13 ou peptide LL-37) ne seraient
pas responsables de cette interaction étant donné que des interférences similaires ont été
notées avec les billes portant des charges opposées. Ces interactions inattendues entre un
composant du milieu de culture et les billes ont été observées précédemment (Liesse Iyamba
et al., 2011). Les auteurs démontrent que l’ajout de la protéinase K dans le milieu du BFRT®
provoque une diminution importante de l’IFB suggérant que la suspension d’enzyme
immobilise les billes ou interfère avec leur sensibilité à l’aimant. Badel et son équipe
constatent que certains milieux de culture peuvent interférer avec la mobilité des billes et que
l’addition d’une très faible concentration de Tween 20 au milieu (0,002 %) inhibe ces
Caractérisation phénotypique des souches
116
interférences (Badel et al., 2011). Badel et al. (2008) démontrent aussi que la pronase bloque
la migration des billes et rend les analyses par le BFRT® difficiles.
Mobilité bactérienne et rhamnolipides
Le swarming est une mobilité de surface affectée non seulement par le flagelle mais
également par les pili de type IV et les rhamnolipides (Köhler et al., 2000). La mobilité de
type swarming et la production de rhamnolipides ne peuvent distinguer la population de
bactéries s’attachant rapidement à la surface du fond du puits des populations adhérant
lentement. La souche ATCC PAO1 a la plus grande mobilité de type swarming. Les autres
souches présentent une mobilité swarming beaucoup moins importante et leur mobilité n’est
pas liée à leur capacité à s’attacher rapidement à une surface ou à former un biofilm. Les
rhamnolipides sont des molécules amphipatiques composées d’un lipide hydrophobe et d’un
sucre hydrophile. Ils sont les constituants principaux des biosurfactants produits par P.
aeruginosa (Soberon-Chavez et al., 2005). Ils favorisent le swarming car ils agissent comme
agents mouillants qui réduisent la tension de surface (Caiazza et al., 2005). Trois souches
(ATCC 9027, ATCC 15442 et MC099-450467) ne produisent pas de rhamnolipides et pour la
souche PYO1 la production de rhamnolipides n’est pas significative. Parmi les 4 autres
souches, la souche MC093-450507 est la productrice de rhamnolipides la plus importante.
Cette séquence n’est pas corrélée avec la capacité des différentes souches à initier le
développement du biofilm. Le swimming est une autre forme de mobilité qui est dépendante
du flagelle (Murray et Kazmierczak, 2006). Excepté pour la souche ATCC PAO1 qui a une
activité très importante, la différence au sein des autres souches est plus faible. Les 4 souches
avec la mobilité de type swimming la plus importante sont les 4 souches avec un BFRT®
positif ou qui forment rapidement un biofilm avec la méthode de CV. Ceci est cohérent avec
la vision actuelle selon laquelle le flagelle est impliqué dans les étapes initiales du
développement du biofilm (O’Toole et Kolter, 1998b). Nos résultats confirment donc
l’importance du flagelle dans la phase d’attachement initial pour la formation du biofilm.
Sensibilité à la tobramycine
Les jeunes biofilms (24 h) formés par les souches non mucoïdes sont significativement
plus affectés par la tobramycine que les biofilms mucoïdes. Après 24 h, la formation des
biofilms par les souches mucoïdes versus non mucoïdes n’est pas significativement différente
par la technique de coloration au CV. Cette différence devient significative après 48 h.
Caractérisation phénotypique des souches
117
Aucune corrélation ne peut être établie entre la sensibilité des souches à la tobramycine et leur
capacité à former un biofilm important après 24 h (CV) ou à adhérer à une surface (BFRT®).
Activité protéolytique et élastolytique
L’activité élastolytique diffère au sein des 8 souches étudiées. Les deux souches
secrétant la plus grande quantité d’élastase sont les souches mucoïdes MC75-450457 et
ATCC PAO1. En accord avec ces résultats, ces deux souches sont également parmi les 3
souches ayant la plus grande activité protéolytique. Pratiquement aucune activité élastolytique
n’est détectée chez les autres souches. Les souches MC093-450507, ATCC 9027 et ATCC
15442 présentent une activité protéolytique importante probablement liée à d’autres protéases
que l’élastase.
Production d’AHL
Las et rhl sont 2 systèmes autoinducteurs majeurs contribuant au QS et exprimés par
P. aeruginosa. LasI et RhlI sont les enzymes qui synthétisent 3-oxo-C12-HSL et C4-HSL
respectivement. Après liaison à leur facteur de transcription respectif (LasR et RhlR), les
AHL activent la transcription de nombreux gènes (plus de 6 % du génome entier pour LasR)
(Schuster et al., 2003). Pour estimer la production de C4-HSL, nous avons utilisé une souche
de P. aeruginosa incapable de produire des C4-HSL par absence de rhlI. Cette souche
surexprime rhlR la rendant très sensible à des C4-HSL exogènes. En réponse à l’activation de
RhlR, cette souche environnementale synthétise un pigment bleu facilement détectable.
Quatre souches produisent des quantités importantes de C4-HSL. Il n’y a pas de différence
évidente entre les souches mucoïdes et non mucoïdes. La souche A. tumefaciens
NTL4(pZLR4) utilisée pour détecter Cn≥6-HSL a été conçue par Cha et ses collaborateurs
(1998). Elle exprime TraR, un facteur de transcription qui, contrairement à LasR et RhlR, est
plutôt non spécifique et répond à différentes AHL avec un groupement acyle plus long que 4
atomes de carbone (Cha et al., 1998). Ces résultats sont confirmés par CCM. L’analyse des
AHL activant TraR révèle 3 bandes distinctes qui migrent avec 3-oxo-C8-HSL, 3-oxo-C10-
HSL et 3-oxo-C12-HSL. Ces 3 AHL sont synthétisées par LasI. Il est largement accepté que
les 2 systèmes du QS de P. aeruginosa sont principalement sensibles à C4-HSL (RhlR) et à
C10- et 3-oxo-C12-HSL (LasR). Le rôle de 3-oxo-C8-HSL ou 3-oxo-C10-HSL reste incertain. Il
a été rapporté récemment que la sensibilité de P. aeruginosa à 3-oxo-C9- ou 3-oxo-C10-HSL
est régulée par la pompe à efflux MexAB-OprM (Minagawa et al., 2012). Cette pompe permet
l’efflux de 3-oxo-AHL avec un acide gras à longue chaîne. Des mutations de cette protéine
Caractérisation phénotypique des souches
118
peuvent contribuer à l’accumulation intracellulaire de 3-oxo-C10-HSL à des concentrations
suffisantes pour activer LasR. Le 3-oxo-C8-HSL qui diffuse hors de la bactérie, pourrait
interagir avec des protéines transcriptionnelles d’autres bactéries à Gram négatif pourvues
d’un régulateur de la transcription sensible à cette molécule et contribuer au développement
de biofilms multi-espèces (Riedel et al., 2001).
Séquençage
Considérant que des mutations spontanées des gènes du QS, particulièrement lasR,
sont fréquentes (Sandoz et al., 2007), nous avons séquencé 4 gènes du système : les gènes
lasI, lasR, rhlI et rhlR. L’analyse des séquences des 4 gènes révèle de fortes analogies avec la
souche P. aeruginosa LESB58. La souche hypervirulente LESB58 a été identifiée pour la
première fois en 1996 chez des patients atteints de mucoviscidose (Cheng et al., 1996). Nos
résultats suggèrent que 7 souches étudiées dans ce travail sont probablement dérivées de la
souche P. aeruginosa LESB58. Trois gènes de ces 7 souches (lasI, rhlI et rhlR) sont très
similaires aux gènes de la souche LESB58. LasR est le seul gène avec des mutations affectant
la structure de la protéine. Ces résultats sont cohérents avec des observations rapportant que
les souches cliniques de P. aeruginosa isolées de patients atteints de mucoviscidose montrent
un grand taux de mutations du gène lasR : après colonisation des poumons de ces patients, 60
% des isolats portent une mutation de lasR (Smith et al., 2006). Dans notre étude, 2 souches
(PYO1 et MC099-450467) ont des mutations provoquant une altération majeure de la protéine
(codon STOP prématuré et expression d’une protéine raccourcie ; décalage du cadre de
lecture et changements dans la structure primaire de la protéine). Ces altérations majeures de
LasR pourraient expliquer la faible quantité d’AHL produites par les souches PYO1 et
MC099-450467 (plus d’amplification du système par auto-induction). Trois autres souches
ont une mutation faux sens dans l’hélice-α impliquée dans la liaison de LasR à l’ADN
(Bottomley et al., 2007). Une de ces mutations (V208M dans la souche MC093-450507)
affecte un résidu conservé mais le rôle de cette valine n’a pas été défini (Bottomley et al.,
2007). Sa substitution par un autre acide aminé hydrophobe ne devrait pas affecter l’activité
de la protéine. Les deux autres mutations concernent la méthionine 212. Cet acide aminé
appartient à une hélice-α interagissant avec l’ADN (Bottomley et al., 2007). Il est substitué
soit par une valine, un autre acide aminé hydrophobe (ATCC 15442), soit par une thréonine,
un résidu polaire (ATCC 9027). Cette mutation peut expliquer la faible quantité d’AHL
observée avec cette souche. Deux gènes lasR sont amplifiés dans la souche de référence
ATCC PAO1. Un de ces gènes a une délétion qui recouvre la majeure partie du fragment
Caractérisation phénotypique des souches
119
amplifié. L’expérience est répétée avec une autre souche ATCC PAO1 obtenue par le Dr O.
Vandeputte (Vandeputte et al., 2011). Seul un amplicon lasR est observé avec cette souche
(données non montrées) confirmant qu’une mutation est apparue dans notre souche ATCC
PAO1 pendant la conservation. Des mutations spontanées de la souche ATCC PAO1
apparaissant après plusieurs passages ont été décrites par Klockgether et al. (2010). Sandoz et
al. (2007) suggèrent que ces mutations apparaissent sous des conditions dans lesquelles les
nutriments sont en abondance et les signaux de QS absents. D’après ces auteurs, une souche
compétente en QS et une souche déficiente en QS, souche « tricheuse », pourraient coexister
dans une population hétérogène.
Corrélations AHL et phénotype
La présence d’AHL dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose et
infectés par P. aeruginosa a été remarquée pour la première fois par Singh et al. (2000). Ces
résultats ont été en partie confirmés par Middleton et ses collaborateurs qui ont détecté et testé
dans les expectorations de certains patients atteints de mucoviscidose des AHL avec des
groupements acyls de 4 à 12 carbones (Middleton et al., 2002). Erickson et ses collègues ont
rapporté que P. aeruginosa synthétise 3-oxo-C12-HSL dans les poumons de patients atteints
de mucoviscidose (Erickson et al., 2002). A partir de tels résultats il a été suggéré que la
formation d’un biofilm par P. aeruginosa, et donc sa pathogénicité, est corrélée avec sa
capacité à libérer des AHL (Høiby et al., 2010b).
Nous avons donc comparé certaines caractéristiques phénotypiques des 8 souches avec
leur capacité à produire des AHL. Nos résultats n’ont pas illustré de corrélation entre la
production de Cn≥6-HSL et l’adhésion des bactéries (BFRT®), leur production de biofilm
(CV), leur sensibilité à la tobramycine, leur sécrétion de protéases ou leur production de
rhamnolipides. Des résultats similaires ont été démontrés par Perez et al. (2013) qui n’ont pas
détecté de lien dans la capacité de souches cliniques et non cliniques de P. aeruginosa à
former un biofilm et à produire des AHL. Nous avons cependant mis en évidence une
corrélation entre la production de C4-HSL et la production de rhamnolipides. Cette corrélation
est secondaire à la régulation de l’opéron rhlAB par le complexe RhlR-C4-HSL (Ochsner et
Reiser, 1995). La production de C4-HSL est aussi corrélée avec la formation d’un biofilm
(CV) mais pas avec l’attachement initial des bactéries sur une surface abiotique (BFRT®), la
sensibilité à la tobramycine ou la sécrétion de protéases.
Caractérisation phénotypique des souches
120
Nos résultats suggèrent dès lors que l’essai de la production des C4-HSL a une certaine
valeur prédictive sur la tendance d’une souche à former un biofilm. En outre, ils illustrent la
variabilité de la production d’AHL et la difficulté de prédiction du comportement des
souches.
Conclusion
Dans la première partie de ce travail, nous soulignons la diversité phénotypique et
génotypique des 8 souches de P. aeruginosa et dès lors la complexité pour l’étude de
traitements potentiels sur ces souches. La capacité d’une souche à adhérer rapidement à une
surface ou à former un biofilm important ne semble pas prédire sa sensibilité à un
antibiotique. Etant donné la difficulté de prédiction du comportement de la souche en fonction
de son phénotype, l’étude de l’activité d’un agent antimicrobien sur une large collection de
souches permettra de s’approcher au mieux de l’effet réel attendu chez le patient.
La suite du travail consistera à évaluer le potentiel de nouveaux agents antimicrobiens
dans le traitement d’infections à P. aeruginosa liées à la formation d’un biofilm, pour
contourner l’émergence de la résistance développée avec les antibiotiques conventionnels.
L’étude de l’activité d’un nouvel antibiotique potentiel (CSA-13) sera réalisée sur les
biofilms formés par les 8 souches de P. aeruginosa afin d’élargir le panel des phénotypes et
génotypes des souches étudiées.
Un screening de l’effet antibactérien et antibiofilm de peptides cationiques dérivés du
LL-37 sera réalisé sur la souche la plus documentée dans la littérature sur la mucoviscidose, la
souche ATCC PAO1. Etant donné ses propriétés d’adhésion très rapide et importante au fond
du puits en comparaison aux autres souches (BFRT®), ainsi que sa capacité à former un
biofilm important (CV), la souche ATCC PAO1 semble être un bon modèle pour l’étude d’un
screening de l’activité d’agents antimicrobiens. Cette souche est également celle dont les
mobilités swimming et swarming sont les plus importantes et qui produit une grande quantité
de rhamnolipides, de protéases (dont l’élastase) et d’AHL, autant de facteurs susceptibles de
contribuer à la virulence du pathogène.
Etude du CSA-13
121
CHAPITRE II
ETUDE DU CSA-13
Etude du CSA-13
122
I. INTRODUCTION
Dans la lutte pour combattre les infections pulmonaires à P. aeruginosa chez les
patients atteints de mucoviscidose et l’apparition de souches multirésistantes, de nouvelles
stratégies thérapeutiques sont développées. L’administration par inhalation des antibiotiques a
permis d’augmenter considérablement la concentration locale des composés dans les
expectorations des patients en comparaison avec l’administration intraveineuse (Flume,
2008). De nouvelles associations d’antibiotiques ont été préconisées pour cibler non
seulement la bactérie mais également le biofilm qu’elle forme (Kaplan, 2010 ; Tré-Hardy et
al., 2009). La combinaison des antibiotiques avec des molécules contribuant au système
immunitaire inné est une autre option thérapeutique envisagée pour combattre les souches
multirésistantes (Rosenthal, 2006). Dans ce but, les PAM ont suscité un grand intérêt
puisqu’ils sont peu susceptibles d’induire une résistance et possèdent un large spectre
d’activité. Ces peptides sont caractérisés par une structure amphipatique et agissent par
déstabilisation de la membrane bactérienne (Guani-Guerra et al., 2010). Cependant,
l’utilisation in vivo des PAM comme agents antibactériens présente des inconvénients qu’il
faut résoudre avant de tirer pleinement profit de ces molécules. Parmi les stratégies explorées
pour contourner la fragilité des PAM rencontrée sous des conditions physiologiques, le
développement de dérivés peptido-mimétiques offre des alternatives potentielles. Les
céragenines sont une famille de molécules dérivées de l’acide cholique auxquelles des
groupements aminoalkyls ont été ajoutés (Epand et al., 2008). Ces molécules ont été
synthétisées dans le but de mimer la structure amphipatique des PAM (Ding et al., 2002).
Contrairement à ces derniers, les céragenines sont résistantes aux protéases et ne sont pas
inactivées par les composants du biofilm (Bucki et al., 2007b).
Dans une deuxième partie de ce travail, nous avons investigué le potentiel d’activité
d’un composé appartenant à la famille des céragenines, le CSA-13, dans l’éradication des
infections liées à P. aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose. Nous avons
exploré l’effet du composé sur les différents aspects de la colonisation bactérienne. L’activité
du CSA-13 sur culture planctonique, sur la formation du biofilm, sur biofilm jeune et sur
biofilm mature a été étudiée sur différentes souches de P. aeruginosa, comprenant des
souches de référence et des souches cliniques. L’intérêt d’administrer une association
Etude du CSA-13
123
d’agents antimicrobiens, le CSA-13 et la tobramycine, pour combattre le biofilm de P.
aeruginosa a été exploré. La MCBL a permis de caractériser l’activité de l’antibiotique
stéroïde cationique dans l’architecture tridimensionnelle du biofilm. Des études in vitro de la
toxicité cellulaire du composé ont également été réalisées et l’atténuation de la toxicité par
association du CSA-13 avec l’acide pluronique F-127 a été investiguée.
Tableau 5 : Détermination de la CMI et de la CMB
Souche Tobramycine CSA-13
CMI CMB CMI CMB
ATCC PAO1 2-4 4 6-12 12
ATCC 9027 1-2 2-4 3 6
ATCC 15442 2 2-4 3 6-12
PYO1 8 8 1 3-6
PYO2 2 2-4 1,5 6-12
MC75-450457 < 1 2 6 12-25
MC099-450467 < 2 16 3 6
MC093-450507 16 62-125 6 6-12
La détermination de la CMI est réalisée par la technique de microdilution de 2 en 2
conformément au protocole du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2003).
Après 24 h d’incubation à 35 °C, les résultats sont lus par observation de l’absence de
turbidité. Les puits clairs de cette même microplaque sont repiqués et après 24 h d’incubation
à 35 °C la CMB est déterminée. Les résultats sont exprimés en mg/L et sont la moyenne de 3
expériences.
Figure 58 : Effet du CSA-13 sur l’insertion membranaire du NPN
PAO1
0 25 50 75 1000
25
50
75
100
CSA-13 (mg/L)
Flu
ore
sc
en
ce
(%
du
ma
xim
um
)
MC093-450507
0 25 50 75 1000
20
40
60
80
100
CSA-13 (mg/L)
Flu
ore
sc
en
ce
(%
du
ma
xim
um
)
PYO1
0 20 40 60 80 1000
10
20
30
40
50
60
70
CSA-13 (mg/L)
Flu
ore
sc
en
ce
(%
du
ma
xim
um
)
Des cultures planctoniques de 3 souches de P. aeruginosa sont incubées en présence de NPN
et de différentes concentrations en CSA-13. Les résultats sont exprimés comme variation de la
fluorescence ± SEM après 10 min d’exposition au CSA-13. Les résultats sont ajustés à l’aide
de l’équation d’une hyperbole à une composante et sont la moyenne de 3 expériences
indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).
Etude du CSA-13
124
II. RESULTATS
II.1 EFFET DU CSA-13 SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES
II.1.1 Détermination de la CMI et de la CMB
Les cultures planctoniques de 8 souches de P. aeruginosa sont étudiées pour leur
sensibilité au CSA-13 et à la tobramycine. La CMI varie de 1 mg/L pour la souche PYO1 à 12
mg/L pour la souche ATCC PAO1. Les CMB sont légèrement plus élevées (de 2 à 8 fois)
avec la souche MC75-450457 qui est la moins sensible au CSA-13 (CMI de 12 à 25 mg/L).
Le ratio CMI/CMB varie de 1 à 8 suggérant que le CSA-13 est principalement bactéricide.
Sept souches sont de sensibilité égale à la tobramycine (CMI entre 1 et 8 mg/L). La CMB
pour la tobramycine est dans la même gamme de concentrations, très similaire à la CMI pour
chaque souche. Une souche (MC093-450507) est nettement moins sensible à la tobramycine
(CMI à 16 mg/L et CMB à 62-125 mg/L).
II.1.2 Effet du CSA-13 sur la perméabilité au NPN
La perturbation membranaire de 3 souches de P. aeruginosa (ATCC PAO1, PYO1 et
MC093-450405) après exposition à différentes concentrations de CSA-13 est mesurée à l’aide
d’un essai de perméabilité au NPN. Comme le montre la figure 58, des concentrations en
CSA-13 entre 1 et 10 mg/L provoquent une augmentation de la fluorescence reflétant une
perturbation de la membrane bactérienne. La courbe dose-réponse est analysée par ajustement
de la courbe expérimentale à l’équation d’une hyperbole à une composante (r2
= 0,543
(MC093-450405) ; 0,852 (ATCC PAO1) et 0,919 (PYO1)). La concentration mi-maximale de
saturation en CSA-13 pour les 3 souches est de 4,4 ± 0,7 mg/L (n = 3). Cette valeur est très
proche de la CMB des différentes souches et souligne l’importance de l’interaction entre le
CSA-13 et la membrane bactérienne dans l’effet bactéricide du composé. La courbe dose-
réponse du CSA-13 sur l’insertion du NPN est similaire pour les 3 souches, confirmant que
les cultures planctoniques de ces 3 souches sont de manière égale hautement sensibles au
CSA-13.
Figure 59 : Effet du CSA-13 sur la formation d’un biofilm
Souches non mucoïdes
PAO1 PYO1 ATCC 9027 ATCC 154420
1
2
3
4
Contrôle 24h
CSA-13 24h
CSA-13 48h
Contrôle 48h
*
AD
O5
40
nm
Souches mucoïdes
MC093 PYO2 MC099 MC750
1
2
3
4Contrôle 24h
CSA-13 24h
CSA-13 48h
Contrôle 48h
*
*
B
DO
54
0 n
m
L’effet du CSA-13 sur la formation d’un biofilm par 4 souches non mucoïdes (figure A) et 4
souches mucoïdes (figure B) est évalué par la technique de coloration au CV après 24 et 48 h.
Les résultats sont la moyenne ± SEM de 9 valeurs obtenues dans 3 expériences indépendantes
réalisées en triplicat (n = 9). * P < 0,05.
Etude du CSA-13
125
II.2 EFFET DU CSA-13 SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM
II.2.1 Effet d’une faible concentration en CSA-13 sur la formation d’un
biofilm
L’effet du CSA-13 sur la formation du biofilm par les 8 souches bactériennes est
évalué par la technique de coloration au CV après 24 et 48 h d’incubation. La capacité des
souches à former un biofilm est très variable. La formation du biofilm par la souche ATCC
PAO1, une des 2 souches non mucoïdes formant un biofilm important, est significativement
affectée par une administration préventive de 1 mg/L de CSA-13 (figure 59 A). Le composé
stéroïdien permet une diminution de l’absorbance de 3,3 ± 0,4 à 1,5 ± 0,5 unités d’absorbance
(u.a.) (P < 0,05 ; n = 8) après 48 h. Parmi les 4 souches mucoïdes, le CSA-13 inhibe
significativement la formation du biofilm par les souches MC75-450457 et MC099-450467
mais aucun effet apparent n’est observé sur les souches MC093-450507 et PYO2 (figure 59
B). Après 48 h d’incubation, le composé stéroïdien diminue l’absorbance de 2,0 ± 0,5 u.a. (n
= 8) à 0,6 ± 0,3 u.a. (n = 7 ; P < 0,05) pour la souche MC75-450457 et de 1,9 ± 0,7 u.a. (n =
8) à 0,3 ± 0,1 u.a. (n = 9 ; P < 0,05) pour la souche MC099-450467. En conclusion, une
concentration en CSA-13 très faible (jusqu’à 10 fois plus faible que la CMI) inhibe la
biomasse de 3 des 8 souches testées (les souches ATCC PAO1, MC75-450457 et MC099-
450467).
Figure 60 : Spectres de fluorescence du CSA-119
Spectre d'émission
CSA-119
400 450 500 550 6000
50000
100000
150000
200000
250000
A
Longueur d'onde (nm)
Flu
ore
scen
ce (
u.a
.f.)
Spectre d'excitation
CSA-119
250 300 350 400 4500
20000
40000
60000
80000
100000
B
Longueur d'onde (nm)
Flu
ore
scen
ce (
u.a
.f)
Spectre d'émission
PBS et CSA-119
400 450 500 550 6000
200000
400000
600000
C
Longueur d'onde (nm)
Flu
ore
scen
ce (
u.a
.f.)
Spectre d'émission
PAO1 et CSA-119
350 400 450 500 550 6000
200000
400000
600000
D
Longueur d'onde (nm)
Flu
ore
scen
ce (
u.a
.f.)
Figures A et B : Les spectres d’émission (figure A) et d’excitation (figure B) du CSA-119 à
la concentration de 2 mg/L dans un tampon PBS sont obtenus à l’aide d’un fluorimètre.
Figures C et D : Le spectre d’émission du CSA-119 à la concentration de 2 mg/L dans un
tampon PBS est mesuré à l’aide d’un fluorimètre en absence (figure C) ou en présence (figure
D) d’une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1.
Figure 61 : Cinétique de l’interaction entre le CSA-119 et la souche ATCC PAO1
0 200 400 600 800
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
350000 mg/L
1 mg/L
2 mg/L
5 mg/L
6 mg/L
Temps (s)
Flu
ore
sc
en
ce
(u
.a.f
.)
Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée en présence de 5
concentrations de CSA-119 dans un tampon PBS dans des plaques 96-puits. La fluorescence
de chaque puits est mesurée à intervalle de 40 sec. Les résultats sont corrigés en fonction de la
photodégradation de la sonde et sont exprimés comme variation de la fluorescence en fonction
du temps (à chaque temps et chaque concentration en CSA-119, les résultats reflètent la
différence entre la variation de fluorescence mesurée en absence et en présence des bactéries).
Ils sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).
Etude du CSA-13
126
II.2.2 Etude de la cinétique d’interaction du CSA-119 avec 8 souches de
P. aeruginosa
Nous avons démontré que l’administration préventive de CSA-13 à une concentration
de 1 mg/L inhibe la formation de biofilm par les souches MC099-450467, ATCC PAO1 et
MC75-450457. L’interaction entre le CSA-13 et les bactéries est étudiée à l’aide d’un
analogue fluorescent du CSA-13 (greffement du groupement dansyle), le dérivé CSA-119,
dans le but de mettre en évidence une éventuelle corrélation entre la sensibilité au CSA-13 et
les propriétés membranaires des souches. Dans un premier temps, les spectres d’émission et
d’excitation de la molécule (à une concentration de 2 mg/L) ont été établis dans un tampon
PBS (figure 60 A et B). Ceux-ci ont permis d’obtenir les longueurs d’onde d’excitation (345
nm) et d’émission (495 nm) optimales de la sonde fluorescente. La mesure de l’interaction du
CSA-119 avec les souches bactériennes repose sur l’environnement lipophile de l’agent
fluorescent dansyle greffé au CSA-13. La translocation du CSA-119 d’un environnement
polaire (tampon) vers un compartiment hydrophobe (membrane bactérienne) provoque une
augmentation de l’intensité de la lumière émise à 495 nm après excitation à 345 nm (figure 60
C et D).
La souche ATCC PAO1 est ensuite exposée à différentes concentrations de CSA-119
et une cinétique de la fluorescence est enregistrée. Comme le montre la figure 61, la vitesse de
l’augmentation de l’intensité de fluorescence varie en fonction de la concentration en CSA-
119 (concentrations de 1 à 6 mg/L). Une concentration plus importante en CSA-119 induit
une augmentation plus importante de la fluorescence.
Figure 62 : Interaction entre le CSA-119 et les 8 souches de P. aeruginosa
ATC
C 1
5442
PYO1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO2
MC75
MC09
3
MC09
90
5000
10000
15000
20000 Souches
non mucoïdes
Souches
mucoïdes
Souches de référence
Souches cliniquesF
luo
res
ce
nc
e (
u.a
.f.)
Les 8 souches de P. aeruginosa sont incubées en présence de 2 mg/L de CSA-119 pendant 12
min. Les résultats sont corrigés en fonction de la photodégradation et sont exprimés comme
variation de la fluorescence en fonction du temps (pour chaque temps et chaque concentration
en CSA-119 les résultats reflètent la différence entre la variation de fluorescence mesurée en
absence et en présence des bactéries). Ils sont la moyenne ± SEM de 3 expériences
indépendantes réalisées en triplicat (n = 3).
Figure 63 : Effet du CSA-13 sur la production de rhamnolipides
MC093-450507 PAO1 MC75-4504570
10
20
30
40
50Contrôle
+ CSA-13 1 mg/L
5
4
6
3
33
n=
Co
nc
en
tra
tio
n e
n r
ha
mn
os
e
(µg
/mL
)
Les souches MC75-450457, MC093-450507 et ATCC PAO1 sont incubées pendant 48 h en
absence ou en présence de CSA-13 à 1 mg/L. La production de rhamnose par les trois souches
est évaluée par la méthode à l’orcinol – acide sulfurique. Les résultats sont exprimés en µg de
rhamnose/mL dans le bouillon de culture. Ils sont la moyenne ± SEM de 3 à 6 expériences
indépendantes réalisées en triplicat.
Etude du CSA-13
127
Afin de comparer la sensibilité membranaire des 8 souches de P. aeruginosa au CSA-
119, la fluorescence lue après un temps arbitraire d’exposition (12 min) à une concentration
arbitraire de CSA-119 (2 mg/L) est représentée (figure 62). L’interaction de la membrane
bactérienne avec le CSA-119 est différente selon les souches ; certaines suspensions
bactériennes présentent une intensité de fluorescence plus élevée corrélée avec une plus
grande sensibilité membranaire au CSA-119 (ATCC PAO1 > MC75-450457 > ATCC 9027 >
ATCC 15442 > PYO1 > MC099-450467 > MC093-450507 > PYO2).
II.2.3 Effet du CSA-13 sur la production de rhamnolipides
Les rhamnolipides sont des surfactants pouvant contribuer à la formation du biofilm.
Nous avons démontré précédemment que 3 souches sur les 8 souches de P. aeruginosa (les
souches MC093-450507, MC75-450457 et ATCC PAO1) produisent une quantité importante
de rhamnolipides (figure 49). Afin d’étudier l’effet d’une longue exposition au CSA-13 sur la
production de rhamnolipides par ces souches, les souches MC093-450507, MC75-450457 et
ATCC PAO1 sont incubées pendant 48 h en présence ou non de 1 mg/L de CSA-13 (figure
63). La quantité de rhamnolipides dans le milieu de culture est évaluée par dosage du sucre en
utilisant la méthode de coloration à l’orcinol en milieu acide. Les souches MC093-450507,
MC75-450457 et ATCC PAO1 produisent respectivement 30 ± 6 (n = 5) ; 20 ± 3 (n = 6) et 26
± 6 (n = 4) µg/mL de rhamnose. Le traitement des 3 souches par le CSA-13 n’a pas démontré
d’effet significatif sur la production de rhamnose.
Figure 64 : Distribution du potentiel zêta des 4 souches mucoïdes de P. aeruginosa
PYO2
-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750
50000
100000
150000
- 41 mV (46 %)
- 18 mV (19 %)
+ 4 mV (35 %)
- 21 22 mV
Potentiel zêta (mV)
Co
mp
tag
e
MC75-450457
-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750
50000
100000
150000
200000
- 56 mV (54 %)
- 40 mV (45 %)
- 50 10 mV
Potentiel zêta (mV)
Co
mp
tag
e
MC093-450507
-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750
50000
100000
150000
200000
- 34 mV (64 %)
- 55 mV (35 %)
- 42 13 mV
Potentiel zêta (mV)
Co
mp
tag
e
MC099-450467
-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750
50000
100000
150000
200000
- 49 8 mV
Potentiel zêta (mV)
Co
mp
tag
e
Figure 65 : Distribution du potentiel zêta de 4 souches non mucoïdes de P. aeruginosa
ATCC 9027
-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750
50000
100000
150000
200000
- 28,5 mV (91 %)
- 49,3 mV (9 %)
- 30 9 mV
Potentiel zêta (mV)
Co
mp
tag
e
ATCC 15442
-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750
100000
200000
300000
- 28 5 mV
Potentiel zêta (mV)
Co
mp
tag
e
PYO1
-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750
50000
100000
150000
200000
- 50 mV (25 %)
- 17,1mV (22 %)
1,68 mV (32 %)
-23 22 mV
Potentiel zêta (mV)
Co
mp
tag
e
PAO1
-150 -125 -100 -75 -50 -25 0 25 50 750
50000
100000
150000- 18,8 mV (60 %)
- 52,4 mV (40 %)
- 32 19 mV
Potentiel zêta (mV)
Co
mp
tag
e
La distribution du potentiel zêta des 4 souches mucoïdes (figure 64) et des 4 souches non
mucoïdes (figure 65) de P. aeruginosa en suspension dans un tampon phosphate 10 mM (pH
7,0) est mesurée à l’aide du Zetasizer Malvern Nano ZS. La mesure du potentiel zêta est
réalisée 3 fois pour 2 concentrations de chaque suspension bactérienne et 3 lots différents de
chaque échantillon sont mesurés. Chaque tracé est représentatif de 18 tracés. L’analyse de la
courbe est représentée (moyenne ± SD du potentiel zêta de la population entière et
éventuellement des sous-populations significatives avec le pourcentage respectif de ces sous-
populations).
Etude du CSA-13
128
II.2.4 Etude du potentiel zêta
Le potentiel zêta des 8 souches de P. aeruginosa est étudié à l’aide d’un instrument
Malvern Nanosizer ZS (Malvern, Worcestershire, UK). La distribution du potentiel zêta est
différente au sein des 8 souches de P. aeruginosa (figures 64 et 65). Deux souches (ATCC
15442 et MC099-450467) présentent une distribution unimodale du potentiel zêta avec un pic
étroit reflétant une faible dispersion des résultats pour chaque mesure. La souche ATCC
15442 présente un potentiel zêta de -30,9 ± 0,7 mV (n = 6) et la souche MC099-450467 de -
53 ± 1 mV (n = 6). Cette divergence entre les deux souches est significative (P < 0,001).
Quatre autres souches (MC75-450457, MC093-450507, ATCC PAO1 et ATCC 9027) ont une
distribution plus étendue du potentiel avec l’apparition d’un deuxième pic. La souche ATCC
PAO1 présente clairement une distribution bimodale (-57 ± 1 mV ; 18 ± 3 % pour le premier
pic et -25,6 ± 0,9 mV ; 80 ± 3 % pour le deuxième pic). La moyenne du potentiel zêta pour
ces 4 souches varie de -49,7 ± 0,9 mV (n = 6) pour MC093-450507 à -30,8 ± 0,3 mV (n = 6)
pour ATCC PAO1. Enfin, les deux dernières souches, PYO1 et PYO2, ont un potentiel zêta
moyen aux alentours de -20 mV. Ces dernières souches présentent une large dispersion du
potentiel zêta allant de +15 à -65 mV.
Figure 66 : Potentiel zêta moyen des 8 souches de P. aeruginosa
ATC
C 1
5442
PYO1
PAO1
ATC
C 9
027
PYO2
MC75
MC09
3
MC09
90
10
20
30
40
50
60
Souches de référence
Souches cliniques
Souches
non mucoïdes
Souches
mucoïdesP
ote
nti
el zê
ta (
- m
V)
Le potentiel zêta moyen des 8 souches de P. aeruginosa en suspension dans un tampon
phosphate 10 mM (pH 7,0) est mesuré à l’aide du Zetasizer Malvern Nano ZS. Les résultats
sont la moyenne ± SEM des 6 essais réalisés en triplicat pour chaque souche (n = 6).
Etude du CSA-13
129
La moyenne du potentiel zêta des 4 souches mucoïdes est de -40 ± 7 mV et de -30 ± 3
mV pour les souches non mucoïdes. Cette différence entre les 2 potentiels est significative (P
= 0,0013). Il n’y a pas de différence significative (P = 0,2635) entre le potentiel zêta des 3
souches de référence (ATCC 15442, ATCC 9027 et ATCC PAO1 : -32,1 ± 0,5 mV) et celui
des 5 souches cliniques (PYO1, PYO2, MC75-450457, MC099-450467 et MC093-450507 : -
37 ± 8 mV).
Tableau 6 : Effet du CSA-13 et de la tobramycine sur un biofilm jeune
PYO1 PYO2 MC75-450457 ATCC 9027
Moy SD Moy SD Moy SD Moy SD
CSA 5 -0,1 0,3 0,1 0,1 -0,2 0,5 0,1 0,1
CSA 20 6,1* 0,1 1,2 0,1 -0,9 0,1 -0,7 0,1
CSA 50 6,1* 0,1 2,2 0,3 5,6* 0,1 -0,7 0,1
CSA 100 6,1* 0,1 6,3* 0,1 5,6* 0,1 2,9 0,1
CSA 200 6,1* 0,1 6,3* 0,1 5,6* 0,1 4,5* 0,1
TOB 4 6,1* 0,1 0,8 0,2 2,0 0,7 3,5 0,2
TOB 4 / CSA 5 6,1* 0,1 0,6 0,1 0,9 0,3 3,9 0,3
TOB 4 / CSA 20 6,1* 0,1 1,0 0,6 5,6* 0,1 3,5 0,2
TOB 4 / CSA 50 6,1* 0,1 6,3* 0,1 5,6* 0,1 3,3 0,1
TOB 4 / CSA 100 6,1* 0,1 6,3* 0,1 5,6* 0,1 3,8 0,1
TOB 4 / CSA 200 6,1* 0,1 6,3* 0,1 5,6* 0,1 4,5* 0,1
MC099-450467 MC093-450507 ATCC 15442 ATCC PAO1
Moy SD Moy SD Moy SD Moy SD
CSA 5 -0,4 0,1 0,6 0,0 -0,4 0,1 0,2 0,1
CSA 20 4,6 0,1 0,3 0,5 -0,6 0,3 1,1 0,7
CSA 50 6,3* 0,1 1,2 0,3 -0,4 0,1 1,8 0,2
CSA 100 6,3* 0,1 1,3 0,2 1,1 0,1 6,0* 0,1
CSA 200 6,3* 0,1 1,8 0,1 5,2* 0,1 6,0* 0,1
TOB 4 1,6 0,1 0,1 0,1 3,8 0,3 5,0 0,1
TOB 4 / CSA 5 2,8 0,1 -0,1 0,3 3,3 0,2 3,2 0,1
TOB 4 / CSA 20 6,3* 0,1 0,4 0,5 5,2* 0,1 2,0 0,1
TOB 4 / CSA 50 6,3* 0,1 1,4 0,1 5,2* 0,1 6,0* 0,1
TOB 4 / CSA 100 6,3* 0,1 2,8 0,1 5,2* 0,1 6,0* 0,1
TOB 4 / CSA 200 6,3* 0,1 6,1* 0,1 5,2* 0,1 6,0* 0,1
Les résultats sont présentés en diminution logarithmique du nombre d’ufc/mL. Ils sont la
moyenne de 2 expériences (n = 2). Nombres en gras = synergie entre la tobramycine et le
CSA-13 ; nombres en italique = inhibition entre la tobramycine et le CSA-13 ; * = limite de
détection atteinte.
Etude du CSA-13
130
II.3 EFFET DU CSA-13 SUR UN BIOFILM PREFORME
II.3.1 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé – étude par
dénombrement
II.3.1.1 Effet du CSA-13, seul ou en combinaison avec la tobramycine à 4 mg/L, sur
un biofilm jeune
L’activité du CSA-13 seul ou lors d’une co-administration avec la tobramycine est
étudiée sur des biofilms de 24 h par un dénombrement bactérien. Les résultats sont ajustés
avec l’équation d’une hyperbole à une composante (r2
= 0,986 pour le CSA-13 seul et r2
=
0,970 pour le CSA-13 en co-administration avec la tobramycine) (figure 67). Le CSA-13 à
des concentrations plus élevées que 5 mg/L diminue le nombre d’ufc/mL de manière dose-
dépendante. La concentration mi-maximale de CSA-13, réduisant de 50 % le nombre de
bactéries vivantes dans le biofilm, atteint en moyenne 88 mg/L pour les 8 souches. A une
concentration maximale (100 à 200 mg/L), le composé réduit le nombre d’ufc/mL de 5 log.
L’analyse des résultats obtenus pour chaque souche révèle que la différence de sensibilité au
CSA-13 entre les souches est plus importante au sein du biofilm qu’en culture planctonique.
Comme présenté dans le tableau 6, 50 mg/L de CSA-13 détruisent la totalité du biofilm jeune
formé par les souches PYO1, MC75-450457 et MC099-450467. Le CSA-13 à 100 mg/L
permet l’éradication de l’entièreté du biofilm formé par 5 souches (PYO1, PYO2, ATCC
PAO1, MC75-450457 et MC099-450467). Parmi ces 5 souches, PYO1 est la plus sensible. En
effet, à une faible concentration de 20 mg/L, le CSA-13 permet l’éradication complète du
biofilm PYO1. MC093-450507 est la souche la plus résistante : à 200 mg/L la diminution
logarithmique du nombre d’ufc/mL est inférieure à 2. A 200 mg/L, les 7 autres souches sont
très sensibles au CSA-13 et la limite de détection est atteinte pour ces 7 souches.
La tobramycine à 4 mg/L diminue le nombre d’ufc/mL de seulement 3 log (moyenne
pour les 8 souches). On observe une très grande hétérogénéité de la sensibilité des 8 souches à
la tobramycine : PYO1 est très sensible à l’aminoglycoside (diminution de plus de 6 log) alors
que les souches PYO2 et MC093-450507 ne répondent pas à l’antibiotique.
Figure 67 : Effet du CSA-13 et de la tobramycine sur un biofilm jeune
0 50 100 150 200
0
1
2
3
4
5
6
CSA-13
Tobramycine 4 mg/L + CSA-13
CSA-13 (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
Les biofilms sont formés sur les pointes d’un couvercle après exposition pendant 24 h à 8
souches de P. aeruginosa. Les biofilms sont ensuite mis en contact pendant 24 h avec
différentes concentrations en CSA-13 seul (triangles fermés) ou en association avec la
tobramycine à 4 mg/L (cercles ouverts). Les résultats sont exprimés en variations
logarithmiques du nombre d’ufc/mL mesuré avant et après exposition au traitement. Ce sont
les moyennes ± SEM des résultats obtenus avec les 8 souches (n = 8). Les résultats sont
ajustés avec l’équation d’une hyperbole à une composante.
Etude du CSA-13
131
L’addition de faibles concentrations en CSA-13 potentialise l’effet de la tobramycine.
Cet effet est démontré par la diminution importante de la concentration mi-maximale de
l’antibiotique stéroïde cationique (moins de 10 mg/L) (figure 67). Une synergie d’action entre
la tobramycine et le CSA-13 est observée pour 5 souches (PYO2, MC075-450457, MC099-
450467, MC093-450507 et ATCC 15442) : la diminution logarithmique observée avec une
co-administration est plus importante que l’addition des effets des composés utilisés
séparément (tableau 6). Seule la souche ATCC PAO1 montre une activité antagoniste entre la
tobramycine et le CSA-13. Des faibles concentrations en CSA-13 (5 et 20 mg/L) inhibent
l’effet bactéricide de l’aminoglycoside. Cependant, la co-administration de la tobramycine
avec des concentrations plus élevées en CSA-13 entraîne une diminution logarithmique de 6
et plus aucune bactérie viable n’est détectable.
Figure 68 : Effet du CSA-13 sur un biofilm mature
Effet du CSA-13 seul
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10CSA-13 5 mg/L
CSA-13 20 mg/L
CSA-13 100 mg/L
CSA-13 200 mg/L
CSA-13 50 mg/L
A
Temps (jours)
- L
og
(u
fc/m
L)
Interaction entre la tobramycine et le CSA-13
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10-1
0
1
2
3
4
5
6
7
8Tob 4 mg/L
Tob + CSA 5 mg/L
Tob + CSA 20 mg/L
Tob + CSA 50 mg/L
B
Temps (jours)
- L
og
(u
fc/m
L)
Les biofilms sont formés sur les pointes d’un couvercle après exposition pendant 12 jours à 6
souches de P. aeruginosa. Figure A : Les biofilms sont exposés pendant 1, 2 ou 9 jours à
différentes concentrations en CSA-13 seul. Figure B : Les biofilms sont exposés pendant 1, 2
ou 9 jours à différentes concentrations en CSA-13 en association avec la tobramycine à 4
mg/L. Les résultats sont exprimés en variations logarithmiques du nombre d’ufc/mL mesuré
avant et après exposition au traitement. Ce sont les moyennes ± SEM des résultats obtenus
avec les 6 souches (n = 6).
Etude du CSA-13
132
II.3.1.2 Effet du CSA-13, seul ou en combinaison avec la tobramycine à 4 mg/L, sur
un biofilm mature
L’expérience est répétée sur des biofilms de 12 jours qui sont beaucoup plus organisés
que les biofilms jeunes. Six souches sont testées dans ce modèle. Après 1 jour, le CSA-13 est
moins efficace dans les biofilms matures que dans les biofilms jeunes. En effet, la diminution
logarithmique du nombre d’ufc/mL à des concentrations élevées en CSA-13 (200 mg/L) est
en moyenne de 2,9 log dans les biofilms matures versus 5,2 log dans les biofilms jeunes. La
sensibilité au CSA-13 est très différente au sein des 6 souches (MC099-450467 > PYO1 >
MC093-450507 > PYO2 > ATCC PAO1 = MC75-450457). MC099-450467 est la seule
souche complètement éradiquée par le CSA-13 à une concentration de 100 mg/L (figure 69).
La réponse des différentes souches au CSA-13 est fortement améliorée après les 24 h
suivantes de traitement. Après 2 jours d’administration du CSA-13, 2 fois par jour, la réponse
maximale au composé (200 mg/L) atteint en moyenne une diminution logaritmique de 4,8.
Après 2 jours de traitement, seule la souche MC093-450507 ne répond pas au CSA-13 et le
biofilm formé par 4 souches est complètement éradiqué par l’administration du stéroïde à une
concentration de 50 (PYO1 et MC099-450467) à 100 mg/L (ATCC PAO1 et PYO2) (figure
70).
L’exposition du biofilm au CSA-13 pendant 9 jours améliore la réponse au composé
antimicrobien pour toutes les souches et la diminution logarithmique moyenne maximale
atteint 5,6 (à 200 mg/L de CSA-13). A cette concentration, l’entièreté du biofilm est détruite
pour toutes les souches, excepté la souche MC093-450507 (figure 71).
L’efficacité de la tobramycine est fortement diminuée dans les biofilms matures. En
effet, après 1 jour, l’administration de 4 mg/L diminue le nombre d’ufc/mL de seulement 1
log (figure 68 B). En réalité, la souche ATCC PAO1 est la seule souche avec une diminution
logarithmique significative du nombre d’ufc/mL (3,6 log). Cependant même cette souche
devient progressivement résistante à la tobramycine et après 9 jours, l’antibiotique n’a plus
d’effet significatif sur aucune des 6 souches testées.
Après 1 jour d’une co-administration de CSA-13 et de tobramycine, on observe un
déplacement vers la gauche de la courbe dose-réponse (données non montrées) ce qui corrèle
Figure 69 : Effet du CSA-13 sur un biofilm mature après 1 jour
PYO1
0 5 20 50 100 200
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
PYO2
0 5 20 50 100 200
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
MC75-450457
0 5 20 50 1000
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
MC099-450467
0 5 20 50 100 200
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
MC093-450507
0 5 20 50 100 200-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
5.5
6.5
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
PAO1
0 5 20 50 100 200
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
Les biofilms sont formés sur les pointes d’un couvercle après exposition pendant 12 jours à 6
souches de P. aeruginosa. Les biofilms sont ensuite exposés à différentes concentrations en
CSA-13 seul ou en association avec la tobramycine à 4 mg/L pendant 24 h (administration
unique). Les résultats sont exprimés en variations logarithmiques du nombre d’ufc/mL mesuré
avant et après exposition au traitement. Ce sont les moyennes ± SD de 2 expériences (n = 2).
Etude du CSA-13
133
avec une forte potentialisation d’activité entre les 2 composés sur 4 des 6 souches testées
(PYO1, MC099-450467, MC093-450507 et ATCC PAO1). L’efficacité de l’administration
d’une association des molécules diminue avec le temps aux concentrations en CSA-13 de 5 et
20 mg/L (figure 68 B). Cette diminution d’efficacité est en corrélation avec la résistance
observée par l’administration de la tobramycine seule. La réponse à une co-administration de
tobramycine et de CSA-13 à 50 mg/L n’a pas changé entre le 1er
jour et le 9ème
jour de
traitement (figure 68 B), suggérant qu’à ces concentrations le CSA-13 prévient la résistance à
la tobramycine. Après 9 jours, la souche MC093-450507 est la seule souche qui ne répond pas
à l’association CSA-13 et tobramycine (diminution d’ufc/mL < 1 log). En culture
planctonique, la souche MC093-450507 est la moins sensible à la tobramycine. Après 9 jours
de traitement, une activité synergique par utilisation d’une co-administration de CSA-
13/tobramycine se dégage pour 3 souches (ATCC PAO1, PYO2 et MC75-450457).
Figure 70 : Effet du CSA-13 sur un biofilm mature après 2 jours
PYO1
0 5 20 50 100 200
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
PYO2
0 5 20 50 100 200
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
MC75-450457
0 5 20 50 100 2000
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
MC099-450467
0 5 20 50 100 200
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
MC093-450507
0 5 20 50 100 200-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
5.5
6.5
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
PAO1
0 5 20 50 100 200
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
Les biofilms sont formés sur les pointes d’un couvercle après exposition pendant 12 jours à 6
souches de P. aeruginosa. Les biofilms sont ensuite exposés à différentes concentrations en
CSA-13 seul ou en association avec la tobramycine à 4 mg/L, 2 fois par jour pendant 2 jours.
Les résultats sont exprimés en variations logarithmiques du nombre d’ufc/mL mesuré avant et
après exposition au traitement. Ce sont les moyennes ± SD de 2 expériences (n = 2).
Etude du CSA-13
134
Figure 71 : Effet du CSA-13 sur un biofilm mature après 9 jours
PYO1
0 5 20 50 100 200
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
PYO2
0 5 20 50 100 200
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
MC75-450457
0 5 20 50 100 200
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
MC099-450467
0 5 20 50 100 200
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
MC093-450507
0 5 20 50 100 200
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
PAO1
0 5 20 50 100 200
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
+ TOBCSA-13
[CSA-13] (mg/L)
- L
og
(u
fc/m
L)
Les biofilms sont formés sur les pointes d’un couvercle après exposition pendant 12 jours à 6
souches de P. aeruginosa. Les biofilms sont ensuite exposés à différentes concentrations en
CSA-13 seul ou en association avec la tobramycine à 4 mg/L, 2 fois par jour pendant 9 jours.
Les résultats sont exprimés en variations logarithmiques du nombre d’ufc/mL mesuré avant et
après exposition au traitement. Ce sont les moyennes ± SD de 2 expériences (n = 2).
Figure 72 : Effet du CSA-13 sur un biofilm ATCC PAO1
Un biofilm de 24 h de la souche ATCC PAO1, développé dans les puits d’une microplaque à
base µclear, est exposé à des concentrations croissantes de CSA-13 (0, 20, 50 et 100 mg/L).
Après traitement, le biofilm est marqué par le kit de coloration BacLight™ Live/Dead®. Les
cellules vivantes apparaissent vertes et les cellules endommagées apparaissent rouges. Les
images représentent une section horizontale dans le plan xy et sont les plus représentatives de
2 expériences indépendantes. Les barres blanches indiquent une distance de 20 µm.
Figure 73 : Etude cinétique de l’effet du CSA-13 sur un biofilm
ATCC PAO1-GFP marqué par l’IP
Un biofilm de 24 h de la souche ATCC PAO1-GFP, développé dans les puits d’une
microplaque à base µclear est exposé à (A) 100 mg/L de CSA-13 et (B) 0 mg/L de CSA-13
(conditions contrôles) en présence de 60 µM d’IP. Des séries d’images sont scannées pendant
30 min à intervalle de 5 min par MCBL. Les cellules vivantes apparaissent vertes par
expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges par perméabilisation à
l’IP. Les images représentent une section horizontale dans le plan xy et sont les plus
représentatives de 2 expériences indépendantes. Les barres blanches représentent une distance
de 20 µm.
Etude du CSA-13
135
II.3.2 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé – étude par MCBL
II.3.2.1 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans une microplaque
Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans une microplaque
L’effet du CSA-13 sur un biofilm jeune de ATCC PAO1 est également observé par
MCBL après marquage des cellules par le kit de coloration BacLight™ Live/Dead®. Les
cellules bactériennes développent un biofilm uniforme et lisse dans les puits d’une
microplaque. Comme le montre la figure 72, l’ensemble des cellules du biofilm développé
dans des conditions contrôles (en absence du composé stéroïdien) apparaît vert par coloration
au Syto9 et confirme que les cellules au sein du biofilm contrôle sont imperméables à l’IP.
Lorsque le biofilm est exposé à des concentrations croissantes en CSA-13, les cellules
apparaissent rouges par perméabilisation à l’IP. L’effet du CSA-13 est dose-dépendant. A 20
mg/L, le composé provoque l’apparition de petites taches rouges dispersées de manière
homogène dans le biofilm. A 50 mg/L, une grande surface du biofilm apparaît rouge
soulignant qu’une vaste majorité des cellules sont devenues perméables à l’IP. Une
concentration plus importante (100 mg/L) perméabilise la totalité des cellules présentes dans
le biofilm et l’entièreté de la surface apparaît rouge. Ces résultats confirment l’efficacité du
CSA-13 sur les bactéries au sein du biofilm et sont concordants avec les expériences de
dénombrement bactérien réalisées sur des biofilms de la souche ATCC PAO1.
Etude cinétique de l’effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans une microplaque
L’activité du CSA-13 à 100 mg/L sur un biofilm préformé par la souche ATCC PAO1
exprimant la GFP est suivie au cours du temps (figure 73). Le biofilm de 24 h développé dans
des conditions contrôles (en absence du composé stéroïdien) apparaît vert par expression de la
GFP et confirme que les cellules au sein du biofilm contrôle sont imperméables à l’IP. L’effet
du CSA-13 apparaît très rapidement : après 10 min d’exposition au composé, une
augmentation significative de la captation de l’IP est observée. Après 20 min, une grande
majorité des cellules bactériennes est endommagée. Après 30 min, toutes les cellules sont
rouges confirmant la rapidité d’action du dérivé stéroïdien.
Figure 74 : Effet du CSA-13 sur un biofilm ATCC PAO1-GFP
Le CSA-13 à (A) 0, (B) 100 et (C) 200 mg/L est exposé pendant 25 min sur un biofilm
préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes apparaissent vertes
par expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges par
perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL représentent une section horizontale du biofilm
et deux sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La colonne de droite représente
une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. La barre d’échelle correspond à 30 µm. Les
images micrographiques sont les plus représentatives de 2 expériences.
Etude du CSA-13
136
II.3.2.2 Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé dans un réacteur CDC
Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé ATCC PAO1 dans un réacteur CDC
Le biofilm développé dans les puits d’une microplaque est plutôt plat et lisse et la
plupart des bactéries facilement accessibles au CSA-13. Afin de développer un biofilm plus
structuré et robuste, les expériences suivantes sont réalisées sur des biofilms formés sous un
flux constant de milieu et de forces de frottements. Les coupons du réacteur CDC sont
perfusés de manière continue pendant 24 h avant d’être exposés au CSA-13 dans des
conditions statiques et examinés par MCBL. L’architecture du biofilm développé dans ces
conditions est beaucoup plus complexe (figure 74). Les bactéries exprimant la GFP sont
observées non seulement à la surface du coupon mais également dans des extensions
verticales donnant une architecture tridimensionnelle au biofilm. En absence de traitement
(conditions contrôles), les cellules sont imperméables à l’IP et apparaissent vertes. Après une
courte exposition au CSA-13, le composé affecte la viabilité de l’ensemble des bactéries
indépendamment de leur localisation dans le biofilm. Les bactéries localisées à la surface du
biofilm et facilement accessibles au CSA-13 ainsi que les cellules cachées à la base de
l’extension verticale sont affectées de manière similaire au CSA-13. Dès lors, la matrice
extracellulaire du biofilm ne bloque pas la pénétration du CSA-13 dans les profondeurs du
biofilm. Lorsque le biofilm est exposé à 100 mg/L de CSA-13, sa structure n’est pas affectée
et les extensions ascendantes des colonies bactériennes peuvent encore être observées.
Augmenter la concentration à 200 mg/L n’a pas modifié les résultats. Le composé augmente
la perméabilité de la bactérie à l’IP sans modifier l’architecture tridimensionnelle du biofilm.
Ces résultats suggèrent que le CSA-13 est bactéricide envers les bactéries englobées dans le
biofilm complexe, mais après une courte exposition au CSA-13 dans des conditions statiques,
le composé ne peut éradiquer le biofilm.
Figure 75 : Effet du CSA-13 sur un biofilm ATCC 15442
Le CSA-13 à (A) 0, (B) 100 et (C) 200 mg/L est exposé pendant 25 min sur un biofilm
préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Après traitement, le biofilm est rincé et
marqué par le kit BacLight™ Live/Dead®. Les images de MCBL montrent une section
horizontale du biofilm et deux sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La
colonne de droite représente une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. Les barres
blanches indiquent une distance de 30 µm. Les images micrographiques sont les plus
représentatives de 2 expériences.
Figure 76 : Effet du CSA-13 marqué au Bodipy sur un biofilm ATCC PAO1-RFP
Le CSA-13 marqué au Bodipy à (A) 100 et (B) 200 mg/L est exposé pendant 25 min sur
biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes apparaissent
rouges, par expression de la RFP, et les cellules qui lient le CSA-13 fluorescent apparaissent
vertes. (I) Images représentant une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm reconstituées
à partir d’images prises dans le plan xy, xz et yz. (II) Déconvolution de l’image pour le
colorant vert (CSA-13 marqué au Bodipy). (III) Déconvolution de l’image pour le colorant
rouge (RFP). Les images micrographiques sont les plus représentatives de 2 expériences.
Etude du CSA-13
137
Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé ATCC 15442 dans un réacteur CDC
L’expérience est répétée sur un biofilm formé par la souche ATCC 15442. La bactérie
utilisée dans cet essai n’exprime pas de protéine fluorescente. Le kit de coloration BacLight™
Live/Dead® est utilisé pour marquer les cellules vivantes (Syto9) et les cellules mortes (IP). A
100 mg/L, le CSA-13 affecte l’intégrité de la majorité des cellules des micro-colonies
localisées à la surface du biofilm (figure 75). Certaines cellules localisées en profondeur dans
le biofilm restent vertes et ne sont pas affectées par 100 mg/L de CSA-13. Doubler la
concentration en CSA-13 affecte l’intégrité de l’entièreté du biofilm.
Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé ATCC PAO1 dans un réacteur CDC par
utilisation d’un analogue fluorescent du CSA-13
La formation du biofilm ATCC PAO1 exprimant la RFP est réalisée dans un réacteur
CDC et l’accessibilité à l’intérieur du biofilm d’un analogue fluorescent du CSA-13, le CSA-
13 marqué par 1 % de Bodipy, est étudiée. Comme le dérivé Bodipy et la GFP ont des
spectres de fluorescence comparables, ces expériences sont réalisées avec des bactéries
exprimant la RFP plutôt que la GFP. Le composé fluorescent (100 mg/L et 200 mg/L) colore
l’ensemble des cellules du biofilm, confirmant que la matrice extracellulaire ne limite pas
l’accès du CSA-13 aux parties internes du biofilm (figure 76). La séparation des images
(collection de la fluorescence verte (II) ou collection de la fluorescence rouge (III)) permet de
mettre en évidence que le CSA-13 recouvre pratiquement la totalité du biofilm et semble
atteindre toutes les cellules le composant.
Figure 77 : Effet du CSA-13 sur la perméabilité des membranes plasmiques des HUVEC
-0.264
0
20
40
60
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Captation du BrEt
Libération de la LDH
***
*
[CSA-13] (Log mg/L)
Ré
po
ns
e a
u C
SA
-13
(%
ma
xim
um
)
Les cellules HUVEC sont incubées à 37 °C en présence de différentes concentrations en
CSA-13 et l’insertion du bromure d’éthidium (carrés ouverts, trait pointillé) ou la libération
de la LDH (triangles fermés, trait plein) est estimée après 10 min. Les résultats sont exprimés
en pourcentage de l’insertion/la libération maximale et sont la moyenne ± SEM de 4
expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 4). * P < 0,05 ; *** P < 0,001.
Etude du CSA-13
138
II.4 TOXICITE DU CSA-13 SUR CELLULES EUCARYOTES
II.4.1 Evaluation de la libération de la LDH
Les cellules HUVEC sont incubées à 37 °C en présence de concentrations croissantes
en CSA-13 et la libération de la LDH est mesurée. L’exposition des cellules HUVEC au
CSA-13 à 50 et 100 mg/L pendant 10 min à 37 °C induit la libération de respectivement 25 ±
3 % et 52 ± 5 % (n = 4) de leur contenu en LDH (figure 77). La libération de la LDH à 100
mg/L est significativement plus élevée que celle du contrôle (P < 0,001 quand on compare à
l’incubation en absence de CSA-13). A des concentrations plus faibles, le CSA-13 n’a pas
d’effet significatif sur la libération de la LDH par les cellules.
II.4.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium
Les cellules HUVEC sont incubées à 37 °C en présence de concentrations croissantes
en CSA-13 et la captation de bromure d’éthidium est mesurée. La fluorescence du bromure
d’éthidium augmente de 5,7 ± 0,3 % en absence de CSA-13 à 31 ± 11 % en présence de 50
mg/L de CSA-13 et à 39 ± 8 % en présence de 100 mg/L de CSA-13 (n = 4 ; P < 0,05) (figure
77). Ces observations sont en accord avec les résultats obtenus après la mesure de la libération
de la LDH des HUVEC : à 100 mg/L, le CSA-13 perméabilise la membrane des cellules
eucaryotes HUVEC.
Figure 78 : Effet du CSA-13 sur la viabilité de P. aeruginosa
3 heures
0 20 40 60 80 100
10 3
10 4
10 5
10 6
10 7
10 8
10 9
CSA-13CSA-13 avec acide pluronique F-127
0
[CSA-13] (mg/L)
No
mb
re d
e b
ac
téri
es
(u
fc/m
L)
24 heures
0 20 40 60 80 100
102
103
104
105
106
107
108
109
101 0
CSA-13CSA-13 avec acide pluronique F-127
0
[CSA-13] (mg/L)
No
mb
re d
e b
ac
téri
es
(u
fc/m
L)
Une suspension bactérienne de ATCC PAO1 est incubée pendant 3 et 24 h avec des
concentrations croissantes en CSA-13 en absence (triangles fermés, trait plein) ou en présence
(cercles ouverts, trait pointillé) d’acide pluronique F-127 à 5 %. A la fin de l’incubation un
aliquot de bactéries est dilué et cultivé pendant 48 h sur des boîtes de gélose TSA. Les ufc
sont comptées. Après correction du facteur de dilution, le nombre d’ufc est indiqué en
fonction de la concentration en CSA-13. Les données sont présentées comme la moyenne ±
SD de 2 expériences indépendantes réalisées en duplicat (n = 2).
Figure 79 : Cinétiques de l’effet de l’acide pluronique sur la captation d’IP
par P. aeruginosa en réponse au CSA-13
Cinétiques sans acide pluronique F-127
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 20000
10000
20000
30000
40000Contrôle
CSA-13 50 mg/L
CSA-13 100 mg/L
CSA-13 10 mg/L
A
Temps (s)
Ca
pta
tio
n d
'IP
(u
.a.f
.)
Cinétiques avec acide pluronique F-127
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 20000
10000
20000
30000
40000
Contrôle
CSA-13 50 mg/L
CSA-13 10 mg/L
CSA-13 100 mg/L
B
Temps (s)
Cap
tati
on
d'IP
(u
.a.f
.)
Les bactéries sont incubées pendant 1 h en présence de 6 µM d’IP et de concentrations
croissantes en CSA-13, en absence (figure A) ou en présence (figure B) de 5 % d’acide
pluronique F-127. Pour la clarté des graphiques, un point sur six a été représenté. Les résultats
sont la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en duplicat (n = 3).
Etude du CSA-13
139
II.5 EFFET DE L’ASSOCIATION CSA-13 ET ACIDE PLURONIQUE F-127
II.5.1 Activité antibactérienne de l’association CSA-13 et acide
pluronique F-127
II.5.1.1 Essai de viabilité par dénombrement
Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée dans une
microplaque pendant 3 et 24 h. La viabilité des bactéries exposées au CSA-13, en présence ou
en absence d’acide pluronique à 5 %, est investiguée par réalisation d’un dénombrement
bactérien. L’activité du CSA-13 est dose-dépendante. Après 24 h d’incubation, l’effet du
CSA-13 sur les bactéries est plus important qu’après 3 h d’incubation (figure 78). En effet, la
limite de détection est atteinte à une concentration de 50 mg/L après 3 h d’incubation, cette
même efficacité étant observée après 24 h d’incubation à une concentration plus faible de 20
mg/L. Après 3 h d’incubation, le CSA-13 à 5 mg/L permet de diminuer de 1,9 log le nombre
de cellules vivantes. L’association du CSA-13 avec le dérivé pluronique diminue légèrement
l’activité antimicrobienne du CSA-13 mais à une concentration de 50 mg/L plus aucune
bactérie viable n’est détectée. Après 3 h de contact, la concentration de 20 mg/L de CSA-13
diminue le nombre d’ufc de 4,8 log en absence et 2,0 log en présence du dérivé pluronique.
Après 24 h d’incubation, cette même dose en CSA-13 diminue le nombre d’ufc de plus de 7
log en absence et de 3,5 log en présence du dérivé pluronique.
II.5.1.2 Essai de viabilité par perméabilisation à l’IP
L’effet antimicrobien de l’association du CSA-13 et de l’acide pluronique F-127 est
évalué par un essai de la perméabilité membranaire de ATCC PAO1 à l’IP. La fluorescence
des bactéries incubées à 37 °C en absence du stéroïde cationique n’a pas changé pendant la
durée de l’expérience (60 min) confirmant que l’IP n’est pas perméable aux cellules vivantes
(figure 79 A). Le CSA-13, à des concentrations comprises entre 0 et 10 mg/L, provoque une
augmentation importante de la captation de l’IP pendant les dix premières minutes
d’exposition (figure 79 A). Lors de l’exposition de la souche ATCC PAO1 à des
concentrations plus importantes, cette captation diminue légèrement. La présence de 5 %
Figure 80 : Effet de l’acide pluronique sur la captation d’IP
par P. aeruginosa en réponse au CSA-13 (après 1 h)
0 20 40 60 80 1000
10000
20000
30000
40000
CSA-13
CSA-13 avec acide pluronique F-127
[CSA-13] (mg/L)
Cap
tatio
n d
'IP (
u.a
.f.)
Les bactéries sont incubées pendant 60 min en présence de 6 µM d’IP et de concentrations
croissantes en CSA-13, en absence (triangles fermés, trait continu) ou en présence (cercles
ouverts, trait pointillé) de 5 % d’acide pluronique F-127. Les résultats sont la moyenne ±
SEM de 3 expériences indépendantes réalisées en duplicat (n = 3).
Figure 81 : Effet de l’acide pluronique sur la libération de la LDH
par les HUVEC en réponse au CSA-13
0 20 40 60 80 100
0
10
20
30
40
50
60
CSA-13
CSA-13 avec acide pluronique F-127
***
[CSA-13] (mg/L)
Lib
éra
tio
n d
e l
a L
DH
(%
du
to
tal)
Les cellules HUVEC sont incubées à 37 °C pendant 10 min avec des concentrations
croissantes en CSA-13 en absence (triangles fermés, trait plein) ou en présence (cercles
ouverts, trait pointillé) d’acide pluronique F-127 à 3 %. La LDH libérée dans le milieu à la fin
de l’incubation est dosée comme décrit dans Matériel et Méthodes. Les résultats sont
exprimés en pourcentage de l’activité maximale de la LDH dans les cellules. Les résultats
sont la moyenne ± SEM de 3 à 4 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3 à 4).
*** P < 0,001.
Etude du CSA-13
140
d’acide pluronique dans le milieu n’a pas d’effet significatif sur la fluorescence basale des
cellules (figure 79 B). Après 60 min d’exposition des bactéries au CSA-13, l’acide pluronique
F-127 n’affecte pas significativement la réponse au CSA-13 (figure 80). Dès lors, dans ces
conditions expérimentales, l’efficacité antibactérienne du CSA-13 est maintenue en présence
de 5 % d’acide pluronique F-127.
II.5.2 Toxicité de l’association CSA-13 et acide pluronique F-127 sur
cellules eucaryotes
II.5.2.1 Evaluation de la libération de la LDH
La libération de la LDH dans le milieu extracellulaire, reflétant une perméabilisation
membranaire des HUVEC, est mesurée en présence de concentrations croissantes en CSA-13.
La libération de l’enzyme augmente de manière dose-dépendante lors de l’exposition des
HUVEC à des concentrations en composé stéroïdien supérieures à 5 mg/L (figure 81). En
présence d’une dose de 100 mg/L, la moitié de la LDH cellulaire est libérée dans le milieu (52
± 5 %, n = 4) après 10 min d’incubation. L’association du CSA-13 à 3 % d’acide pluronique
permet une atténuation importante de l’effet sur la perméabilisation membranaire provoquée
par le composé. L’acide pluronique permet une diminution significative de la libération de la
LDH extracellulaire à 100 mg/L de CSA-13 de 52 ± 5 % (n = 4) en absence du dérivé à 22 ± 2
% (n = 3) en présence du dérivé pluronique (P < 0,001).
II.5.2.2 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium
Les HUVEC sont mises en présence de concentrations croissantes en CSA-13 pendant
50 min à 37 °C et la fluorescence est détectée. Les résultats sont la vitesse de captation du
bromure d’éthidium, calculée sur base de la pente de la courbe de régression, calculée elle-
même sur base des mesures prises pendant les premières minutes de l’essai. En condition
contrôle, la vitesse de captation du bromure d’éthidium est faible et est en moyenne de 0,07 ±
0,06 unités arbitraires de fluorescence (u.a.f.)/sec (n = 3) (figure 82 A). Le CSA-13 provoque
une augmentation de la vitesse de captation du bromure d’éthidium par les HUVEC. A 100
mg/L de CSA-13, la vitesse de captation du bromure d’éthidium atteint 2,8 ± 0,7 a.f.u/sec (n =
4) après 10 min (figure 83). L’addition de 3 % d’acide pluronique au milieu augmente la
Figure 82 : Cinétiques de l’effet de l’acide pluronique sur la captation de bromure
d’éthidium par les HUVEC en réponse au CSA-13
Cinétiques sans acide pluronique F-127
0 500 1000 1500 2000 2500 30002000
2500
3000
3500
4000
4500
5000Contrôle
CSA-13 50 mg/L
CSA-13 100 mg/L
CSA-13 20 mg/L
CSA-13 30 mg/L
CSA-13
A
Temps (s)
Cap
tatio
n d
u B
rEt
(u.a
.f.)
Cinétiques avec acide pluronique F-127
0 500 1000 1500 2000 2500 30002000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Contrôle
CSA-13 20 mg/L
CSA-13 50 mg/L
CSA-13 100 mg/L
CSA-13 30 mg/L
CSA-13
B
Temps (s)
Cap
tatio
n d
u B
rEt
(u.a
.f.)
Les cellules HUVEC sont incubées à 37 °C en présence de 10 mg/L de bromure d’éthidium
dans des conditions contrôles (figure A) ou en présence de 3 % d’acide pluronique F-127
(figure B). Cinq min après le début de l’essai, les cellules sont exposées à différentes
concentrations en CSA-13 et la fluorescence est mesurée pendant 50 min. Pour la clarté des
graphiques, un point sur 6 est représenté. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 à 4
expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3 à 4).
Figure 83 : Effet de l’acide pluronique sur la captation de bromure d’éthidium
par les HUVEC en réponse au CSA-13
0 20 40 60 80 100
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
CSA-13 avec acide pluronique F-127
CSA-13
*
**
[CSA-13] (mg/L)
Va
ria
tio
n d
e la
ca
pta
tio
n d
u B
rEt
(u.a
.f./s
ec
)
La vitesse de captation du bromure d’éthidium est mesurée entre 5 min (juste avant l’addition
du CSA-13) et 15 min (c.à.d. pendant 10 min après ajout de CSA-13). L’augmentation de la
vitesse de captation du bromure d’éthidium (u.a.f./sec) est représentée en fonction de la
concentration en CSA-13. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 à 4 expériences
indépendantes réalisées en triplicat (n = 3 à 4). * P < 0,05 ; ** P < 0,01.
Etude du CSA-13
141
captation basale du bromure d’éthidium (0,5 ± 0,8 (n = 3) u.a.f./sec) (figure 82 B). Comme le
montre la figure 83, l’ajout du dérivé pluronique à 3 % inhibe significativement la captation
du bromure d’éthidium en réponse à 50 et 100 mg/L de CSA-13 (de 2,8 ± 0,7 u.a.f./sec (n = 4)
pour 100 mg/L de CSA-13 seul à 0,5 ± 0,2 u.a.f./sec (n = 3) pour 100 mg/L de CSA-13 en
présence de 3 % d’acide pluronique F-127 ; P < 0,01).
Figure 84 : Effet de l’acide pluronique sur l’activité mitochondriale
des HUVEC en réponse au CSA-13
0 25 50 75 1000
25
50
75
100
125 CSA-13
CSA-13 avec pluronique F-127
[CSA-13] (mg/L)
Ab
so
rba
nc
e (
% d
u c
on
trô
le)
Les HUVEC sont incubées à 37 °C pendant 20 min avec des concentrations croissantes en
CSA-13 en absence (triangles fermés, trait plein) ou en présence (cercles ouverts, trait
pointillé) d’acide pluronique F-127 à 6 %. A la fin de l’incubation, le milieu est éliminé et une
solution de MTT est ajoutée à chaque puits. L’absorbance mesurée à 540 nm est utilisée pour
estimer la production de formazan durant la réaction. Les résultats sont exprimés en
pourcentage de l’absorbance mesurée dans les conditions contrôles et sont la moyenne ± SEM
de 3 à 4 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 3 à 4).
Figure 85 : Effet de l’acide pluronique sur la captation du TMRE
par les HUVEC en réponse au CSA-13
pH 6
0 20 40 60 80 1000
25
50
75
100 CSA-13
CSA-13 avec acide pluronique F-127
[CSA-13] (mg/L)
Flu
ore
scen
ce (
% d
u c
on
trô
le)
pH 8
0 20 40 60 80 1000
25
50
75
100CSA-13
CSA-13 avec acide pluronique F-127
[CSA-13] (mg/L)
Flu
ore
scen
ce (
% d
u c
on
trô
le)
pH 7
0 20 40 60 80 1000
25
50
75
100CSA-13
CSA-13 avec acide pluronique F-127
[CSA-13] (mg/L)
Flu
ore
scen
ce (
% d
u c
on
trô
le)
Les HUVEC sont incubées pendant 1 h à 37 °C dans un tampon phosphate à pH 6, 7 et 8. Les
cellules endothéliales sont exposées à différentes concentrations en CSA-13 en absence
(triangles fermés, trait plein) ou en présence (cercles ouverts, trait pointillé) d’acide
pluronique F-127 à 5 %. Après élimination du milieu, les cellules sont incubées pendant 1 h
en présence de TMRE. A la fin de cette seconde incubation la fluorescence des cellules est
estimée comme décrit dans Matériel et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage
de la fluorescence mesurée dans les cellules incubées pendant 1 h dans des conditions
contrôles avant exposition au TMRE. Les résultats sont la moyenne ± SEM de 3 expériences
indépendantes réalisées en duplicat (n = 3).
Etude du CSA-13
142
II.5.2.3 Evaluation de l’activité mitochondriale
L’activité mitochondriale des HUVEC après exposition au CSA-13, seul ou en
association avec l’acide pluronique F-127, est estimée par un test colorimétrique MTT. La
courbe de la figure 84 représente l’absorbance du formazan formé chez les cellules actives.
Des concentrations faibles en CSA-13 n’ont pas d’effet sur la capacité métabolique des
HUVEC. Une concentration de 50 mg/L en composé stéroïdien diminue significativement
l’absorbance jusqu’à 40 ± 12 % par rapport au contrôle (n = 3 ; P < 0,01). L’absorbance
diminue avec l’augmentation des concentrations en CSA-13 et à 100 mg/L l’absorbance
atteint 25 ± 5 % (n = 4 ; P < 0,001). L’addition de 6 % d’acide pluronique au milieu (sans
CSA-13) n’a pas d’effet sur l’absorbance du formazan réduit (de 0,33 ± 0,06 ; n = 4 en
absence à 0,321 ± 0,009 ; n = 4 en présence d’acide pluronique F-127). Un déplacement léger,
mais non significatif, de la courbe dose-réponse du CSA-13 est observé en présence du dérivé
pluronique vers des concentrations plus élevées sans affecter l’effet maximal du CSA-13. A
100 mg/L de CSA-13, l’ajout d’acide pluronique ne modifie pas la toxicité mitochondriale du
produit.
II.5.2.4 Evaluation du potentiel de membrane mitochondrial
De faibles concentrations en CSA-13 (à partir de 5 mg/L) provoquent une diminution
importante de la fluorescence associée aux cellules (figure 85). La présence du composé
stéroïdien à une concentration de 5 et 50 mg/L diminue la fluorescence de 60 et 85 %
respectivement (pH 7). Ces résultats suggèrent que le CSA-13 détériore les mitochondries des
HUVEC. L’addition de 5 % d’acide pluronique F-127 au milieu n’a pas d’influence
significative sur la fluorescence de base (de 47436 ± 6130 u.a.f. (n = 3) en absence à 47271 ±
8822 u.a.f. (n = 3) en présence d’acide pluronique F-127, P > 0,05) et n’a pas d’influence
significative sur l’effet néfaste du CSA-13 sur le potentiel mitochondrial (pH 7). L’étude de
l’effet du CSA-13 sur le potentiel mitochondrial des HUVEC est effectuée à 3 pH différents.
Les courbes de l’intensité de la fluorescence en fonction de la concentration en CSA-13 sont
semblables aux différents pH étudiés. La dissipation du potentiel de membrane mitochondrial
par le CSA-13 (seul ou en présence d’acide pluronique) n’est pas affectée par une incubation
des HUVEC à pH 6 et 8 plutôt que à pH 7.
Etude du CSA-13
143
III. DISCUSSION
Effet du CSA-13 sur des cultures planctoniques
Nous avons confirmé l’activité antibactérienne du CSA-13 sur des cultures
planctoniques de P. aeruginosa, y compris sur des souches cliniques isolées de patients
atteints de mucoviscidose. Des faibles concentrations de l’agent stéroïdien ont une importante
activité inhibitrice et bactéricide sur les souches. L’étude de l’interaction membranaire de P.
aeruginosa avec un agent fluorescent (NPN) souligne l’importance de l’interaction entre le
CSA-13 et la membrane bactérienne dans l’effet bactéricide du composé.
Effet du CSA-13 sur la formation d’un biofilm
L’éradication des infections liées à P. aeruginosa chez les patients atteints de
mucoviscidose implique des stratégies de traitement préventives. L’activité du CSA-13 sur la
formation du biofilm par 8 souches de P. aeruginosa a été évaluée par la méthode de
coloration au CV. Nous avons démontré dans cette étude qu’une très faible concentration en
CSA-13, 1 mg/L, inhibe la formation du biofilm par 3 des 8 souches étudiées (la souche non
mucoïde ATCC PAO1 et deux souches mucoïdes MC75-450457 et MC099-450467).
Potentiel zêta
Nous avons exploré quelques propriétés des 8 souches bactériennes afin de souligner
une éventuelle corrélation entre celles-ci et l’activité du CSA-13 sur la bactérie. L’activité
antibactérienne des céragenines est généralement expliquée par l’interaction de ces composés
avec les membranes bactériennes (Epand et al., 2010). Les LPS sont des composants de la
membrane des bactéries à Gram négatif spécialement ciblées par les céragenines (Ding et al.,
2004). Comme les LPS sont des contributeurs majeurs au potentiel de membrane des bactéries
à Gram négatif (Buchanan et al., 2009), nous avons estimé les charges sur la membrane de la
bactérie par mesure du potentiel zêta des 8 souches (Wilson et al., 2001).
La mesure de potentiel zêta est variable au sein des souches mais également au sein
d’une même souche, comme rapporté précédemment (Habash et al., 1997). Pour certaines
souches, la distribution du potentiel zêta est bimodale (van der Mei et Busscher, 2001). Une
large distribution du potentiel zêta peut être attribuée à la présence de petits agrégats de
bactéries dans la suspension (Klodzinska et al., 2010), le nombre de pics dans le profil du
potentiel zêta augmentant avec la formation d’agrégats de cellules bactériennes. D’autre part,
Etude du CSA-13
144
on observe des pics différents pour les cellules vivantes et mortes. Habash et ses collègues
mettent en évidence un changement du potentiel zêta en fonction de l’activité métabolique des
bactéries (Habash et al., 1997). Une population bactérienne métaboliquement plus active
contiendrait une plus grande proportion de bactéries chargées plus négativement qu’une
suspension de bactéries métaboliquement non actives. Ils décrivent également le potentiel zêta
comme étant fonction de la phase de croissance bactérienne. Herzberg et ses collaborateurs
constatent également l’influence des conditions de croissance des bactéries sur le potentiel
zêta des souches (Herzberg et al., 2009). Cependant, d’après Soni et al. (2008), les différents
niveaux de nutrition et l’état physiologique de la bactérie n’affectent pas le potentiel zêta pour
Pseudomonas sp. Flemming et ses collaborateurs observent que la longue chaîne B des
polysaccharides des LPS augmente le potentiel zêta en masquant la charge du core (Flemming
et al., 1998).
En comparant le potentiel d’une souche et de son variant mucoïde, Herzberg et al.
(2009) constatent un potentiel zêta plus négatif chez le variant mucoïde. Nos résultats
marquent également une différence significative du potentiel zêta entre les 4 souches
mucoïdes et les 4 souches non mucoïdes.
Trois souches sur les 8 souches étudiées sont sensibles à une administration préventive
de CSA-13 à 1 mg/L. Parmi ces 3 souches, les souches MC75-450457 et MC099-450467
présentent un potentiel zêta très négatif. La troisième souche qui est sensible au composé, la
souche ATCC PAO1, a un potentiel plus élevé suggérant qu’il n’y a pas de corrélation entre
les charges de la membrane et l’interaction avec le stéroïde cationique. Cependant, il existe
parfois une hétérogénéité dans la distribution du potentiel zêta, même au sein d’une unique
souche, et l’existence de sous-populations doit être prise en compte afin d’éviter des
conclusions hâtives (van der Mei et Busscher, 2001). La souche ATCC PAO1 est clairement
hétérogène avec une distribution bimodale du potentiel zêta. Une de ses 2 sous-populations a
un potentiel moyen de -56 mV, qui est l’un des potentiels les plus bas des 8 souches étudiées.
Nous pouvons donc conclure que la population entière ou une sous-population des 3 souches
sensibles au CSA-13 possède un potentiel zêta inférieur à -50 mV établissant une corrélation
entre la sensibilité au composé et les interactions électrostatiques entre la bactérie et le
composé. Ceci est en accord avec les résultats de Bruinsma et ses collègues qui décrivent que
la sensibilité de P. aeruginosa à une solution de protection de polyquaternium-1 pour lentilles
Etude du CSA-13
145
de contact est liée aux charges des bactéries : les bactéries chargées le plus négativement sont
les plus sensibles à la solution (Bruinsma et al., 2006).
Interaction avec le CSA-119
Dans une autre tentative pour corréler la sensibilité au CSA-13 aux propriétés des
membranes bactériennes, l’interaction des bactéries avec le CSA-119, un analogue fluorescent
du CSA-13, a été investiguée. La liaison de l’agent fluorescent aux souches bactériennes est
dose-dépendante et rapide pour les 8 souches. Parmi les 3 souches sensibles à une faible
concentration en CSA-13 avec la technique de coloration au CV, les souches ATCC PAO1 et
MC75-450457 sont celles présentant la plus grande affinité de liaison pour le CSA-119. Ce
sont également les souches ayant le potentiel zêta, pour la population entière ou pour une
sous-population, le plus négatif. Cependant, aucune corrélation ne peut être établie entre la
sensibilité de la souche MC099-450467 au CSA-13 et la liaison au CSA-119. En effet, cette
souche se trouve parmi les 3 souches sensibles à une faible concentration en CSA-13. Par
contre elle lie faiblement le CSA-119. L’explication peut se trouver au niveau des propriétés
du groupement dansyle ajouté au CSA-13 afin de le rendre fluorescent. Dans le CSA-119, le
groupement dansyle greffé au noyau stéroïde du CSA-13 est un groupement hydrophobe. Dès
lors, il est possible que de nouvelles interactions hydrophobes entre le CSA-119 et la
membrane bactérienne apparaissent rendant difficile toute comparaison avec l’interaction
qu’on observerait avec le CSA-13 seul.
Production des rhamnolipides
L’effet du CSA-13 à 1 mg/L sur l’inhibition de la formation d’un biofilm ne survient
qu’après une latence de plusieurs heures (24 ou 48 h) et pourrait dès lors être induit par une
modulation de l’expression de gènes impliqués dans la formation du biofilm. Overhage et ses
collègues soulignent une diminution de la régulation de composants clés des deux systèmes
majeurs de QS chez P. aeruginosa, les systèmes las et rhl, en présence de très faibles
concentrations en LL-37 (Overhage et al., 2008). Ainsi l’expression des gènes rhlB et rhlA
codant pour une rhamnosyltransférase impliquée dans la synthèse des rhamnolipides (Ochsner
et al., 1995) est diminuée en présence du PAM. Nous avons démontré précédemment que la
production de rhamnolipides par les 3 souches sensibles au CSA-13 était très différente : les
souches ATCC PAO1 et MC75-450457 produisent de grandes quantités de rhamnolipides. La
présence de rhamnolipides n’a pu être détectée dans le milieu de culture de la souche MC099-
450467 (voir chapitre « Caractérisation phénotypique des souches »). Dans ce travail nous
Etude du CSA-13
146
avons investigué l’effet d’une longue exposition à une faible concentration de CSA-13 sur la
synthèse de rhamnolipides. Cette étude n’a pas mis en évidence une différence de production
du surfactant. Le dérivé stéroïde cationique n’affecte donc pas la production de rhamnolipides
et l’opéron rhlAB régulant la synthèse des rhamnolipides (Lequette et Greenberg, 2005) n’est
pas une cible intracellulaire du CSA-13. Ainsi l’inhibition de la formation du biofilm par le
CSA-13 n’est pas médiée par une diminution de la production de rhamnolipides.
Effet du CSA-13 sur un biofilm préformé
Jusqu’à présent nous avons exploré les propriétés antimicrobiennes du CSA-13 et son
activité préventive sur la formation d’un biofilm. Dans la mesure où la prise en charge des
infections chroniques comme les infections pulmonaires à P. aeruginosa chez les patients
atteints de mucoviscidose nécessite parfois l’éradication d’un biofilm dans lequel se nichent
les bactéries, il est essentiel d’investiguer les effets du CSA-13 sur des biofilms préétablis,
jeunes et matures. Nous avons aussi étudié son activité en association avec la tobramycine, le
traitement de référence pour le traitement par aérosol des infections pulmonaires à P.
aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose.
Plusieurs facteurs peuvent expliquer la persistance des infections à P. aeruginosa
formant un biofilm. Premièrement, l’accès des antibiotiques vers le centre du biofilm peut être
limité. Deuxièmement, les antibiotiques peuvent être inactivés par des composants du biofilm.
Finalement, la croissance de la bactérie dans un biofilm favorise l’émergence de souches
résistantes après exposition des bactéries à des concentrations sub-inhibitrices de
l’antibiotique dans un biofilm (Nair et al., 2013). Nous avons illustré cet effet par la
tobramycine. Les 8 souches étudiées dans ce travail présentent une CMI comprise entre 1 et
10 mg/L. La sensibilité des souches à 4 mg/L de tobramycine est diminuée dans les biofilms
jeunes et est pratiquement absente dans les biofilms matures. La seule souche sensible à
l’aminoglycoside, la souche ATCC PAO1, développe une résistance avec le temps et après 9
jours plus aucune souche ne répond à l’antibiotique. Ces résultats confirment que la résistance
des bactéries à l’antibiotique n’est pas induite par l’aminoglycoside mais est une conséquence
de la formation d’un biofilm. Il faut souligner que la concentration en tobramycine utilisée
dans cette étude est proche de la CMI des différentes souches mais bien inférieure à la
concentration pouvant être atteinte dans les voies respiratoires des patients traités par aérosol
de tobramycine (Flume, 2008).
Etude du CSA-13
147
Etude par dénombrement sur un biofilm jeune
Le CSA-13 administré seul possède déjà une activité bactéricide importante sur les
biofilms jeunes sur 7 des 8 souches étudiées : il détruit l’entièreté du biofilm formé par ces 7
souches. Cette activité bactéricide est dose-dépendante et comprise entre 20 mg/L (pour la
souche PYO1) et 200 mg/L. Les concentrations actives sur un biofilm sont plus importantes
que celles actives sur les mêmes souches en culture planctonique. Ces observations sont
conformes avec la vision actuelle que la formation d’un biofilm augmente la résistance aux
agents antimicrobiens (Stewart et Costerton, 2001).
Un bénéfice évident à utiliser le CSA-13 en association avec la tobramycine sur
biofilm jeune s’est dégagé : des synergies d'action sont observées pour 5 souches. La souche
MC093-450507 est particulièrement intéressante ; elle est résistante à la fois à une
administration de la tobramycine seule ou du CSA-13 seul, même à une concentration de 200
mg/L. Mais à ces mêmes concentrations utilisées en association, une activité synergique se
dégage et aucune bactérie viable n'est détectée après 24 h. La souche ATCC PAO1 montre un
effet antagoniste de l'association lorsque le CSA-13 est utilisé à une concentration inférieure à
50 mg/L. Ces résultats sont concordants avec les résultats de Chin et al. (2008). Ces auteurs
ont testé l’interaction entre le CSA-13 et la tobramycine dans 4 souches de P. aeruginosa
multirésistantes. Après 24 h, ils n’ont pas observé d’interaction entre le CSA-13 et la
tobramycine chez 2 souches, une synergie chez une souche et un antagonisme pour la
dernière. De faibles concentrations en CSA-13 diminuaient l’efficacité de la tobramycine chez
ATCC PAO1. L’hypothèse suivante pourrait expliquer la sensibilité plus faible à la
tobramycine de la souche ATCC PAO1 exposée à de faibles concentrations en CSA-13. La
résistance de P. aeruginosa envers les peptides cationiques antimicrobiens implique
généralement l’addition de 4-aminoarabinose au lipide A des LPS. Cette différence
structurelle diminue les charges négatives de la membrane externe et entrave l’interaction
entre la membrane et les peptides cationiques. La modification dans la structure des LPS est
secondaire à l’activation de l’opéron arn BCADTEF qui est contrôlé par deux systèmes
senseurs agissant en cascade, les systèmes à deux composantes PhoP/Q et PmrA/B (Gunn,
2001). L’exposition de ATCC PAO1 à de faibles concentrations de polyamines active
l’opéron oprH-phoPQ qui provoque l’incorporation d’aminoarabinose aux LPS et explique
pourquoi les polyamines induisent une résistance aux agents antimicrobiens cationiques
(Kwon et Lu, 2006). Les polyamines augmentent également la résistance de la bactérie aux
aminoglycosides par un mécanisme qui reste non déterminé (Kwon et Lu, 2006). Le CSA-13
Etude du CSA-13
148
qui possède plusieurs groupements amines (Epand et al., 2008) pourrait se comporter comme
une polyamine. La diminution de la perméabilité de la membrane externe est généralement le
mécanisme de résistance le plus commun des aminoglycosides dans des souches cliniques de
patients atteints de mucoviscidose (MacLeod et al., 2000). Dela Vega et Delcour (1996) ont
démontré que les polyamines diminuent la perméabilité de la membrane bactérienne externe
et nous avons confirmé l’interaction du CSA-13 avec la membrane bactérienne. Il est donc
concevable que l’interaction initiale entre le CSA-13 et la membrane externe et
l’incorporation d’un aminoarabinose au lipide A qui s’ensuit induisent la résistance de la
bactérie à la tobramycine.
Etude par dénombrement sur un biofilm mature
L’importance d’étudier l’activité des agents antimicrobiens sur des modèles de
biofilms matures se rapprochant plus des conditions in vivo rencontrées chez les patients
atteints de mucoviscidose a été démontrée (Tré-Hardy et al., 2009). Les expériences sont donc
poursuivies sur des biofilms matures âgés de 12 jours, en référence au cycle de formation du
biofilm. L’activité du CSA-13 sur des biofilms matures est dose-dépendante. L’activité du
composé augmente également au cours du temps soulignant que les bactéries n’ont pas
développé de résistance au composé. Après 1 jour de traitement, le CSA-13 est moins efficace
dans les biofilms matures que dans les biofilms jeunes et la sensibilité au CSA-13 est très
différente au sein des 6 souches. Après 2 jours de traitement, seule la souche MC093-450507
ne répond pas au CSA-13 et après 9 jours de traitement, toutes les souches sont sensibles au
CSA-13.
Dans les biofilms matures, l’intérêt d’une co-administration est également avancé et
après 1 jour d’administration de la combinaison de la tobramycine avec le CSA-13, 4 sur 6
souches sont affectées par une synergie d’action. Cependant l’efficacité de l’administration de
l’association des molécules diminue avec le temps aux concentrations en CSA-13 de 5 et 20
mg/L, en corrélation avec la résistance observée par l’administration de la tobramycine seule.
La réponse à une co-administration de la tobramycine et du CSA-13 à 50 mg/L ne change pas
entre le 1er
jour et le 9ème
jour de traitement, suggérant qu’à ces concentrations le CSA-13
prévient la résistance à la tobramycine.
L’efficacité du CSA-13 sur l’inhibition de l’adhésion des bactéries, la première étape
de la formation d’un biofilm, a été rapportée précédemment (Isogai et al., 2009). L’efficacité
Etude du CSA-13
149
du CSA-13 sur P. aeruginosa, sur culture planctonique et sur biofilm jeune a également été
démontrée (Bucki et al., 2007b; Chin et al., 2008). Nos résultats non seulement confirment ces
observations mais aussi démontrent clairement l’efficacité du composé sur un biofilm mature.
Dans ce modèle, le CSA-13 prouve être un composé antibactérien très prometteur pour
l’éradication de certaines souches devenues résistantes à la tobramycine. Le composé est
même capable de prévenir la résistance à l’aminoglycoside.
Etude par MCBL
La MCBL est une technique non invasive permettant la visualisation directe et dans
l’espace de l’action d’un agent antimicrobien. La MCBL permet d'analyser un échantillon
d'épaisseur biologique, par exemple un biofilm microbien, par traitement des images, couche
par couche, dans les directions x, y et z. A l’aide de la microscopie confocale et de 2
méthodes différentes de développement d’un biofilm (microplaque et réacteur CDC), nous
avons clairement confirmé que le CSA-13 est actif envers les bactéries au sein d’un biofilm.
Lors d’un court temps d’exposition au CSA-13, les bactéries englobées dans le biofilm formé
à la surface d’une microplaque sont perméables à l’IP et apparaissent rouges. Les images
microscopiques montrent également que les biofilms développés à la surface des puits, sans
apport constant de milieu, sont pourvus d’une architecture plate et ne reproduisent pas la
géométrie des biofilms complexes rencontrés in vivo. Les biofilms formés sous un stress de
frottement constant (perfusion du milieu de culture et mélange par agitation magnétique) sont
plus robustes et se développent non seulement à la surface du support mais aussi via des
extensions verticales. Les biofilms croissant dans ces conditions, à l’aide d’un réacteur CDC,
sont très différents des biofilms formés à la surface des puits et présentent une architecture
beaucoup plus complexe et robuste. Les biofilms formés dans les réacteurs CDC ont été
extensivement étudiés et validés comme de bon modèles pour les biofilms in vivo (Hadi et al.,
2010 ; ASTM, 2012). Nous avons démontré que le CSA-13 est aussi efficace sur ces biofilms
que sur les biofilms plats développés en microplaques. Ce résultat suggère que la matrice
extracellulaire complexe n’interfère pas avec l’activité antimicrobienne du composé qui a un
accès total à l’ensemble des bactéries du biofilm. Ces observations sont en accord avec
d’autres mesures d’une pénétration adéquate des antibiotiques dans le biofilm (Davison et al.,
2010 ; Stewart et al., 2009). Cette conclusion est confortée par l’analogue fluorescent du
CSA-13 qui interagit avec les bactéries au travers du biofilm. Des concentrations plus
importantes en CSA-13 sont nécessaires pour observer le même effet sur le biofilm entier
formé par la souche ATCC 15442. Cette observation s’accorde avec les résultats précédents
Etude du CSA-13
150
soulignant que cette souche est moins sensible au CSA-13 que la souche ATCC PAO1. Nos
résultats sont en accord avec ceux de Pollard et al. (2009). Par dénombrement bactérien, ces
auteurs ont étudié l’effet du CSA-13 sur des biofilms préétablis formés par P. aeruginosa
dans un réacteur CDC. Après une exposition à long terme (72 h), le composé a démontré son
activité bactéricide.
Les expérimentations basées sur l’étude du biofilm par MCBL démontrent que le CSA-13 est
antimicrobien sur les cellules piégées dans le biofilm mais que, après un court temps
d’exposition et dans des conditions statiques, le composé ne modifie pas la structure du
biofilm. Ceci rappelle les résultats de Hadi et ses collaborateurs ayant rapporté que le biofilm
formé dans un réacteur CDC était affecté différemment par l’hydroxyde de sodium, qui tue les
bactéries et détruit le biofilm, et par le Tween20, qui tue les bactéries sans affecter le biofilm
(Hadi et al., 2010). Il est cependant légitime de penser que les cellules endommagées dans le
biofilm contribuent à la déstabilisation de la structure globale du biofilm et que les conditions
rencontrées in vivo (par exemple, la clairance mucocilliaire) peuvent mener à une destruction
complète du biofilm déjà affaibli. La destruction du biofilm par un composé comme la N-
acétylcystéine (Zhao et Liu, 2010) ou la DNAse (Fuxman et al., 2010) est secondaire à l’effet
sur la matrice, et non sur la bactérie. Considérant que l’élimination du biofilm et la mort des
bactéries sont des processus distincts, une co-administration pourrait être nécessaire pour
démanteler intégralement l’architecture du biofilm. Les enzymes antibiofilms, comme
l’alginate lyase, constituent également une nouvelle stratégie émergente de lutte contre le
biofilm microbien (Ranall et al., 2012 ; Thallinger et al., 2013 ) et pourraient renforcer l’effet
du CSA-13 sur l’éradication entière du biofilm. Malgré tout, nos résultats démontrent que
l’accès du CSA-13 à l’intérieur du biofilm de P. aeruginosa n’est pas entravé et que le CSA-
13 tue efficacement les cellules bien installées dans les biofilms établis.
Etude de la toxicité du CSA-13 sur cellules eucaryotes
Nous avons confirmé le potentiel du CSA-13 dans l’éradication des biofilms de P.
aeruginosa. La toxicité du stéroïde vis-à-vis de cellules eucaryotes semble primordiale à
investiguer.
Il apparaît que les concentrations de CSA-13 actives sur les bactéries du biofilm (10-
100 mg/L) sont dans la même gamme des concentrations perméabilisant la membrane des
HUVEC (100 mg/L lorsqu’on considère la libération de la LDH et la perméabilité au bromure
d’éthidium). La toxicité des composés antimicrobiens cationiques en général, et du CSA-13
Etude du CSA-13
151
en particulier, a toujours été une préoccupation et un frein à l’usage clinique de ces composés.
Leszcynska et ses collègues rapportent qu’à 100 mg/L, le CSA-13 provoque la libération de
50 % de l’hémoglobine de globules rouges humains et la libération de 20 % du contenu en
LDH de cellules humaines d’adénocarcinome gastrique (Leszcynska et al., 2009). Ding et ses
collaborateurs démontrent que la sélectivité cellulaire des dérivés de l’acide cholique est liée à
la longueur de la chaîne du groupement cationique attaché en C24 (Ding et al., 2002). Ces
résultats ouvrent de nouvelles voies dans la conception de dérivés avec une activité
bactéricide importante et avec une toxicité réduite sur cellules eucaryotes (Savage et al.,
2002).
Effet de l’association du CSA-13 avec l’acide pluronique F-127
Les céragenines non seulement interagissent avec la membrane bactérienne, mais nous
avons démontré qu’à des concentrations élevées le CSA-13 perméabilise également la
membrane plasmique des cellules eucaryotes. Leszczynska et ses collègues rapportent une
augmentation de la libération de l’hémoglobine des globules rouges en présence de fortes
concentrations en CSA-13, mais l’association du stéroïde avec le pluronique F-127 inhibe
significativement l’activité hémolytique du CSA-13 (Leszczynska et al., 2011). Ces auteurs
suggèrent qu’une application combinée de CSA-13 et d’acide pluronique peut avoir un effet
bénéfique sur la toxicité du composé stéroïde sans pour autant modifier l’effet antimicrobien
du CSA-13. Le protocole suivi par l’équipe de Leszczynska se limite à l’étude de l’activité
perméabilisante du CSA-13 au niveau de la membrane plasmique de globules rouges. Les
céragenines, qui perturbent l’intégrité des membranes bactériennes, peuvent avoir des effets
délétères sur les mitochondries (Voronina et al., 2004). L’acide pluronique F-127 à lui seul
peut également affecter le métabolisme cellulaire au niveau mitochondrial (Alakhova et al.,
2010). Il semble donc essentiel de reconsidérer les effets d’une combinaison de l’acide
pluronique F-127 avec le CSA-13 sur des cellules pourvues d’un noyau et avec un
métabolisme aussi bien aérobie qu’anaérobie. Dans cette étude nous avons donc examiné
l’interaction de l’acide pluronique F-127 avec le CSA-13 sur P. aeruginosa et sur cellules
eucaryotes (HUVEC).
L’acide pluronique F-127 est un surfactant non-ionique composé de copolymères de
polyoxyethylène-polyoxypropylène à une concentration de 20 à 30 %. Ils forment des
agrégats multimoléculaires résultant en un corps hydrophobe central avec des chaînes
hydrophiles de polyoxyethylène dirigées vers le milieu externe, lorsque la concentration
Etude du CSA-13
152
micellaire critique est atteinte. C’est un hydrogel thermoreversible, qui est plus soluble à
faible température et qui forme un gel à température corporelle. Le pluronique F-127 est
utilisé comme véhicule dans différentes préparations pharmaceutiques (administration orale,
topique, oculaire,…) pour ses bonnes capacités de solubilisation et sa faible toxicité (Escobar-
Chavez et al., 2006). Les concentrations en acide pluronique F-127 utilisées dans ce travail
sont de ~5 %. L’analyse de la toxicité du composé, réalisée par Khattak et ses collègues, n’a
démontré aucune diminution de la viabilité cellulaire pour des concentrations en acide
pluronique égales à 5 % (Khattak et al., 2005). Des concentrations plus importantes, à partir
de 10 % de pluronique F-127, diminuent la viabilité et la prolifération cellulaire.
Activité antibactérienne
Dans un premier temps, nous avons investigué l’activité antibactérienne du CSA-13 en
présence d’acide pluronique F-127. Les propriétés antimicrobiennes du CSA-13, évaluées par
dénombrement bactérien, sont (faiblement) diminuées en présence de 5 % du dérivé
pluronique. Cette diminution de l’activité antibactérienne du CSA-13 combiné à 5 % d’acide
pluronique n’a pas été retrouvée par Leszczynska et al. (2011). Le temps court d’incubation (1
h) étudié par ces auteurs pourrait expliquer cette différence. Le choix du temps d’incubation
étudié dépend en général de la durée pendant laquelle le composé est présent et disponible
dans un organisme vivant. A l’heure actuelle, aucune donnée sur la demi-vie in vivo du CSA-
13 n’est rapportée dans la littérature, mais nous pouvons raisonnablement penser qu’elle est
probablement comprise entre 1 h (temps d’incubation étudié par Leszczynska et ses
collaborateurs) et 24 h (temps d’incubation nécessaire pour observer l’effet inhibiteur du
dérivé pluronique sur l’activité du CSA-13). Dès lors, les données observées après 3 h
d’incubation apparaissent plus pertinentes et, à ce temps, l’inhibition observée par 5 %
d’acide pluronique était plutôt marginale. En accord avec ces observations, la comparaison de
l’efficacité du CSA-13 sur P. aeruginosa, seul ou en présence d’acide pluronique, par mesure
de la captation d’IP, n’a pas montré de différence significative après 1 h d’incubation.
Toxicité sur cellules eucaryotes
Nous avons ensuite évalué l’effet de l’association sur la toxicité des cellules
endothéliales. En associant le CSA-13 à l’acide pluronique F-127, on observe une réduction
significative de la libération de la LDH ainsi que de la captation du bromure d’éthidium par
les HUVEC aux concentrations en CSA-13 toxiques (100 mg/L). Cette association semble
donc protéger les cellules de la toxicité membranaire du CSA-13. Cependant, le dérivé
Etude du CSA-13
153
stéroïdien affecte également l’intégrité des mitochondries des HUVEC. Le CSA-13 inhibe la
réduction du tétrazole par les HUVEC (test MTT), suggérant que les mitochondries ont perdu
leur capacité à transférer des électrons. Ces résultats sont confirmés par des mesures de la
captation du TMRE, un dérivé fluorescent s’accumulant dans la mitochondrie selon le
potentiel électrique de la membrane mitochondriale interne (Scaduto et Grotyohann, 1999).
L’exposition des cellules eucaryotes au CSA-13 provoque une diminution de la fluorescence
corrélée à une diminution de la captation mitochondriale du TMRE. L’ajout d’acide
pluronique ne modifie pas l’effet observé sur la mitochondrie en présence de fortes
concentrations en stéroïde. Nos résultats suggèrent donc que le CSA-13 a accès au
compartiment intracellulaire. Nous avons émis l’hypothèse que la forme non-ionique du CSA-
13 diffuserait de manière passive à travers la membrane plasmique selon son gradient de
concentration. Une fois le cytoplasme atteint, le CSA-13 se protonerait, ce qui maintiendrait
un gradient de la forme non ionique. Les pKas des divers groupements amines de la molécule
sont inconnus mais les amines secondaires se dissocient généralement à un pH autour de 10.
D’après l’équation de Henderson-Hasselbach, une augmentation du pH de 6 à 8 devrait
augmenter 100 fois la concentration de la forme neutre du composé (Hallifax et Houston,
2006). Cependant nos résultats montrent que, malgré une augmentation de la forme non
ionique du CSA-13, l’effet du composé sur la mitochondrie n’a pas changé. Ces résultats ne
sont donc pas en accord avec le modèle de diffusion de la forme neutre du CSA-13 et
suggèrent une accumulation du composé dans le cytosol par un mécanisme de transport. La
structure du CSA-13 dérive des acides choliques. Les sels biliaires, dérivés de l’acide
cholique, traversent les membranes plasmiques par diffusion (transport passif) mais également
par transport actif (Dawson et al., 2009). La synthèse de médicaments combinant l’acide
cholique et une molécule active a été proposée afin de faciliter la captation cellulaire de ces
pro-drogues par les nombreux transporteurs des sels biliaires (Sievänen, 2007). Il est donc
concevable que des types similaires de transporteurs puissent également transporter le CSA-
13 à travers la membrane plasmique. Une fois entré dans le compartiment intracellulaire, le
composé peut facilement interagir avec les membranes mitochondriales. Ce modèle s’accorde
avec les résultats de Trainor et al. (2011) qui ont montré que la résistance de H. pylori au
CSA-13 implique HefC, une pompe à efflux capable de transporter les sels biliaires et les
céragenines.
En conclusion, ainsi que le montre le dosage de la captation de bromure d’éthidium et
de la libération de la LDH, une concentration faible (3 %) en dérivé pluronique permet une
Etude du CSA-13
154
inhibition de la perméabilisation de la membrane plasmique des cellules eucaryotes par le
CSA-13. Cependant l’acide pluronique F-127, même à une concentration de 6 %, n’inhibe pas
l’effet délétère du CSA-13 sur la fonction mitochondriale. Braff et ses collaborateurs ont
également mis en évidence une différence dans les résultats mesurant la perméabilité
membranaire et ceux évaluant la fonction mitochondriale des kératinocytes. Ainsi le LL-37 à
la concentration de 10 µM n’affecte pas la perméabilité membranaire des kératinocytes
(LDH) mais diminue la réduction du tetrazolium (test MTT) (Braff et al., 2005). Dès lors,
l’étude de la toxicité in vitro de dérivés synthétiques à hautes concentrations ne devrait pas se
focaliser uniquement sur l’intégrité de la membrane plasmique des cellules eucaryotes mais
également sur la fonction mitochondriale. Nous pouvons ainsi conclure que le CSA-13 affecte
non seulement l’intégrité des membranes plasmiques de cellules eucaryotes mais exerce
également des effets délétères sur leurs mitochondries. L’ajout de l’acide pluronique F-127 ne
peut que soulager une partie de ces effets toxiques et ne peut donc être proposé comme agent
dispersant neutralisant la toxicité du stéroïde cationique.
Ces résultats sont basés sur des expériences réalisées in vitro et il n’est pas clairement
établi comment l’interaction du CSA-13 avec les mitochondries va avoir un impact sur la
toxicité des cellules eucaryotes in vivo. De futures expérimentations in vivo sont nécessaires
pour déterminer si les effets potentiels adverses du CSA-13 sur les mitochondries diminuent
la fenêtre thérapeutique dans laquelle le composé antimicrobien peut être utilisé.
Conclusion et perspectives
Dans cette partie de notre travail, nous avons confirmé le potentiel bactéricide du
CSA-13 sur des cultures planctoniques de 8 souches de P. aeruginosa, comprenant des
souches de référence et des souches cliniques isolées de patients atteints de mucoviscidose.
Nous avons démontré qu’une concentration très faible et non cytotoxique de CSA-13 (10 fois
inférieure à la CMI), inhibe la formation d’un biofilm, de 3 sur les 8 souches testées, via des
interactions électrostatiques. Une concentration plus importante, de 20 à 200 mg/L, de CSA-
13 éradique l’entièreté du biofilm âgé de 24 h pour 7 des 8 souches étudiées. Six souches ont
été évaluées dans un biofilm mature et toutes ont répondu au composé avec des
concentrations croissantes ou un temps d’exposition du composé au biofilm plus important.
Aucune résistance au CSA-13 n’est apparue durant le traitement. L’usage de la MCBL a
confirmé la rapidité et l’efficacité d’action du composé stéroïdien sur un biofilm robuste et
complexe de P. aeruginosa par visualisation dans le temps et dans l’espace de l’effet du CSA-
Etude du CSA-13
155
13 sur le biofilm. Ces résultats soulignent la sensibilité au CSA-13 de 7 sur les 8 souches, soit
à un stade initial de la formation du biofilm, soit après maturation du biofilm. Ces résultats
corroborent le potentiel important comme agents thérapeutiques, envers tous les stades de
formation et de développement du biofilm, de composés à structure amphiphile comme le
CSA-13, avec une face cationique favorisant les interactions avec les membranes bactériennes
chargées négativement et leur face hydrophobe qui contribue à la perturbation de ces
membranes.
Un bénéfice évident à administrer une combinaison de CSA-13 et de tobramycine s’est
dégagé dans cette étude aussi bien sur un biofilm jeune que mature. Dans certaines conditions,
le CSA-13 semble même prévenir la résistance à la tobramycine.
La conception d’expériences in vivo sera cependant indispensable pour confirmer
l’intérêt du CSA-13 ou d’une co-administration de CSA-13 et de la tobramycine dans le
traitement des infections à P. aeruginosa chez des patients atteints de mucoviscidose.
Nos études in vitro sur cellules eucaryotes ont mis en évidence une toxicité
membranaire provoquée par le CSA-13 lors de l’administration de concentrations
importantes. L’association du CSA-13 avec l’acide pluronique F-127 a permis de
significativement réduire la toxicité du composé sur les membranes. Cependant, l’association
n’a pas soulagé les effets délétères exercés par le CSA-13 sur l’activité mitochondriale. Les
études devront donc se poursuivre afin d’affiner notre compréhension du mécanisme d’action
des céragenines et de décéler des dérivés moins toxiques. L’évaluation de l’activité in vivo du
composé devrait nous éclairer quant à la fenêtre thérapeutique utilisable en clinique.
En conclusion, les stéroïdes cationiques antimicrobiens dérivés de l’acide cholique
offrent de nouvelles perspectives pour le traitement de souches résistantes de P. aeruginosa se
développant dans un biofilm. Une faible concentration non cytotoxique de CSA-13 peut être
bénéfique pour la prévention de la formation d’un biofilm. L’activité antibactérienne de ces
composés n’est pas affectée par l’ADN et l’actine-F qui sont présents en concentrations
importantes ou par la composition ionique des fluides respiratoires dans la mucoviscidose. Ils
sont donc un modèle de composés prometteurs pour le traitement d’infections chroniques
provoquées par ce pathogène et qui sont si fréquentes et délétères pour les patients atteints de
mucoviscidose.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
156
CHAPITRE III
ETUDE DU PEPTIDE LL-37 ET DE
SES DERIVES
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
157
I. INTRODUCTION
La hausse fulgurante de la résistance bactérienne et le faible développement de
nouveaux antibiotiques sont une réelle menace pour la santé publique (Kuehn, 2011). La
recherche de nouvelles molécules antibactériennes est donc devenue une priorité. Les PAM
sont un attrait majeur dans la recherche de nouvelles stratégies anti-infectieuses. Par leur
mécanisme d’action non spécifique, ils contournent la résistance bactérienne. De plus, les
PAM possèdent une activité antimicrobienne très large. De nombreuses approches sont
envisagées et explorées afin d’optimaliser le potentiel thérapeutique des PAM pour le
traitement des infections liées à des souches multirésistantes.
Les cathélicidines sont un groupe de PAM retrouvés chez différentes espèces
mammifères. Chez l’homme, une seule cathélicidine, la protéine hCAP18/LL-37 a été
identifiée. Nous voulons explorer son potentiel thérapeutique dans les infections pulmonaires
persistantes chez les patients atteints de mucoviscidose colonisés de manière prédominante
par P. aeruginosa. Les infections à P. aeruginosa présentent en effet un problème majeur car
cette bactérie développe rapidement une résistance à l’antibiothérapie. Dans ce travail, nous
exploitons l’activité anti-Pseudomonas de fragments dérivés de la cathélicidine humaine LL-
37 par utilisation d’une librairie de 13 peptides aux propriétés physico-chimiques distinctes.
Ces fragments possèdent en effet de légères différences d’hydrophobicité, d’amphipaticité, de
charge ou de degré d’hélice-α susceptibles de modifier considérablement l’activité
antimicrobienne des peptides et leur toxicité (Friedrich et al., 1999). Un screening de l’effet
antibactérien et antibiofilm des peptides dérivés du LL-37 a été réalisé sur la souche la plus
documentée dans la littérature sur la mucoviscidose, la souche ATCC PAO1. Nous avons
également exploré quelques propriétés des peptides comme leur capacité à former une hélice-
α ou leur liaison aux LPS.
Tableau 7 : Séquences et caractéristiques du LL-37 et de ses fragments dérivés
Séquences des acides aminés PMa
Index de
Boman HRMb H Moy
c Charge
Hyd
Moyd Hydro
e Agadir
1 7 13 19 25 31 37
LL-37 LL-37
LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES 4494 2,99 0,59 3,74 6 -1,84 35 % 5,10
LL-31 LL-31 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNL 3824 2,81 0,70 4,43 6 -1,47 38 % 3,72
LL-25 LL-25 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIK 3065 2,79 0,62 3,91 6 -1,99 36 % 1,19
LL-19 LL-19 LLGDFFRKSKEKIGKEFKR 2327 3,03 0,60 3,77 4 -2,38 31 % 0,92
LL-13 LL-13 LLGDFFRKSKEKI 1581 2,21 0,62 3,90 2 -1,14 38 % 0,84
LL7-31 RK-25 RKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNL 3131 3,81 0,75 4,72 7 -2,98 32 % 4,06
LL13-31 IG-19 IGKEFKRIVQRIKDFLRNL 2374 2,82 0,88 5,54 4 -1,16 42 % 4,33
LL7-25 RK-19 RKSKEKIGKEFKRIVQRIK 2372 4,09 0,65 4,08 7 -4,13 26 % 0,73
LL13-25 IG-13 IGKEFKRIVQRIK 1615 2,77 0,79 4,97 4 -2,01 38 % 0,71
LL7-37 RK-31 RKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES 3801 3,83 0,62 3,90 7 -3,12 29 % 5,68
LL13-37 IG-25 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES 3044 3,08 0,69 4,33 4 -1,78 36 % 5,87
LL19-37 RI-19 RIVQRIKDFLRNLVPRTES 2341 3,58 0,65 4,11 3 -1,73 36 % 2,08
LL25-37 KD-13 KDFLRNLVPRTES 1575 3,59 0,55 3,50 1 -2,18 30 % 0,09
aPM = poids moléculaire
bHRM = moment hydrophobe relatif moyen
cH moyen = moment hydrophobe moyen
dHydrophobicité moyenne
eHydro = acides aminés hydrophobes
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
158
II. RESULTATS
II.1 SEQUENCES ET CARACTERISTIQUES DES PEPTIDES
Les peptides étudiés dans ce travail et présentés dans le tableau 7 comprennent environ
70 % d’acides aminés hydrophiles avec une proportion importante de résidus basiques. Ils
sont cationiques. A pH neutre, la charge positive est de +1 à +7 en fonction des peptides. Le
moment hydrophobe moyen, le moment hydrophobe relatif moyen et l’hydrophobicité
moyenne sont calculés avec le programme HydroMCalc de Tossi et ses collaborateurs en
utilisant l’échelle d’hydrophobicité de Eisenberg (Tossi et al., 2002). L’hydrophobicité
moyenne correspond à l’hydrophobicité totale (somme des indices d’hydrophobicité de tous
les résidus) divisée par le nombre de résidus. Le moment hydrophobe est une mesure de
l’amphipaticité de l’hélice. Il est la somme vectorielle de tous les indices d’hydrophobicité
divisée par le nombre de résidus. Le moment hydrophobe relatif moyen d’un peptide est son
moment hydrophobe relatif à celui d’un peptide parfaitement amphipatique. Une valeur de 0,5
indique que le peptide présente environ 50 % de l’amphipaticité maximale possible (Tossi et
al., 2002). Le moment hydrophobe relatif moyen est très similaire parmi les peptides (de 0,5 à
0,9) indiquant qu’ils ont une amphipaticité très importante. Les peptides ont également un
potentiel de liaison aux protéines comparable avec un index de Boman variant entre 2 et 4
(Boman, 2003). L’index Agadir est une mesure de la tendance des peptides à former une
hélice-α (Lacroix et al., 1998). Cet index varie fortement au sein des différents fragments (de
moins de 1 à plus de 5 pour les peptides LL-37, LL7-37 et LL13-37). La suppression de 6 à
12 acides aminés du domaine C-terminal (LL-25) mais non du domaine N-terminal (LL13-37)
diminue fortement la tendance des peptides à former une hélice-α. En accord avec ces
résultats, le fragment intermédiaire LL13-31 a un score Agadir compatible avec la formation
d’une hélice-α.
A partir de ce tableau nous pouvons conclure que la plupart des fragments possèdent
les propriétés cationiques et amphiphiles du peptide initial LL-37 et que le plus petit peptide
formant une hélice-α s’étend du résidu 13 au résidu 31.
Tableau 8 : Détermination de la CMI et de la CMB des peptides
La détermination de la CMI est réalisée par la technique de microdilution de 2 en 2
conformément au protocole du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2003).
Après 24 h d’incubation à 35 °C, les résultats sont lus par observation de l’absence de
turbidité. Les puits clairs de cette même microplaque sont repiqués et après 24 h d’incubation
à 35 °C la CMB est déterminée. Les résultats sont exprimés en µM.
Figure 86 : Cinétique de l’effet du LL-37 sur la perméabilité à l’IP
0 10 20 30 40 50 600
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000 0 µM
1 µM
5 µM
10 µM
2,5 µM
Temps (min)
Ca
pta
tio
n d
'IP
(u
.a.f
.)
Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée en présence de différentes
concentrations de LL-37 et en présence d’IP pendant 1 h. La fluorescence est lue toutes les
min. Les résultats sont exprimés en u.a.f. et sont la moyenne ± SEM de 3 essais indépendants
réalisés en duplicat (n = 3). Pour la clarté du graphique, un point sur trois est représenté.
CMI
(µM)
CMB
(µM)
LL-37 25 >100
LL-31 50 >100
LL-25 >100 >100
LL-19 >100 >100
LL-13 >100 >100
LL7-31 100 >100
LL13-31 100 >100
LL7-25 >100 >100
LL13-25 >100 >100
LL7-37 50 >100
LL13-37 >100 >100
LL 19-37 >100 >100
LL 25-37 >100 >100
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
159
II.2 EFFET DES PEPTIDES SUR DES CULTURES PLANCTONIQUES
II.2.1 Determination de la CMI et de la CMB
Le peptide LL-37 est le plus actif (CMI : 25 µM). ATCC PAO1 est sensible de manière
égale aux fragments LL-31 et LL7-37 (CMI : 50 µM). La souche est légèrement moins
sensible au LL7-31 et LL13-31 (CMI : 100 µM). Les autres fragments peptidiques présentent
une CMI > 100 µM. Ces résultats suggèrent la contribution de la partie centrale du peptide
(LL13-31) à l’activité inhibitrice des peptides sur la croissance bactérienne. L’activité
bactéricide requiert des concentrations > 100 µM pour tous les peptides étudiés.
II.2.2 Effet des peptides sur la perméabilité à l’IP
La fluorescence de l’IP est stable durant l’incubation des bactéries en absence de
peptides (0 µM) (figure 86). Ce résultat confirme l’intégrité des membranes bactériennes
incubées en conditions contrôles. Lorsque les bactéries sont exposées à 10 µM de LL-37,
celles-ci deviennent perméables à l’ion et la fluorescence augmente durant les 40 premières
min.
L’effet des peptides dérivés du LL-37 sur l’entrée d’IP dans la bactérie est étudié à
différentes concentrations (0 à 10 µM). Comme le montre la figure 87, le peptide LL-37
présente l’activité antimicrobienne la plus importante et induit la perméabilisation de la
membrane à une faible concentration de 2,5 µM (n = 3 ; P < 0,001). A 5 µM, les fragments
LL-31 et LL7-37 perméabilisent également de manière significative la membrane (n = 3 ; P <
0,001). L’activité de la cathélicidine LL-37 augmente fortement à 10 µM. A cette même
concentration, la suppression de 6 acides aminés au niveau de l’extrémité N-terminale (LL7-
37) provoque une diminution de l’activité de ~50 % par rapport au peptide initial (figure 87
C). La suppression des 6 acides aminés suivants (LL13-37) abolit l’activité antimicrobienne.
Après suppression de 6 acides aminés au niveau de l’extrémité C-terminale (LL-31), le
peptide conserve une activité significative de perméabilisation (figure 87 A). De plus petits
fragments (LL-25, LL-19, LL-13, LL13-37, LL19-37 et LL25-37) n’ont pas d’effet
significatif sur la variation de la fluorescence. Lorsque la délétion de résidus est réalisée de
Figure 87 : Effet des peptides sur la perméabilité à l’IP
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000LL-37
LL-31
LL-25
LL-19
LL-13
A
-1 0 1
***
***
***
***
***
Concentration en peptide (Log µM)
Cap
tatio
n d
'IP (
u.a
.f.)
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
B
-1 0 1
LL-31
LL7-31
LL-25
LL13-31
LL7-25
LL13-25
***
***
Concentration en peptide (Log µM)
Cap
tatio
n d
'IP (
u.a
.f.)
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
C
-1 0 1
LL-37
LL7-37
LL13-37
LL19-37
LL25-37
***
***
***
***
***
Concentration en peptide (Log µM)
Cap
tatio
n d
'IP (
u.a
.f.)
Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée à 37 °C pendant 1 h en
présence de 10 µM d’IP et en absence (conditions contrôles) ou en présence de différentes
concentrations des fragments N-terminaux (figure A), des fragments intermédiaires (figure B)
ou des fragments C-terminaux (figure C). Pour comparaison, les fragments LL-31 et LL-25
sont représentés dans la figure B. Les résultats sont la variation de fluorescence provoquée par
les peptides après 1 h et sont exprimés en u.a.f. Ils sont la moyenne ± SEM de 2 à 4 essais
indépendants réalisés en duplicat (n = 2 à 4). *** P < 0,001.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
160
part et d’autre du peptide, la fluorescence diminue de ~40 à 50 % pour les peptides LL7-31 et
LL13-31 mais l’effet des fragments est toujours significatif. En conclusion, 5 peptides (LL-
37, LL-31, LL7-37, LL7-31 et LL13-31) ont une activité antibactérienne significative sur
ATCC PAO1 à la concentration de 10 µM (n = 3 ; P < 0,001). Ces résultats confirment aussi
que la partie centrale du peptide (LL13-31) est la partie dont l’activité antimicrobienne est la
plus importante.
Figure 88 : Relation semi-logarithmique
entre la perméabilité à l’IP et la mort bactérienne
0 0,1 0,5 1 2,5 5 100
10000
20000
30000
40000
50000
60000
0
2
4
6
8
Dénombrement
Captation d'IP
LL-37 (µM)
Ca
pta
tio
n d
'IP
(u
.a.f
.)- L
og
(ufc
/mL
)
Une suspension bactérienne de la souche ATCC PAO1 est incubée à 37 °C pendant 1 h en
présence de différentes concentrations (0 à 10 µM) de la cathélicidine LL-37. L’effet du
peptide sur la membrane bactérienne est évalué par un essai de perméabilité à l’IP (colonnes
avec damier) et par réalisation en parallèle d’un dénombrement bactérien des cellules vivantes
(colonnes hachurées). Les résultats sont exprimés en u.a.f. (n = 3) et en variation
logarithmique du nombre d’ufc/mL (n = 2).
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
161
II.2.3 Relation entre perméabilité membranaire et mort cellulaire
La perméabilité membranaire peut être un phénomène transitoire, les dommages
membranaires pouvant être réparés (Davey et Hexley, 2011). Dès lors l’utilisation des termes
« IP-positif » et « mort cellulaire » de manière synonyme peut être erronée. Afin de confirmer
la mort cellulaire, un dénombrement bactérien est réalisé en parallèle à l’essai de
perméabilisation à l’IP. Des concentrations inférieures à 2,5 µM de la cathélicidine LL-37
n’ont pas significativement augmenté la perméabilité à l’IP. A 2,5 ; 5 et 10 µM, le peptide
augmente significativement la captation d’IP. En présence de 2,5 µM de LL-37, le nombre de
bactéries vivantes, exprimé en log ufc/mL, diminue de 7,9 à 5,4 et diminue jusqu’à 3,6 en
présence de 5 µM de LL-37. La limite de détection est atteinte à 10 µM de LL-37. Ces
résultats confirment la toxicité du LL-37 sur les bactéries.
Figure 89 : Effet des peptides à 10 µM sur la formation d’un biofilm
LL-37LL-31
LL-25LL-19
LL-130
20
40
60
80
100
120 Fragments N-terminauxA
**
***
*****
Fo
rmatio
n d
u b
iofilm
(%
)
LL7-31
LL13-31
LL7-25
LL13-250
20
40
60
80
100
120 Fragments intermédiairesB
***
Fo
rmatio
n d
u b
iofilm
(%
)
LL-37
LL7-37
LL13-37
LL19-370
20
40
60
80
100
120 Fragments C-terminauxC
*****
**
Fo
rmatio
n d
u b
iofilm
(%
)
L’effet des fragments N-terminaux (figure A), des fragments intermédiaires (figure B) et des
fragments C-terminaux (figure C) à la concentration de 10 µM sur la prévention de la
formation d’un biofilm de 18 h est évalué par la technique de coloration au CV. La masse de
biofilm résiduel est estimée par mesure de la DO 590 nm. Les résultats sont exprimés en
pourcentage de formation du biofilm avec un pourcentage maximal correspondant aux puits
contrôles (pas de peptide ajouté aux bactéries, trait pointillé). Les résultats sont la moyenne ±
SEM de 9 valeurs obtenues dans 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 9). * P
< 0,05 ; ** P < 0,01 ; *** P < 0,001.
Figure 90 : Effet de 6 peptides à différentes concentrations sur la formation d’un biofilm
0 2 4 6 8 100
20
40
60
80
100
120LL-37LL7-37 Contrôle
LL13-37
Concentration en peptide (µM)
Fo
rmatio
n d
u b
iofilm
(%
)
0 2 4 6 8 100
20
40
60
80
100
120LL-31LL7-31
LL-19Contrôle
Concentration en peptide (µM)
Fo
rmatio
n d
u b
iofilm
(%
)
ns******
*******
***
*******
Plusieurs dilutions des peptides LL-37, LL7-31, LL7-37 et LL13-37 (concentrations finales
1 ; 2,5 ; 5 et 10 µM) sont incubées pendant 18 h dans les puits d’une microplaque contenant
une suspension bactérienne de P. aeruginosa ATCC PAO1. La masse de biofilm résiduel est
évaluée par la technique de coloration au CV. Les résultats sont exprimés en pourcentage de
formation de biofilm avec un pourcentage maximal correspondant aux puits contrôles (pas de
peptide ajouté aux bactéries, trait pointillé). Les résultats sont la moyenne ± SEM de 9 valeurs
obtenues dans 3 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n = 9).
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
162
II.3 EFFET DES PEPTIDES SUR LA FORMATION D’UN BIOFILM
La capacité des peptides à inhiber la formation d’un biofilm de 18 h est évaluée par la
technique de coloration au CV. Un contrôle est effectué par incubation du peptide LL-37
(concentration finale 10 µM) pendant une nuit dans les puits d’une microplaque en
polystyrène. Le lendemain, les puits sont rincés et le développement du biofilm est comparé
avec les puits contrôles (pas de pré-incubation avec le peptide). Il n’y a pas de différence
significative dans la formation du biofilm confirmant que le peptide ne se lie pas à la surface
du puits.
Huit parmi les 13 peptides (les peptides LL-37, LL-31, LL-25, LL-19, LL7-31, LL7-
25, LL7-37 et LL13-37) inhibent de manière significative la formation d’un biofilm ATCC
PAO1 (figure 89). Le peptide initial LL-37 provoque une inhibition de ~60 % de la formation
du biofilm (n = 9 ; P < 0,01). Les peptides LL-31 et LL7-37 sont les plus efficaces et
induisent une réduction de ~70 % de la biomasse (n = 9 ; P < 0,001).
L’activité de 6 peptides (LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31 et LL-19) est
ensuite investiguée par mesure du pourcentage de biofilm résiduel après incubation avec
différentes concentrations des fragments (figure 90). Les peptides LL-37, LL7-37 et LL-31
inhibent significativement le pourcentage de formation de biomasse à une faible concentration
de 5 µM (n = 9 ; P < 0,001). A cette concentration, les autres peptides n’ont pas d’effet
significatif sur l’inhibition de la formation du biofilm. L’administration préventive de plus
faibles concentrations (< 5 µM) n’a pas d’activité significative sur la formation du biofilm.
Un dénombrement des cellules vivantes après 18 h d’incubation de P. aeruginosa
ATCC PAO1 avec 4 peptides (10 µM) est réalisé. Il n’y a pas de différence significative dans
le nombre de bactéries viables parmi les bactéries incubées dans les conditions contrôles et
celles exposées aux fragments (contrôle: 10,1 log ufc/mL ; LL-37: 9,8 log ufc/mL ; LL7-37:
10,1 log ufc/mL ; LL13-37: 9,7 log ufc/mL ; LL-31: 9,9 log ufc/mL). A partir de ces résultats,
on peut conclure que la capacité des peptides à diminuer la biomasse n’est pas liée à la mort
cellulaire et à une diminution de leur nombre, mais probablement à une diminution de la
matrice organique.
Figure 91 : Effet de 6 peptides sur un biofilm ATCC PAO1-GFP
Un biofilm de 24 h de la souche PAO1-GFP, développé dans les puits d’une microplaque à
base µclear, est exposé à des concentrations croissantes de peptide en présence de 10 µM d’IP
pendant 25 min. Après traitement, le biofilm est rincé et observé par MCBL. Les cellules
vivantes apparaissent vertes par expression de la GFP et les cellules endommagées
apparaissent rouges par perméabilisation à l’IP. Les images représentent une section
horizontale dans les plans xy et sont les plus représentatives de 2 expériences indépendantes.
Les barres blanches représentent une distance de 20 µm.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
163
II.4 EFFET DES PEPTIDES SUR UN BIOFILM PREFORME – ETUDE PAR
MCBL
II.4.1 Effet des peptides sur un biofilm préformé dans une microplaque
Dans un premier temps, l’effet de 6 peptides à différentes concentrations est étudié sur
un biofilm préformé dans une microplaque par la souche ATCC PAO1 exprimant la GFP
(pMF230) (figure 91). Les bactéries incubées dans des conditions contrôles sont vertes avec
très peu de petits spots rouges. Ces résultats confirment que les bactéries incubées en
conditions contrôles sont imperméables à l’IP. La plupart des bactéries exposées à 100 µM de
LL-37 virent au rouge. L’effet du LL-37 est dose-dépendant dans la gamme de concentrations
de 20 à 100 µM. Un plus petit peptide, le fragment LL7-37 est très efficace et même plus
efficace que le peptide initial LL-37. A 20 µM, il provoque l’augmentation de la captation
d’IP par une fraction considérable de la surface du biofilm. Les deux fragments LL-31 et
LL7-31 ont une activité similaire au LL7-37. Ces trois fragments sont les plus efficaces dans
la perméabilisation de la membrane bactérienne au sein du biofilm. Le fragment LL13-37 est
moins actif que le peptide initial LL-37 (LL7-37 = LL-31 = LL7-31 > LL-37 > LL13-37)
mais à la concentration de 100 µM il induit la perméabilisation de la totalité du biofilm au
fond du puits. Par contre, le fragment LL-19 se distingue des 5 autres peptides étudiés : il n’a
qu’un effet marginal et provoque une très faible augmentation de la captation d’IP à 100 µM.
En conclusion, ces résultats établissent que le peptide LL-37 et certains de ses
fragments ont une activité bactéricide même au sein d’un biofilm ATCC PAO1 mais à des
concentrations plus élevées que celles actives sur culture planctonique (test de
perméabilisation à l’IP).
Tableau 9 : Effet de 6 peptides sur les biofilms préformés de 5 souches cliniques
MC099-450467 PYO2
0 µM 20 µM 50 µM 100 µM 0 µM 20 µM 50 µM 100 µM
LL-37 - + + ++ LL-37 - - + ++
LL7-37 - - + ++ LL7-37 - - + ++
LL13-37 - - - + LL13-37 - - - -
LL-31 - + + ++ LL-31 - - - ++
LL7-31 - + + ++ LL7-31 - - + ++
LL-19 - - - - LL-19 - - - ++
MC093-450507 MC75-450457
0 µM 20 µM 50 µM 100 µM 0 µM 20 µM 50 µM 100 µM
LL-37 - + + ++ LL-37 - - - ++
LL7-37 - + + ++ LL7-37 - - + ++
LL13-37 - - - - LL13-37 - - - ++
LL-31 - + + + LL-31 - - - ++
LL7-31 - - - + LL7-31 - + + ++
LL-19 - - - - LL-19 - - - -
PYO1
0 µM 20 µM 50 µM 100 µM
LL-37 - - + ++
LL7-37 - + + ++
LL13-37 - - - ++
LL-31 - + + ++
LL7-31 - + + ++
LL-19 - - - -
Des biofilms de 24 h de 5 souches cliniques exprimant la GFP (les souches PYO1, PYO2,
MC75-450457, MC099-450467 et MC093-450507) développés dans les puits d’une
microplaque à base µclear sont exposés à des concentrations croissantes de peptide en
présence de 10 µM d’IP pendant 25 min. Après traitement, les biofilms sont rincés et observés
par MCBL. Les cellules vivantes apparaissent vertes par expression de la GFP et sont
représentées par un signe (-). Les cellules endommagées apparaissent rouges par
perméabilisation à l’IP : lorsqu’une partie du biofilm est endommagée on note un signe (+) ;
lorsque l’entièreté du biofilm est endommagée on note un signe (++).
- Aucune perméabilisation à l'IP
+ Perméabilisation à l'IP d'une
partie du biofilm
++ Perméabilisation à l'IP de
l'entièreté du biofilm
- Aucune perméabilisation à
l'IP
+ Perméabilisation à l'IP d'une
partie du biofilm
++ Perméabilisation à l'IP de
l'entièreté du biofilm
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
164
L’expérience est répétée sur 5 souches cliniques de P. aeruginosa exprimant la
GFP (pMF230) : les souches PYO1, PYO2, MC75-450457, MC099-450467 et MC093-
450507 (tableau 9).
Le peptide LL-37 affecte les bactéries du biofilm MC099-450467 et MC093-450507
à une faible concentration de 20 µM. A 50 µM, il provoque l’augmentation de la captation de
l’agent fluorescent également pour les souches PYO1 et PYO2 et à 100 µM le biofilm des 5
souches cliniques de P. aeruginosa est totalement affecté par le peptide.
De manière générale, le peptide LL7-37 possède une activité similaire au peptide
initial LL-37. Il endommage les bactéries du biofilm MC093-450507 et PYO1 à une faible
concentration de 20 µM. Toutes les souches sont sensibles à 50 µM de LL7-37 et une
proportion importante de la surface du biofilm est atteinte. Une concentration plus importante
de 100 µM perméabilise l’ensemble des cellules du biofilm formé par les 5 souches.
Le fragment LL13-37 est efficace sur 3 des 5 souches cliniques (MC099-450467,
PYO1 et MC75-450457) à une concentration importante de 100 µM.
Une faible concentration du peptide LL-31 (20 µM) endommage le biofilm formé par
3 des 5 souches cliniques (PYO1, MC099-450467 et MC093-450507). A 100 µM, le fragment
perméabilise la totalité du biofilm formé par les 5 souches.
Une faible concentration du peptide LL7-31 (20 µM) endommage le biofilm formé
par 3 des 5 souches cliniques (MC099-450467, PYO1 et MC75-450457). Le peptide est très
actif et à 100 µM toutes les souches sont sensibles au fragment et la captation d’IP augmente
fortement.
Aucune activité n’est observée avec le peptide LL-19, excepté sur la souche PYO2 à
une concentration importante de 100 µM.
Figure 92 : Effet des peptides LL-37 et LL7-37 sur un biofilm ATCC PAO1-GFP
Les peptides LL-37 et LL7-37 (concentration finale 50 μM) sont déposés pendant 25 min sur
un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes
apparaissent vertes par expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges
par perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL montrent une section horizontale du biofilm
et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La colonne de droite représente une
vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. Les images micrographiques sont les plus
représentatives de 2 expériences. La barre d’échelle représente 30 µm.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
165
En conclusion, l’étude de l’effet des peptides à l’aide de la MCBL sur des biofilms
formés dans les puits d’une microplaque a permis de réaliser un screening de l’effet de
différentes concentrations sur différentes souches. Une distinction dans l’importance de l’effet
entre les 6 peptides peut être établie. Le peptide original LL-37 et les dérivés LL7-37, LL7-31
et LL-31 ont une activité comparable. A une concentration de 20 µM, ces peptides
endommagent la membrane bactérienne et l’entrée d’IP au sein de la cellule est observée.
Cependant l’ensemble des bactéries du biofilm n’est pas perméable à l’IP. La proportion du
biofilm sensible aux peptides est nettement plus importante à une concentration en peptide de
50 µM, et, à 100 µM, la totalité du tapis cellulaire du puits est endommagée. Le fragment
LL13-37 est nettement moins actif que le peptide initial. La partie N-terminale du peptide, le
fragment LL-19, n’a aucune activité sur le biofilm formé par les 5 souches et ce même aux
concentrations élevées.
II.4.2 Effet des peptides sur un biofilm préformé dans un réacteur CDC
Effet des peptides sur un biofilm ATCC PAO1 préformé dans un réacteur CDC
L’effet des 6 peptides à 50 µM est évalué sur un biofilm préformé par la souche ATCC
PAO1 (figures 92, 93 et 94). Les biofilms sont développés sur les coupons de verre d’un
réacteur CDC avec des bactéries exprimant la GFP. Les bactéries incubées dans des
conditions contrôles apparaissent vertes confirmant que les bactéries incubées en conditions
contrôles sont imperméables à l’IP. Quatre peptides (LL-37, LL7-37, LL-31 et LL7-31) ont
une activité comparable sur la perméabilisation des bactéries au sein d’un biofilm dont la
structure est robuste et complexe (figures 92 et 93). Les peptides endommagent fortement la
surface du biofilm sans atteindre la base de la structure. Ces résultats soulignent que des
fragments dérivés du peptide initial ont une activité antibactérienne sur les cellules sessiles
d’un biofilm épais avec une structure tridimensionnelle complexe. Le fragment LL13-37
présente une activité plus faible sur la dégradation du biofilm (figure 94). L’effet du LL-19 est
pratiquement inexistant (figure 94). Ces résultats sont comparables avec ceux observés sur les
biofilms formés en microplaque.
Figure 93 : Effet des peptides LL-31 et LL7-31 sur un biofilm ATCC PAO1-GFP
Les peptides LL-31 et LL7-31 (concentration finale 50 μM) sont déposés pendant 25 min sur
un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes
apparaissent vertes par expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges
par perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL montrent une section horizontale du biofilm
et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La colonne de droite représente une
vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. Les images micrographiques sont les plus
représentatives de 2 expériences. La barre d’échelle correspond à 30 µm.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
166
Figure 94 : Effet des peptides LL13-37 et LL-19 sur un biofilm ATCC PAO1-GFP
Les peptides LL13-37 et LL-19 (concentration finale 50 μM) sont exposés pendant 25 min sur
un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes
apparaissent vertes par expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges
par perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL montrent une section horizontale du biofilm
et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La colonne de droite représente une
vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. Les images micrographiques sont les plus
représentatives de 2 expériences. La barre d’échelle représente 30 µm.
Figure 95 : Effet des peptides LL7-37 et du LL-37 sur un biofilm ATCC PAO1-GFP
Les peptides LL7-37 et LL-37 à (A) 0, (B) 25, (C) 50 et (D) 100 μM sont exposés pendant 25
min sur un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Les cellules vivantes
apparaissent vertes par expression de la GFP et les cellules endommagées apparaissent rouges
par perméabilisation à l’IP. Pour chaque peptide, les images de MCBL montrent une section
horizontale du biofilm et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de gauche). La colonne
de droite représente une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm. Les images
micrographiques sont les plus représentatives de 2 expériences. Les barres blanches indiquent
une distance de 30 µm.
LL7-37 LL-37
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
167
L’activité de différentes concentrations du peptide LL7-37, un des fragments les plus
actifs sur les biofilms, est étudiée et comparée à l’activité du peptide LL-37 (figure 95). L’IP
n’a pas coloré le biofilm dans les conditions contrôles (0 µM). Les concentrations actives de
peptide sur un biofilm développé dans un réacteur CDC sont dans la même gamme que celles
actives sur un biofilm développé dans une microplaque. A de plus faibles concentrations, les
peptides LL-37 et LL7-37 augmentent non seulement la perméabilité à l’IP de certaines
bactéries mais endommagent également la couche supérieure du biofilm. Une concentration
importante des peptides (100 µM) perméabilise la membrane bactérienne de l’entièreté de la
microcolonie et perturbe l’intégrité de la surface du biofilm.
Figure 96 : Effet des peptides LL-37 et LL7-37 sur un biofilm ATCC 15442
Les peptides LL-37 et LL7-37 (concentration finale 100 μM) sont exposés pendant 25 min sur
un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Après traitement, le biofilm est
rincé et marqué par le kit BacLight™ Live/Dead®. Les cellules vivantes apparaissent vertes,
par marquage par l’indicateur fluorescent Syto9 spécifique des cellules vivantes, et les
cellules endommagées apparaissent rouges par perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL
montrent une section horizontale du biofilm et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de
gauche). La colonne de droite représente une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm.
Les images micrographiques sont les plus représentatives de 2 expériences. La barre d’échelle
correspond à 30 µm.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
168
Effet des peptides sur un biofilm ATCC 15442 préformé dans un réacteur CDC
L’effet des 6 peptides (LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31 et LL-19) à 100 µM
est également évalué sur un biofilm préformé par la souche de référence ATCC 15442
(figures 96, 97 et 98). Les biofilms sont développés dans un réacteur CDC et marqués par le
kit BacLight™ Live/Dead®
après traitement. Les biofilms incubés dans des conditions
contrôles (absence de peptide) apparaissent verts confirmant qu’ils sont imperméables à l’IP.
Le traitement du biofilm par le peptide initial LL-37 endommage l’ensemble des cellules
bactériennes du biofilm qui apparaissent rouges par perméabilité à l’IP (figure 96). Le peptide
LL7-37 semble également très actif sur la base du biofilm (forte coloration rouge) mais les
cellules en surface du biofilm restent imperméables au fragment (figure 96). Les fragments
LL-31 et LL7-31 perméabilisent un volume important du biofilm et atteignent aussi bien la
surface que la base de la structure du biofilm. Cependant toutes les cellules ne sont pas
endommagées par les fragments et des cellules de coloration verte sont toujours présentes
(figure 97). Le fragment LL13-37 montre également une légère activité de perméabilisation
de la membrane bactérienne, principalement au niveau de la périphérie du biofilm (figure 98).
La moitié N-terminale, le fragment LL-19, n’a aucune activité sur les cellules du biofilm
(figure 98).
De manière générale, les biofilms formés par la souche ATCC 15442 sont plus
résistants au traitement par les différents peptides en comparaison aux biofilms formés par la
souche ATCC PAO1 : une concentration plus importante (100 µM) est nécessaire pour
observer une activité de perméabilisation des cellules au sein du biofilm.
Figure 97 : Effet des peptides LL-31 et LL7-31 sur un biofilm ATCC 15442
Les peptides LL-31 et LL7-31 (concentration finale 100 μM) sont exposés pendant 25 min sur
un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Après traitement, le biofilm est
rincé et marqué par le kit BacLight™ Live/Dead®. Les cellules vivantes apparaissent vertes,
par marquage par l’indicateur fluorescent Syto9 spécifique des cellules vivantes, et les
cellules endommagées apparaissent rouges par perméabilisation à l’IP. Les images de MCBL
montrent une section horizontale du biofilm et 2 sections dans les plans xz et yz (colonne de
gauche). La colonne de droite représente une vue tridimensionnelle du sommet du biofilm.
Les images micrographiques sont les plus représentatives de 2 expériences. La barre d’échelle
correspond à 30 µm.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
169
Figure 98 : Effet des peptides LL13-37 et LL-19 sur un biofilm ATCC 15442
Les peptides LL13-37 et LL-19 (concentration finale 100 μM) sont exposés pendant 25 min
sur un biofilm préformé de 24 h développé dans un réacteur CDC. Après traitement, le
biofilm est rincé et marqué par le kit BacLight™ Live/Dead®. Les cellules vivantes
apparaissent vertes, par marquage par l’indicateur fluorescent Syto9 spécifique des cellules
vivantes, et les cellules endommagées apparaissent rouges par perméabilisation à l’IP. Les
images de MCBL montrent une section horizontale du biofilm et 2 sections dans les plans xz
et yz (colonne de gauche). La colonne de droite représente une vue tridimensionnelle du
sommet du biofilm. Les images micrographiques sont les plus représentatives de 2
expériences. La barre d’échelle correspond à 30 µm.
Figure 99 : Spectre ATR-FTIR des peptides en présence d’eau d’hydratation
1800 1700 1600 1500 14000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
1
2
3
4
5
Avidine (A)
Myoglobine (M)
1 = LL-37
2 = LL-13
3 = LL13-25
4 = LL13-31
5 = LL13-37
A
M
A
Nombre d'onde (cm-1)
Ab
so
rba
nc
e r
ela
tiv
e
1800 1700 1600 1500 14000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
1
2
3
4
5
Myoglobine (M)
1 = LL-37
2 = LL7-37
3 = LL-31
4 = LL7-31
5 = LL-19
Avidine (A)
A
M
B
Nombre d'onde (cm-1)
Ab
so
rba
nc
e r
ela
tiv
e
Les spectres des peptides LL-37, LL13-31, LL13-37, LL-13 et LL13-25 (figure A) et les
spectres des peptides LL-37, LL7-37, LL-31, LL7-31 et LL-19 (figure B) en présence d’eau
d’hydratation sont comparés aux spectres de l’avidine (A), structure de référence des feuillets-
β, et de la myoglobine (M), structure de référence d’une hélice-α.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
170
II.5 ETUDE DES STRUCTURES SECONDAIRES DES PEPTIDES A L’AIDE
DE LA SPECTROSCOPIE INFRAROUGE A TRANSFORMEE DE FOURIER
A REFLEXION TOTALE ATTENUEE (ATR-FTIR)
II.5.1 Etude des structures secondaires des peptides seuls
En présence d’eau d’hydratation
La structure de 9 peptides (LL-37, LL13-31, LL-13, LL13-25, LL7-37, LL13-37, LL-
31, LL7-31 et LL-19), choisis pour leurs différences d’efficacité sur P. aeruginosa, est
analysée par spectroscopie ATR-FTIR. Les spectres sont enregistrés à partir des peptides
préparés dans un tampon aqueux. Le spectre des peptides est comparé avec le spectre de la
myoglobine, une protéine avec un haut contenu en hélices-α et l’avidine, un peptide avec une
structure secondaire en feuillets-β (figure 99).
Sur les 9 peptides étudiés, le spectre de 6 peptides (LL-37, LL13-31, LL13-37, LL7-
37, LL-31 et LL7-31) présente un pic majeur étroit et symétrique dans la région de l’amide I,
vers 1653-1655 cm-1
, qui est aussi la région du pic majeur de l’amide I du spectre de la
myoglobine et qui se trouve dans la région où la plupart des protéines à hélices-α ont leur
maximum de l’amide I (Goormaghtigh et al., 2006 ; Oberg et al., 2003). Ce résultat suggère
que ces 6 peptides forment une hélice-α dans un tampon aqueux.
Trois autres peptides, les fragments LL-13, LL13-25 et LL-19, ont un pic majeur plus
large et non symétrique, légèrement décalé vers des nombres d’onde plus faibles, dans la
région de 1646 cm-1
(LL-13), 1632 cm-1
(LL13-25) et 1647 cm
-1 (LL-19). Dès lors, les spectres
des fragments LL-13, LL13-25 et LL-19 suggèrent que des structures autres que l’hélice-α
(random et feuillet-β) peuvent contribuer au pic.
Figure 100 : Spectre ATR-FTIR des peptides après échange H2O/D2O « deutération »
1800 1700 1600 1500 14000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.51 = LL-37
2 = LL-13
3 = LL13-25
5 = LL13-37
1
2
3
45 4 = LL13-31
A
Nombre d'onde (cm-1)
Ab
so
rba
nc
e r
ela
tiv
e
1800 1700 1600 1500 14000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
1
2
3
4
1 = LL7-37
2 = LL-31
3 = LL7-31
4 = LL-19
B
Nombre d'onde (cm-1)
Ab
so
rba
nc
e r
ela
tiv
e
Figure A : Spectres des peptides LL-37, LL13-31, LL13-37, LL-13 et LL13-25 après échange
H2O/D2O « deutération ». Figure B : Spectres des peptides LL7-37, LL-31, LL7-31 et LL-19
après reconstitution dans une solution de D2O.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
171
Après échange H2O/D2O « deutération »
Ces résultats sont confirmés après deutération des peptides (figure 100). Une structure
secondaire en hélice-α ou une structure désordonnée peuvent contribuer à la vibration de
l’amide I à des nombres d’onde pratiquement identiques pouvant compliquer la différentiation
des deux structures lors de l’analyse du spectre IR. Cependant l’échange H/D permet cette
différentiation car l’absorption de la structure désordonnée est décalée de manière beaucoup
plus importante que la structure en hélice-α. En effet, au sein d’une hélice-α, le lien
hydrogène entre l’atome d’azote d’un groupe amine d’un résidu n impliqué dans un lien
amide n et l’atome d’oxygène d’une fonction carboxylique impliquée dans un lien amide n+4
retarde l’échange entre l’hydrogène et le deutérium. Par contre, on a observé que dans le
random (séquence de la protéine dépourvue de structure secondaire) les atomes d’hydrogène
(proton amide) sont relativement accessibles et plus facilement échangeables avec du
deutérium (par exemple de Jongh et al., 1997). L’échange H/D est observé par la diminution
de l’aire du pic amide II (vibration N-H) autour de 1550 cm-1
qui est sensible à l’échange H/D
comparé à l’aire du pic amide I (vibration C=O) de 1600-1700 cm-1
pris comme référence.
Après échange de l’H du groupement amine par du D, le pic amide II se décale vers 1440 cm-
1. Après deutération, le pic majeur de la région de l’amide I de 6 peptides (LL-37, LL13-31,
LL13-37, LL7-37, LL-31 et LL7-31) est légèrement déplacé vers des nombres d’onde plus
faibles mais est toujours situé dans la bande de l’hélice-α confirmant que ces peptides
adoptent une structure secondaire en hélice-α. Ce décalage différencie une hélice-α d’une
conformation en random car la composante de l’hélice-α subit seulement un décalage modéré
de faible fréquence après deutération en comparaison avec la structure random
(Goormaghtigh et al., 1994a). Deux pics sont apparus à 1636 cm-1
et 1620 cm-1
pour le
peptide LL13-25. Le spectre de ce peptide après deutération suggère que ce fragment adopte
une structure secondaire autre que l’hélice-α, probablement des feuillets-β parallèles. Après
deutération des peptides LL-13 et LL-19, un pic majeur est apparu à 1616 cm-1
et un second
pic est apparu à 1684 cm-1
(LL-13) et 1685 cm-1
(LL-19). L’apparition d’une composante
additionnelle dans les nombres d’onde élevés (1685 cm-1
) est caractéristique d’un feuillet-β
antiparallèle, les feuillets-β parallèles n’ayant pas de composante dans les nombres d’onde
élevés (Barth, 2007 ; Arrondo et al., 1993). Par ailleurs, il est généralement établi que la
bande de l’amide I d’une structure secondaire β agrégée est dominée par une large
composante vers 1615-1620 cm-1
et une composante mineure vers 1675-1695 cm-1
(Morgera
et al., 2009 ; Barth et Zscherp, 2002 ; Tamm et Tatulian, 1997). Dès lors les spectres
Figure 101 : Spectre ATR-FTIR de 6 peptides au contact de liposomes
après reconstitution dans une solution de D2O
1800 1700 1600 1500 14000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
1
2
3
4
5
6 4 = LL7-31
2 = LL7-37
3 = LL-31
1 = LL-37
5 = LL13-37
6 = LL-19
Nombre d'onde (cm-1)
Ab
so
rba
nc
e r
ela
tiv
e
Spectres des peptides LL-37, LL7-37, LL-31, LL7-31, LL13-37 et LL-19 en présence de
lipides après reconstitution dans une solution de D2O.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
172
suggèrent que les peptides LL-13 et LL-19 ne forment pas une hélice-α mais forment une
autre structure secondaire, probablement un agrégat de feuillets-β antiparallèles.
II.5.2 Etude des structures secondaires des peptides au contact de liposomes
La structure secondaire de 6 peptides (LL-37, LL7-37, LL-31, LL7-31, LL13-37 et
LL-19) au contact d’une bicouche lipidique est analysée par ATR-FTIR (figure 101).
L’apparition d’un pic vers 1735 cm-1
correspond à l’étirement du groupement C=O des
chaînes acyles des lipides et confirme la présence de lipides dans le mélange. Le ratio lipides :
protéines peut être évalué à partir du ratio de la bande de lipide autour de 1735 cm-1
et de la
bande de la protéine autour de 1650 cm-1
(Goormaghtigh et al., 1994a). Dans cette expérience,
le ratio est de 1 : 2. La bande de vibration du C=O des lipides à 1735 cm-1
est absente pour les
peptides purs et aucune absorption n’apparaît dans la région de l’amide I (1600-1700 cm-1
)
pour le lipide pur (données non montrées). Le spectre des peptides LL-37, LL7-37, LL13-37,
LL-31 et LL7-31 présente un pic majeur étroit de l’amide I dans la région de l’hélice-α (1645
à 1651 cm-1
) confirmant que ces peptides adoptent une structure secondaire en hélice-α même
au contact d’une bicouche lipidique. Deux pics sont apparus pour le fragment LL-19, à 1648
et 1618 cm-1
, suggérant que ce peptide ne forme pas d’hélice-α mais une autre structure
secondaire, probablement un feuillet-β.
Figure 102 : Synthèse de la dansyl-PMB
Le mélange réactionnel entre le sulfate de PMB et le chlorure de dansyle est injecté dans une
colonne Sephadex G50 équilibrée avec un tampon phosphate. Des fractions de 5 à 6 mL sont
collectées. Les fractions récoltées sont exposées à une lampe UV. Le tube de gauche de
fluorescence jaune correspond à la dansyl-PMB et le tube de droite de fluorescence bleue-
verte correspond au chlorure de dansyle.
Figure 103 : Essai de dinitrophénylation de la dansyl-PMB
0 5 100
1
2
3
4
y = 0,2982 x + 0,0017
Concentration PMB (mg/mL)
Ab
so
rban
ce 4
20 n
m
Une courbe standard de la PMB est réalisée à partir de différentes concentrations en
antibiotique. L’absorbance est mesurée en fonction de la concentration.
Dansyl-PMB
Chlorure de dansyle
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
173
II.6 FIXATION DES PEPTIDES AUX LPS
Les LPS sont présents sur la membrane des bactéries à Gram négatif. Ces lipides sont
chargés négativement et facilitent les attractions électrostatiques initiales entre les PAM
cationiques et la membrane bactérienne. La PMB est un peptide antibiotique cationique qui se
lie aux LPS. Cette interaction peut être mesurée par utilisation d’un agent fluorescent, la
dansyl-PMB, qui émet de la lumière dans un environnement hydrophobe, par exemple après
interaction avec les LPS.
II.6.1 Synthèse de la dansyl-PMB
La fluorescence des fractions collectées est observée et permet la différenciation entre
la PMB dansylée et le chlorure de dansyle n’ayant pas réagi. Lorsque les tubes sont placés
sous une lampe UV, la fluorescence jaune est indicatrice de la dansyl-PMB (figure 102). On a
ainsi pu séparer le produit de réaction entre le sulfate de PMB et le chlorure de dansyle.
II.6.2 Dosage de la dansyl-PMB par dinitrophénylation
La dansyl-PMB synthétisée est dosée par dinitrophénylation. Une courbe étalon est
obtenue par dinitrophénylation de concentrations croissantes de PMB et mesure de
l’absorbance à 420 nm. Une droite de régression est établie et permet d’évaluer la
concentration en équivalents PMB de la solution de dansyl-PMB (figure 103). La régression
linéaire permet de calculer une concentration de 3,8 mg/mL de PMB dans la solution de
dansyl-PMB, ce qui correspond à 2,7 mM équivalent PMB (masse molaire de la PMB =
1385,61 g/mol).
Figure 104 : Fluorescence de la dansyl-PMB
0 200 400 600 8000
100000
200000
300000
400000
A
dansyl-PMB
Temps (s)
Flu
ore
scen
ce (
u.a
.f.)
0 200 400 600 8000
100000
200000
300000
400000
B dansyl-PMB
Temps (s)
Flu
ore
scen
ce (
u.a
.f.)
La fluorescence de la dansyl-PMB est étudiée dans un tampon HEPES 5 mM (pH 7,2) en
absence de LPS (figure A) et en présence de LPS à une concentration finale de 3 µg/mL
(figure B) à l’aide d’un fluorimètre.
Figure 105 : Effet des peptides sur la fixation aux LPS
Fragments N-terminaux
Contr
ôle
LL-37
LL-31
LL-25
LL-19
LL-13
0
25
50
75
100
125
**
***
A
Fix
atio
n d
e la
da
ns
yl-P
MB
(%
du
to
tal)
Fragments intermédiaires
LL-37
LL7-31
LL13-3
1
LL7-25
LL13-2
5
0
25
50
75
100
125
** *** **
B
Fix
atio
n d
e la
da
ns
yl-P
MB
(%
du
to
tal)
Fragments C-terminaux
LL-37
LL7-37
LL13-3
7
LL19-3
7
LL25-3
7
0
25
50
75
100
125
** ****
***
C
Fix
atio
n d
e la
da
ns
yl-P
MB
(%
du
to
tal)
Les LPS de P. aeruginosa sont incubés en présence de 10 µM de fragments N-terminaux
(figure A), fragments intermédiaires (figure B) ou fragments C-terminaux (figure C) et de 13
µM équivalent PMB de dansyl-PMB. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle
et sont la moyenne ± SEM de 4 expériences indépendantes réalisées en duplicat (n = 4). ** P
< 0,01 ; *** P < 0,001.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
174
II.6.3 Effet des peptides sur la fixation de la dansyl-PMB aux LPS
L’augmentation de la fluorescence suite à la liaison de la dansyl-PMB aux LPS est
mesurée à l’aide d’un fluorimètre. Un contrôle est effectué en absence des LPS (figure 104
A). L’incubation de 0,55 µM de dansyl-PMB en présence des LPS de P. aeruginosa provoque
une augmentation de la fluorescence plus importante qu’en absence des LPS (figure 104 B)
confirmant que l’augmentation de la fluorescence observée est consécutive à la liaison de la
dansyl-PMB aux LPS.
A 10 µM, le peptide LL-37 déplace la dansyl-PMB et se fixe aux LPS (figure 105). La
fluorescence en présence du peptide diminue de manière significative par rapport au contrôle
et atteint 52 ± 4 % (n = 4 ; P < 0,01). Six fragments (LL-31, LL7-31, LL13-31, LL7-37,
LL13-37, LL19-37) se fixent de manière significative aux LPS et une diminution importante
de la fluorescence, correspondant au déplacement de la dansyl-PMB, est détectée. La
suppression jusqu’à 18 acides aminés au niveau N-terminal (LL19-37) ou de 6 acides aminés
au niveau C-terminal (LL-31) du peptide n’a pas modifié l’interaction avec les LPS. Ainsi, la
partie centrale du peptide initial (résidus 19 à 31) semble intervenir dans la fixation aux LPS.
Figure 106 : Perméabilisation de la membrane interne et externe de E. coli ML-35p
LL-37
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100
20
40
60
80
100
Nitrocéfine
ONPG
Temps (min)
Activ
ité e
nzym
atiq
ue (
% d
u t
ota
l)
LL7-37
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100
20
40
60
80
100
Nitrocéfine
ONPG
Temps (min)
Activ
ité e
nzym
atiq
ue (
% d
u t
ota
l)
LL-31
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100
20
40
60
80
100
Nitrocéfine
ONPG
Temps (min)
Activ
ité e
nzym
atiq
ue (
% d
u t
ota
l)
LL13-37
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100
20
40
60
80
100
Nitrocéfine
ONPG
Temps (min)
Activ
ité e
nzym
atiq
ue (
% d
u t
ota
l)
LL7-31
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100
20
40
60
80
100
Nitrocéfine
ONPG
Temps (min)
Activ
ité e
nzym
atiq
ue (
% d
u t
ota
l)
LL-19
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100
20
40
60
80
100
Nitrocéfine
ONPG
Temps (min)
Activ
ité e
nzym
atiq
ue (
% d
u t
ota
l)
L’activité de 6 peptides sur la perméabilisation de la membrane externe (en rose) et
cytoplasmique (en bleu) est étudiée par mesure de l’activité enzymatique de la β-lactamase et
de la β-galactosidase comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont
exprimés en pourcentage de l’activité totale de l’enzyme et sont la moyenne ± SEM de 3 à 4
expériences indépendantes réalisées en duplicat (n = 3 à 4).
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
175
II.7 EFFET DES PEPTIDES SUR LA PERMEABILISATION DES
MEMBRANES DE E. COLI ML-35P
La souche E. coli ML-35p a été conçue spécifiquement pour étudier la
perméabilisation de la membrane externe et interne sur une même souche (Lehrer et al.,
1988). Cinq peptides (LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31 et LL7-31) sur les 6 étudiés
perméabilisent efficacement la membrane externe à la nitrocéfine (figure 106, courbe rose).
Les courbes des cinétiques d’entrée de la nitrocéfine sont cependant différentes pour ces 5
peptides. Afin de quantifier la différence, les t1/2 sont calculés pour chaque peptide. Le t1/2
correspond au temps nécessaire pour que 50 % du substrat (nitrocéfine) soit consommé. Le
peptide LL-37 est le plus actif avec un t1/2 de 35 ± 2 min (LL-37 > LL13-37 t1/2 37 ± 1 min >
LL-31 t1/2 40 ± 2 min > LL7-31 t1/2 49 ± 2 min > LL7-37 t1/2 52 ± 2 min) (n = 3 ; P < 0,001).
Les 5 peptides ayant une activité sur l’entrée de la nitrocéfine perméabilisent
également efficacement la membrane interne (figure 106, courbe bleue). L’activité des 5
peptides sur l’entrée d’ONPG est comparable (pas de différence significative du t1/2 pour les 5
peptides). Le t1/2 est atteint entre 15 min (LL7-31) et 29 min (LL-37) plus tard que le t1/2 de
l’entrée de la nitrocéfine. La perméabilisation des membranes externes et internes médiée par
les peptides est donc couplée dans le temps.
Enfin, le fragment LL-19 se distingue des 5 autres peptides et ne présente aucune
efficacité sur l’entrée de nitrocéfine ou d’ONPG dans la cellule.
Figure 107 : Effet des peptides sur la captation du bromure d’éthidium par les HUVEC
LL-37
0 20 40 60 800
20
40
60
80
100
100 M
0 M
5 M
10 M
30 M
50 M
20 M
Temps (min)
Cap
tatio
n d
u B
rEt
(% m
axim
um
)
LL-31
0 20 40 60 800
20
40
60
80
100
100 M
0 M
5 M
10 M
30 M
50 M
20 M
Temps (min)
Cap
tatio
n d
u B
rEt
(% m
axim
um
)
LL7-37
0 20 40 60 800
20
40
60
80
100
100 M
0 M
5 M
10 M
30 M
50 M
20 M
Temps (min)
Cap
tatio
n d
u B
rEt
(% m
axim
um
)
LL7-31
0 20 40 60 800
20
40
60
80
100
100 M
0 M
5 M
10 M
30 M
50 M
20 M
Temps (min)
Cap
tatio
n d
u B
rEt
(% m
axim
um
)
LL13-37
0 20 40 60 800
20
40
60
80
100
100 M
0 M
5 M
10 M
30 M
50 M
20 M
Temps (min)
Cap
tatio
n d
u B
rEt
(% m
axim
um
)
LL13-31
0 20 40 60 800
20
40
60
80
100
100 M
0 M
5 M
10 M
30 M
50 M
20 M
Temps (min)
Cap
tatio
n d
u B
rEt
(% m
axim
um
)
LL13-25
0 20 40 60 800
20
40
60
80
100
100 M
0 M
5 M
10 M
30 M
50 M
20 M
Temps (min)
Cap
tatio
n d
u B
rEt
(% m
axim
um
)
LL-19
0 20 40 60 800
20
40
60
80
100
100 M
0 M
5 M
10 M
30 M
50 M
20 M
Temps (min)
Cap
tatio
n d
u B
rEt
(% m
axim
um
)
Les HUVEC sont incubées à 37 °C en présence de bromure d’éthidium (concentration finale
10 mg/L) et de différentes concentrations du peptide LL-37 ou de certains de ses fragments.
La captation du bromure d’éthidium par les HUVEC est suivie par mesure de la fluorescence
à 590 nm après excitation à 540 nm pendant 1 h. A la fin de l’expérience, 10 µL de Triton X-
100 sont ajoutés (concentration finale 0,5 % (m/V)) aux puits afin de déterminer le taux
maximal de captation du bromure d’éthidium. Les résultats sont exprimés en pourcentage du
taux maximal de captation et sont la moyenne ± SEM de 3 essais indépendants réalisés en
triplicat (n = 3).
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
176
II.8 TOXICITE DES PEPTIDES SUR CELLULES EUCARYOTES
II.8.1 Evaluation de l’insertion du bromure d’éthidium
Les HUVEC sont incubées en présence de bromure d’éthidium et la fluorescence est
mesurée pendant 1 h (figure 107). Les cellules sont incubées pendant 10 min en absence des
peptides (taux basal de la captation du bromure d’éthidium) avant d’être exposées à
différentes concentrations des différents peptides. Le peptide LL-37 à 20 µM provoque une
augmentation linéaire de la fluorescence et, après une heure d’incubation, la captation du
bromure d’éthidium augmente de 8 ± 2 % en absence à 22 ± 1 % en présence du peptide (n =
3). La captation de l’indicateur fluorescent augmente après 10-20 min d’exposition à des
concentrations plus élevées du peptide. En présence de 100 µM de LL-37, la captation du
fluorophore augmente à 54 ± 3 % (n = 3). Cette réponse n’est pas affectée par la suppression
de 6 acides aminés au niveau du domaine C-terminal (LL-31). Par contre, la suppression des 6
premiers acides aminés du domaine N-terminal du peptide (LL7-37 et LL7-31) abolit la
captation du bromure d’éthidium qui est restaurée lorsque les 6 acides aminés suivants (LL13-
37 et particulièrement LL13-31) sont supprimés. Des fragments plus courts (LL-19 et LL13-
25) n’ont pas d’effet sur la captation du bromure d’éthidium.
Au vu de ces résultats nous pouvons conclure que l’extrémité N- terminale du LL-37
contribue à sa toxicité envers les cellules eucaryotes. Il apparaît également que des fragments
plus petits (LL7-37, LL7-31, LL13-25 et LL-19) dérivés du peptide initial LL-37 ont une
toxicité réduite sur les cellules endothéliales même à une concentration importante de 100
µM.
Figure 108 : Effet des peptides sur la libération de la LDH par les HUVEC
0 20 40 60 80 100
0
50
100
LL-37LL7-37LL13-37LL-19
Concentration (µM)
Lib
éra
tio
n d
e la
LD
H (
% d
u t
ota
l)
0 20 40 60 80 100
0
50
100
LL-31LL7-31LL13-31LL13-25
Concentration (µM)
Lib
éra
tio
n d
e la
LD
H (
% d
u t
ota
l)
Les HUVEC sont incubées à 37 °C pendant 20 min en présence de différentes concentrations
du peptide LL-37 et de certains de ses dérivés. Après centrifugation, la LDH présente dans le
surnageant est dosée. L’activité totale de la LDH est évaluée après la lyse des HUVEC. Les
résultats sont exprimés en pourcentage de l’activité totale de la LDH durant l’incubation avec
les peptides. Ils sont la moyenne ± SD de 2 expériences indépendantes réalisées en triplicat (n
= 2).
Figure 109 : Effet des peptides sur l’activité mitochondriale des HUVEC
0 20 40 60 80 1000
25
50
75
100
125
150
175
LL-37LL7-37LL-31LL7-31
Concentration (µM)
Ab
so
rba
nc
e (%
du
co
ntr
ôle
)
0 20 40 60 80 1000
25
50
75
100
125
150
LL13-37LL-19LL13-31LL13-25
Concentration (µM)
Ab
so
rba
nc
e (%
du
co
ntr
ôle
)
Les HUVEC sont incubées pendant 20 min en présence de différentes concentrations des
fragments dérivés du LL-37. Après élimination du milieu, l’activité mitochondriale est
estimée par le test MTT. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l’absorbance mesurée
dans les HUVEC incubées en absence des peptides et sont la moyenne ± SD de 2 expériences
indépendantes réalisées en triplicat (n = 2).
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
177
II.8.2 Evaluation de la libération de la LDH
L’effet du peptide original et de 7 fragments sur la libération par les HUVEC de
l’enzyme cytosolique LDH est testé (figure 108). Des concentrations en peptide LL-37 plus
élevées que 10 µM induisent la libération de la LDH qui atteint 50 % de la LDH totale à 100
µM. Des résultats similaires sont obtenus avec les fragments LL-31 et LL13-31. Les 5 autres
fragments (LL7-37, LL13-37, LL-19, LL7-31, LL13-25) n’ont pas d’effet sur la libération de
la LDH par les HUVEC.
II.8.3 Evaluation de l’activité mitochondriale
L’effet des fragments dérivés du LL-37 sur l’intégrité des mitochondries des HUVEC
est examiné par le test MTT (figure 109). A toutes les concentrations évaluées, l’absorbance
mesurée après incubation en présence des peptides est similaire à l’absorbance mesurée en
leur absence suggérant que la capacité des mitochondries à transférer les électrons est
maintenue en présence des peptides. Nous pouvons conclure que les peptides n’ont pas d’effet
délétère sur la mitochondrie.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
178
III. DISCUSSION
Effet des peptides sur des cultures planctoniques
Nous avons confirmé que la cathélicidine humaine LL-37 est très active sur des
cultures planctoniques de P. aeruginosa et, après un temps court (1 h), elle perméabilise de
manière importante la membrane bactérienne et entraîne la mort cellulaire. Cinq fragments
dérivés du peptide initial (LL-31, LL-25, LL7-31, LL13-31 et LL7-37) ont également une
activité antimicrobienne significative sur la souche ATCC PAO1 : nous avons mis en
évidence une diminution de la viabilité cellulaire après 1 h d’exposition à 10 µM de ces
peptides. Nos résultats suggèrent que la partie centrale (résidus 13 à 31) est nécessaire à
l’activité antibactérienne. Ce fragment (LL13-31) est aussi le plus petit fragment dérivé du
LL-37 avec une activité bactéricide sur B. thailandis (Kanthawong et al., 2010).
Les valeurs de CMI sont plus importantes que les concentrations perméabilisant la
membrane bactérienne à l’IP. Le milieu plus complexe utilisé pour effectuer la CMI
(possibilité d’interaction et d’inhibition de l’activité peptidique) peut expliquer cette
différence. Par ailleurs, la concentration de la suspension bactérienne est différente dans ces
deux protocoles.
Effet des peptides sur la formation d’un biofilm
Nous avons démontré que le peptide LL-37, mais aussi des fragments dérivés du LL-
37, bloquent la formation d’un biofilm de P. aeruginosa mesurée par la technique de CV.
L’inhibition du biofilm par le peptide LL-37 a déjà été décrite précédemment par Kapoor et
al. (2011) et par Dean et al. (2011) qui ont démontré une réduction de 43 % de la formation du
biofilm sur des cultures ATCC PAO1 traitées par le LL-37. Overhage et ses collègues ont
démontré que le peptide LL-37 modifie l’expression de presque 800 gènes et bloque la
formation d’un biofilm ATCC PAO1 (Overhage et al., 2008). L’activité antibiofilm du
peptide LL-37 a également été décrite pour S. epidermidis (Hell et al., 2010) et F. novicida
(Amer et al., 2010).
Nous constatons que la diminution de la coloration par le CV n’est pas secondaire à la
diminution du nombre de cellules. Considérant que le CV colore non seulement les cellules
mais également la matrice organique du biofilm, la diminution de la coloration en présence de
LL-37 est probablement liée à une diminution de la biomasse de la matrice extracellulaire.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
179
Nous avons démontré que 7 des 12 fragments dérivés du LL-37 inhibent également la
formation du biofilm de P. aeruginosa. Les peptides LL7-37 et LL-31 sont les plus efficaces
et provoquent une diminution importante du pourcentage de la formation de biomasse à une
concentration très faible de 5 µM. Bien que nos résultats suggèrent qu’un fragment assez long
du peptide original soit nécessaire à l’activité antibiofilm, de la Fuente-Nunez et ses collègues
ont montré qu’un nonapeptide dérivé du fragment LL-37 avait une activité antibiofilm très
importante. Il faut cependant mentionner que le peptide actif (KRFRIRVRV) n’est pas un
fragment direct du LL-37 ce qui rend la comparaison des résultats moins pertinente (de la
Fuente-Nunez et al., 2012).
Effet des peptides sur un biofilm préformé
L’effet de 6 peptides sur des biofilms préformés dans une microplaque est étudié par
MCBL avec des bactéries exprimant la GFP. Nivens et ses collaborateurs ont comparé la
production de biofilm par des souches de P. aeruginosa exprimant la GFP et les mêmes
souches n’exprimant pas la GFP et ont démontré que l’expression de la protéine fluorescente
n’a pas d’effet significatif sur la formation du biofilm de P. aeruginosa (Nivens et al., 2001).
Par MCBL, nous avons montré que la cathélicidine LL-37 affecte également les
bactéries de P. aeruginosa ATCC PAO1 au sein d’un biofilm préformé. Le peptide induit
l’augmentation de la captation d’IP par les cellules mortes de manière dose-dépendante. Un
début d’activité est observé à 20 µM et l’ensemble du biofilm est atteint à 100 µM. L’effet
d’une faible concentration (~1 µM) du peptide LL-37 sur un biofilm préétabli de P.
aeruginosa a été démontré par Overhage et ses collaborateurs qui ont observé in vitro
l’activité du peptide sur la réduction de l’épaisseur du biofilm formé dans des chambres en
flux. Ces mêmes auteurs ont montré que l’effet du peptide LL-37 sur la formation du biofilm
et sur la réduction du biofilm préétabli est le résultat de plusieurs actions : une diminution de
l’adhésion des cellules bactériennes sur une surface, la stimulation de la motilité twitching, et
la sous-expression de gènes liés au QS (Overhage et al., 2008). Récemment, Dean et ses
collègues ont observé par la technique de coloration des puits au CV que le peptide LL-37
(~0,25 µM) dégrade de manière significative le biofilm préformé de P. aeruginosa (Dean et
al., 2011). Les différences de concentrations actives sur le biofilm entre les études peuvent
être liées aux conditions expérimentales variables (milieu, technique, etc.).
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
180
Dans notre étude nous avons mis en évidence que des fragments peptidiques plus
petits dérivés du peptide original LL-37 ont également une activité sur les cellules sessiles du
biofilm. Nous démontrons plus particulièrement que les peptides LL7-37, LL-31 et LL7-31,
induisent l’augmentation de la perméabilité à l’IP des membranes bactériennes du biofilm
ATCC PAO1. La suppression de 6 résidus supplémentaires au niveau N-terminal (LL13-37)
atténue l’effet du peptide. La partie N-terminale, le fragment LL-19, n’a montré aucune
activité de perméabilisation des cellules bactériennes du biofilm et ce, même à une
concentration élevée de 100 µM.
L’étude sur les biofilms préformés dans une microplaque est approfondie par
utilisation de 5 souches cliniques de P. aeruginosa pour comparer l’effet des différents
peptides. Le plasmide pMF230 est inséré dans les souches PYO1, PYO2, MC75-450457,
MC099-450467 et MC093-450507 afin que celles-ci expriment de manière constitutive la
GFP et puissent être visualisées par MCBL. Les expériences réalisées sur les différentes
souches confirment que le peptide LL-37 et les dérivés LL7-37, LL7-31 et LL-31, ont une
activité comparable. A une concentration de 20 µM, ces peptides endommagent la membrane
bactérienne et l’entrée d’IP au sein de la cellule est observée pour une majorité des souches
étudiées. Cependant, l’ensemble des bactéries du biofilm n’est pas atteint à cette
concentration. La proportion du biofilm sensible au peptide est nettement plus importante à
une concentration de 50 µM et, à 100 µM, la totalité du tapis cellulaire du puits est
endommagée chez toutes les souches étudiées. Le fragment LL13-37 est nettement moins
actif que le dérivé original. La partie N-terminale du peptide, le fragment LL-19, ne montre
aucune activité sur le biofilm formé par les 5 souches.
Par la suite, l’étude de l’activité des 6 peptides sur un biofilm robuste et complexe des
souches ATCC PAO1 et ATCC 15442, développé dans un réacteur CDC avec un flux continu
de milieu et des forces de frottement, est effectuée. Les 5 peptides actifs sur un biofilm plat
développé dans les puits d’une microplaque (LL-37, LL7-37, LL7-31, LL-31 et LL13-37)
perméabilisent considérablement la surface du biofilm ATCC PAO1 à 50 µM. L’efficacité de
différentes concentrations du fragment LL7-37 est comparée à celle du peptide original. Le
peptide LL7-37 permet non seulement de diminuer la hauteur du biofilm mais promeut
également sa désagrégation. A 100 µM, l’entièreté de l’architecture complexe du biofilm est
atteinte. L’activité des peptides sur les biofilms plats ou développés via des extensions
verticales et horizontales est donc similaire.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
181
Bien que les fragments LL7-37, LL7-31 et LL-31 soient actifs sur le biofilm ATCC
15442 développé à l’aide du réacteur CDC, le peptide original LL-37 présente l’activité la
plus importante sur cette souche.
En conclusion, cette étude est la première démontrant la destruction du biofilm de P.
aeruginosa par utilisation d’une librairie de fragments dérivés du LL-37, confirmant les
potentialités de ces peptides pour le développement de nouvelles stratégies anti-infectieuses et
donc antibiofilms. De ces expériences, 3 fragments sortent du lot (les peptides LL7-37, LL7-
31 et LL-31) pour leurs propriétés destructrices sur le biofilm.
Récemment, Kanthawong et ses collègues ont étudié l’effet de fragments dérivés du
LL-37 sur des biofilms de B. pseudomallei développés en microplaque. Le fragment LL-31,
déjà à 20 µM, était le plus efficace sur la diminution du nombre de cellules vivantes au sein
du biofilm de B. pseudomallei (Kanthawong et al., 2012).
Etude de la structure secondaire des peptides
Neuf peptides sont choisis pour leur propriétés antibactériennes et antibiofilms
différentes afin d’effectuer des analyses ATR-FTIR et de déterminer leur structure secondaire.
Des études de dichroïsme linéaire et circulaire (Zhang et al., 2010 ; Lee et al., 2011), de
spectroscopie FTIR (Oren et al., 1999 ; Tossi et al., 1994) et de spectroscopie RMN (Porcelli
et al., 2008 ; Li et al., 2006 ; Wang, 2008) ont établi que le peptide LL-37 appartient au
groupe des PAM avec une hélice-α intimement associée aux activités du peptide. Nos spectres
confirment la structure en hélice-α de la cathélicidine humaine. Nos analyses indiquent que
les peptides LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31 et LL13-31 forment une hélice-α en
présence d’eau d’hydratation et après deutération. Ces 6 peptides sont également actifs sur P.
aeruginosa (en culture planctonique, sur la formation du biofilm ou sur biofilm préformé).
Les fragments LL-13, LL13-25 et LL-19 adoptent une structure secondaire différente de
l’hélice-α. Ils n’ont pas non plus d’activité sur P. aeruginosa, suggérant qu’une structure
secondaire sous forme d’hélice-α contribue à l’efficacité de ces peptides sur la bactérie.
Nous avons élargi l’investigation par l’analyse de la structure secondaire de 6 peptides
(LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31, LL7-31 et LL-19) en présence d’une bicouche lipidique
dans le but de mimer la membrane bactérienne rencontrée par les peptides. Les structures
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
182
secondaires observées précédemment sont maintenues au contact de la bicouche lipidique.
Seul le fragment LL-19 présente une structure secondaire différente d’une hélice-α.
Le score Agadir, index de la tendance des peptides à former une hélice-α, différencie
également le fragment LL-19 des 5 autres peptides (de moins de 1 pour LL-19 à 4-5 pour les
autres peptides). Ces résultats sont en accord avec ceux de Sigurdardottir et al. (2006) qui ont
démontré la différence importante du score Agadir entre le fragment N-terminal et le peptide
initial.
En accord avec la vision actuelle que l’activité antibactérienne des PAM dépend de
leur structure secondaire, il apparaît de nos différentes expérimentations que l’adoption par les
peptides d’une structure secondaire sous forme d’hélice-α contribue à leur activité sur P.
aeruginosa.
Etude de la fixation des peptides aux LPS
La haute affinité de liaison du peptide LL-37 aux LPS a déjà été démontrée
(Rosenfeld, 2006 ; Yount et Yeaman, 2013). Par mesure du déplacement de la dansyl-PMB,
nous confirmons la fixation du peptide LL-37 aux LPS de P. aeruginosa. Six fragments (LL-
31, LL7-31, LL13-31, LL7-37, LL13-37, LL19-37) se fixent également de manière
significative aux LPS. Tous ces peptides, à l’exception du LL19-37, sont aussi les peptides
actifs sur P. aeruginosa et perméabilisent la membrane bactérienne des cellules sessiles dans
le biofilm. Les autres fragments étudiés ne se lient pas aux LPS et ne possèdent pas non plus
d’activité anti-Pseudomonas significative. En accord avec les études impliquant la liaison des
PAM aux LPS dans les étapes initiales de l’action antimicrobienne (Yount et Yeaman, 2013 ;
Junkes et al., 2011), nous soulignons par ce travail que l’activité antibactérienne et même
antibiofilm des fragments dérivés du LL-37 suppose leur fixation aux LPS. Il découle aussi de
nos résultats que la partie centrale du fragment initial (résidus 19 à 31) est nécessaire à la
fixation aux LPS.
La propriété des fragments à se fixer aux LPS pourrait également limiter les effets
endotoxiques qui découlent de l’activation d’une cascade immunitaire initiée par les LPS
(Kai-Larsen et Agerberth, 2008) et renforcer ainsi l’efficacité de ces fragments dans le
traitement de l’infection.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
183
Etude de la perméabilisation de la membrane interne et externe
La souche E. coli ML-35p a été conçue spécifiquement pour étudier la
perméabilisation de la membrane externe et interne sur une même souche (Lehrer et al.,
1988). Nos résultats obtenus à l’aide de cette souche sont en accord avec Turner et al. (1998)
et Krahulec et al. (2010) quant à la capacité du LL-37 à perméabiliser la membrane à la fois
externe et interne, comme en témoigne l'augmentation au cours du temps de la perméabilité
des substrats de la β-lactamase et de la β-galactosidase. Dans cette étude, nous démontrons
que les fragments LL7-37, LL13-37, LL-31 et LL7-31 perméabilisent également efficacement
la membrane externe à la nitrocéfine. Les courbes des cinétiques d’entrée de la nitrocéfine
sont cependant différentes pour les 5 peptides et le calcul des t1/2 différencie l’efficacité de
perméabilisation des peptides (LL-37 > LL13-37 > LL-31 > LL7-31 > LL7-37). Les 5
peptides actifs sur la membrane externe perméabilisent aussi efficacement la membrane
cytoplasmique à l’ONPG avec un délai des t1/2 de 15 à 29 min après perméabilisation de la
membrane externe. Les courbes des cinétiques d’entrée de l’ONPG sont similaires pour les 5
peptides suggérant qu’ils perméabilisent facilement et efficacement la membrane interne. Les
peptides LL-37, LL7-37, LL13-37, LL-31 et LL7-31 sont aussi ceux ayant une activité
antimicrobienne et antibiofilm importante sur P. aeruginosa. Le fragment LL-19, dépourvu de
toxicité sur P. aeruginosa, n’a pas non plus perméabilisé les membranes externes et internes
de E. coli ML-35p. Ces résultats suggèrent que l’activité antimicrobienne des peptides peut
impliquer une action sur les membranes externe et interne et induire éventuellement la perte
de composés essentiels de la cellule.
Etude de la toxicité des peptides sur cellules eucaryotes
La sélectivité des PAM pour les membranes procaryotes versus eucaryotes reste un
point de discussion : certains peptides désintègrent non seulement les membranes bactériennes
mais peuvent également être toxiques pour les membranes plasmiques des cellules eucaryotes.
Cet effet secondaire constitue un inconvénient majeur dans le développement de ces peptides
pour un usage thérapeutique. Nos résultats confirment la toxicité cellulaire du peptide initial ;
la cathélicidine augmente la perméabilité membranaire des HUVEC au bromure d’éthidium et
à la LDH. La littérature rapporte également des propriétés de pénétration cellulaire pour le
peptide LL-37 ; son activité dans le transfert d’ADN extracellulaire vers le compartiment
nucléaire a été démontrée (Sandgren et al., 2004). Nous avons évalué la toxicité intracellulaire
du composé par mesure de l’activité des déshydrogénases mitochondriales des HUVEC (test
MTT) mais n’avons pas mis en évidence de diminution de la viabilité cellulaire. Ce résultat
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
184
était inattendu considérant que le peptide LL-37 affecte l’activité des déshydrogénases
mitochondriales de kératinocytes (Braff et al., 2005). La toxicité peut différer parmi les
différentes lignées cellulaires : Wong et ses collègues ont récemment démontré que la
cathélicidine LL-37 n’a pas de toxicité sur les mitochondries des monocytes (Wong et al.,
2011b).
L’étude de la toxicité des dérivés du LL-37 a souligné des résultats très intéressants.
Ainsi, supprimer les 6 premiers résidus du domaine N-terminal de la molécule permet
d’atténuer fortement la toxicité du peptide : LL7-37 et LL7-31 sont beaucoup moins toxiques
que LL-37 et LL-31. Ces fragments n’ont pas d’effet sur la perméabilisation de la membrane
eucaryote et n’affectent pas l’activité mitochondriale de la cellule. Par contre, la toxicité
membranaire est restaurée lorsque les 6 acides aminés suivants (LL13-37 et LL13-31) sont
supprimés. Des fragments plus courts (LL-19 et LL13-25) n’ont pas d’effet sur la captation du
bromure d’éthidium ou la libération de la LDH.
Nos résultats suggèrent donc que la partie N-terminale du peptide LL-37 contribue à sa
toxicité. Ces résultats sont concordants avec l’étude de Oren et ses collègues qui établissent
que la partie N-terminale du LL-37 est responsable de son activité hémolytique (Oren et al.,
1999). En accord avec nos résultats, Thennarasu et son équipe observent que le fragment
LL7-27 dérivé du peptide LL-37 présente une activité puissante contre les bactéries mais pas
contre les érythrocytes (Thennarasu et al., 2010).
Conclusion et perspectives
Il apparaît de cette étude approfondie de l’activité des différents peptides dérivés du
LL-37 sur cultures planctoniques de P. aeruginosa, sur la formation du biofilm par cette
souche, ou sur un biofilm préétabli, qu’il y a un potentiel évident à utiliser des fragments
peptidiques dérivés du LL-37 dans la lutte contre les infections à P. aeruginosa. Comme
soutenu par plusieurs groupes, de petits changements au niveau de la charge, de l’hélicité et
de l’hydrophobicité ont un impact important sur l’activité du peptide (Braff et al., 2005 ; Nell
et al., 2006). Etant donné leurs propriétés antibactérienne et antibiofilm importantes, les
peptides LL7-37 et LL7-31 semblent particulièrement intéressants à exploiter. Ils sont
efficaces sur des cultures planctoniques de P. aeruginosa, inhibent la formation du biofilm et
endommagent les cellules bactériennes au sein d’un biofilm plat ou à architecture complexe.
Ces deux fragments ne présentent pas de toxicité cellulaire in vitro confirmant qu’ils sont les
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
185
plus prometteurs de ceux décrits dans ce travail pour traiter les infections chroniques et
persistantes impliquant la formation d’un biofilm chez les patients atteints de mucoviscidose.
Nos travaux soulignent également l’importance de la structure secondaire en hélice-α
ainsi que la fixation aux LPS dans le mode d’action de ces peptides sur P. aeruginosa. Les
peptides à activité anti-Pseudomonas perméabilisent la membrane externe et interne de E. coli
ML-35p et agissent donc probablement via plusieurs mécanismes.
En outre, on reconnaît aux PAM de nombreuses fonctions de régulateurs et effecteurs
de l’immunité. Ces propriétés non explorées dans ce travail renforcent le potentiel de ces
peptides comme agents anti-infectieux. Les propriétés de réparation des plaies et
d’angiogenèse reconnues pour le peptide LL-37 devront également être approfondies sur les
fragments dérivés et pourraient offrir de nouvelles voies pour le traitement des infections.
L’étude d’une activité synergique par une co-administration du peptide LL7-31 ou
LL7-37 avec un antibiotique conventionnel est à explorer pour améliorer l’efficacité du
traitement thérapeutique et prophylactique. La combinaison d’agents antimicrobiens permet
d’en diminuer les doses et ainsi de réduire la toxicité et les chances de sélection de résistances
(Barriere, 1992 ; Steenbergen et al., 2009). Ainsi la littérature rapporte des données
encourageantes soulignant un bénéfice évident à utiliser une co-administration
PAM/antibiotique. Park et al. (2004) mettent en avant des effets synergiques par combinaison
du chloramphénicol avec des peptides dérivés du HP(2-20). Des PAM à hélice-α, la
magainine II et la cécropine A, combinés à la rifampicine ont significativement réduit le
nombre de bactéries vivantes de souches de P. aeruginosa multirésistantes, aussi bien in vitro
que in vivo. Ces résultats suggèrent que l’action de perméabilisation de la membrane par les
PAM permet à la rifampicine d’atteindre son site d’action intracellulaire (Cirioni et al., 2008).
Une approche alternative pourrait consister en une co-administration de deux PAM. En effet,
la combinaison du peptide LL-37 et de la protégrine 1, deux PAM isolés de mammifères,
exerce une activité synergique sur cultures planctoniques de P. aeruginosa (Yan et Hancock,
2001). Malheureusement, la plupart des études de synergies ont été réalisées sur cultures
planctoniques or l’étude de l’activité antibactérienne sur biofilm est indispensable et devra
faire l’objet de recherches futures.
Etude du peptide LL-37 et de ses dérivés
186
Les peptides LL7-31 et LL7-37 constituent une avancée également par leur plus petite
taille qui permet de diminuer leurs coûts de production de ces peptides. Des modifications
chimiques (substitution, remplacement des acides aminés L par des acides aminés D,
cyclisation) de ces peptides sont des options à envisager dans le futur pour maintenir une
stabilité envers les protéases ou éviter d’autres inconvénients rencontrés sous des conditions
physiologiques. L’administration par inhalation et des formulations adaptées devront être
développées pour optimaliser l’efficacité in vivo des peptides.
Conclusion générale et perspectives
187
CONCLUSION
GENERALE
ET PERSPECTIVES
Conclusion générale et perspectives
188
Les infections à P. aeruginosa impliquant la formation de biofilms sont une
préoccupation majeure chez les patients atteints de mucoviscidose. Les mutations rapides et
fréquentes liées à l’administration d’antibiotiques posent un défi pour le développement de
stratégies de lutte antibactérienne. De plus, le développement d'antibiotiques n'a pas suivi le
rythme de la prévalence croissante de résistance aux médicaments. Aujourd’hui, de nombreux
laboratoires dans le monde se préoccupent de la complexité structurelle et fonctionnelle du
biofilm, de sa résistance aux antibiotiques et aux défenses de l’hôte et du caractère persistant
qu’il confère aux infections chez ces patients. Face à l’émergence de plus en plus importante
de la résistance bactérienne, l’urgence de développer de nouveaux agents dirigés contre les
infections et les biofilms nécessite de poursuivre la recherche dans l’espoir d’augmenter
l’espérance et la qualité de vie des patients atteints de mucoviscidose.
Le contrôle des biofilms peut être atteint par trois moyens : par réduction de la
population bactérienne planctonique, par prévention de la formation du biofilm et par
éradication du biofilm établi. Les études existantes de stratégies de contrôle des biofilms
impliquent principalement des stratégies prophylactiques. Dans cette thèse, nous avons
exploré l’efficacité de nouveaux agents antibactériens sur l’ensemble des étapes du biofilm, y
compris sur les biofilms matures à structure robuste et complexe.
Durant ces dernières années, l’intérêt des PAM comme agents anti-infectieux s’est
renforcé et est apparu de plus en plus évident. Leur faible capacité à induire une résistance et
leur haut pouvoir antimicrobien en font d’excellents candidats thérapeutiques. Les résultats
obtenus au cours de notre travail confirment la possibilité d'optimaliser les propriétés et
l’efficacité des PAM par des manipulations de séquences qui modulent les fonctions des
peptides. Ainsi, de plus petits fragments dérivés de la cathélicidine humaine LL-37,
notamment les peptides LL7-31 et LL7-37, offrent un réel espoir dans le développement de
nouveaux composés à action antimicrobienne et antibiofilm importante avec une toxicité
réduite. Nous avons démontré dans cette étude que ces petits fragments sont actifs sur des
cultures planctoniques de P. aeruginosa, qu’ils sont capables de prévenir la formation d’un
biofilm et qu’ils agissent sur un biofilm épais avec une architecture tridimensionnelle. Ces
peptides pourront aussi servir de modèle pour le développement de nouveaux antibiotiques.
Conclusion générale et perspectives
189
Les dérivés peptido-mimétiques ont également fait l’objet d’études comme alternatives
de traitement aux antibiotiques conventionnels. Nous avons souligné dans ce travail que la
céragenine CSA-13 possède un large spectre d’activités anti-Pseudomonas et que le composé
est efficace aux différents stades de développement du biofilm. Plus précisément, considérant
les propriétés de perméabilisation de la membrane bactérienne conférées par le CSA-13, sa
résistance à la dégradation, son effet préventif sur l’adhésion bactérienne aux surfaces, sa
capacité à diffuser dans un biofilm et à détruire un biofilm mature, le CSA-13 est un candidat
potentiel pour traiter non seulement les infections aiguës causées par des bactéries
planctoniques de P. aeruginosa mais également les infections chroniques impliquant des
biofilms. Un intérêt évident à utiliser une co-administration de CSA-13 avec la tobramycine
s’est également dégagé de cette étude. Cependant, la toxicité du CSA-13 sur cellules
eucaryotes est un point à approfondir et à améliorer.
Ce travail offre donc de réelles perspectives pour le traitement des infections à P.
aeruginosa impliquant la formation d’un biofilm. Différentes pistes restent à explorer comme
par exemple l’association des peptides dérivés de la cathélicidine avec d’autres agents
antibiofilms ou antibiotiques pour combattre le pathogène. En outre, le développement de
nouveaux médicaments à base de dérivés peptidiques nécessite une meilleure compréhension
de leurs mécanismes d’action, complexes et multiples. L’ensemble des données générées dans
ce travail par l’expérimentation in vitro servira à exploiter des modèles in vivo dans l’espoir
d’aboutir à de nouvelles thérapeutiques efficaces dans la lutte contre les pathogènes
respiratoires chez les patients atteints de mucoviscidose.
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Annexes
206
ANNEXES
Annexes
207
Annexe 1 : Tableau récapitulatif « Caractérisation phénotypique des souches »
Souche
P.aeruginosa Origine Propriété
Adhésion
1 h
(BFRT)
Formation
du biofilm
48 h (CV)
Motilité Rhamno.
a
Sensibilité
à ATB Protéase
b Elastase
c
Production
de
C6-HSL
Production
de
C4-HSL Swimming Swarming
ATCC 15442 Souche de
référence
Non
mucoïde +++ + ++ ++ - ++ + - +++ +
PYO1 Souche
clinique
Non
mucoïde - + + + + +++ - - + +
ATCC PAO1 Souche de
référence
Non
mucoïde +++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ +++
ATCC 9027 Souche de
référence
Non
mucoïde +++ + ++ ++ - ++ + - - +
PYO2 Souche
clinique Mucoïde - +++ + ++ ++ + - - +++ ++
MC75-450457 Souche
clinique Mucoïde - ++ + + ++ + +++ +++ +++ ++
MC093-
450507 Souche
clinique Mucoïde +++ +++ ++ + +++ - ++ - ++ ++
MC099-
450467 Souche
clinique Mucoïde - + + ++ - + - - - +
a Rhamnolipides
b Activité protéolytique
c Activité élastolytique
Annexes
208
Annexe 2 : Composition des milieux de culture
Milieu AB (Agrobacterium)
K2HPO4 : 1,2 g/L
NaH2PO4 : 0,4 g/L
NH4Cl : 0,4 g/L
MgSO4.2H2O : 0,12 g/L
KCl : 0,06 g/L
CaCl2.2H2O : 0,004 g/L
FeSO4.7H2O : 0,001 g/L
Milieu BBM (Bouillon Biofilm Modifié)
MgSO4.2H2O : 0,2 g/L
FeSO4.7H2O : 0,0005 g/L
Na2HPO4 : 1,25 g/L
KH2PO4 : 0,5 g/L
(NH4)2SO4 : 0,1 g/L
Glucose : 0,05 g/L
Bouillon BHI (Brain Heart Infusion)
(Difco)
Infusion de cervelle de veau : 12,5 g/L
Infusion de cœur de bœuf : 5 g/L
Protéose-peptone : 10 g/L
Glucose : 2 g/L
NaCl : 5 g/L
Na2HPO4 : 2,5 g/L
Milieu BM2 (Biofilm Modifié 2)
Na2HPO4 : 1,25 g/L
KH2PO4 : 0,5 g/L
MgSO4.2H2O : 0,2 g/L
FeSO4.7H2O : 0,0005 g/L
(NH4)2SO4 : 0,1 g/L
Glucose : 5 g/L
Bouillon CAMHB (Mueller Hinton
Broth ajusté en ions Ca2+
et Mg2+
)
(Difco)
Infusion déshydratée de bœuf : 300 g/L
Hydrolysat acide de caséine
(casaminoacides) : 17,5 g/L
Amidon : 1,5 g/L
MgCl2.6H2O : 10 - 12,5 mg/L
CaCl2.2H2O : 20 - 25 mg/L
Milieu EGM (Endothelial Growth
Medium) (Lonza)
EBM (Endothelial Basal Medium)
hEGF : 0,5 mL
Hydrocortisone : 0,5 mL
GA-1000 (Gentamicine, Amphotéricine B)
: 0,5 mL
Extrait du cerveau de bovin : 2 mL
Sérum bovin foetal : 10 mL
Acide ascorbique
Milieu LB (Luria Bertani) (Sigma)
Tryptone : 10 g/L
Extrait de levures : 5 g/L
NaCl : 10 g/L
Bouillon MH (Mueller Hinton) (Difco)
Infusion déshydratée de bœuf : 300 g/L
Hydrolysat acide de caséine
(casaminoacides) : 17,5 g/L
Amidon : 1,5 g/L
Milieu solide MH (Mueller Hinton)
(Oxoid)
Infusion déshydratée de bœuf : 300 g/L
Hydrolysat acide de caséine
(casaminoacides) : 17,5 g/L
Amidon : 1,5 g/L
Agar : 17 g/L
Milieu MS (Mineral Salt) supplémenté
en lait
K2HPO4 : 7 g/L
KH2PO4 : 2 g/L
MgSO4.7H2O : 0,2 g/L
(NH4)2SO4 : 1 g/L
Glycérol : 4 g/L
Lait écrémé : 20 mL/L
Milieu PB (Pseudomonas broth)
Peptone : 20 g/L
MgCl2.6H2O : 1,4 g/L
K2SO4 : 10 g/L
Milieu PPGAS (Proteose Peptone-
Glucose-Ammonium Salts)
NH4Cl : 1 g/L
KCl : 1,5 g/L
TRIS-HCl : 19 g/L
MgSO4.7H2O : 0,4 g/L
Glucose : 5 g/L
Peptone : 10 g/L
Milieu Pseudomonas Agar (Difco)
Peptone : 20 g/L
MgCl2.6H2O : 1,4 g/L
K2SO4 : 10 g/L
Glycérol : 10 g/L
Agar : 15 g/L
Milieu TSA (Tryptic Soy Agar) (Oxoid)
Digestion pancréatique de caséine : 15 g/L
Digestion enzymatique de farine de soja : 5
g/L
NaCl : 5 g/L
Agar : 15 g/L
Milieu TSB (Tryptic Soy Broth) (Difco)
Digestion pancréatique de caséine : 17 g/L
Digestion enzymatique de farine de soja : 3
g/L
NaCl : 5 g/L
K2HPO4 : 2,5 g/L
Dextrose : 2,5 g/L
Annexes
209
Annexe 3 : Liste des publications
Seil, M., Kabré, E., Nagant, C., Vandenbranden, M., Fontanils, U., Marino, A., Pochet,
S. et Dehaye, J.P. (2009) Regulation by CRAMP of the responses of murine peritoneal
macrophages to extracellular ATP. Biochimica et Biophysica Acta. 1798: 569-578.
Seil, M., Nagant, C., Dehaye, J.P., Vandenbranden, M. et Lensink, M.F. (2010) Spotlight
on human LL-37, an antimicrobial peptide with promising cell-penetrating properties.
Pharmaceuticals. 3: 3435-3460.
Tré-Hardy, M., Nagant, C., El Manssouri, N., Vanderbist, F., Traore, H., Vaneechoutte,
M. et Dehaye, J.P. (2010) Efficacy of the combination of tobramycin and a macrolide
in an in vitro mature biofilm model of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents
Chemother. 54: 4409-4415.
Nagant, C., Tré-Hardy, M., El-Ouaaliti, M., Savage, P.B., Devleeschouwer, M. et
Dehaye, J.P. (2010) Interaction between tobramycin and CSA-13 on clinical isolates of
Pseudomonas aeruginosa in a model of young and mature biofilms. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 88: 251-263.
Nagant, C., Tré-Hardy, M., Devleeschouwer, M. et Dehaye, J.P. (2010) Study of the initial
phase of biofilm formation using a biofomic approach. J. Microbiol. Methods. 82: 243-
248.
Nagant, C., Feng, Y., Lucas, B., Braeckmans, K., Savage, P.B. et Dehaye, J.P. (2011)
Effect of a low concentration of a cationic steroid antibiotic (CSA-13) on the formation
of a biofilm by Pseudomonas aeruginosa. J. Appl. Microb. 111: 763-772.
Nagant, C., Savage, P.B. et Dehaye, J.P. (2012) Effect of pluronic acid F-127 on the toxicity
towards eukaryotic cells of CSA-13, a cationic steroid analogue of antimicrobial
peptides. J. Appl. Microb. 112: 1173-1183.
Nagant, C., Pitts, B., Nazmi, K., Vandenbranden, M., Bolscher, J.G., Stewart, P.S. et
Dehaye, J.P. (2012) Identification of peptides derived from the human antimicrobial
peptide LL-37 active against the biofilms formed by Pseudomonas aeruginosa using a
library of truncated fragments. Antimicrob. Agents Chemother. 56: 5698-5708.
Liesse lyamba, J.M., Seil, M., Nagant, C., Dulanto, S.A., Deplano, A., El Khattabi, C.,
Takaisi Kikuni, N.B. et Dehaye, J.P. (2013) Inhibition by EGTA of the formation of a
biofilm by clinical strains of Staphylococcus aureus. J. Basic Microbiol. Sous presse.
Nagant, C., Pitts, B., Stewart, P.S., Feng, Y., Savage, P.B. et Dehaye, J.P. (2013) Study of
the effect of antimicrobial peptide mimic, CSA-13, on an established biofilm formed by
Pseudomonas aeruginosa. MicrobiologyOpen. 2: 318-325.
Nagant, C., Seil, M., Nachtergael, A., Dulanto, S.A. et Dehaye, J.P. (2013) Contribution of
the production of quormones to some phenotypic characteristics of Pseudomonas
aeruginosa clinical strains. J. Med. Microbiol. Sous presse.