Post on 28-Nov-2015
ED3
Cancer, vieillissement et inflammation
ARNm du PSEUDOGENE PTEN dans la régulation tumorale
Fotine LIBANJE
Bruno FRANCOU
Biogenèse des microARN
• petit ARN non codants (19-25 nucléotides)
• environ 2000 microARN chez l’Homme
• Pri-miARN (miARN primaire)
� ARNPol-II dépendants� ARNPol-II dépendants
�« cappés »
� queue poly-A
• interaction avec le 3’UTR des ARNm
-> inhibition traduction de l’ARNm
-> dégradation de l’ARNm
Iorio et al., JCO, 2009
Rôles des microARN
• Interviennent dans des voies de signalisation importantes– Développement
– Prolifération cellulaire
– Apoptose
– Differentiation
• Deregulés dans de nombreuses pathologies : Parkinson, HSV (Herpes simlpex• Deregulés dans de nombreuses pathologies : Parkinson, HSV (Herpes simlpexvirus) , Cancer, etc.– Contribue à l’oncogenèse comme oncomiRs ou comme suppresseurs de tumeur
• Biomarqueurs potentiels– Diagnostic
– Réponse au traitement
– Stratification du risque
• Cibles potentiels pour des nouvelles thérapies
Les Pseudogènes
• Découverts dans les années 70
• Loci du génome non-codant
• Homologie de séquence avec gènes codants
• Font l’objet de transcription (mais absence de promoteurs canoniques)
• ARN non codant (mutations/ décalage du cadre de lecture empêche leur traduction) • ARN non codant (mutations/ décalage du cadre de lecture empêche leur traduction)
- séquence 3’UTR homologue à celui de l’ARNm du gène codant
• D’abord considérés comme inutiles car inactifs : vestiges de l’évolution…
(Vestiges de gènes devenus obsolètes, peuvent résulter d’erreurs de réplication)
MAIS suractivation de leur transcription retrouvés dans les cancers…
Rôle des pseudogènes dans la régulation de l’expression des gènes ?
Gène - ADN
ARNm
Transcription
Rôles des pseudogènes dans l’expression de PTEN ?
PSEUDOGENE?
ARNm
Protéine
Traduction microARN
• Phosphatase and Tensin homolog mutated in multiple advanced cancers 1
• Chromosome 10, 9 exons
• Protéine : 403 acides aminés
PTEN
• Protéine : 403 acides aminés
• Deux domaines protéiques : phosphatase-tensin et C2 tensine
• Exprimée dans la grande majorité des cellules du corps humain
Fonction de PTEN
PI3KPH
AKT
Membrane Plasmique
RAS
EGFR
PIP2 PIP3Prolifération
SurvieMigration
AKT
PTEN
PI3KPH
AKT
Membrane Plasmique
RASmuté
EGFR
PTEN : suppresseur de tumeur
PIP2 PIP3Prolifération
SurvieMigration
AKT
CARCINOGENESE
PTEN
Fonction de PTEN
• Déphosphoryle les phosphatidyl-inostitol
(3,4,5) triphosphates ainsi que diverses
protéines en des formes inactives.
• Action antagoniste de la phosphatidyl-
inositol 3'-kinase (PI 3-kinase ou PI3K)
• Les PI(3,4,5)P3 intervient dans le
métabolisme et la croissance cellulaire.
• Une diminution de la protéine PTEN
augmente le taux de PI(3,4,5)P3 et donc
le métabolisme et la croissance
cellulaires. Cette baisse d’activité entraîne
un risque augmenté de cancer.
• Une élévation de son activité pourrait
être protectrice contre le cancer mais
diminuerait également la taille globale
des tissus.
• gène suppresseur de tumeur haploinsuffisant
-mutation monoallélique dans de nombreux cancers humains (prostate, colon)
-Modèle souris: -PTEN hétérozygotie entraîne de multiples cancers
- Baisse de l’expression de PTEN-> augmentation sévérité et incidence de cancers épithéliaux
PTEN et pathologies
• Perte totale de PTEN rare, sauf dans cancer métastatique
• Mutations dans les formes adultes de la maladie de Lhermitte-Duclos et dans 20% des individus associant une macrocéphalie et un autisme.
• Une diminution de l'activité de la protéine PTEN pourrait augmenter la sensibilité à l'insuline avec un risque accru d'obésité.
Gène - ADN
ARNm
Transcription
pseudogène de PTEN ?
Rôles du pseudogène de PTEN dans l’expression de PTEN ?
ARNm
Protéine: PTEN
Traduction microARN
Rôles du pseudogène de PTENP1 dans l’expression de PTEN ?
PTEN
PTENP1
PTENP1 :
•localisé en 9p13.3
•Forte homologie avec PTEN (seulement 18 mismatches sur la séquence codante)
•3’UTR plus court d’1 kb par rapport à 3’UTR PTEN
•Deux régions d’homologies dans les 3’UTR : une forte (95%) et une faible (<50%)
Rôles du pseudogène de PTENP1 dans l’expression de PTEN ?
miR
HYPOTHESE rôle de PTENP1 :
•Détournement des miR ciblant ARNm PTEN par ARNm PTENP1 ?
•Corrélation entre absence de PTENP1 et cancer ?
Le gène PTEN est un suppresseur de tumeur
Des microARN peuvent inhiber l’expression de PTEN
Méthodologie: qPCR
• Fluorescence (Sybr Green) = ADN double brin• Réaction de PCR avec mesure de la fluorescence après chaque cycle• Ct proportionnelle à la quantité d’ADN présente au début de la réaction de PCR
1/ Effet des miR ciblant ARNm PTEN sur ARNm PTENP1 ?
Sur-expression des miR-19b et miR-20a
-> inhibition de l’expression des transcrits de PTEN et de PTENP1.
miR ciblant ARNm PTEN ciblent aussi l’ARNm de PTENP1
Inhibition de microARN
Dérepression de l’expression de PTEN et de PTENP
Rôle biologique du 3’UTR de PTENP1 ?
Surexpression de PTENP1 3’UTR:
-> augmentation ARNm PTEN-> augmentation de la protéine PTEN
Surexpression de PTENP1 3’UTR:
-> baisse de signalisation PI3K (pAKT)
PC3 human prostate cancer cell lines DU145
2/ Rôle biologique du 3’UTR de PTENP1 ??
Surexpression de PTENP1 3’UTR:
-> baisse de la prolifération cellulaire
Surexpression de PTENP1 3’UTR:
-> baisse de la tumorigénécité->effet plus important de PTENP1 plus important que PTEN
2/ Rôle biologique du 3’UTR de PTENP1 ?
• 3’UTR de PTENP1 agit comme suppresseur de tumeur- Entraîne augmentation de l’expression de PTEN- Action dépendant des miR
Avec surexpression de PTENP13’UTR
Surexpression de PTENP1 3’UTR:
-> pas d’augmentation ARNm de PTEN lorsque défaut de la biogénèse de miR
Surexpression de PTENP1 3’UTR:
-> pas d’augmentation ARNm de PTEN lorsque défaut de la biogénèse de miR HCT 116 = Homo sapiens colon
colorectal carcin cell line
2/ Rôle biologique du 3’UTR de PTENP1 ?
Invalidation de PTEN et PTENP1-> augmentation de la prolifération cellulaire-> effet additif de la transfection de de PTEN et PTENP1
Invalidation de PTENP1
-> baisse de l’ARNm de PTEN
Invalidation de PTEN
-> baisse de l’ARNm de PTENP1
Invalidation de PTEN+PTENP1-> perte totale de l’expression de PTEN
3’UTR de PTENP1 agit comme suppresseur de tumeur
Exploration de l’expression de PTEN et
de PTENP1 dans
(a) Des tissus normaux
(b) Des échantillons tumoraux de
prostate
Exploration de l’expression de PTEN et
de PTENP1 dans
(a) Des tissus normaux
(b) Des échantillons tumoraux de
prostate
Corrélation directe et affine entre
les expressions de PTEN et
PTENP1.
Ce qui suggère l’existence d’une
co-régulation de leurs expressions.
Ce qui est en accord avec les
données moléculaires obtenus
jusqu’alors, puisque PTENP1 peut
réguler l’expression de PTEN.
Exploration des altérations génomiques éventuelles du locus de
PTENP1.
Les analyses identifient
un certain nombre
d’échantillons de cancers
du colon présentant des
pertes détectable du
nombre de copie de nombre de copie de
PTENP1.
Exploration des altérations génomiques éventuelles du locus de
PTENP1.
Les analyses identifient
un certain nombre
d’échantillons de cancers
de colon présentant des
pertes détectable du
nombre de copie de nombre de copie de
PTENP1.
Pertes focales et non associées
à de larges pertes génomiques.
les analyses pointent une sous-expression de PTEN dans les
échantillons tumoraux par rapport aux échantillons normaux de
colon.
Exploration des altérations génomiques éventuelles du locus de
PTENP1.
les analyses pointent une sous-expression de PTEN dans les
échantillons tumoraux par rapport aux échantillons normaux de
colon.
Exploration des altérations génomiques éventuelles du locus de
PTENP1.
Ces résultats suggèrent que PTENP1 exercent des fonctions
suppressives de tumeurs.
Exploration des altérations génomiques éventuelles du locus de PTENP1.
Analyse de régression (corrélation)
Identification de 2 populations dans
lesquelles nombre de copies de
PTENP1 et expression de PTEN sont PTENP1 et expression de PTEN sont
étroitement liés.
Ce qui suggère que le niveau
d’expression de PTENP1 peut réguler
l’expression de PTEN.
Activité Biologique de PTEN ?
Figure 4a
Le 3’UTR de PTEN exerce lui aussi une activité biologique.
En effet, sa surexpression entraîne une sur-régulation de l’expression de PTENP1 de la
même manière que le 3’UTR de PTENP1 agit sur celle de PTEN.
Le 3’UTR de PTEN entraîne une inhibition de la croissance cellulaire.
Phénomène isolé ou modèle général de régulation des gènes par leurs pseudogènes ?
Figure 4b
Le 3’UTR de KRASP1 exerce lui aussi une activité biologique.
En effet, sa surexpression entraîne une sur-régulation de l’expression de KRAS.
Le 3’UTR de KRASP1 entraîne une augmentation de la croissance cellulaire.
RESULTATS SIMILAIRES DE CEUX OBTENUS PRECEDEMMENT AVEC PTENP1…
KRAS oncogene (mutation activatrice dans les cancer s) PTEN suppresseur de tumeurs (perte de copies, haplo insuffisance dans les cancers