ED3

Cancer, vieillissement et inflammation

ARNm du PSEUDOGENE PTEN dans la régulation tumorale

Fotine LIBANJE

Bruno FRANCOU

Gène - ADN

ARNm

Transcription

DOGME DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE

ARNm

Protéine

Traduction

LE MONDE DES ARN

miR (MicroRNA): Leur découverte

La découverte des microARN

Biogenèse des microARN

• petit ARN non codants (19-25 nucléotides)

• environ 2000 microARN chez l’Homme

• Pri-miARN (miARN primaire)

� ARNPol-II dépendants� ARNPol-II dépendants

�« cappés »

� queue poly-A

• interaction avec le 3’UTR des ARNm

-> inhibition traduction de l’ARNm

-> dégradation de l’ARNm

Iorio et al., JCO, 2009

Gènes des microARN

Mode de fonctionnement

Gène - ADN

Transcription

Rôles des microARN

ARNm

Protéine

Traduction microARN

Rôles des microARN

• Interviennent dans des voies de signalisation importantes– Développement

– Prolifération cellulaire

– Apoptose

– Differentiation

• Deregulés dans de nombreuses pathologies : Parkinson, HSV (Herpes simlpex• Deregulés dans de nombreuses pathologies : Parkinson, HSV (Herpes simlpexvirus) , Cancer, etc.– Contribue à l’oncogenèse comme oncomiRs ou comme suppresseurs de tumeur

• Biomarqueurs potentiels– Diagnostic

– Réponse au traitement

– Stratification du risque

• Cibles potentiels pour des nouvelles thérapies

Les Pseudogènes

• Découverts dans les années 70

• Loci du génome non-codant

• Homologie de séquence avec gènes codants

• Font l’objet de transcription (mais absence de promoteurs canoniques)

• ARN non codant (mutations/ décalage du cadre de lecture empêche leur traduction) • ARN non codant (mutations/ décalage du cadre de lecture empêche leur traduction)

- séquence 3’UTR homologue à celui de l’ARNm du gène codant

• D’abord considérés comme inutiles car inactifs : vestiges de l’évolution…

(Vestiges de gènes devenus obsolètes, peuvent résulter d’erreurs de réplication)

MAIS suractivation de leur transcription retrouvés dans les cancers…

Rôle des pseudogènes dans la régulation de l’expression des gènes ?

Gène - ADN

ARNm

Transcription

Rôles des pseudogènes dans l’expression de PTEN ?

PSEUDOGENE?

ARNm

Protéine

Traduction microARN

• Phosphatase and Tensin homolog mutated in multiple advanced cancers 1

• Chromosome 10, 9 exons

• Protéine : 403 acides aminés

PTEN

• Protéine : 403 acides aminés

• Deux domaines protéiques : phosphatase-tensin et C2 tensine

• Exprimée dans la grande majorité des cellules du corps humain

Fonction de PTEN

PI3KPH

AKT

Membrane Plasmique

RAS

EGFR

PIP2 PIP3Prolifération

SurvieMigration

AKT

PTEN

PI3KPH

AKT

Membrane Plasmique

RASmuté

EGFR

PTEN : suppresseur de tumeur

PIP2 PIP3Prolifération

SurvieMigration

AKT

CARCINOGENESE

PTEN

Fonction de PTEN

• Déphosphoryle les phosphatidyl-inostitol

(3,4,5) triphosphates ainsi que diverses

protéines en des formes inactives.

• Action antagoniste de la phosphatidyl-

inositol 3'-kinase (PI 3-kinase ou PI3K)

• Les PI(3,4,5)P3 intervient dans le

métabolisme et la croissance cellulaire.

• Une diminution de la protéine PTEN

augmente le taux de PI(3,4,5)P3 et donc

le métabolisme et la croissance

cellulaires. Cette baisse d’activité entraîne

un risque augmenté de cancer.

• Une élévation de son activité pourrait

être protectrice contre le cancer mais

diminuerait également la taille globale

des tissus.

• gène suppresseur de tumeur haploinsuffisant

-mutation monoallélique dans de nombreux cancers humains (prostate, colon)

-Modèle souris: -PTEN hétérozygotie entraîne de multiples cancers

- Baisse de l’expression de PTEN-> augmentation sévérité et incidence de cancers épithéliaux

PTEN et pathologies

• Perte totale de PTEN rare, sauf dans cancer métastatique

• Mutations dans les formes adultes de la maladie de Lhermitte-Duclos et dans 20% des individus associant une macrocéphalie et un autisme.

• Une diminution de l'activité de la protéine PTEN pourrait augmenter la sensibilité à l'insuline avec un risque accru d'obésité.

Gène - ADN

ARNm

Transcription

pseudogène de PTEN ?

Rôles du pseudogène de PTEN dans l’expression de PTEN ?

ARNm

Protéine: PTEN

Traduction microARN

Rôles du pseudogène de PTENP1 dans l’expression de PTEN ?

PTEN

PTENP1

PTENP1 :

•localisé en 9p13.3

•Forte homologie avec PTEN (seulement 18 mismatches sur la séquence codante)

•3’UTR plus court d’1 kb par rapport à 3’UTR PTEN

•Deux régions d’homologies dans les 3’UTR : une forte (95%) et une faible (<50%)

Rôles du pseudogène de PTENP1 dans l’expression de PTEN ?

miR

HYPOTHESE rôle de PTENP1 :

•Détournement des miR ciblant ARNm PTEN par ARNm PTENP1 ?

•Corrélation entre absence de PTENP1 et cancer ?

Le gène PTEN est un suppresseur de tumeur

Des microARN peuvent inhiber l’expression de PTEN

Méthodologie: qPCR

• Fluorescence (Sybr Green) = ADN double brin• Réaction de PCR avec mesure de la fluorescence après chaque cycle• Ct proportionnelle à la quantité d’ADN présente au début de la réaction de PCR

1/ Effet des miR ciblant ARNm PTEN sur ARNm PTENP1 ?

Sur-expression des miR-19b et miR-20a

-> inhibition de l’expression des transcrits de PTEN et de PTENP1.

miR ciblant ARNm PTEN ciblent aussi l’ARNm de PTENP1

Inhibition de microARN

Dérepression de l’expression de PTEN et de PTENP

Rôle biologique du 3’UTR de PTENP1 ?

Figure 2Figure 2

Rôle biologique du 3’UTR de PTENP1 ?

Surexpression de PTENP1 3’UTR:

-> augmentation ARNm PTEN-> augmentation de la protéine PTEN

Surexpression de PTENP1 3’UTR:

-> baisse de signalisation PI3K (pAKT)

PC3 human prostate cancer cell lines DU145

2/ Rôle biologique du 3’UTR de PTENP1 ??

Surexpression de PTENP1 3’UTR:

-> baisse de la prolifération cellulaire

Surexpression de PTENP1 3’UTR:

-> baisse de la tumorigénécité->effet plus important de PTENP1 plus important que PTEN

2/ Rôle biologique du 3’UTR de PTENP1 ?

• 3’UTR de PTENP1 agit comme suppresseur de tumeur- Entraîne augmentation de l’expression de PTEN- Action dépendant des miR

Avec surexpression de PTENP13’UTR

Surexpression de PTENP1 3’UTR:

-> pas d’augmentation ARNm de PTEN lorsque défaut de la biogénèse de miR

Surexpression de PTENP1 3’UTR:

-> pas d’augmentation ARNm de PTEN lorsque défaut de la biogénèse de miR HCT 116 = Homo sapiens colon

colorectal carcin cell line

2/ Rôle biologique du 3’UTR de PTENP1 ?

Invalidation de PTEN et PTENP1-> augmentation de la prolifération cellulaire-> effet additif de la transfection de de PTEN et PTENP1

Invalidation de PTENP1

-> baisse de l’ARNm de PTEN

Invalidation de PTEN

-> baisse de l’ARNm de PTENP1

Invalidation de PTEN+PTENP1-> perte totale de l’expression de PTEN

3’UTR de PTENP1 agit comme suppresseur de tumeur

Statuts génomique et d’expression de PTENP1

dans les cancers ?

Figure 3

Exploration de l’expression de PTEN et

de PTENP1 dans

(a) Des tissus normaux

(b) Des échantillons tumoraux de

prostate

Exploration de l’expression de PTEN et

de PTENP1 dans

(a) Des tissus normaux

(b) Des échantillons tumoraux de

prostate

Corrélation directe et affine entre

les expressions de PTEN et

PTENP1.

Ce qui suggère l’existence d’une

co-régulation de leurs expressions.

Ce qui est en accord avec les

données moléculaires obtenus

jusqu’alors, puisque PTENP1 peut

réguler l’expression de PTEN.

Exploration des altérations génomiques éventuelles du locus de

PTENP1.

Les analyses identifient

un certain nombre

d’échantillons de cancers

du colon présentant des

pertes détectable du

nombre de copie de nombre de copie de

PTENP1.

Exploration des altérations génomiques éventuelles du locus de

PTENP1.

Les analyses identifient

un certain nombre

d’échantillons de cancers

de colon présentant des

pertes détectable du

nombre de copie de nombre de copie de

PTENP1.

Pertes focales et non associées

à de larges pertes génomiques.

les analyses pointent une sous-expression de PTEN dans les

échantillons tumoraux par rapport aux échantillons normaux de

colon.

Exploration des altérations génomiques éventuelles du locus de

PTENP1.

les analyses pointent une sous-expression de PTEN dans les

échantillons tumoraux par rapport aux échantillons normaux de

colon.

Exploration des altérations génomiques éventuelles du locus de

PTENP1.

Ces résultats suggèrent que PTENP1 exercent des fonctions

suppressives de tumeurs.

Exploration des altérations génomiques éventuelles du locus de PTENP1.

Analyse de régression (corrélation)

Identification de 2 populations dans

lesquelles nombre de copies de

PTENP1 et expression de PTEN sont PTENP1 et expression de PTEN sont

étroitement liés.

Ce qui suggère que le niveau

d’expression de PTENP1 peut réguler

l’expression de PTEN.

Activité Biologique de PTEN ?

Figure 4a

Le 3’UTR de PTEN exerce lui aussi une activité biologique.

En effet, sa surexpression entraîne une sur-régulation de l’expression de PTENP1 de la

même manière que le 3’UTR de PTENP1 agit sur celle de PTEN.

Le 3’UTR de PTEN entraîne une inhibition de la croissance cellulaire.

Phénomène isolé ou modèle général de régulation des gènes par leurs pseudogènes ?

Phénomène isolé ou modèle général de régulation des gènes par leurs pseudogènes ?

Figure 4b

Le 3’UTR de KRASP1 exerce lui aussi une activité biologique.

En effet, sa surexpression entraîne une sur-régulation de l’expression de KRAS.

Le 3’UTR de KRASP1 entraîne une augmentation de la croissance cellulaire.

RESULTATS SIMILAIRES DE CEUX OBTENUS PRECEDEMMENT AVEC PTENP1…

KRAS oncogene (mutation activatrice dans les cancer s) PTEN suppresseur de tumeurs (perte de copies, haplo insuffisance dans les cancers

Drago

Sticky Note

*

Gène - ADN

ARNm

Transcription

Rôles des pseudogènes dans l’expression de PTEN ?

Pseudogène

ARN non codantARNm

Protéine: PTEN

Traduction microARN