Post on 04-Apr-2015
Biologie Moléculaire
Travailler avec l’ADNTravailler avec l’ADN
SujetsSujets
ADN Genomique vs. VecteurADN Genomique vs. Vecteur Purification d’ADN plasmidiquePurification d’ADN plasmidique Enzyme de restrictionEnzyme de restriction Essentielle de la cartographie de Essentielle de la cartographie de
restriction restriction
ADNADN
GenomiqueGenomique Prokaryote vs. eukaryoteProkaryote vs. eukaryote Circulaire ou linéaireCirculaire ou linéaire Un ou plus dUn ou plus d’un’un chromosomes chromosomes
Extra-genomiqueExtra-genomique VecteursVecteurs PlasmidesPlasmides
Vecteurs Vs PlasmidesVecteurs Vs Plasmides
Vecteur: Vecteur: Véhicule d’ADN permettant le clonage, Véhicule d’ADN permettant le clonage,
maintien et amplification d’une maintien et amplification d’une séquence d’ADNséquence d’ADN
PlasmidesPlasmides VirusVirus ChromosomesChromosomes
Tous les plasmides sont des vecteursTous les plasmides sont des vecteurs Pas tous les vecteurs sont des plasmides Pas tous les vecteurs sont des plasmides
PlasmidesPlasmides
Petites molécules d’ADN circulaires Petites molécules d’ADN circulaires maintenues et amplifiées chez des maintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotes ou procaryotescellules eucaryotes ou procaryotes
Amplification chez les bactériesAmplification chez les bactéries
Utilisé en tant que vecteur pour le Utilisé en tant que vecteur pour le clonage ou l’expression d’ADN clonage ou l’expression d’ADN d’intérêtd’intérêt
Caractéristiques des Caractéristiques des Vecteurs PlasmidiquesVecteurs Plasmidiques
Sites de restrictions Sites de restrictions uniques pour le uniques pour le clonageclonage
Origine de réplication Origine de réplication (Ori)(Ori)
Marqueur de Marqueur de sélectionsélection Gènes de résistance Gènes de résistance
aux antibiotiques aux antibiotiques
Isolation d’ADNIsolation d’ADN
ButsButs Isolation de l’ADN désiréIsolation de l’ADN désiré
Chromosomique ou plasmidique?Chromosomique ou plasmidique? Retirer les autres composantesRetirer les autres composantes
ADN chromosomique ou plasmidique?ADN chromosomique ou plasmidique? ProtéinesProtéines ARNARN Produits chimiquesProduits chimiques
Sels, détergents, etc.Sels, détergents, etc.
Lyse cellulaireLyse cellulaire Paroi et membraneParoi et membrane
EnzymatiqueEnzymatique ChimiqueChimique MécaniqueMécanique
Isolation de l’ADN désiréIsolation de l’ADN désiré Sédimentation différentielleSédimentation différentielle ChromatographieChromatographie
Retirer les autres composantesRetirer les autres composantes EnzymatiqueEnzymatique Sédimentation différentielleSédimentation différentielle ChromatographieChromatographie
Isolation d’ADN Isolation d’ADN (suite)(suite)
Isolation d’ADN Isolation d’ADN Plasmidique par Lyse Plasmidique par Lyse Alcaline (Alcaline (E.coli E.coli ))
Solutions UtiliséesSolutions Utilisées
Sol. I – Tampon de suspensionSol. I – Tampon de suspension Tris HCl - Tampon, protège les acides Tris HCl - Tampon, protège les acides
nucléiques nucléiques EDTA - Chélates Mg++, empêche les EDTA - Chélates Mg++, empêche les
nucléases de fonctionner nucléases de fonctionner Sol. II – Solution de lyseSol. II – Solution de lyse
NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN ADN
SDS - dissous membranes, denture et lie SDS - dissous membranes, denture et lie protéines protéines
Solutions Utilisées Solutions Utilisées (suite)(suite)
Sol. III- Acétate de potassiumSol. III- Acétate de potassium Renaturation de l’ADNRenaturation de l’ADN Précipite SDSPrécipite SDS Précipite ADN génomique et protéinesPrécipite ADN génomique et protéines
Isopropanol / Éthanol Isopropanol / Éthanol Précipite acides nucléiques (plasmide Précipite acides nucléiques (plasmide
et ?) et ?) Sels demeurent solubles Sels demeurent solubles
TE-RNase - Tris & EDTA encore; TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase??RNase??
Quantification de l’DNAQuantification de l’DNA
Déterminer la Conc. d’DNADéterminer la Conc. d’DNA A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µLA260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL
Déterminer la quantité d’DNADéterminer la quantité d’DNA 1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg DNA1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg DNA 1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng DNA1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng DNA
Ne pas oublier de prendre en considération le Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTIONFACTEUR DE DILUTION
Enzymes de RestrictionEnzymes de Restriction
Clive les liens phosphodiester Clive les liens phosphodiester internesinternes
Reconnaissent des séquences Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiquesdoubles brins spécifiques
Différentes endonucléases Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquencesreconnaissent différentes séquences
Reconnaissent des séquences Reconnaissent des séquences palindromespalindromes
PalindromesPalindromes
La même séquence est lue dans la La même séquence est lue dans la direction 5’» 3’ sur les deux brinsdirection 5’» 3’ sur les deux brins
5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’
Les mêmes liens phosphodiesters Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins!sont clivés sur les deux brins!
5’-G
3’-C C T A G
G A T C C-3’
G-5’
Différentes Extrémités Différentes Extrémités sont Généréessont Générées
5’-G
3’-C C T
G A
A G
T C C-3’
G-5’Extrémités franches
Différentes Extrémités Différentes Extrémités sont Généréessont Générées
Extrémités 5’ protubérantes5’-G
3’-C C T A G
G A T C C-3’
G-5’
Différentes Extrémités Différentes Extrémités sont Généréessont Générées
Extrémités 3’ protubérantes3’-C
5’-G G A T C C-3’
C T A G G-5’
Compatibilité des Compatibilité des ExtrémitésExtrémités
OPO
P
Extrémités franches
HOPOH
P
Compatible
Compatibilité des Compatibilité des ExtrémitésExtrémités
Extrémités Protubérantes
HOPOH
P
HOPO
P
Incompatible
Compatibilité des Compatibilité des ExtrémitésExtrémités
Extrémités Protubérantes
HOPOH
P
HOPO
P
Incompatible
Compatibilité des Compatibilité des ExtrémitésExtrémités
Extrémités Protubérantes
P-CTAGHOGATC-P
OH
Compatible
P-CTAGOGATC-P
O
Appariement
Compatibilité des ExtrémitésCompatibilité des Extrémités
Extrémités protubérantes
P-TCCAHOGATC-P
OH
Incompatible
P-TCCAHO
GATC-POH
Appariement
Cartographie des Sites Cartographie des Sites de Restrictionsde Restrictions
L’ADN est-il digéré?L’ADN est-il digéré?
Doit comparer à un témoin non digéré
D1ND D2
La digestion est-elle La digestion est-elle complète?complète?
Doit comparer à un témoin non-digéré
Partiel
Complet
Digestion partielleDigestion partielle
Toutes les molécules cibles ne sont Toutes les molécules cibles ne sont pas coupées à toutes les sites pas coupées à toutes les sites possibles!possibles! Génère différents produits Génère différents produits
intermédiairesintermédiaires
1 2 3
1 Produit d’une digestion complète
Produit d’une digestion partielle (intermédiaire)1 + 2
Produit d’une digestion partielle (intermédiaire)
2 + 3
Digestion partielleDigestion partielle
Complète Vs PartielleComplète Vs Partielle
Une digestion complète donne une Une digestion complète donne une stoechiométrie de 1:1:1…stoechiométrie de 1:1:1… Le nombre de molécules de chacun Le nombre de molécules de chacun
des différents fragments est le même!des différents fragments est le même!
La stoechiométrie d’une digestion La stoechiométrie d’une digestion partielle est variable:partielle est variable: Ex. 1:3:2…Ex. 1:3:2…
Ex.Ex.1 2 3
Combien de molécules de chacun des fragments seraient générées suite à une digestion complète?
3; donc une stœchiométrie de 3:3:3 =1:1:13; donc une stœchiométrie de 3:3:3 =1:1:1
Combien de molécules de chacun des fragments seraient générées suite à une digestion partielle?
Évaluer la Stœchiométrie Évaluer la Stœchiométrie sur Gel d’Agarosesur Gel d’Agarose
PrincipePrincipe La quantité de bromure d’éthidium qui lie La quantité de bromure d’éthidium qui lie
l’ADN est proportionnelle à la taille de l’ADNl’ADN est proportionnelle à la taille de l’ADN La quantité de bromure d’éthidium qui lie La quantité de bromure d’éthidium qui lie
l’ADN est proportionnelle à la quantité d’ADNl’ADN est proportionnelle à la quantité d’ADN Dans le cas d’une digestion complète, la quantité Dans le cas d’une digestion complète, la quantité
de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est seulement de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est seulement proportionnelle à la taille de l’ADNproportionnelle à la taille de l’ADN
Pourquoi?Pourquoi?
Ex.Ex.
Stœchiométrie pas respectée
Stœchiométrie respectée
Stœchiométrie pas respectée
Stœchiométrie respectée
ExemplesExemples
ExemplesExemples
11ièreière étape: étape: Déterminer le nombre de Déterminer le nombre de coupurescoupures
Est-ce que l’ADN a été digéré? Est-ce que l’ADN a été digéré? Non- Aucune cartographie requiseNon- Aucune cartographie requise OuiOui
La digestion est-elle complète?La digestion est-elle complète? La digestion est-elle partielle?La digestion est-elle partielle?
Quels produits sont des intermédiairesQuels produits sont des intermédiaires
Combien de fois l’ADN a-t-il coupéCombien de fois l’ADN a-t-il coupé Les coupures sont dans le vecteurLes coupures sont dans le vecteur
Aucune cartographie requiseAucune cartographie requiseLes coupures sont dans l’insertionLes coupures sont dans l’insertion
Cartographie requiseCartographie requise
Combien de Sites de Combien de Sites de Restriction est-ce qu’il y a?Restriction est-ce qu’il y a?
ADN linéaire (ex. Chromosome ADN linéaire (ex. Chromosome humain)humain) Le nombre de coupures est égal au Le nombre de coupures est égal au
nombre de fragments moins unnombre de fragments moins un
ADN circulaire (ex. Plasmide)ADN circulaire (ex. Plasmide) Le nombre de coupures est égal au Le nombre de coupures est égal au
nombre de fragmentsnombre de fragments
Les coupures sont-elles Les coupures sont-elles dans l’insertion ou le dans l’insertion ou le vecteur?vecteur?
B coupe 2 fois dans le vecteur et 0 fois dans l’insertion E coupe 1 fois dans le vecteur et 1 fois dans l’insertionP coupe 1 fois dans le vecteur et 2 fois dans l’insertion
insertB BE ?
S
Taille du vecteur2.5kpb
P
22ee Étape: Quelles sont les Étape: Quelles sont les positions des sites de positions des sites de restrictions? restrictions?
Cartographie relative est faiteCartographie relative est faite Les sites de restriction sont Les sites de restriction sont
cartographiés en relation en un point cartographiés en relation en un point de référencede référence
La position du point de référence doit La position du point de référence doit être connueêtre connue
Dois Déterminer la Taille de Dois Déterminer la Taille de l’Insertion l’Insertion
1. Déterminer la taille des fragments issus d’une digestion complète2. Déterminer la taille totale du plasmide (Somme des tailles)3. Déterminer la taille de l’insertion (Taille du plasmide - Taille du vecteur)
insertB BE ?
S
Taille du vecteur2.5kpb
P
Déterminer les TaillesDéterminer les Tailles
Enz Distance (cm)Tailles
pb
P0.60.92.1
30001100900
E0.31.9
45001000
Donc : Taille du plasmide 5KpbTaille de l’insertion 5000pb – 2500pb = 2500pb
Cartographie du Site PCartographie du Site P
Insertion (2.5kpb)P
1.1kbpouP
1.1kbpP
Impossible puisque le second site doit être dans l’insert!
Insertion (2.5kpb)P
0.9kbpouP
0.9kbpP
Impossible puisque le second site doit être dans l’insert!
Cartographie du Site P Cartographie du Site P (Suite)(Suite)
Insertion (2.5kpb)P
1.1kbpP
0.9kbpP
Insert (2.5kpb)P
0.9kbpP
1.1kbpP
Ou
Déterminer l’OrientationDéterminer l’Orientation
Insertion (2.5kpb)P1.0kbpE E
Déterminer l’OrientationDéterminer l’Orientation
Insertion (2.5kpb)P
1.1kbpP
0.9kbpP
Insert (2.5kpb)P
0.9kbpP
1.1kbpP
Or
1.0kbpE E
1.0kbpE E
Déterminer l’OrientationDéterminer l’Orientation