Biologie du système de signalisation cellulaire induitpar l’hormone folliculo-stimulante (FSH).

UMR 6175 INRA/CNRS/Université de Tours/Haras Nationaux,Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Nouzilly.

Responsable Eric Reiter.

INRIA Rocquencourt.

Projet Contraintes, Responsable François Fages.

Projet SOSSO2, Responsable Frédérique Clément.

UMR 6204 CNRS/Université de Nantes.

Responsable Véhary Sakanyan.

D’après http://www.imr-marseille.com/consultation_endocrinologique.htm#

Rôle physiologique de la FSH.

FSH

FSH

granulosa

Cellules de Sertoli

Versatilité des effets exercés par la FSH sur les cellules somatiques des gonades.

folliculeprimaire

folliculeà antrum

folliculepré-ovulatoire

folliculeprimordial

ATRESIE OVULATION

antrum

granulosa

ovocyte

proliférationdifférentiation

apoptose

prolifération différentiation

Vie foetale

birth

puberté

peritubular cells

spermatogoniaspermatocytesspermatidsspermatozoa

lumen

Sertoli cellsBasement

membrane

Mâle

Femelle

SPERMATOGENESE

De multiples voies de signalisation sont activées par la FSH via un RCPG.

ERK

p38

p70S6K

AMPc PKA/

PI3-K

HIF-1CREBNF1USF C/EBPNF-B Sp1facteurs detranscription

kinases

SF1

Akt

S6

Mâle

Femelle Gs

FSH

De multiples voies de signalisation sont activées par la FSH via un RCPG.

ERK

p38

p70S6K

AMPc PKA/

PI3-K

HIF-1CREBNF1USF C/EBPNF-B Sp1facteurs detranscription

kinases

SF1

Akt

S6

Mâle

Femelle Gs

FSH

AMPc

Réponses cellulaires

Gs

-arrestin

GRKP

PPP

Désensibilisation

R-FSH

Mécanisme de désensibilisation.

pERKp70S6K

Gs/AMPc

-arrestin

GRKP

PPP

R-FSH

Réponses cellulaires

DésensibilisationGRK2

pERKp70S6K

SignalisationGRK5/6

Signalisation dépendante des -arrestines.

Gs/AMPc SignalisationGRK5/6

pERKp70S6K

-arrestin

GRKP

PPP

R-FSH

Réponses cellulaires

DésensibilisationGRK2

Signalisation dépendante des -arrestines.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

20

40

60

80

100

120

Time (min)

Gs/PKA pERK

pERKp70S6K

Gs/AMPc SignalisationGRK5/6

pERKp70S6K

pERKp70S6K

-arrestin

GRKP

PPP

R-FSH

Réponses cellulaires

DésensibilisationGRK2

Signalisation dépendante des -arrestines.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

20

40

60

80

100

120

Time (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

20

40

60

80

100

120

Time (min)

Gs/PKA pERK -arrestines pERK

Gs/AMPc SignalisationGRK5/6

pERKp70S6K

pERKp70S6K

-arrestin

GRKP

PPP

R-FSH

Réponses cellulaires

DésensibilisationGRK2

Signalisation dépendante des -arrestines.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

20

40

60

80

100

120

Time (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

20

40

60

80

100

120

Time (min)

Gs/PKA pERK -arrestines pERK

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

20

40

60

80

100

120

Time (Min)

Gs/PKA pERK

-arrestines pERK+

Objectif scientifique: mieux conceptualiser le réseau de signalisation induit par la FSH

Prolifération/Différenciation

Gs/PKA-arr ? ?

p70S6K

Erk? ? ?

Transduction

Cascades de signalisation

« Cross-talks »

Facteurs de transcription

Expression du génome

R-FSH

Rétro-contrôles

Comparaison mâle/femelleImpact sur la gamétogenèse

Codage spatio-temporel

« Check-points? »

Mise en place d’un réseau pluridisciplinaire.

2 équipes de biologistes: Mécanisme d’Action des Gonadotropines (MAG), UMR6175, Nouzilly.

Follicule Ovocyte et Développement, UMR6175, Nouzilly.

1 équipe de protéomique: Véhary Sakanyan, UMR6204 CNRS, Nantes.

2 équipes de modélisation: François Fages, projet Contraintes, INRIA Rocquencourt.

Frédérique Clément, projet SOSSO2, INRIA Rocquencourt.

ASC INRA(2 X 3ans)

Connaissances

Expériences

MesuresModèle

Mécanisme intracellulaires :interface Biocham

Intégration dans un modèlemulti-échelles de l’ovulation

Cinétiques de stimulation FSHinhibitions ciblées (agents pharmaco, siRNA)

Phosphorylation (puces à anticorps)AMPc,…

prolifération, marqueurs de différenciation,...

Modèles cellulaires : HEK293 R-FSH, cellules de Sertoli, granulosa primaires à différents stades

Projet AgroBI 2006-2008:

Outils disponibles: puces à anticorpsmesures des niveaux de phosphorylation à haut débit.

AktAkt1Akt2Akt3ATMBadBaxBcl-2EGFRERBb2ERK1ERK2FAKGSK-3aGSK-3bJNK ½MEK 1MEK 2NFkB p65P38a/SAPKP70S6KPI3K p85aPKB Kinase/PDK1Raf/c-RafSTAT 3

Actin-Tubulin-Tubulin-GAPDH

Rb1 S608Akt S473Akt T308ATM S1981Bad S112EGFR Y1173ERBb2 Y1248ERK1/2 T202/Y204FAK Y397GSK-3a S21GSK-3b S9JNK ½ T183/Y185MEK ½ S218/222NFkB p65 S536P38a/SAPK

T180/Y182PDK1 S241PKA STPTEN S380Raf S259Raf S338STAT 3 Y705

normalisation

Anti-protéines totales Anti-phospho-protéines

Plusieurs méthodes de révélation sont en phase d’évaluation et de mise au point. Objectif: 100 à 200 protéines différentes.

2 types de puces:

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

0 100 200 300 400 500

Time (Seconds)

cAM

P (

ICU

E2

C/Y

nR

atio

)

100 ng/mL

10 ng/mL

1 ng/mL

FSH

CFP

YFP

434 nm

528 nm

FRET

EPAC 1 AMPc

PDE

CFPYFP

434 nm528 nm

FRET

AMPc

Outils disponibles: senseurs fluorescents. Cinétiques de signalisation l’echelle d’une cellule.

Paramètres mesurables:

AMPcPKAPKCDAGPI3K,...

Transfection/micro-injection

calcium

Outils disponibles: “knock-down” cellulaires par siRNA

Transfection transitoire (HEK293)

Lentivirus

Micro-injectionCellules primaires