Analyse bio-instrumentale

A. Garnier

GCH-2103

A-2010

Mise en contexte

Problème réel: Quantifier la production en adénovirus recombinant, produit par culture de HEK-293S

– Dynamique de la production– Méthodes standards longues, fastidieuses et peu précises.– Méthode indirecte, 1ère génération: suivre la protéine

d’intérêt (ici la PTP1C)– Méthode de 2ème génération: suivre l’expression d’un gène

rapporteur (ici la « green fluorescent protein », GFP) suite à une infection secondaire, puis mesure au (fluorescence assisted cell sorter » (FACS: directe ou indirecte?

Titration virale: Méthode de plage de lyse

FACS

Fluorescence

Généralisation

L’utilisation de gènes rapporteurs (reporter genes) est très fréquente:– GFP, lac Z (le gène de la -galactosidase, gène

de la luciférase)

Distinction importante entre méthode directe et indirecte– Appliquer au cas de la mesure de la

concentration en micro-organismes

Méthodes directes pour la biomasse

Masse sèche (filtration) Dénombrement:

– Hemacymètre– Coulter– FACS

Avantages et inconvénients Autres méthodes directes: utilisation de

colorants, CFU, dilutions limites…

Quelle est la précision des méthodes basées sur le dénombrement

Rappel de la loi de Poisson:– x: nb d’évènements quelconques observés dans un

espace dimensionnel quelconque– n: espérance de x – espace dimensionnel peut être le temps, une longueur,

une surface, un volume, etc

Alors:

!

)exp(),Pr(

x

nnnx

x

Exemple classique: le standard téléphonique

Un standard reçoit en moyenne 60 appels/h. quelle est la probabilité qu’il reçoive 0, 1, 2, 3, etc appels durant la prochaine minute?

n = 1 appel/minute x = 0, 1, 2, 3, etc P(0,1) = exp(-1)*10 / 0! = 0,368 P(1,1) = exp(-1)*11 / 1! = 0,368 P(2,1) = exp(-1)*12 / 2! = 0,184 P(3,1) = exp(-1)*13 / 3! = 0,06 …..

Pr(x,1) vs x, pour n=1

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 1 2 3 4

x (appels/min)

P(x

,1)

Pr(x,100) vs x

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100

102

104

106

108

110

112

114

116

118

120

x (-)

P(x

,100

) +/- 10%

Écart-type de la loi de Poisson

É.-t. ()= n1/2

Estimation de l’é.-t. (s) = x1/2

Estimation de l’é.-t. relatif: s/x = x-1/2

Indication pour le dénombrement:– Limite inférieure: 100-200 évènements– Limite supérieure: « comptabilité »!

Autre application de la loi de Poisson: dilutions limites

Ex: concentration d’un échantillon en micro-organismes =107 cellules/mL

7 éprouvettes contenant chacune 9 mL de milieu de culture stérile, inoculées, laissées à incuber

1 mL d’échantillon

1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10

?

1/10

9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 ml

Milieux initialement stériles

On peut calculer la probabilité que P(x>0,n)

!

)exp(),Pr(

x

nnnx

x )exp(1),0Pr(1),0Pr( nnxnx

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

n (-)

Pr(

x>0,

n)

Dilutions limites répétées (ex préc.)

1 mL d’échantillon

1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10

1 mL d’échantillon

1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10

1/101/10 1/10 1/10 1/101 mL d’échantillon

1/10 1/10 1/10

1/101/10 1/10 1/10 1/101 mL d’échantillon

1/10 1/10 1/10

1/101/10 1/10 1/10 1/101 mL d’échantillon

1/10 1/10 1/10

P(x>0,n)=3/5

n≈1

X = 107 !!!

Méthodes indirectes de détermination de la concentration en micro-organismes

Densité optique:– Turbidité: 545 nm– L’absorption lumineuse

peut également servir à déterminer la concentration en:

– Protéines: 214nm (lien peptidique), 280nm (aromatiques: Tyr, Trp, Phe)

– ADN: 260 nm

Fluorescence…

Autres mesures du déroulement d’un procédé de bioproduction

Nutriments: sucres, ac. aminés, vitamines, O2

Constituants cellulaires: ADN, protéines, ARN (gene chip)

Sous-produits métaboliques: acides organiques, alcools, ammoniaque, CO2

Produit d’intérêt Autres: pH, T, vitesse d’agitation, viscosité,

mousse, marqueurs cellulaires, etc

Composition cellulaire

Variation de la composition cellulaire

Méthodes

Sondes: pH, OD, pCO2, T Tests enzymatiques, exemples:

– Glucose par hexokinase(hk) (mesure de la fluorescence du NADH exc. 320-370, ém 420-460) :

Glucose + ATP hk G6P + ADPG6P + NAD glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) 6-PG +NADH

– G6PDH par G6P

G6P + NADP G6PDH 6-PG + NADPH

Méthodes (suite)

Immuno-affinité: Anticorps-antigène

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

La Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

Animation tirée du site du Réseau Lyonnais d'Ingénierie Éducative (RELIE), École Normale Supérieure de Lyon (cliquez sur le lien).

PCR en temps réel (real time)

Expression génétique

Biopuces

(cliquez sur une des images pour l’animation)

Séparation + détection

Électrophorèse (SDS-PAGE)

Western: EP + anticorps spécifiques à protéines

Southern: EP + ADN marqué

Northern: EP + ARN marqué

Tiré de Segura, Garnier et al (2007). Figure 2. Fractionation of purified retroviral vector preparations by 1D Gel ElectrophoresisPurified virus preparations with (a) and without (b) subtilisin treatment were fractionated on a 4-12% Tris-Glycine polyacrylamide gel (Invitrogen) run under reducing conditions and visualized by silver staining. Protein bands from gel b were excised and subjected to in-gel tryptic digestion prior to MS/MS analysis. Bands containing statistically significant peptide identifications (A-L) are indicated on gel b. Figure 2c shows the protein profiles of samples a (green) and b (blue) superimposed. The theoretical migration positions of all MoMLV viral-encoded proteins are indicated in figure c.

Électrophorèse SDS-PAGE

Gel d’électrophorèse 2-D

(Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)

2-DE des protéines soluble de levures

Séparation + détection = chromatographieEx: High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Réservoir dePhase mobile Pompe

Échantillon

Colonne

Échantilloneur

Détecteur

Collecteur de fraction

•Échange d’ions•Tamis moléculaire•Interaction hydrophobe•Phase inverse•Électrophorèse

•En fonctionde la colonne•Gradient

•UV/visible•Fluorescence•Infra-rouge•Indice de réfraction•Conductivité•Spectrométrie de masse

•Automatique•Réfrigéré

Exemple de HPLC (Agilent 1100)

Hydrolysat trypsique de la BSA

Chromatographie

Chromatographie (suite)

Chromatographie (suite)

Temps de rétention: identification; surface sous le pic: quantification tM: temps d’élution de la phase mobile tR: temps de rétention tR’: temps de rétention réduit = tR-tM k: facteur de fixation = tR’/tM : écart-type d’un pic gaussien : largeur du pic à mi-hauteur = 2,354 : largeur du pic à la base = 4 /tR: écart-type relatif N: efficacité de la colonne = (tR/)2 = 5,545 (tR/)2 = 16 (tR/)2

N: nb de plateau théorique H: hauteur de plateau théorique = L/N, où L: longueur de la colonne

Exemple: 2 colonnes de 25 cm, 1 et 2– tR1 = 416,4 - tR2 = 481,2 1= 10,2s - 2= 13,2sCalculez N1, N2, h1, h2 identifiez la colonne la plus efficace

Chromatographie (suite)

Pour 2 pics:– : facteur de sélectivité = tRB’/tRA’ = kB/kA, où B est le pic le plus à

droite– Pour phase stationnaire, phase mobile et T données, =constante– Résolution (RS)= t/

Exemple, 3 pics A, B et C:tM =83,4 stR(A)= 195 stR(B)= 415,4stR(C)= 481,2 sCalculez B/A et C/B

Chromatographie (suite)

B

BS k

kNR

1

1

4

222 1

116

B

BS k

kRN

322

2

16 1( )

1

où u = vitesse de la phase mobile

S BR

B

R H kt B

u k

Calcul de Résolution (RS):

Spectroscopie de masse – arc magnétique

Spectrométrie de Masse - Quadrupole

m/z 10-4000 Précision :~m/z 0.1-0.2 Vitesse de balayage: 5000

m/z par sec Le temps de vie d’un ion de sa

formation a sa détection ~40-100 μs.

www.bris.ac.uk

Spectrométrie de Masse - Temps d’Envol (TOF)

L’incorporation d’un réflectron dans le tube du TOF ou une extraction ionique délayée (Cornish et Cotter, 1994;

Cotter et al., 2004) TOF est communément

employé avec MALDI, il peut aussi être utilisé avec un ESI (Boyle et Whitehouse, 1992)

www.chemistry.adelaide.edu.au

Spectroscopie de masse 3 (GCMS)

Spectroscopie de masse 1

Spectroscopie de masse 4 (LCMS)

Tout est dans l'interface LC-MS

L'electro-atomisation (electro-spray ionisation, ESI)

Exemple d'analyse MS

Albumine

Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L), souvent utilisé en milieu de culture de cellules de mammifères

Exemple d'analyse MS

Albumine

Informations obtenues sur Expasy

>P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus (Bovine). MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA

Number of amino acids: 594 Molecular weight: 68026.9 Theoretical pI: 5.77

Michaud et al (2008)

Spectrométrie de Masse – analyse de protéines par MSMS

(Yates, 1998; Westermeier et Naven, 2002; Graves, 2002)

MS spectrum

MS/MS ion spectrum

m/z

m/z

Dissociation nomenclature fragment proposée par Roepstorff, 1984

position mass peptide sequence position mass peptide sequence

25-28 500,2463 DTHK 300-309 1177,5591 ECCDKPLLEK

29-34 712,3736 SEIAHR 310-318 1015,4877 SHCIAEVEK

37-44 974,4577 DLGEEHFK 319-336 1955,9596 DAIPENLPPLTADFAEDK

45-65 2435,2427 GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK 341-346 752,3573 NYQEAK

66-75 1163,6306 LVNELTEFAK 347-359 1567,7427 DAFLGSFLYEYSR

76-88 1349,546 TCVADESHAGCEK 361-371 1283,7106 HPEYAVSVLLR

89-100 1362,6722 SLHTLFGDELCK 375-386 1388,5708 EYEATLEECCAK

101-105 545,3405 VASLR 387-399 1497,6314 DDPHACYSTVFDK

106-117 1364,4803 ETYGDMADCCEK 402-412 1305,7161 HLVDEPQNLIK

118-122 658,3155 QEPER 413-420 1011,42 QNCDQFEK

123-130 977,4509 NECFLSHK 421-433 1479,7954 LGEYGFQNALIVR

131-138 886,4152 DDSPDLPK 438-451 1511,8427 VPQVSTPTLVEVSR

139-151 1519,7461 LKPDPNTLCDEFK 460-468 1052,4499 CCTKPESER

157-160 537,282 FWGK 469-482 1667,8131 MPCTEDYLSLILNR

161-167 927,4934 YLYEIAR 483-489 841,46 LCVLHEK

169-183 1888,9268 HPYFYAPELLYYANK 490-495 660,3563 TPVSEK

184-197 1633,6621 YNGVFQECCQAEDK 499-507 1024,455 CCTESLVNR

198-204 701,4014 GACLLPK 508-523 1823,8996 RPCFSALTPDETYVPK

205-209 649,3338 IETMR 524-528 609,2878 AFDEK

212-218 703,4097 VLASSAR 529-544 1850,8993 LFTFHADICTLPDTEK

223-228 649,3338 CASIQK 549-557 1014,6193 QTALVELLK

229-232 508,2514 FGER 558-561 509,3194 HKPK

236-241 689,3729 AWSVAR 562-568 818,4254 ATEEQLK

249-256 922,488 AEFVEVTK 569-580 1399,6926 TVMENFVAFVDK

257-263 789,4716 LVTDLTK 581-587 725,2593 CCAADDK

267-280 1578,5981 ECCHGDLLECADDR 588-597 1050,4924 EACFAVEGPK

281-285 517,298 ADLAK 598-607 1002,583 LVVSTQTALA

286-297 1386,6206 YICDNQDTISSK      

Albumine: fragments trypsiques

Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique

ANALYSE MS2, cliquez ici

Identification de protéine, cliquez ici(Logiciel Mascot, Matrix Science)

Protéomique du sérum sanguin

Tirumalai et al., 2003

•60 à 80 g/L de protéine (Tirumalai et al., 2003) •10 000 protéines différentes •22 protéines = 99% de la quantité protéinique du sérum (Zhang et al., 2005)•12 log de variation de concentration (Anderson et Anderson, 2002; Zhang et al., 2005)

Ex: protéomique du sérum sanguin

Anderson et Anderson, 2002

Microscopie de cellules vivantes

Imagerie hyper-spectrale