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Option : Bio Ingnierie et Nanotechnologies
Mtier : Ingnieur Business Development
Tuteur ECL : Virginie Monnier
Tuteur Entreprise : Jean-Sbastien Thomann
cole Centrale de Lyon
TFE 2014
Centre de Recherche Public Gabriel Lippmann
Belvaux, Luxembourg
Rapport Final de Travail de Fin dtudes
Fabrication of hybrid organic-inorganic nanoparticles for
encapsulation and stability studies
ARTAUD Clment
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RemerciementsJe remercie chaleureusement mon tuteur Jean-Sbastien Thomann, chef de file au sein dUGN de
la thmatique Nano4Med dans laquelle sinscrit ce projet, pour son management clair et toute
la pdagogie dont il a su faire preuve au long du stage.
Je remercie de mme Galle Corne, tudiante en thse sous la direction de Jean-SbastienThomann, pour tout le temps et laide prcieuse quelle a pu maccorder, sans qui les dbuts du
projet auraient t beaucoup plus fastidieux.
Merci galement au directeur dquipe, Damien Lenoble, pour son coute et sa comprhension.
Un grand merci lensemble de lquipe UGN et leurs doctorants pour leurs conseils et leur
disponibilit tout au long de ce stage. Je les remercie galement pour leur accueil chaleureux mon
gard et les bons moments de dtente partags autour dun caf.
Je remercie enfin ma fiance qui ma suivi et soutenu sans faillir pendant ces 6 mois.
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RsumCe rapport dtaille les avances de 6 mois de travail de recherche sur la synthse et la
fonctionnalisation de nanoparticules doxyde de fer ferromagntique et biocompatibles afin de
vectoriser le traitement spcifique du glioblastome multiforme. Ce travail se prsente sous deux
objectifs : crer un vecteur superparamagntique de plus de 5nm pour le marquage spcifique duglioblastome et sa rvlation sous IRM, et explorer un procd de fabrication de vecteurs poreux et
ferromagntiques de moins de 100nm pour lencapsulation de principes actifs anticancreux.
Des nanoparticules de magntite superparamagntiques hydrophobes de 9nm ont ainsi t
fabriques avec succs en utilisant un procd de coprcipitation bien dtaill dans la littrature.
Ces particules ont t fonctionnalises pour les rendre hydrophiles et biocompatibles en greffant
des PEGs leur surface. Ces PEG ont leur tour t utiliss comme site de liaison pour coupler un
anticorps de marquage du glioblastome, le Cetuximab. Des conclusions ont t tires quant la
qualit de ce couplage et loptimisation quil peut en tre faite pour amliorer le produit.
Les vecteurs msoporeux de maghmite ont t synthtiss suivant un mme protocole, issu de
la synthse de silice msoporeuse dcrite dans la littrature, en tudiant linfluence de la ractivit
du prcurseur, du temps, et des conditions de traitement des particules sur leur structure poreuse.
Les mcanismes ractionnels ont t partiellement tablis, ainsi que le procd permettant
datteindre la structure la plus poreuse.
Les produits de synthse ont tous t analyss en utilisant la microscopie lectronique en
transmission et balayage, la diffraction des rayons X et la diffusion dynamique de la lumire.
Mots cls : Nanomdecine, Glioblastome Multiforme, Anticorps, Cetuximab, Nanoparticule,
Magntite, Maghmite, Oxyde de fer, Superparamagntisme, Ferromagntisme, Msopores, PEG
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AbstractThis report presents the results of a 6 months work of research about the diagnosis and therapy
of multiform gliomas by the mean of functionalized ferromagnetic iron oxide nanoparticles. Two
aspects where analyzed: the proper synthesis of a superparamagnetic nanoparticle for the targeting
and observation of gliomas tumor under MRI, and the study of the fabrication of a porousnanoparticle for use in drug delivery.
The superparamagnetic particles were synthetized with success, and were made of magnetite
with a size of 9nm. Their functionalization went through the addition of PEG on the surface, to
provide biocompatibility. The targeting functions were added by the grafting of a specific antibody
for gliomas, the Cetuximab. Some conclusions and perspectives of optimization are discussed.
The synthesis of mesoporous maghemite nanoparticles was achieved on the basis of the
knowledge about the mesoporous silica synthsis. Time, Reactivity of the precursor and post
treatment were analyzed as the main parameters involved, and the mechanism of reaction was
partially explained. A process to achieve a good porosity was then set.
Particles were analyzed using the classical transmission electron microscopy, scanning electron
microscopy, X-ray diffraction and dynamic light scattering.
Keywords: Nanomedicine, Multiform glioma, Antibody, Cetuximab, Nanoparticle, Magnetite,
Maghemite, Iron oxide, Superparamagnetism, Ferromagnetism, Mesopores, PEG
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GlossaireAPTES : (3-Aminopropyl)triethoxysilane
BET : Thorie Brunauer, Emmett et Teller
CTACl : Cetyltrimethylammonium chlorideDLS : Diffusion lastique de la lumire
DRX : Diffraction des rayons X
IRM : Imagerie par rsonnance magntique
MEB : Microscopie lectronique balayage
MET : Microscopie lectronique en transmission
PEG : Polythylne glycol
TEA : Trithanolamine
TEOS : Orthosilicate de ttrathyle
TOPO : Trioctylphosphine oxide
UGN : Unit du Gnie des Nanomatriaux
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Table des matiresREMERCIEMENTS ....................................................................................................................................... 3
RESUME ..................................................................................................................................................... 4
ABSTRACT .................................................................................................................................................. 5GLOSSAIRE ................................................................................................................................................. 6
TABLE DES MATIERES ................................................................................................................................. 7
TABLE DES ILLUSTRATIONS ......................................................................................................................... 8
INTRODUCTION ........................................................................................................................................ 11
1. UN PROJET DE RECHERCHE ACTIF : LE TRAITEMENT DU GLIOBLASTOME .............................................. 13
1.1.UGNET SES PARTENAIRES .......................................................................................................................... 13
1.2.LA MALADIE ET LES MECANISMES DACTIONS .................................................................................................. 13
1.3.AXES DE DEVELOPPEMENT DU PROJET ........................................................................................................... 14
1.4.CAHIER DES CHARGES DU PROJET .................................................................................................................. 15
2. ETAT DE LART DES DISPOSITIFS NANOPARTICULAIRES DOXYDE DE FER .............................................. 17
2.1.SYNTHESE DE NANOCRISTAUX ...................................................................................................................... 17
2.1.1. Coprcipitation ....................................................................................................................... 17
2.1.2. Synthse haute temprature ............................................................................................... 18
2.1.3. Synthses haut rendement .................................................................................................. 19
2.2.FONCTIONNALISATION DES PARTICULES ......................................................................................................... 20
2.2.1. Traitement de surface ............................................................................................................ 20
2.2.2. Structuration pour lencapsulation de mdicaments ............................................................. 23
2.3.CONCLUSION ........................................................................................................................................... 26
3. PRODUCTION DES AGENTS DE CONTRASTE .......................................................................................... 27
3.1.SYNTHESE PAR COPRECIPITATION.................................................................................................................. 27
3.2.FONCTIONNALISATION PAR LAPTES ............................................................................................................ 283.3.INTRODUCTION DES PEG ............................................................................................................................ 30
3.4.GREFFAGE DU CETUXIMAB .......................................................................................................................... 31
3.5.CONCLUSION ........................................................................................................................................... 32
4. PRODUCTION DE PARTICULES POREUSES DOXYDE DE FER................................................................... 33
4.1.ADAPTATION DES PROCEDES DE SYNTHESE ..................................................................................................... 33
4.2.RESULTATS GENERAUX ............................................................................................................................... 36
4.3.INFLUENCE DE LA REACTIVITE ET DU TEMPS ..................................................................................................... 37
4.4.MECANISME REACTIONNEL REEL PROPOSE ..................................................................................................... 40
4.5.INCORPORATION DE SILICE .......................................................................................................................... 41
4.6.LA CALCINATION POUR ACCROITRE LES PROPRIETES MAGNETIQUES ...................................................................... 43
4.7.CONCLUSION ........................................................................................................................................... 45
CONCLUSION ............................................................................................................................................ 47
BIBLIOGRAPHIE ........................................................................................................................................ 48
ANNEXE : MAGNETISME DANS LES OXYDES DE FER .................................................................................. 50
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Table des illustrationsFIGURE 1:EVOLUTION DU NOMBRE DE PUBLICATIONS CONTENANT LE MOT-CLE :"NANOMEDICINE"(DONNEES SCOPUS) ............ 11
FIGURE 2:STRUCTURE DE LA BARRIERE HEMATOENCEPHALIQUE ......................................................................................... 14
FIGURE 3:IMAGE METDE NANOPARTICULES DE MAGNETITE COPRECIPITEES (EXTRAIT DE8).ON REMARQUE LA DISPARITE DE FORME
ET DE TAILLE DES PARTICULES ............................................................................................................................... 18
FIGURE 4:IMAGE METDE PARTICULES ISSUES DE LA DECOMPOSITION THERMIQUE (EXTRAIT DE 11) .......................................... 19
FIGURE 5:POLYETHYLENE GLYCOL ............................................................................................................................... 20
FIGURE 6:MECANISME DE SEQUESTRATION DES NANOPARTICULES.A:SANS PEG,LA PARTICULE EST CAPTEE PAR LES MACROPHAGES
ET ELIMINEE.B:AVEC UNE COUCHE DE PEG LA PARTICULE A MOINS D'AFFINITE AVEC LES OPSONINES,ET EST DONC MOINS
SUSCEPTIBLE D'ETRE ELIMINEE (EXTRAIT DE13
) ........................................................................................................ 21
FIGURE 7:REACTION D'HYDROLYSE ET DE CONDENSATION DU SILANE FONCTIONNEL.RDESIGNE LE GROUPE FONCTIONNEL (EXTRAIT DE11
) ................................................................................................................................................................. 21
FIGURE 8:STRUCTURE D'UN ANTICORPS ET GROUPES FONCTIONNELS ACCESSIBLES,ESSENTIELLEMENT AMINES ET CARBOHYDRATES.FC
DESIGNE LE FRAGMENT CONSTANT,SITE PREFERENTIEL DE MODIFICATION DE LANTICORPS............................................... 22
FIGURE 9:(A)PROCESSUS DE FABRICATION DE LA NANOPARTICULE SUR LE MOULE EN POLYSTYRENE .(B)NANOPARTICULE CREUSE
APRES CALCINATION (EXTRAIT DE14
) ..................................................................................................................... 23FIGURE 10:MECANISME DE RESTRUCTURATION DE LA PARTICULE PAR L'EFFET KIRKENDALL (EXTRAIT DE
15) .............. ............... ... 24
FIGURE 11:IMAGE METDES NANOPARTICULES CREUSEES APRES RECUIT.LA BARRE D'ECHELLE REPRESENTE 10NM..................... 24
FIGURE 12 : MECANISME DE FORMATION D'UNE STRUCTURE MESOPOREUSE DE MAGNETITE SUR LES MICELLES DE POLYMERE
AMPHIPHILE (EXTRAIT DE17
) ................................................................................................................................ 25
FIGURE 13 : IMAGE MET DES NANOPARTICULES MESOPOREUSES. LA STRUCTURE DES JOINTS DE GRAINS EST PARTICULIEREMENT
VISIBLE,SIGNE DUNE IMPORTANTE POROSITE (EXTRAIT DE18
) .................................................................................... 25
FIGURE 14:NANOPARTICULES DE SILICE MESOPOREUSE.LE CONTRASTE DU AUX PORES EST BIEN VISIBLE DANS LES PARTICULES...... 26
FIGURE 15:IMAGE METDES NANOPARTICULES SYNTHETISEES PAR COPRECIPITATION.LE GRAPHE MONTRE LA DISPERSION DE TAILLES
DES PARTICULES,CALCULEE A PARTIR DES IMAGES MET ............................................................................................ 27
FIGURE 16:SPECTRE DRXDES PARTICULES.LES PICS INDEXES CORRESPONDENT A DES PLANS CRISTALLINS DE LA MAGNETITE, SAUF
MENTION SPECIFIQUE POUR LE PIC 104CORRESPONDANT A L'HEMATITE.LE SPECTRE EST LISSE POUR PLUS DE LISIBILITE........ 28
FIGURE 17:L'APTES................................................................................................................................................. 28
FIGURE 18 : SPECTRE DLS DES PARTICULES COUVERTES D'APTES. LE MILIEU EST LEGEREMENT ACIDIFIE, ET DES EPANCHEMENTS
DAGREGATION SONT VISIBLES A 70NM ET 120NM.LE RAYON HYDRODYNAMIQUE MOYEN EST DE 56NM +/-30NM............ 29
FIGURE 19:SPECTRE DLSDES NANOPARTICULES PEGYLEES .............................................................................................. 30
FIGURE 20:LE SULFO-SMCC ..................................................................................................................................... 31
FIGURE 21 : (A) PROFIL D'ELUTION DES ANTICORPS SUVI PAR SPECTROMETRIE DE FLUORESCENCE (RHODAMINE, EXCITATION A
540NM,EMISSION A 590NM).(B)PHOTO DES COLONNES CHARGEES EN RHODAMINE RESIDUELLE................................... 31
FIGURE 22:ETHOXYDE DE FER ..................................................................................................................................... 33
FIGURE 23:FERRATRANE ........................................................................................................................................... 33
FIGURE 24 :DIAGRAMME DE STABILITE DES HYDROXYDES DE FER SELON LE PH.AU PH12, LE FER EST PRESENT SOUS UNE FORME
ANIONIQUE (EXTRAIT DE 23)................................................................................................................................. 33
FIGURE 25 : PARTICULES DANS L'EAU APRES DIALYSE. UNE FLOCULATION TYPIQUE DE L'OXYHYDROXYDE DE FER EST CLAIREMENTOBSERVEE ........................................................................................................................................................ 36
FIGURE 26:IMAGE MEBDE PARTICULES ENGLUEES DANS LE SURFACTANT RESIDUEL.ELLES SONT INUTILISABLES EN L'ETAT............ 36
FIGURE 27 : IMAGES MET DES PRODUITS SYNTHETISEES SELON LES DIFFERENTES METHODES DINJECTION DU PRECURSEUR, DANS
LORDRE CROISSANT DE REACTIVITE.LES IMAGES DU BAS SONT DES MAGNIFICATIONS DES PREMIERES IMAGES. .................... 37
FIGURE 28:IMAGES METDES PRODUITS DE SYNTHESE DE L'INJECTION SOLIDE APRES 2H OU 16H DE REACTION.LES IMAGES DU BAS
CARACTERISENT L'ETAT DES NOYAUX CRISTALLINS ISOLES,PLUS PETITS APRES UN TEMPS DE REACTION PLUS LONG............... .. 39
FIGURE 29:IMAGE METDUNE PARTICULE D'OXYDE DE FER RECOUVERTE DE SILICE ............................................................... 41
FIGURE 30:IMAGE METDE NOYAUX DOXYDE DE FER ENROBES DE SILICE ............................................................................ 42
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FIGURE 31 : IMAGE MET DE L'INTERFACE SILICE-OXYDE DE FER. LES INTERFERENCES DU RESEAU CRISTALLIN SE DISTINGUENT
PARTICULIEREMENT BIEN .................................................................................................................................... 42
FIGURE 32: IMAGE MEBDE PARTICULES CALCINEES A 500C.LES PARTICULES ONT FONDU ET SE SONT COLLEES SOUS L 'EFFET DU
RECUIT ............................................................................................................................................................ 43
FIGURE 33 : SPECTRE DRX DES PARTICULES CALCINEES, METTANT EN EVIDENCE UNE PHASE MAGHEMITE (NOTEE M) ET HEMATITE
(NOTEE H) ....................................................................................................................................................... 44
FIGURE 34:NANOCRISTAUX RESIDUELS APRES CALCINATION DANS L'ETHYLENE GLYCOL A 200C .............................................. 44FIGURE 35:STRUCTURE CRISTALLINE D'UN SPINELLE ........................................................................................................ 50
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IntroductionLe glioblastome multiforme est la forme la plus frquente et agressive de tumeurs malignes du
cerveau chez lhomme. Ces tumeurs sont extrmement invasives et ressurgissent au mieux quelques
mois aprs traitement. Il reprsente ainsi la principale cause de dcs par cancer chez les personnes
de moins de 35 ans. 1
Lapparition dun tel cancer est spontane, et peut tre associe lvolution vers un grade pluslev dune tumeur bnigne du cerveau. La difficult de dtection du glioblastome, par son
caractre multiforme et son origine sporadique, impliquent rapidement la mise en cause du
pronostic vital du patient.
Les tumeurs infiltrent rapidement et facilement les tissus sains, et les traitements classiques que
sont la chirurgie, la radiothrapie et la chimiothrapie ne suffisent pas les liminer. Par ailleurs la
nature mme de lorgane touch, le cerveau, laisse peu de flexibilit aux mdecins : il faut prserver
un maximum de tissus sains et viter les effets secondaires, au risque de ne pas liminer totalement
la tumeur. De ce fait les rsurgences aprs quelques mois sont invitables, et les traitements ne
prolongent la dure de vie dun patient que de 7 mois en moyenne. 2
Les dernires avances en matire de nanotechnologies laissent ainsi entrevoir de nouvelles
perspectives : couples une comprhension toujours plus prcise des mcanismes biologiques, ces
nouvelles technologies font dj lobjet de recherches et ouvrent la voie vers une nouvelle
mdecine, fonde sur le traitement extrmement slectif et efficace des pathologies. Cet essor se
traduit notamment par lintrt croissant que portent les chercheurs aux possibilits mdicales
offertes par les nanotechnologies (voir Figure 1).
Figure 1 : Evolution du nombre de publications contenant le mot-cl : "nanomedicine" (donnes SCOPUS)
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Parmi ces dispositifs le plus simple envisager dans une utilisation mdicale est la nanoparticule.
De taille comparable un virus, elle est facile injecter dans lorganisme et ne ncessite pas
dintervention chirurgicale invasive. Par ailleurs le choix des matriaux et leurs structures
permettent de nombreuses applications. On dnombre ainsi lutilisation en tant quagent de
contraste en imagerie mdicale, la vectorisation de mdicaments vers les tumeurs, ou encore le
traitement par hyperthermie localise. Ces effets recherchs sont grandement favoriss par des
phnomnes passifs daccumulation dans les tumeurs, quil est possible daccentuer en
fonctionnalisant la surface des particules. Elles deviennent alors des vecteurs capables de cibler avec
une grande spcificit un type de cellules tumorales donn, accroissant ainsi lefficacit des
diagnostics et des traitements. 3
Lobjectif du travail expos ici est ainsi de produire une nanoparticule superparamagntique
capable dtre utilise comme agent de contraste rvlateur du glioblastome en IRM. Cette particule
est synthtise et fonctionnalise selon des mthodes connues.
Une seconde dmarche de recherche est mene en parallle afin de dvelopper un procd de
fabrication et de structuration dun tout nouveau type de vecteur poreux et magntique pour
encapsuler des principes actifs et les dlivrer aux cellules tumorales.
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1.Un projet de recherche actif : le traitement duglioblastome
1.1.UGN et ses partenairesLe projet est un projet de recherche men au sein de lquipe UGN (Unit du Gnie des
Nanomatriaux) du Centre de Recherche Public Gabriel Lippmann, au Luxembourg. Cette quipe fait
force dexprience dans la conception de nanomatriaux fonctionnels, et constitue ainsi un
important atout pour le dveloppement de nouveaux processus de fabrications. De plus
lenvironnement restreint du projet est centr sur les thmatiques de la nanomdecine, et apporte
tout le savoir ncessaire pour la bonne comprhension des contraintes et des enjeux de la
production des nanoparticules. Ce projet sinscrit ainsi dans la progression logique de lquipe sur
ces thmatiques.
Le laboratoire met disposition les outils danalyse standards pour un tel projet, savoir un
microscope lectronique transmission (MET), un microscope lectronique balayage (MEB), un
appareil de diffraction des rayons X (DRX), un appareil de mesure de diffusion dynamique de la
lumire (DLS) ainsi que tout le matriel ncessaire la synthse des particules.
1.2.La maladie et les mcanismes dactionsLe glioblastome multiforme est une tumeur particulirement invasive qui a la particularit de
ncroser les tissus infiltrs. Les dommages causs sont irrversibles et se traduisent
symptomatiquement par des pertes de mmoire et de motricit. Malheureusement ces symptmes
apparaissent trs tardivement et il est souvent trop tard pour traiter correctement la tumeur.
En plus dtre situ dans un organe difficilement oprable, le glioblastome bnficie de la
protection de la barrire hmatoencphalique, rendant peu efficaces la plupart des traitements.
Cette barrire constitue lendothlium le plus slectif de lorganisme. Elle est compose dun
empilement de cellules lies de manire compacte. La Figure 2 montre lorganisation cellulaire de la
barrire hmatoencphalique.
Les cellules endothliales constituent la premire ligne de contrle de cette barrire. Les
jonctions serres qui les lient ne permettent le passage que de petits lments de moins de 5nm 4.
Tout autre lment destin traverser lendothlium doit le faire au travers des cellules par des
mcanismes dendocytose et dexocytose biologiquement ou chimiquement promus. Les pricytes
lis lendothlium renforcent ltanchit de la barrire tout en jouant un rle de rgulateur du
flux sanguin par leur contraction. Enfin les astrocytes sont les gardiens du bien tre des neurones, en
assurant leur soutien mcanique et le transfert des nutriments et des influx nergtiques. Leur rle
dans la cicatrisation du cerveau par neurognse en font galement la source des astrocytomes,
tumeurs bnigne du cerveau et potentiellement volutives vers un glioblastome multiforme.
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Figure 2 : Structure de la barrire hmatoencphalique
Le principal levier utilisable par la nanomdecine est la possibilit de crer des objets capables detraverser cette barrire hmatoencphalique. La taille de lobjet est un paramtre important, mais
concevoir des particules de moins 5nm capables de traverser passivement la barrire rendrait
caduque les problmatiques de ciblage actif. En effet si les particules sont capables de traverser la
barrire la plus slective, elles vont pouvoir se disperser dans lensemble de lorganisme et
saccumuler dans des organes quil nest pas utile dobserver.
Des particules plus grosses prsentent donc un plus grand potentiel slectif. Afin de leur faire
traverser la barrire hmatoencphalique, il est ncessaire dutiliser le phnomne dendocytose
dans les cellules endothliales. Il est possible de promouvoir activement ce transfert en greffant la
surface des particules des cibles pour les intgrines (V3) surexprimes sur les parois des no
vaisseaux sanguins tumoraux
5
. Pour des particules bien stabilises par leur traitement de surface,lendocytose peut tre promue jusqu un diamtre de 100nm.
1.3.Axes de dveloppement du projetLe vecteur cr devra prsenter un caractre extrmement slectif pour les cellules tumorales du
glioblastome, tout en ayant la possibilit de traverser la barrire hmatoencphalique. Cela implique
une taille des particules entre 5nm et 100nm. En outre les particules devront tre
superparamagntiques pour pouvoir apparaitre sur les images IRM dans les tumeurs. Lensemble de
ces proprits devront tre prsentes sous la contrainte dune parfaite biocompatibilit et non
toxicit de la particule.La seconde partie du projet sera attache dvelopper le processus de fabrication de
nanoparticules poreuses et superparamagntiques. Il sera ainsi possible de coupler la fonction de
vecteur de mdicaments la facilit dobservation dun agent de contraste magntique sous IRM.
Les particules produites devront tre caractrises afin de comprendre au mieux les mcanismes
ractionnels impliqus, et ainsi contrler les structures synthtises.
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Une contrainte est impose quant au choix des matriaux : les particules seront uniquement
composes doxyde de fer ferromagntique.
Ce type de matriau bon march est le plus biocompatible des matriaux ferromagntiques, et
est galement le plus utilis sous ses diffrentes formes. Sa prsence ltat naturel dans les
minraux et certains organismes (bactries magntotactiques 6 ) et sa facilit de synthse en
laboratoire en font un matriau de choix pour les applications recherches.
Par ailleurs il a t dmontr que la prsence de fer dans une nanoparticule facilite
biodgradation, rduisant ainsi la toxicit et le risque dagglomration des particules 7.
Plus de dtails quant ce choix et les principales proprits cristallines des oxydes de fer sont
disponibles en Annexe page 50.Error! Reference source not found.
1.4.Cahier des charges du projet
FonctionContraintes
Agent de contraste Particules poreuses
Saccumuler spcifiquement
dans les tumeurs 5nm < diamtre NA
Traverser la barrire
hmatoencphalique
diamtre < 100nm
Endocytose promue par les
rcepteurs surexprims
diamtre < 100nm
Prsenter une structure
adapte lutilisation
mdicale
Solide cristallin
superparamagntique
Solide poreux
superparamagntique
Etre biocompatible
Constitue doxyde de fer
Stabilise par un traitement de
surface
Constitue doxyde de fer
Exempte de rsidus organiques
de synthse
Tableau 1 : Cahier des charges du projet
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2.Etat de lart des dispositifs nanoparticulaires doxyde defer
2.1.Synthse de nanocristauxLa synthse de nanocristaux doxyde de fer superparamagntique se fonde sur des procds bien
connus. Selon la mthode employe il est possible de trouver un compromis entre la facilit et la
quantit de particules produites, tout en conservant une qualit adquat. Lintrt majeur tant
toujours dobtenir une dispersion de cristaux de moins de 20nm et le plus monodisperse possible.
2.1.1.Coprcipitation
Cette mthode est la plus simple et rapide mettre en uvre. Elle permet moindre cot avec
de simples ractifs en solution aqueuse de produire une grande quantit de particules
monocristallines de magntite. Seule la monodispersit des produits laisse dsirer, ce qui peut tre
en partie compens par lajout dun ligand comme lacide olique. 8
quation 1 : Raction de coprcipitation
La raction est simple (quation 1) : il sagit dune prcipitation de sels de fer trivalent et divalent
en solution aqueuse basique, en prsence dacide olique. Gnralement la solution est brutalement
basifie par lajout dammoniaque aprs dissolution des prcurseurs. Cette perturbation brutale du
pH, combine la complexation du fer par lacide olique, permet une tape de nuclation
extrmement rapide et contrle. Des noyaux sont produits en grand nombre, puis laisss croitre
en solution.
La rapidit de nuclation garanti la monodispersit des particules, tandis que ltape de
maturation permet une croissance uniforme des cristaux jusqu la taille souhaite. Si cette tapedure trop longtemps, le phnomne de murissement dOstwald soppose la croissance en
dissolvant et agglomrant les particules, donnant un produit plus grossier (voir Figure 3).
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Figure 3 : Image MET de nanoparticules de magntite coprcipites (extrait de8
). On remarque ladisparit de forme et de taille des particules
Le contrle plus prcis de la taille et de la forme des particules peut soprer en formant laide
de surfactants une mulsion deau dans lhuile. Si les prcurseurs ont pralablement t dissouts
dans leau, les gouttelettes de ce mlange serviront de nanoracteurs pour la prcipitation en milieu
restreint des particules. Les particules seront moins nombreuses, mais mieux dfinies. Le choix du
mlange ractionnel dpend alors pleinement du compromis entre quantit et qualit. 9
2.1.2.Synthse haute temprature
Une possibilit pour amliorer la forme et la monodispersit des particules est de travailler plushaute temprature. Il sagit ici non plus de mettre en contact deux sels en solution, mais de
dcomposer thermiquement un prcurseur organomtallique dans un solvant haut point
dbullition. Les prcurseurs couramment utiliss sont lolate de fer, lactylactonate de fer et les
alkoxydes de fer. Le pentacarbonyle de fer peut galement tre utilis, mais les particules
synthtises seront compose dun cur de fer pur entour dune coquille amorphe oxyde 10.
Un de ces prcurseurs est plac dans loctadcne 320C sous reflux pendant 30min pour initier
sa dcomposition. De lacide olique peut ventuellement tre rajout pour contrler la nuclation.
Ensuite la solution est refroidie lentement pour permettre sa maturation. 11
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Figure 4 : Image MET de particules issues de la dcomposition thermique (extrait de 11)
La temprature bien plus leve dun tel processus permet un contrle beaucoup plus fin de laforme et de la taille des particules de magntite (voir Figure 4). Cependant il est parfois compliqu
mettre en uvre, et les prcurseurs sont relativement chers.
2.1.3.Synthses haut rendement
Pour des applications industrielles il est ncessaire dutiliser des procds de synthse en
continu, assurant la meilleure reproductibilit du rsultat. Il sagit soit de pulvriser haute
temprature un spray de nanogouttelettes dun mlange de prcurseurs et solvants, soit de faire
ragir en phase gazeuse les prcurseurs grce une impulsion laser.
Dans les deux cas la raction est trs localise et produit des cristaux de magntite entre 2 et
60nm de diamtre dans un flux continu de prcurseur. La forme et la taille des particules sontdtermines par les conditions de chauffage des prcurseurs, et la taille des gouttelettes par voie
liquide.
De telles installations sont cependant peu videntes faire fonctionner et ne conviennent qu
un usage exclusivement industriel.
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2.2.Fonctionnalisation des particulesLes particules synthtises doivent subir certaines modifications, que ce soit pendant la synthse
ou suite celle-ci, afin dobtenir les proprits physico-chimiques voulues. Cette dmarche de
fonctionnalisation permet notamment dinduire la reconnaissance spcifique des cellules tumorales,
ou la possibilit dencapsuler des principes actifs.
2.2.1.Traitement de surface
La fonctionnalisation post-synthse consiste en une modification de la surface des particules. Elle
sobtient par lajout de ligands organiques qui vont se lier la particule et induire de nouvelles
proprits de surfaces, comme un caractre plus hydrophile.
2.2.1.1. Stabilisation
La stabilit des particules disperses en solution aqueuse est primordiale pour pouvoir les utiliser.
En effet celles-ci ne doivent en aucun cas sagrger dans lorganisme, ni tre squestres par le
systme immunitaire.
Naturellement loxyde de fer est hydrophile, en raison des groupements Fe-OH de surface, mais
cet tat peut varier suivant les ligands prsents sa surface.Les espces organiques composes damines ou de groupes carboxyles sont trs hydrophiles et
possdent diffrentes charges selon le pH de la solution. En liant la surface de la particule une de
ces espces, il est possible dinduire des charges de surface contrles pour des pH spcifiques, et
notamment pour le pH physiologique 7,4. Ces charges vont stabiliser les particules en solution en
crant des rpulsions lectrostatiques. 12
Dautres ligands organiques, les PEG, constituent une coquille
protectrice autour de la particule. Ces molcules sont des
polymres de longueur variable dthylne glycol, au proprits
biocompatibles reconnues
13
. En effet les PEGs sont despolymres peu ractifs mais capables de former une grande
quantit de liaisons hydrogne, en raison de la mobilit de la
chaine carbone et du nombre important doxygnes qui la
composent (Figure 5).
Les PEGs sont ainsi particulirement hydrophiles et forment un gel aqueux autour de la particule,
qui nexhibe ainsi pas plus daffinits pour lorganisme que ne peut en avoir leau.
Cela se traduit par une plus faible toxicit de la particule, et sa stabilit face lopsonisation et la
squestration est ainsi largement amliore (voir Figure 6).
Figure 5 : Polythylne Glycol
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Figure 6 : Mcanisme de squestration des nanoparticules. A : Sans PEG, la particule est capte par les
macrophages et limine. B : Avec une couche de PEG la particule a moins d'affinit avec les opsonines, et
est donc moins susceptible d'tre limine (extrait de13
)
La conformation des PEG la surface de la particule dpend de la densit de greffage par rapport
la longueur du PEG. Si la densit est trop faible ou le PEG trop long, il se repliera dans une forme en
champignon et ne remplira pas correctement son rle. A linverse une densit importante
produira une conformation en brosse , visible sur la Figure 6.
Ces groupements peuvent tre lis la surface des oxydes de fer principalement par silanisation.
La molcule organique dintrt est termine par un silane, qui va shydrolyser et ragir avec les
groupements Fe-OH de surface de la particule, formant ainsi une coquille de silice fonctionnalise
par des groupements organiques (voir Figure 7). Cette raction est le plus souvent ralise dans le
tolune, qui permet de trs bons rendements et un contrle strict de la quantit deau disponible
pour lhydrolyse. Il est ainsi possible de former une monocouche uniforme et fonctionnelle lasurface des particules 11.
Figure 7 : Raction d'hydrolyse et de condensation du silane fonctionnel. R dsigne le groupe fonctionnel
(extrait de11
)
Selon la disponibilit des ractifs, cet change peut tre ralis en deux pates. La premireconsiste recouvrir la particule dAPTES, un silane amin. Puis il est possible dy greffer avec un
excellent rendement une chaine organique dintrt termine par un ester activ. Ce processus
permet de saffranchir de la synthse prliminaire dun silane fonctionnel, puisquil est construit in
situ la surface de la particule.
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2.2.1.2. Couplage spcifique aux cellules tumorales
Au-del dune simple stabilisation, le choix des ligands de surface permet de spcifier la cible de
la particule. Pour ce faire, des anticorps IgG dirigs contre les cellules du glioblastome sont greffs
sa surface. Ils sont classiquement fonctionnaliss par une chaine organique bifonctionnelle 9.
Le choix de ce liant intermdiaire est motiv par la prsence de nombreux groupes fonctionnels
sur lanticorps (Figure 8). Parmi ces sites de liaison comptent les groupements thiols accessibles parrduction des ponts disulfures, les groupements carbohydrates prsents sur le fragment constant, et
les amines primaires exposes sur lensemble de lanticorps, incluant le site actif. Un couplage mal
maitris risquerait alors de modifier la structure de son site actif et lanticorps perdrait son utilit.
Cest pourquoi il est ncessaire de limiter le nombre dinteractions avec lanticorps lors du
couplage. Un moyen efficace dy parvenir est de faire ragir au pralable lanticorps avec une trs
petite quantit du liant intermdiaire. Un nombre contrl de molcules se fixent ainsi sur
lanticorps, maximisant les chances de conserver le site actif intact. Le liant sera ensuite la seule
espce ractive pour le couplage de la particule.
Cette tape se fait en laissant ragir le second groupe fonctionnel du liant avec llment
correspondant sur la particule. Il est possible dutiliser tous les couples de la chimie organique, en
vitant cependant les ractifs qui risqueraient de lier les anticorps entre eux.
Figure 8 : Structure d'un anticorps et groupes fonctionnels accessibles, essentiellement amines et
carbohydrates. Fc dsigne le fragment constant, site prfrentiel de modification de lanticorps
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2.2.2.Structuration pour lencapsulation de mdicaments
Lorsque lapplication ncessite lincorporation dun principe actif dans la particule, il est
ncessaire de travailler la structure du matriau ds la synthse. La formation de pores ou dun
creux au centre de la particule permet entre autre de protger le principe actif lors de son transport,
et de contrler sa cintique de relargage.
Ces mthodes de synthses impliquent une adaptation du procd classique de coprcipitation,ou une nouvelle approche par des prcurseurs organomtalliques condenss par sol-gel.
2.2.2.1. Utilisation dun moule nanostructur
La manire la plus intuitive de structurer un matriau est de le synthtiser la surface dun
moule. La mthode de moulage la cire perdue est applicable ici en utilisant une nanoparticule
organique ayant une affinit pour le prcurseur. Par exemple il est possible de faire prcipiter du
FeCl2 la surface de nanoparticules de polystyrne pralablement couvertes de groupes carboxyles14.
Une fois le moule recouvert, il est limin par une forte calcination des particules 500C. Il ne
reste alors que la couche doxyde de fer cristalline qui forme une coquille creuse.
(A) (B)
Figure 9 : (A) Processus de fabrication de la nanoparticule sur le moule en polystyrne. (B) Nanoparticule
creuse aprs calcination (extrait de14
)
Ce procd cre ainsi des nanoparticules creuses denviron 200nm de diamtre. Des cristaux plus
petits de magntite forment la coquille et permettent dobtenir une porosit inhrente aux
imperfections des joins de grain (Figure 9).
La structure obtenue est parfaite pour le relargage de mdicaments, mais la particule trop grande
pour pouvoir traverser la barrire hmatoencphalique. Ce procd nest donc pas applicable au
traitement du glioblastome.
2.2.2.2. Murissement structurel sous recuit
Un recuit au-del de 500C des particules induit un rarrangement rapide des cristaux qui la
composent. Il est possible de guider ce rarrangement en sappuyant sur leffet Kirkendall,
impliquant dans une particule la diffusion prfrentielle des espces vers la surface externe 15.
Lide est de construire une particule de fer pure de 10nm de diamtre par dcomposition
thermique du pentacarbonyle de fer. Cette particule va ensuite soxyder en surface pour former une
coquille amorphe de Fe3O4.
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Lors du recuit en prsence doxygne, le fer situ au cur de la particule va prfrentiellement
migrer vers lextrieur et ragir avec loxygne dans la couche doxyde qui recristallise, figeant ainsi
linterface cur/coquille. Il en rsulte une croissance de la couche externe de magntite et une
diminution de la densit du cur de fer (voir Figure 10). Un vide est cr au centre de la particule,
jusqu loxydation complte du cur mtallique.
Figure 10 : Mcanisme de restructuration de la particule par l'effet Kirkendall (extrait de 15)
De petites particules creuses de magntite de 15nm de diamtre sont synthtises par ce
procd (voir Figure 11). Nanmoins la trs petite taille des particules ne permet pas une grande
porosit et donc une encapsulation efficace du principe actif 16, elles ne sont donc pas applicables
aux thmatiques de traitement in vivo traites ici.
Figure 11 : Image MET des nanoparticules creuses aprs recuit. La barre d'chelle reprsente 10nm
2.2.2.3. Synthses hydrothermales guides
Il est possible de modifier directement la manire dont le solvant va interagir avec les
prcurseurs pour structurer les particules. Lutilisation de surfactants dans la solution va permettre
de former des micelles qui vont catalyser la prcipitation des prcurseurs. Le choix du surfactant
dpend de laffinit recherche pour le prcurseur.
Les proportions du mlange ainsi que la temprature doivent tre contrles afin de placer le
mlange dans un quilibre micellaire, et prvenir la formation de lamelles condenses de surfactant.
Au cours de la raction les micelles servent de site de nuclation et se couvrent de noyaux
doxyde. Cette modification de leur tat de surface va induire leur coalescence et des agrgats vontse former, crant une msostructure fortement poreuse. Une calcination permet finalement
dliminer les surfactants et de figer la structure (voir Figure 12) 17.
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Figure 12 : Mcanisme de formation d'une structure msoporeuse de magnetite sur les micelles de
polymre amphiphile (extrait de 17)
Figure 13 : Image MET des nanoparticules msoporeuses. La structure des joints de grains est
particulirement visible, signe dune importante porosit (extrait de18
)
Cette synthse produit des particules non pas creuses mais uniquement poreuses, grce au
rseau complexe de jointures ouvertes entre les grains (Figure 13). Cette porosit est importante sur
des grandes particules, mais il est difficile de maitriser le processus pour crer des particules plus
petites ayant la mme structure, ce qui ne rpond pas au cahier des charges impos.
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Il faut cependant noter que les synthses hydrothermales appliques
la fabrication de nanoparticules de silice poreuses permettent
datteindre des tailles entre 30 et 100nm. Le mcanisme est identique,
mais lutilisation dun surfactant ionique, le CTACl, et dun prcurseur
organosilici, le TEOS, permettent un recouvrement homogne des
micelles par de la silice. Lagrgation des micelles ne donne plus alors
une structure en grain, mais un assemblage compact de sphres creuses.
Lquilibre qui sen suit permet louverture des sphres et la formation
dun rseau de canaux entremls. La structure en trous de vers est
de nature amorphe, mais offre la porosit la plus importante parmi
les structures envisageables (Figure 14).
2.3.ConclusionDans le respect du cahier des charges impos, les nanoparticules utilises comme agent de
contraste seront produites suivant le protocole classique et simple de coprcipitation.
Elles seront fonctionnalises en trois tapes :
Un premier recouvrement par une couche homogne dAPTES, en accord avec lalittrature;
Une greffe de PEG par lintermdiaire dun ester activ afin de stabiliser et passiver la
surface de la particule. Le recouvrement de la surface devra tre le plus important
possible pour assurer une conformation en brosse des PEG. La moiti des PEG utiliss
prsenteront un thiol terminal afin de pouvoir y lier un anticorps ;
Le couplage un anticorps, le Cetuximab, trs largement utilis dans le traitement ducancer. Cet anticorps ragira pralablement avec un ligand par lintermdiaire dune
amine et dun ester activ. Le ligand prsentera un groupe maleimide qui sera enfin
coupl aux thiols des particules.
La conception de particules poreuses sera dveloppe partir des avances les plus
prometteuses sur la silice msoporeuse. La dmarche consistera adapter au mieux les protocoles
pour la synthse de loxyde de fer partir dun prcurseur organomtallique, et permettra de
satisfaire au cahier des charges.
Figure 14 : Nanoparticules de silice
msoporeuse. Le contraste d aux pores
est bien visible dans les particules
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3.Production des agents de contraste
3.1.Synthse par coprcipitationLe protocole de synthse des nanocristaux de magntite est exploit tel quil a t dcrit dans la
littrature 8:
4.8g de FeCl3,6H2O et 1.96g de FeCl2,4H2O sont mlangs dans 20ml deau dionise, puis le
mlange est port 80C sous forte agitation et atmosphre protectrice.
10ml dammoniaque sont ensuite rapidement ajouts. La solution devient immdiatement noire
et, aprs 30min 80C, 849l dacide olique sont ajouts. La solution est conserve sous agitation
80C pendant encore 1h30.
Les particules formes (environ 2g) sont disperses dans leau dionise puis prcipites par un
aimant. Cette procdure de lavage est rpte 3 fois au minimum, jusqu la neutralit de la
solution. Aprs un lavage supplmentaire dans lthanol et prcipitation, les particules sont
redisperses dans 20ml dheptane pour former la solution stock (100mg/ml).
La forme et la taille des particules sont analyses grce des images MET. La structure cristalline
est observe par DRX.
Figure 15 : Image MET des nanoparticules synthtises par coprcipitation. Le graphe montre ladispersion de tailles des particules, calcule partir des images MET
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Figure 16 : Spectre DRX des particules. Les pics indexs correspondent des plans cristallins de la
magntite, sauf mention spcifique pour le pic 104 correspondant l'hmatite. Le spectre est liss pour plus
de lisibilit
Les particules sont synthtises en prsence dacide olique, qui recouvre leur surface lissue de
la synthse. Cela confre aux particules un caractre hydrophobe marqu. La dispersion danslheptane permet dviter lagrgation des particules dans la solution stock, et les protge
efficacement des risques doxydation.
Daprs les analyses MET les particules ne sont pas bien sphriques mais sont relativement bien
monodisperses avec une taille de 9nm +/- 6nm (Figure 15). Ces rsultats sont ceux attendus, et se
conforment au cahier des charges.
Elles sont bien composes essentiellement de magntite, comme visible sur le spectre DRX
(Figure 16), avec une part de phase hmatite non ferromagntique. La prsence dhmatite est
impute loxydation partielle des particules lors de leur mise lair pour lanalyse DRX.
3.2.
Fonctionnalisation par lAPTESAfin de rendre les particules hydrophiles, il est ncessaire de
remplacer lacide olique de surface. LAPTES (Figure 17) est utilis car
lamine primaire, de pKa 9, va tre protone et induire des rpulsions
lectrostatiques entre particules ph 7,4. Les amines vont galement
servir de base lincorporation des PEG.Figure 17 : l'APTES
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Lchange de ligand est fait en suivant un protocole dcrit dans la littrature 19et schmatis la
Figure 7 :
100mg de particules magntiques dans lheptane sont disperses dans 50ml de tolune sous
agitation. A cette solution sont ajouts 2.5ml de triethylamine, 500l dAPTES et enfin 50l deau
dionise. Le mlange est agit sous atmosphre protectrice temprature ambiante pendant 24h.
Les particules sont prcipites par lajout de 50ml dheptane et lutilisation dun aimant. Elles
sont ensuite laves par dispersion dans lactone puis prcipitation par laimant. Aprs 3 lavages, les
particules sont disperses dans 20ml dthanol, pour obtenir une solution stock de 5mg/ml.
Suite la coprcipitation, lacide olique est li la surface de la particule par des liaisons ferro-
esters semi-covalentes. LAPTES, introduit en large excs par rapport la quantit de particules,
dplace ces liaisons pour remplacer lacide olique la surface de la particule.
Le stockage des particules dans lthanol a pour but dviter la prsence deau indsirable pour
les prochaines tapes de fonctionnalisation.
Suite la raction les particules se dispersent trs bien dans des milieux neutres ou lgrementacides, et prcipitent dans les solutions au-del de pH 8,5. Sachant le pKa des amines primaires, ce
rsultat est cohrent avec la prsence ou non de charges positives la surface des particules.
Par ailleurs lintroduction de lAPTES ne modifie en rien la monodispersit des particules, comme
il est possible de lobserver sur les spectres DLS (Figure 18). Toutefois une faible agrgation est mise
en vidence par les panchements du spectre 70nm et 120nm, indiquant un recouvrement non
uniforme, voire incomplet, de la surface, ce qui perturbe les rpulsions lectrostatiques.
Nanmoins le rayon hydrodynamique de 56nm, largement suprieur au diamtre rel des
particules, indique leur bonne solvatation suite cette fonctionnalisation.
Figure 18 : Spectre DLS des particules couvertes d'APTES. Le milieu est lgrement acidifi, et des
panchements dagrgation sont visibles 70nm et 120nm. Le rayon hydrodynamique moyen est de 56nm
+/- 30nm
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3.3.Introduction des PEGLes PEGs choisis pour recouvrir la particule ont une longueur de 40 50 monomres, soit un
poids molculaire moyen de 2500 Da. Ce choix a t fait en accord avec la littrature pour viter
lopsonisation des particules. Chacun des PEGs prsente un groupement NHS (ester activ) pour tre
li aux amines de surface. Les groupements terminaux choisis sont un metyl, absolument inerte,
pour le PEG de protection, et un SSPyr, quivalent un thiol, pour le PEG dancrage de lanticorps.
Le couplage est fait en absence deau avec un fort excs de PEG, suivant le protocole ci-dessous :
25mg de particules enrobes dAPTES sont dcantes par un aimant puis redisperses dans 8ml
de DMF sous agitation. 500l de DIEA sont ajouts, et la solution est laisse incuber pendant
10min. Puis 12.5mg de NHS-PEG-Metyl, 12.5mg de NHS-PEG-SSPyr et 5mg de PyBOP dissouts dans
2ml de DMF sont ajouts. La solution est laisse sous agitation pendant toute une nuit.
Les particules sont collectes par un aimant puis laves dans leau dionise. Cette procdure est
rpte 3 fois. Enfin les particules sont disperses dans 5ml deau, pour obtenir une solution stock
de 5mg/ml.
La DIEA est une amine ternaire qui va permettre de dprotoner les amines de surface des
particules. Son caractre encombr prvient son couplage avec les ester activs par attaque
nuclophile. Le PyBOP est un activateur dacide carboxylique, qui va contrer lhydrolyse des esters
activs par leau rsiduelle.
Les particules PEGyles sont stables dans leau pour une gamme de pH allant de 6 10, des
concentrations infrieures 0.2mg/ml, ce qui est sensiblement plus petit que dans la littrature 12.
Des mesures DLS sur ces particules permettent dobserver la modification de leur rayon
hydrodynamique (Figure 19). Celui-ci a en moyenne augment pour atteindre 83nm +/- 76nm. Les
PEG ont donc bien t greffs la surface de la particule et forment une couche hydrate plusimportante.
Nanmoins la forte dispersion observe implique une conformation mixte entre brosse et
champignon, diffrente de la conformation recherche. Le couplage des PEG na donc pas le
rendement espr, et perd ainsi en efficacit. Cela peut tre d leur longueur, qui provoque des
gnes striques lors de la raction de couplage.
Figure 19 : Spectre DLS des nanoparticules PEGyles
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3.4.Greffage du CetuximabLe greffage du Cetuximab sur la particule est ltape la plus dlicate puisque lanticorps est fragile
et peut tre rapidement dnatur.
Il faut dans un premier temps prparer lanticorps en le nettoyant, car il est indispensable de
saffranchir de tout produit secondaire, telle que la glycine qui maintien les anticorps en suspensionet dont la prsence rduirait considrablement le rendement de couplage de lanticorps. En effet la
glycine est un acide amin, et elle pourrait aisment ragir au lieu de lanticorps, et ainsi prendre sa
place sur la particule.
Le nettoyage seffectue en purifiant par dialyse la solution de Cetuximab 5mg/ml dans du
tampon borate pH 8,5 pendant 24h.
Ce pH est choisi car proche du pKa des amines de lanticorps, sur lesquelles le liant va tre fix. En
protonant une partie des amines, les chances que la raction se produise sur une amine du site actif
sont encore rduites.
Dans le mme temps 2.5mg de particules PEGyles sont traites sous agitation pendant 2h avec
5mg de DTT. Cette tape rduit les ponts disulfures pour activer les thiols de surface. Le DTT est
limin par 3 dialyses successives pour une dure totale de 24h dans le PBS 1x.
Les particules sont stockes en solution sous argon pour viter loxydation des thiols par
loxygne dissout.
Le liant utilis est le Sulfo-SMCC (Figure 20). Il est soluble dans leau et
prsente un groupement ester activ et un groupement maleimide,
faisant un parfait lien entre les amines de lanticorps et les thiols des
particules.
Pour faire ragir le liant sur lanticorps, 100l dune solution de Sulfo-SMCC (4.5mg/ml dans lePBS 1x) sont ajouts 10mg de Cetuximab dans du tampon borate. Le mlange est agit pendant
30min, avant dajouter 23l dune solution de rhodamine isothiocyanate (3mg/ml dans le PBS 1x).
Aprs 1h les anticorps sont spars en utilisant une colonne de dessalage PD10.
(A) (B)
Figure 21 : (A) Profil d'lution des anticorps suvi par spectromtrie de fluorescence (Rhodamine,
excitation 540nm, emission 590nm). (B) Photo des colonnes charges en rhodamine rsiduelle
Figure 20 : Le Sulfo-SMCC
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La sparation des anticorps est rapide et efficace, comme le montre la Figure 21. La rhodamine
permet de suivre la progression des anticorps par spectromtrie de fluorescence.
Enfin le couplage des 5mg danticorps fonctionnels est ralis en y ajoutant 2.5mg de particules
actives. La solution est agite pendant 2h, puis un excs de fluoresceine maleimide est ajout pour
inhiber la raction. Cela permettra galement dobserver le nombre de thiols libres inhibs aprs la
raction.
Les particules sont purifies par un lavage dans le PBS 1x, et dcantes par un aimant. Ces tapes
sont rptes 4 fois, avant de disperser les particules dans 5ml de PBS 1x, formant une solution
stock denviron 0.5mg/ml.
Le couplage des anticorps est attest par un suivi de la rhodamine par spectromtrie de
fluorescence sur la solution stock.
Le rsultat nest pas satisfaisant : moins de 1% de rendement de couplage est atteint. Cependant
il savre que les particules sagrgent dans la solution stock, caractristique dune agglomration
protique.
Les anticorps utiliss sont de taille comparable aux noyaux magntiques synthtiss. La fixation
dun anticorps la surface de la particule perturbe grandement sa stabilit et provoque sont
agrgation avec dautres anticorps et particules. Le rendement de raction sen trouve donc
fortement rduit.
Par ailleurs la disponibilit des thiols nest certainement pas optimale puisque la conformation
des PEGs la surface de la particule est influence par la prsence de lanticorps. Les thiols non
accessibles ne peuvent ainsi pas participer la raction de couplage.
Afin de prvenir ces problmes dagrgation, le milieu ractionnel peut tre dilu et le temps de
raction raccourci. Les anticorps auraient ainsi moins de chances de former des agrgats protiques.
De plus le choix de PEGs plus courts favoriserait leur conformation en brosse et les thiols terminaux
seraient mieux exposs pour le couplage.
3.5.ConclusionLes particules superparamagntiques de magntite ont t correctement synthtises et
caractrises par des mthodes bien tablies. Leur fonctionnalisation a t ralise tape par tape
en conservant une cohrence par rapport au cahier des charges retenu. Les particules ont t
rendues hydrophiles et biocompatibles par lajout dune couche de PEG.Nanmoins le couplage final dun anticorps sur ces particules na pas dmontr son efficacit.
Des ajustements du procd peuvent cependant tre appliqus pour amliorer le rendement de la
raction.
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4.Production de particules poreuses doxyde de fer
4.1.Adaptation des procds de synthseAu vu des rsultats obtenus dans la littrature, le processus de dveloppement dune
nanoparticule poreuse doxyde de fer se fonde sur les acquis obtenus dans les travaux concernant la
silice msoporeuse 20. La principale hypothse de travail sera de considrer que le prcurseur de ferragit de manire analogue au prcurseur de silice.
Le prcurseur utilis est donc comparable au TEOS, prcurseur de
la silice. Il sagit de lthoxyde de fer, un prcurseur organomtallique
trivalent (Figure 22) et extrmement ractif avec leau, pour former
loxyhydroxyde de fer Fe(OH)3.
Lobjectif est justement de contrler cette hydrolyse en vue dobtenir idalement une porosit en
trous de vers .
Le milieu ractionnel est un mlange aqueux de CTACl et de TEA, deux surfactants, en prsence
dthanol, le tout port 60C. Les conditions appliques permettent au CTACl de former des
micelles cationiques denviron 3nm de diamtre.
Le TEA joue un rle de base pour la prcipitation des espces, ainsi
quun rle dagent chlateur du fer, en formant un complexe ferratrane
(Figure 23). Ce complexe ralenti fortement la cintique dhydrolyse du
fer, mais ncessite de fortes tempratures pour apparaitre de manire
significative. 21,22
Sous le pH impos par le TEA (environ pH 12), le fer se prsente en solution sous forme Fe(OH)4-,
comme le montre la Figure 24, laspect anionique permettant en thorie une bonne prcipitation
la surface des micelles cationiques 23.
La condensation des micelles permet ensuite dobtenir la structure poreuse recherche. Cettestructure se caractrise par une grande surface spcifique au sein dune matrice de matriau
amorphe. Cela implique des tapes de traitement supplmentaire des particules pour recristalliser le
matriau et obtenir de bonnes proprits magntiques.
Figure 24 : Diagramme de stabilit des hydroxydes de fer selon le pH. Au pH 12, le fer est prsent sous
une forme anionique (extrait de23
)
Figure 22 : Ethoxyde de fer
Figure 23 : Ferratrane
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Trois voies de synthse ont alors t explores, correspondant chacune, daprs la littrature,
un degr de ractivit du prcurseur, afin de comparer les mcanismes rels ceux connus pour la
silice. Linfluence du temps de raction a galement t tudie. Enfin certains chantillons ont t
combins au prcurseur de la silice msoporeuse, afin dvaluer la possibilit de crer des structures
hybrides poreuses.
Les protocoles utiliss sont les suivants :
Une injection solide du prcurseur pur dans la solution de raction, impliquant la plusgrande ractivit :
Une solution de raction est prpare en mlangeant 64ml deau dionise, 10.4ml
dthanol, 10.4ml dune solution aqueuse de CTACl (25% massique) et 8.28ml de TEA. La
solution est agite 10min temprature ambiante en y faisant buller de largon, afin de
dgazer loxygne dissout.
A 20ml de la solution de raction porte 60C sont ajouts 1.242g de Fe(OEt)3.
Aprs dissolution complte du prcurseur, la solution incube sous forte agitation 60C
pendant 2 16h selon lchantillon recherch.
Les particules sont ensuite centrifuges (45000g, 20min) et le surnageant retir pourstopper la raction. Elles sont enfin stockes forte concentration dans lthanol en vue
de leur post-traitement.
Une injection liquide dans lthanol, limitant la ractivit du prcurseur dans les premierstemps de la raction :
Une solution de raction est prpare en mlangeant 64ml deau dionise, 10.4ml
dune solution aqueuse de CTACl (25% massique) et 8.28ml de TEA. La solution est agite
10min temprature ambiante en y faisant buller de largon, afin de dgazer loxygne
dissout.
Une solution de prcurseur est prpare en dissolvant 1.242g de Fe(OEt)3 dans
2.23ml dthanol. La solution est de couleur brune limpide.
A 20ml de la solution de raction porte 60C est ajoute la solution de
prcurseur. La raction se droule sous forte agitation 60C pendant 2h.
A la moiti de la solution ractionnelle sont ensuite ajouts 865l de TEOS, et la
raction se poursuit pendant 1h 60C. Lautre moiti est immdiatement nettoye.
Chaque produit est nettoy par centrifugation (45000g, 20min) et le surnageant
retir pour stopper la raction. Les particules sont enfin stockes forte concentration
dans lthanol en vue de leur post-traitement.
Une injection suite au traitement pralable du prcurseur avec le TEA, pour forcer la
formation du ferratrane, rduisant par l mme la ractivit du prcurseur :Une solution de raction est prpare en mlangeant 64ml deau dionise, 10.4ml
dthanol, 10.4ml dune solution aqueuse de CTACl (25% massique). La solution est agite
10min temprature ambiante en y faisant buller de largon, afin de dgazer loxygne
dissout.
Le prcurseur est prpar en mlangeant 1.242g de Fe(OEt)3 3.56ml de TEA. Ce
mlange est chauff lair 200C pendant 4h pour permettre la complexation du fer
avec le TEA. Le mlange devient solide, de couleur beige.
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A 20ml de la solution de raction ports 60C est ajout le mlange Fer-TEA. Aprs
dissolution complte du prcurseur, la solution incube sous forte agitation 60C
pendant 2h.
A la moiti de la solution ractionnelle sont ensuite ajouts 865l de TEOS, et la
raction se poursuit pendant 1h 60C. Lautre moiti est immdiatement nettoye.
Chaque produit est nettoy par centrifugation (45000g, 20min) et le surnageant
retir pour stopper la raction. Les particules sont enfin stockes forte concentration
dans lthanol en vue de leur post-traitement.
Les particules traversent ensuite diffrents post-traitements en vue dliminer les prcurseurs et
surfactants incrusts dans les pores. Ces procds sont choisis pour tester certaines proprits des
particules sous des conditions prcises :
La stabilit en solution aqueuse est teste en dialysant les particules dans leau pendant 1semaine :
Environ 20mg de particules dans lthanol sont dilues dans 20ml deau dionise,
puis 2g de NaCl sont ajouts. Cette solution est ensuite agite pendant 2h au bain ultrasons. Les particules sagrgent durant cette opration, qui a pour but dintroduire un
contre ion au CTACl cationique incrust.
Le mlange est ensuite plac dans une poche de dialyse (cut-off molculaire de
15000 Da) dans 1L deau dionise pendant 12h. Les particules dialyses sont
redisperses en ltat dans le bain ultrasons, puis replaces en dialyse pendant 12h
dans 1L deau dionise. Ce processus est rpt pendant 1 semaine, soit environ 10 fois,
suite quoi les particules sont centrifuges (45000g, 20min) et stockes dans lthanol.
La cristallinit du matriau est amliore suivant deux processus de calcination :Une calcination dure , pour laquelle les particules disperses dans lthanol sont
sches sous vide 60C avant dtre chauffes lair durant 3h 500C. Cette opration
calcine tous les rsidus organiques de synthse et recristallise le matriau. 24
Les particules sont ensuite stockes dans lthanol.
Une calcination douce pour laquelle les particules disperses dans lthanol sont
dilues dans un solvant haut point dbullition : squalene, TOPO ou Ethylne glycol. 25
Le mlange est ensuite chauff graduellement jusqu 200C pour liminer lthanol.
Le mlange est alors plac sous reflux pendant 2h 200C, et la solution devient
rapidement noire.
Les particules sont ensuite collectes par centrifugation (45000g, 20min) et
redisperses dans lthanol. Ce processus de lavage est rpt 4 fois. Les particules sontfinalement stockes dans lthanol.
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4.2.Rsultats gnrauxLes particules non retraites ne prsentent que de faibles ractions en prsence dun aimant, et il
est impossible de les prcipiter par ce biais. Cela traduit de faibles proprits magntiques, et donc
une faible cristallinit du matriau juste aprs la synthse hydrothermale.
Comme attendu, le matriau est donc vraisemblablement amorphe. Ce rsultat est confirm par
lanalyse DRX qui ne rvle aucune structure cristalline.Dans leau, la stabilit des particules est assez faible, et la solution retourne rapidement un tat
dquilibre entre le matriau condens et sa forme Fe(OH)3. Cet tat est galement caractristique
de la forte proportion de matire amorphe et donc moins stable (Figure 25).
Figure 25 : Particules dans l'eau aprs dialyse. Une floculation typique de l'oxyhydroxyde de fer est
clairement observe
Enfin une observation MEB des particules rvle que le surfactant est solidement li au matriau,
comme sur la Figure 26. Les surfactants tant toxiques in vivo, il est ncessaire de les liminer, ce qui
implique des lavages plus intenses et donc un risque de destruction des particules.
Figure 26 : Image MEB de particules englues dans le surfactant rsiduel. Elles sont inutilisables en l'tat
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4.3.Influence de la ractivit et du tempsLinfluence de la ractivit du prcurseur et du temps de raction sur la structure des particules
est tudie grce aux images MET.
Ferratrane Ethanol Solide
Figure 27 : Images MET des produits synthtises selon les diffrentes mthodes dinjection du
prcurseur, dans lordre croissant de ractivit. Les images du bas sont des magnifications des premires
images.
Selon la Figure 27, le prcurseur inject dans lthanol a donn lieu la formation de
nanoparticules grossires constitues de grains agglomrs. Ces particules font 80nm +/- 20nm.
Les grains sont des nanocristaux enchsss dans une matrice doxyde de fer amorphe, et sont
rpartis alatoirement au sein de la particule. Des veinures plus claires indiquent des ouvertures au
niveau des joints de grains, et donc une lgre porosit.
Ces particules correspondent ce que les synthses hydrothermales peuvent produire, tout en
respectant la taille limite de 100nm ne pas dpasser. 26
Lorsque la ractivit du prcurseur est amoindrie, par la formation du ferratrane, les objets
produits sont des tapis de nanocristaux de 3nm alatoirement disperss. Parmi ces cristaux setrouvent galement des particules plus grosses denviron 170nm +/- 35nm. Ces particules sont
galement composes de gros cristaux agglomrs, mais ne comportent pas de porosit.
Enfin le prcurseur le plus ractif, inject sous forme solide, cre des particules dont la structure
nest pas sans rappeler un cur moins dense entour dune coquille.
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Il apparait ainsi que plus le prcurseur va tre ractif, plus la nuclation et lagrgation des
noyaux sous forme de nanocristaux vont tre rapides, laissant des lacunes et des vides dans la
particule. A linverse un prcurseur moins ractif provoque des nuclations dsordonnes et un
murissement lent des particules, rsultant en une forte polydispersit du milieu, et des cristaux
agglomrs de manire compacte.
Devant ce constat il est lgitime de se demander quelle est lutilit du TEA. En effet, sans un
prtraitement du prcurseur, il ne semble pas influencer sa ractivit, suggrant que le complexe ne
se forme pas en in situau cours de la raction et que le TEA na quun rle uniquement spectateur.
Cette hypothse est confirme par les donnes littraires qui font tat de la formation du complexe
200C 21.
Le TEA joue cependant un rle de base. Or la raction, par ses similitudes avec des procds sol-
gel (hydrolyse puis condensation des prcurseurs), est sensible au pH. Le TEA permet alors de
rguler ce paramtre ractionnel, connu comme tant dterminant dans les synthses
fondamentales de silice msoporeuse. De plus les prcipitations doxyde de fer sont
systmatiquement ralises en milieu basique, ncessaire la bonne condensation des espces.
Une tude complmentaire pourrait tre mene avec lutilisation dautres bases, afin de
dterminer si le TEA est important pour le mcanisme ractionnel en tant que tel pour son caractrechlateur, ou simplement en tant que base.
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2h de raction 16h de raction
Figure 28 : Images MET des produits de synthse de l'injection solide aprs 2h ou 16h de raction. Les
images du bas caractrisent l'tat des noyaux cristallins isols, plus petits aprs un temps de raction plus
long
Ltude temporelle de la raction sur le prcurseur solide permet de mettre en exergue une
augmentation de la porosit de la particule avec le temps.En effet aprs 16h de raction, il apparait clairement sur limage de droite (Figure 28) des
diffrences de contraste plus prononces et rgulires la surface de la particule, et qui ne sont pas
prsentes lors dune synthse courte. Ce sont des pores dans la coquille cristalline.
La formation de tels pores est attribue un murissement dOswald qui sopre sur la couche
externe de la particule au cours de la synthse. Cette hypothse est corrobore par la rduction en
taille des noyaux cristallins prsents dans la solution : ils passent de 20nm 5nm. Ces noyaux, ainsi
que les plus petits grains de la coquille des particules, se sont dissouts en laissant place aux pores
observs.
Laccroissement du temps de raction permet ainsi daugmenter la porosit de la particule, dans
le cas de linjection solide du prcurseur.
Enfin une tude pousse des images et des interfrences visibles permet daffirmer que les grains
cristallins sont des polycristaux dhmatite non magntique, avec une faible portion de maghmite.
Ce constat explique les faibles proprits magntiques observes prcdemment.
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4.4.Mcanisme ractionnel rel proposSuite ces conclusions, il est possible de remettre en doute certains points du mcanisme
ractionnel, notamment lanalogie de ractivit entre les prcurseurs de fer ou de silice.
La prsence pour un prcurseur peu ractif dune multitude de noyaux de la taille dune micelle
de CTACl suggre une raction interne ces micelles, et non en surface. Or si le prcurseur est trop
ractif, il se condense pour former des noyaux agrgs avant mme davoir pu sinfiltrer dans lesmicelles, processus confirm par labsence de petits noyaux et la croissance de gros cristaux suite
linjection solide du prcurseur.
La raction propose consiste en trois points :
Le prcurseur, caractre hydrophobe, voyage vers lintrieur des micelles de CTACl.Selon sa ractivit, la proportion de prcurseur qui y pntre est variable.
Sous linfluence du milieu basique impos par le TEA, le prcurseur se condense et formedes cristaux, dont la forme et la taille dpendent du lieu de raction. Des noyaux sont
forms dans les micelles et des cristaux plus gros sont forms en solution.
Les cristaux sagrgent pour former des structures dautant plus poreuses que les cristauxsont gros.
Le murissement dOswald rarrange la structure et induit une plus importante porosit.
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4.5.Incorporation de siliceLajout dun prcurseur de la silice, le TEOS, au bout dun certain temps de raction permet
dobserver les mcanismes de formation de structures hybrides doxyde de fer et de silice.
Figure 29 : Image MET dune particule d'oxyde de fer recouverte de silice
La Figure 29 met en vidence lajout en surface dune couche de silice au contraste moins
marqu. Des grains de 3nm se sont forms sur le pourtour de la particule, et agrgs pour former
une structure rugueuse et poreuse.
En observant un autre chantillon (Figure 30), les noyaux susceptibles de sagrger sont enrobsdune coquille de silice, prvenant ainsi la formation de particules.
Il apparait clairement que la silice enrobe bien les particules en ltat, et stoppe totalement la
raction, comme le montrent les cristaux figs dans la silice sur le point de sagrger. Sil sagit
dhybrider les deux matriaux, cela doit tre fait en fin de raction, lorsque le produit a atteint la
maturit recherche.
Par ailleurs une analyse plus fine des interfaces entre la silice et loxyde de fer (Figure 31) rvle
que les cristaux enrobs ont subi une lgre diminution de leur paramtre de maille, de lordre de
5%. La coquille de silice semble donc imposer des contraintes mcaniques aux curs magntiques.
Cette hypothse pourra tre taye par de plus amples analyse en DRX des contraintes internes
du matriau.
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Figure 30 : Image MET de noyaux doxyde de fer enrobs de silice
Figure 31 : Image MET de l'interface silice-oxyde de fer. Les interfrences du rseau cristallin se
distinguent particulirement bien
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4.6.La calcination pour accroitre les proprits magntiquesLa calcination permet non seulement dliminer les surfactants organiques rsiduels, mais elle
provoque une rorganisation du matriau vers une meilleure forme cristalline. La calcination permet
donc en thorie de renforcer la structure du matriau.
Cependant une calcination trop violente induit une condensation des particules de maniretotalement dsorganise. Le produit obtenu est un solide informe, assemblage de multiples
particules soudes les unes aux autres, visible sur la Figure 32.
Figure 32 : Image MEB de particules calcines 500C. Les particules ont fondu et se sont colles sous
l'effet du recuit
Afin dviter de brusquer les structures fragiles, un second recuit est envisag, plus doux, dans
une huile moins de 300C. Le surfactant est bien limin, mais les particules clatent en solution et
retournent ltat de nanocristaux disperss (Figure 34).
Aucun des deux protocoles na permis de conserver la structure des particules. Ils induisent
cependant une cristallisation intressante du matriau : la phase amorphe est transforme en
maghmite et hmatite, comme le montre la Figure 33, provoquant un rehaussement significatif des
proprits magntiques.
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Figure 33 : Spectre DRX des particules calcines, mettant en vidence une phase maghmite (note m) et
hmatite (note h)
Figure 34 : Nanocristaux rsiduels aprs calcination dans l'thylne glycol 200C
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4.7.ConclusionPlusieurs pistes ont t explores pour comprendre comment adapter les rsultats prometteurs
obtenus sur la silice aux oxydes de fer. Il a ainsi t possible dtablir que lthoxyde de fer prcipite
prfrentiellement dans les micelles de CTACl, formant ainsi des nanocristaux qui sagglomrent lors
du murissement de la solution.
Si lobjectif de crer une structure en trous de vers nest pas atteint, il est possible desynthtiser des particules poreuses de moins de 100nm par lintroduction du prcurseur sous sa
forme la plus ractive. Le temps de raction devient ensuite le paramtre dterminant pour le
contrle prcis de la structure. Une tude concernant linfluence du pH sur le produit de raction
pourra tre mene afin dvaluer lutilit prcise du TEA.
Des techniques de recuit plus douces restent dvelopper pour permettre daccroitre la portion
de phase cristalline du matriau, et donc atteindre un ferromagntisme suffisant. Une possibilit
serait de recuire les particules enrobes de silice protectrice. En effet la silice rsiste aux
tempratures employes, et permettrait de conserver une certaine structure en vitant lagrgation.
Certaines caractrisations sont encore mener par la suite, notamment en ce qui concerne
lvaluation de la surface spcifique des particules poreuses analyse par BET, ou ltude
approfondie des contraintes dans les systmes hybrides par incorporation de silice.
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ConclusionDiffrentes approches ont t menes bien au cours de ce projet : la synthse dun agent de
contraste en oxyde de fer ferromagntique, fonctionnel et biocompatible, et la synthse dun
vecteur doxyde de fer poreux de moins de 100nm.
La fonctionnalisation de lagent de contraste na pas donn les rsultats escompts, mais il nesagit ici que dajustements des procds quil conviendra de prendre en compte pour la suite du
projet. La particule synthtise nen reste pas moins conforme aux informations trouves dans la
littrature, et remplit parfaitement les attentes du cahier des charges.
Des particules poreuses doxyde de fer de moins de 100nm ont pu tre synthtises, et le
processus de raction tabli. Il reste nanmoins des zones dombres que des analyses
complmentaires pourront quantifier, notamment propos de linfluence du pH et du temps de
raction.
Enfin un des lments cls qui na pas pu tre abord en raison dun manque de temps estlanalyse prcise du caractre superparamagntique des particules. Cette analyse ncessite des
installations ddies, et devra tre la future priorit pour terminer la caractrisation des particules.
Ces rsultats, bien quincomplets pour dboucher sur des applications immdiatement
thrapeutiques, ouvrent la voie vers de nouveaux