PORTAGE DES EHEC PAR LESRUMINANTSRUMINANTS
ET EFFET DE PROBIOTIQUESE. FORANO, F. CHAUCHEYRAS-DURAND,
Y. BERTIN, C. MARTIN,
INRA UR454 Unité de Microbiologie INRA, UR454, Unité de Microbiologie, Centre de Clermont-Ferrand/TheixL ll d A i l N t itiLallemand Animal Nutrition
Evelyne Forano Colloque France-Brésil 2012Des recherches pour l'agronomie, la biodiversité et la santé
17 octobre 2012, Agropolis International, Montpellier
Escherichia coli entérohémorragiques(EHEC)(EHEC)
EHEC (Ali t )EHEC (Aliments)
Lésions A/E (gènes eae)
Adhésion à l'épithélium intestinal: LEE
Libération de Shiga toxines (Stx)
(gènes stx1, stx2)
Lésions A/E (gènes eae)
Diarrhée aqueuse
(gènes stx1, stx2)
Colite hémorragiqueSyndrome hémolytique et urémique (SHU)
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EpidémiologiePrincipal réservoir ruminant adulte sain
Contamination via excrétion fécaleexcrétion fécale
des EHEC
Définitions
STEC (gènes stx)EHEC = STEC isolé des malades
400 sérotypes Différents sérogroupes
E. coli O157:H7, O103, O26, O111, O113..)
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A l’échelle mondiale-USA : 265 000 infections à STEC par an (~100 000 O157), 30 décèsEpidémies de grande ampleur: -Canada / Mai 2000 : plus de 2000 cas, 27 SHU, 7 décès. + Nombreux casp , ,-Allemagne/ Mai-Juin 2011: 4000 cas, 850 SHU, 58 morts sporadiques
En FranceEn France• Juin 2011 Lille, Steak hachés surgelés, O157, 19 SHU• Été 2011 Bordeaux, Graines de fenugrec germées, O104:H4, 15 personnesÉté 2011 Bordeaux, Graines de fenugrec germées, O104:H4, 15 personnes
infectées, 8 SHU• Juin 2012 Aquitaine, Steak hachés frais, O157:H7, 15 infectés, 9 SHU
Portage
• 2000 : animaux abattoir : 70% STEC (PCR stx+), 34% STEC (isolement),seulement 0,5% O157:H7
Sources : ANSES InVS CDC ; Pradel et al 2000 ; Auvray et al 2012
seulement 0,5% O157:H7• 2010-11: animaux abattoir: 67% STEC (PCR stx+), 2,3% EHEC (potentielles, isolées)
Sources : ANSES, InVS, CDC ; Pradel et al, 2000 ; Auvray et al, 2012Evelyne Forano Colloque France-Brésil 2012
Des recherches pour l'agronomie, la biodiversité et la santé17 octobre 2012, Agropolis International, Montpellier
Au BrésilPortagePortage• Bovins laitiers et viande, 1999. Rio de Janeiro (Cerqueira et al, 1999)• Vaches laitières, 2005. Sao Paulo (Irino et al, 2005)• Water buffaloes, 2007. Minas Gerais (Oliveira et al, 2007)
Prévalence STEC très variable (0 à 85%), gde diversité STECPrévalence O157:H7 : 0,6 à 1,5 %,
Infections humaines• Très peu de cas identifiés : 2000-02 : 3 cas O103:H2 (enfants) ; qqs cas O157:H7• Incidence infections à O157:H7 et non O157difficile à évaluer (pas d’épidémio-surveillance, peu de laboratoires peuvent rechercher ces souches)• Immunité des Brésiliens due contacts EPEC ?
Approfondir les travaux sur portage et incidence des EHEC au Brésil : Approfondir les travaux sur portage et incidence des EHEC au Brésil : risque existe ; Brésil grand producteur de viande ; exportation vers UE pourrait augmenter dans futur…
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Limiter le portage des STEC
Stratégies de rechercheStratégies de rechercheProbiotiques = outil pour le contrôle du
portage au niveau de la ferme?p g
Mieux comprendre la physiologie et l’écologie
d EHEC d l t t
Sélectionner et évaluer différentes souches
i bides EHEC dans le tractus gastro-intestinal bovin
microbiennes compétitrices
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Physiologie des EHECen contenu intestinal bovin
Contenu i t ti l/ MM
Méthodologie
EHEC
intestinal/ MM
EHEC O157:H7 EDL933
Analyse transcriptomique Analyse métabolomique
P K12
métabolites produits, sources C et N pouri b té i i ét b li
SM et RMN
Gè i é (192)
Puces K12+ 2 EHEC
croissance bactérienne : voies métaboliquesGènes sur-exprimés (192)
Identifier les voies métaboliques utilisées par les EHEC dans les conditions physiologiques pour leur survie et leur croissance
stratégies nutritionnelles pour limiter le portage
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Physiologie des EHECen contenu intestinal bovin
Serine EthanolamineSerine Ethanolamine
Sources d'azoteen contenu intestinal bovin
Serine Ethanolamine
eutH x 2sdaC x 3.1
eutB x 1 8sdaA x 2.9sdaB x 1 7
Serine Ethanolamine
eutH x 2sdaC x 3.1
eutB x 1 8sdaA x 2.9sdaB x 1 7
Tryptophane Pyruvate AcetaldehydeTryptophane
NH3 NH3 NH3
tnaAx 23
tnaB
x 3.6
eutB x 1.8eutC x 2.6
sdaB x 1.7tdcG x 1.7
Tryptophane Pyruvate AcetaldehydeTryptophane
NH3NH3 NH3NH3 NH3NH3
tnaAx 23
tnaB
x 3.6
eutB x 1.8eutC x 2.6
sdaB x 1.7tdcG x 1.7
Induction du l t E t
Asparagine Asparagine Aspartate Fumarate
NH3 NH3putP
x 1.4asnB
x 2.1aspAx 4.6
Asparagine Asparagine Aspartate Fumarate
NH3NH3 NH3NH3NH3putP
x 1.4asnB
x 2.1aspAx 4.6
cluster EutUtilisation éthanolamine
cellules épithéliales alimentAspartate
Glutamate
Proline
dctA
x 5.1
proXVW x 2 2 3
putA x 1.6AspartateGlutamate
Proline
dctA
x 5.1
proXVW x 2 2 3
putA x 1.6
• Expression des gènes
cellules épithéliales, aliment
Proline
proXVW x 2-2.3
Proline
proXVW x 2-2.3• Compétitions nutritionnelles• Analyses biochimiques
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Voies métaboliques exprimées dans le contenu digestif bovin
O2
EDL933
O2
EDL933
O2
EDL933
O2
EDL933
g
M9
O2
39°C without shaking
BICM9
O2
39°C without shaking
BIC M9-GlucM9
O2
39°C without shaking
BICM9
O2
39°C without shaking
BIC M9-Gluc
L'éth l i ' t U t t i bl d' tili• L'éthanolamine n'est pas consommée par le microbioteintestinal des bovins
• Un mutant incapable d'utiliserl'éthanolamine présente un défaut de croissance dans le contenu intestinal
L'utilisation de l'éthanolamine comme source d'azote confère aux EHEC un avantage nutritionnel compétitif qui contribue à leur survieEHEC un avantage nutritionnel compétitif qui contribue à leur survie
dans le tractus gastro-intestinal
Bertin et al 2011 Environ MicrobiolBertin et al., 2011, Environ. Microbiol.Evelyne Forano Colloque France-Brésil 2012
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Physiologie des EHEC en contenu intestinal bovin
L-LactateL-LactateBactéries lactiques
commensales
Sources de carbone
lldDlldD
fucAfucA
lldDlldDlldDPyruvate
lldD x 2,3L-Fuculose1P
x 2,9 x 2,1
aldAL-LactateL-LactateL-Lactaldehyde
manA
fucA
lldDlldD
fucAfucA
lldDlldD
lldP x 2
lldDPyruvate
lldD x 2,3L-Fuculose1P
x 2,9 x 2,1
aldA L-LactateL-LactateL-LactateL-LactateL-Lactaldehyde
manA
fucAL-Fucose
lldDlldD
fucAfucA
lldDlldDlldDPyruvate
lldD x 2,3L-Fuculose1P
x 2,9 x 2,1
aldAL-LactateL-LactateL-LactateL-LactateL-Lactaldehyde
manA
fucA
lldDlldD
fucAfucA
lldDlldD
lldP x 2
lldDPyruvate
lldD x 2,3L-Fuculose1P
x 2,9 x 2,1
aldA L-LactateL-LactateL-LactateL-LactateL-Lactaldehyde
manA
fucAL-Fucose
Mucus intestinal
Citrate
Oxaloacetate
Citrate
Oxaloacetate
y
Glycolysis
mdh Citrate
Oxaloacetate
CitrateCitratex 2Dih d t P
D-Mannose6P Fructose 6Px 2
manA
D-Galactose
α-D-glucose1P
galK
galT
galEgalU
x 1.5
x 1.8
CitrateOxaloacetate
Malatex 2
OxaloacetateOxaloacetate
y
Acetyl-CoAGlycolysis
mdh
Oxaloacetate
Dih d t P
D-Mannose6P Fructose 6Px 2
manA
D-Galactose
α-D-glucose1P
galK
galT
galEgalU
x 1.5
x 1.8
CitrateOxaloacetate
Malatex 2
Mannose
D GalactoseCitrate
Oxaloacetate
Citrate
Oxaloacetate
y
Glycolysis
mdh Citrate
Oxaloacetate
CitrateCitratex 2Dih d t P
D-Mannose6P Fructose 6Px 2
manA
D-Galactose
α-D-glucose1P
galK
galT
galEgalU
x 1.5
x 1.8
CitrateOxaloacetate
Malatex 2
OxaloacetateOxaloacetate
y
Acetyl-CoAGlycolysis
mdh
Oxaloacetate
Dih d t P
D-Mannose6P Fructose 6Px 2
manA
D-Galactose
α-D-glucose1P
galK
galT
galEgalU
x 1.5
x 1.8
CitrateOxaloacetate
Malatex 2
Mannose
D Galactose
UtilisationSucres mucus
AspartateAspartate
aspAx 4,6
Isocitrate
toglutarate
Malate IsocitrateMalate
glutarate
Aspartate
x 5,8
Glycerol
sn-Glycerol3PglpK
glpD
glpF
Aspartate
Isocitrate
toglutarate
MalatefumA
Isocitrate
toglutarate
Malate Isocitrate
toglutarate
Malate TCA
x 5
DihydroxyacetoneP
sdhC
D-Ribulose1P
fucAx 2,9
D-GalactoseIsocitrate
Fumarate
Succinate
Oxo-glutarate
Malate
x 2,5
Succinyl-CoA
x 4,2TCA cycle
AspartateAspartate
aspAx 4,6
IsocitrateIsocitrate
Aspartate
x 5,8
Glycerol
sn-Glycerolsn-Glycerol 3PglpK
glpD
x 3,6
glpF
Aspartate
IsocitratefumA
IsocitrateIsocitrateTCA
x 5
Dihydroxyacetone P
sdhC
D-Ribulose1P
fucAx 2,9
D-GalactoseIsocitrate
Fumarate
Succinate
Oxo-glutarate
Malate
x 2,5
Succinyl-CoA
x 4,2TCA cycle
D-GalactoseD-Arabinose
Glycerol AspartateAspartate
aspAx 4,6
Isocitrate
toglutarate
Malate IsocitrateMalate
glutarate
Aspartate
x 5,8
Glycerol
sn-Glycerol3Psn-Glycerol3PglpK
glpD
glpF
Aspartate
Isocitrate
toglutarate
MalatefumA
Isocitrate
toglutarate
Malate Isocitrate
toglutarate
Malate TCA
x 5
DihydroxyacetoneP
sdhC
D-Ribulose1P
fucAx 2,9
D-GalactoseIsocitrate
Fumarate
Succinate
Oxo-glutarate
Malate
x 2,5
Succinyl-CoA
x 4,2TCA cycle
AspartateAspartate
aspAx 4,6
IsocitrateIsocitrate
Aspartate
x 5,8
Glycerol
sn-Glycerolsn-Glycerol 3PglpK
glpD
x 3,6
glpF
Aspartate
IsocitratefumA
IsocitrateIsocitrateTCA
x 5
Dihydroxyacetone P
sdhC
D-Ribulose1P
fucAx 2,9
D-GalactoseIsocitrate
Fumarate
Succinate
Oxo-glutarate
Malate
x 2,5
Succinyl-CoA
x 4,2TCA cycle
D-GalactoseD-Arabinose
GlycerolCellules
épithélialesx 5.1dctA
Aspartate Succinate
x 5.1dctA
Aspartate SuccinateAliment
è Microbiote résident• Expression des gènes• Compétitions nutritionnelles• Analyses biochimiquesy q
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Voies métaboliques exprimées dans le contenu digestif boving
4
5
tes (
mM
0.8
mM
A) B)
4
5
tes (
mM
0.8
mM
A) B)
Microbiote
2
3
4
-der
ived
car
bohy
drat0.4
0.6
***
***
***2
3
4
-der
ived
car
bohy
drat0.4
0.6
***
***
***
MicrobioteE. coli com
EHEC
MicrobioteE. coli comEHEC
0
1
0 1 2 3 4 5 6Time (hours)
Tota
l muc
us-
0.0
0.2
Fuc Gal Man GalNAc GlcNAc NeuAc
******
**
0
1
0 1 2 3 4 5 6Time (hours)
Tota
l muc
us-
0.0
0.2
Fuc Gal Man GalNAc GlcNAc NeuAc
******
**
• La souche d’EHEC utilise plus rapidement les sucres du mucus que le microbiote endogène ou une souchecommensale bovine d’E. coli
• Tous les sucres sont utiliséssimultanément
Time (hours)Time (hours)
L'utilisation de sucres issus de mucus bovin comme source de C confère aux EHEC un avantage nutritionnel compétitif qui contribue àconfère aux EHEC un avantage nutritionnel compétitif qui contribue à
leur survie dans le tractus gastro-intestinal
Bertin et al 2012 Environ MicrobiolBertin et al., 2012, Environ. Microbiol.Evelyne Forano Colloque France-Brésil 2012
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Effet de ProbiotiquesEffet de Probiotiques
• Bactéries lactiques (Lactobacillus acidophilus,…)• Levures (Saccharomyces cerevisiae,…)( y , )• Bactéries de la flore autochtone
Sur la croissanec et la survie des STEC
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Survie des EHEC dans contenus de rumen, intestinaux et fécauxrumen, intestinaux et fécaux
Méthodologie
• Effet du régime• Avec/sans microbiote
JR, JI ou susp fécale
commensal• Avec probiotiques
EHEC5.105 cfu/ml
Rôle fondamental du microbiote digestif
nutritionDégradation/fermentation des aliments
santé Morphologie du TDg
Apport de nutriments essentiels Élimination de molécules toxiques
p gSystème immunitaire
Barrière aux pathogènes
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Survie/croissance de souches EHEC dans le contenu ruminal et intestinaldans le contenu ruminal et intestinalRumen
8
9Contenu intestinal caecal
4
5
6
7
Log
cfu/
ml
7,00
8,00
cfu/
ml
6
7
8
g cf
u/m
l
1
2
3
4
EDL933
EDL933 + L. acidophilus 5,00
6,00
Log
c
4
5
6
Lo
Culture statique en anaérobiose de 24h
00 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Time (h)
4,00EDL933 AR1 AR2 AR3 AR4 AS1 AS2 AS3 AS4
STEC sensibles à l’acidité
4
EDL933 AR1 AR2 AR3 AR4 AS
S2h 8h
• EDL933 persiste 12 h dans le fluide ruminal, puis déclin et mortalité de 100% à 18h (dû pH acide et forte concentration AGV).
• Les STEC se développent dans le contenu intestinal et caecal• recherche de souches capables d’inhiber leur croissance
• En présence de Lactobacillus acidophilus (ou levure) EDL933 n’est plus détectée à 15h
Chaucheyras-Durand et al 2010 AEM
d’inhiber leur croissance
Chaucheyras Durand et al. 2010, AEMEvelyne Forano Colloque France-Brésil 2012
Des recherches pour l'agronomie, la biodiversité et la santé17 octobre 2012, Agropolis International, Montpellier
ConclusionsLe rumen est un compartiment critique pour le contrôle du développement des STECdu développement des STECS.cerevisiae I-1077 et L.acidophilus BT-1386 augmentent la mortalité de STEC dans du contenu ruminalruminalLes STEC se développent dans le contenu intestinal et dans le contenu fécalDans l’intestin les EHEC utilisent des sources de C etDans l intestin les EHEC utilisent des sources de C et N plus efficacement que le microbiote endogène : avantage compétitif?P bi ti til l t ôl d tProbiotiques = outil pour le contrôle du portage au niveau de la ferme?Effet direct (métabolites inhibiteurs, ou compétition) et/ ou effet médié par la flore digestive ?
Comprendre les mécanismes
15
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Merci pour votre attentionThank you for your attentionThank you for your attention
ObrigadaObrigada
Questions ?QEvelyne Forano Colloque France-Brésil 2012
Des recherches pour l'agronomie, la biodiversité et la santé17 octobre 2012, Agropolis International, Montpellier
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