2012/2013
RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIREMINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEURE ET DE LA
RECHERCHE SCIENTIFIQUEUNIVERSITÉ MOHAMED KHIDER BISKRA
DÉPARTEMENT DE BIOLOGIEFACULTÉ DES SCIENCES EXACTES ET DES SCIENCES DE NATURE ET DE
LA VIE
2ANNEÉ MASTER BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLÉCULAIREMODULE DE TYPAGE BACTETIENNE
GROUPE : 01
ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE
« PFGE »
INTRODUCTIONEn 1984 Schwartz et Cantor
ont proposé un nouveau
concept pour la séparation
des molécules d’ADN d’une
taille supérieur à 50 Kpb:
l’utilisation du champs
électriques activés
alternativement( champ
pulsée).
DÉFINITION L’électrophorèse en champ pulsé est
le résultat de la combinaison d’une
digestion par des enzymes de
restriction à faible nombre de sites de
coupure et d’une électrophorèse
adaptée à la grande taille des
produits de digestion. Le résultat est
un profil de restriction intéressant
tout le génome du microorganisme .
Migration des fragments de haut poids moléculaires
ELECTROPHORÈSE TRADITIONNELLE
ELECTROPHORÈSE EN CHAMP PULSÉ
Blocage des gros fragments d’ADN en
début de gel
Déroulement des gros fragments d’ADN par
réorientation du champ électrique
PRINCIPE
LES TYPES DE L’ECP
pouvoir discriminant important
grande résolution, bonne reproductibilité intra-laboratoire
applicable à un grand
nombre d ’espèces
AVANTAGES
technique longue :4 à 5 jours
délicate, manuelle, nécessitant du personnel
qualifié
technique coûteuse
INCONVINIENTS
résultats obtenus non standardisés
MATÉRIEL ET
MÉTHODES
Appareillage
LES ETAPES
La lyse bactérienne
Choix des endonucléases de restrictions
Réalisation de l’électrophorèse
1
2
3
choix de l’enzyme en fonction de l’espèce (GC% du génome de la
bactérie)
CRITERES D ’INTERPRETATION
analyse des différents profils : logiciel (ex : Taxotron® sur MAC
Gelcompar® sur PC) utilisation du coefficient de DICE
= % de similitude entre les souches testées
Nombre total de fragments dans les
2 profils
Coeffi cient de Dice =
Nombre de fragments communs x 2
obtention du dendrogramme
LES FACTEURS DE SÉPARATION
]1%[ en gel
T°C
Cinétique de
pulsation
Exemple d’application de l’électrophorèse en champ pulsé au typage épidémiologique de
Pseudomonas aeruginosa:
(Grx1000)
Bacille, Gram (-) , Mobile, Aérobie ou anaérobie facultatif,
pyocyanique
adapté à l’environnement hospitalier ,commensal du tube
digestif de l’homme ,(2,6 à
24 %) des prélèvements de
selles), Sol, végétaux Pathogène,
mortel , infection
Nosocomiale
OBJECTIF
Le typage épidémiologique de P.
aeruginosa par PFGE permet de
comparer plusieurs isolats
bactériens entre eux, que ces
isolats proviennent d’un même
patient, de patients différents ou
de l’environnement.
RESULTAS ET
INTERPRETATION
Caractéristiques épidémiologiques, phénotypiques et
génotypiques de six souches de P. aeruginosa isolées
Gel d’électrophorèse en champ pulsé de l’ADN de 6 souches de P. aeruginosa.
Pistes 1 à 6 : souches 1 à 6 présentées dans le tableau .Piste M : marqueur de poids moléculaire. Les valeurs de poids
moléculaire sont indiquées sur la gauche en kilobases (kb)
Gel d’électrophorèse en champ pulsé de l’ADN de 9 souches de P. aeruginosa.
Pistes 1 à 5 : souches isolées de divers patients. Pistes 6 à 9 : souches isolées de l’environnement. Piste M : marqueur de poids moléculaire. Les valeurs de poids
moléculaire sont indiquées sur la gauche en kilobases (kb)
Exemple d’interprétation de résultats d’électrophorèse en champ pulsé sous
forme de dendrogramme
DISCUSSION
L’Intérêt de la technique PFGE
pour le typage épidémiologique
de P. aeruginosa: à propos de
deux études :
Études étude n°1 :
Comparaison de 6 souches
isolées chez une même patiente,
ou pourquoi les marqueurs
phénotypiques ne suffisent-ils
pas ?
6 souches isolée sont comparer par 3 méthodes
Phénotypie
Antibiothépie
ECP
Clone A: retrouvé au
niveau abdominal et urinaire
La patiente a été infecter par deux clones différentes de bacille
pyocyanique :
Clone B retrouvé au niveau respiratoire
A partir la combinaison entre
les résultats phénotypique et
génotypique on conclure que :
Une surinfection par une
souches résistante à
l’imipenème se produit au
niveau respiratoire (clone B)
chez une patiente déjà infectée
par une souche sensible aux
antibiotique (clone A).
Études étude n° 2 :
Comparaison de souches isolées
chez plusieurs patients et dans
l’environnement d’un même
service –Importance de maîtriser
les infections nosocomiales à P.
Aeruginosa .
9 souches ont été étudiées par ECP
5 souches proviennent de différents patients infectés
par P. aeruginosa et hospitalisés dans un même
service de réanimation
4 souches proviennent de l’environnement (siphons
de lavabo, claie de chambre)
On trouve les mêmes profils électrophorétique
chez les neuf souches étudies .ces résultats
montre que la diffusion clonale et épidémique
d’une souche de
P. aeruginosa dans le service.
L’ECP à permis de mettre en évidence une
relation génétique entre les souches de
sensibilité différentes et aussi de de différencier
des souches présentant des antibiotique
identique.
CONCLUSION L’ECP est une technique discriminante qui
permet de distinguer des souches
génétiquement très proche et offre une
bonne reproductibilité, malgré un délai
relativement très longue
Cette méthode à prouver son efficacité dans
des nombreuses enquêtes épidémiologique
et a permis de nombreux génotypique dans
l’identification aurais été difficile par autre
méthodes.
La pulsotypie est donc un système de typage
comparatif qui s’il est très bien standardisé
peut être utilisé comme système définitif.
MERCI POUR VOTRE
ATTETION
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