Nouvelle méthode de monitoring Nouvelle méthode de monitoring in situ in situ du du phytoplancton : phytoplancton :

Analyse automatisée, à haute fréquence et à l’échelle Analyse automatisée, à haute fréquence et à l’échelle individuelle des cellulesindividuelle des cellules

M. Thyssen, G.Grégori, A. Malkassian & M. Denis

Laboratoire LMGEM, Centre d’Océanologie de Marseille (OSU) Université de la Méditerranée

Campus de Luminy, Marseille

gerald.gregori@univmed.fr

Atelier Haute Fréquence, 22-23 octobre 2009 (Wimereux)Atelier Haute Fréquence, 22-23 octobre 2009 (Wimereux)

Importance des microorganismes marinsImportance des microorganismes marinsImportance des microorganismes marinsImportance des microorganismes marins

Le phytoplancton:• Principal producteur de matière organique• Phytoplancton = premier élément du

réseau trophique (entrée du C dans le réseau)

• Cycles rapides (jusqu’à plusieurs divisions par jour)

• Sensibilité aux variations environnementales biotiques (prédation, lyse virale) et abiotiques (hydrologie, vent)

• Réponse plus rapide à ces changements

- Groupe polyphylétique très diversifié (>15 000 espèces)

- Principalement des organismes photosynthétiques unicellulaires (<1 à ~ 2 000 µm)

- Flottent dans la couche euphotique

Flux biogéochimiques : Flux biogéochimiques : fonction de la structure de la communautéfonction de la structure de la communauté

Prise de conscience du rôle des microorganismesPrise de conscience du rôle des microorganismes

www.soes.soton.ac.uk

www.jochemnet.de

Toxicité de certaines espècesToxicité de certaines espècesToxicité de certaines espècesToxicité de certaines espèces

© European Communities, 1995-2003

Le problème de l’échantillonnageLe problème de l’échantillonnage

• Nécessité d’un suivi des populations• Compréhension de leurs dynamiques à des échelles de temps et d’espace adéquates.

Approche par analyse individuelle et haute fréquence temporelle

Neither qualitative nor quantitative surveys generally sample the

phytoplankton adequately (Smayda, 1998, Baretta et

al., 1998)

Méthodologie pour étudier le phytoplancton à l’échelle Méthodologie pour étudier le phytoplancton à l’échelle individuelle des cellules (méthode non destructrice)individuelle des cellules (méthode non destructrice)

Echantillonnage

Analyse traditionnelle

Analyse par cytométrie en flux

Principe de la cytométrie en fluxPrincipe de la cytométrie en fluxPrincipe de la cytométrie en fluxPrincipe de la cytométrie en flux

•particules en suspension

•flux monodisperse

•interception par un faisceau laser.

•La diffusion de la lumière et les émissions de fluorescence sont collectées, filtrées et

•converties en valeurs digitales enregistrées sur un PC.

FluidiqueFluidique

OptiqueOptique

ElectroniqueElectronique

Analyse du phytoplancton Analyse du phytoplancton (taille <10 micron)(taille <10 micron)

Analyse du phytoplancton Analyse du phytoplancton (taille <10 micron)(taille <10 micron)

Fluo. verte (ua)Diffusion 90°(ua)

Flu

o.

rou

ge

(ua)

Prochlorococcus

picoeucaryotes

Synechococcus

picoeucaryotes Synechococcus

Billes de calibrage

nanoeucaryotes• 6-10 microns • 3-6 microns

Analyse ataxonomique

Pourquoi la cytométrie en flux devient Pourquoi la cytométrie en flux devient populaire chez les microbiologistes?populaire chez les microbiologistes?

Pourquoi la cytométrie en flux devient Pourquoi la cytométrie en flux devient populaire chez les microbiologistes?populaire chez les microbiologistes?

• Analyses rapides (plusieurs dizaines de milliers de cellules analysées par seconde)

Permet d’analyser un grand nombre de cellules Résultats statistiques robustes et représentatifs

• Analyse multiparamétrique à l’échelle individuelle

• Données quantitatives (corrélation avec d’autres données biochimiques)

• Mesures en temps réel

• Classes de taille et abondance cellulaire

• Marqueurs uniques: - naturels (chlorophylle, autres pigments autofluorescents) - induits (coloration) fluorochromes (sondes)

• Tri (post-analyses, cultures)

Plateforme régionale de cytométrie pour la microbiologie Plateforme régionale de cytométrie pour la microbiologie (PRéCyM) du COM (2005)(PRéCyM) du COM (2005)

Qu’est-ce qu’une plateforme?Qu’est-ce qu’une plateforme?

- Centralisation d’équipements et d’un savoir faire à disposition des unités/instituts, des domaines public et privé,

- Exploitation technique, économique et scientifique optimale des appareils,

- Développement et veille technologique, valorisation de la recherche, formation.

<<< Plateforme animée par un comité de gestion (mise en place en 2005) >>>Contacts : michel.denis@univmed.fr et gerald.gregori@univmed.fr

http://precym.com.univ-mrs.fr

EquipementEquipement

2 analyseurs (paillasse) 2 trieurs dont un embarquable 1 analyseur in situ

Cytosub (Cytobuoy) : un cytomètre en flux Cytosub (Cytobuoy) : un cytomètre en flux

dédié à l’analyse autonome dédié à l’analyse autonome et et in situin situ du phytoplancton. du phytoplancton.

•Analyse in situ jusqu’à 200 m. de profondeur

•Fréquence d’échantillonnage maximale toute les 10 min.

•Durée d’immersion possible de plusieurs semaines

- Deux variables dites de diffusion des photons du laser :+ Aux petits angles (FWS : forward scatter) Taille des particules. + A 90° (SWS : sideward scatter) Morphologie de la cellule (forme,

granularité, paroi cellulaire, composition interne,...).

- Trois variables d’émission de fluorescence (autofluorescence):

+ Rouge centrée sur 734-668nm carotène et chlorophylle a.+ Orange centrée sur 601-668nm phycobilines (spécifiques aux

Cyanobactéries et Cryptophytes)+ Jaune centrée sur 536-601nm phycoérythrine.

- Profil des signaux le long des particules (signature optique du phytoplancton)

- Module de prise d’image (module Image in flow)

Variables mesurées par le CytosubVariables mesurées par le Cytosub

Temps

Flux

FaisceauLaser

Chambre en Quartz

Fluide

Intensité du Signal

Acquisition de Acquisition de donnéesdonnées

Exemples de donnéesExemples de données

Exemples de donnéesExemples de données

Exemples de données sur des chaînesExemples de données sur des chaînes

De la particule détectée De la particule détectée in situ in situ à la cellule identifiéeà la cellule identifiée

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1 100 10000 1000000

Flu

ores

cenc

e ro

uge

(ua)

Taille (ua)

…à la particule …De l’échantillon naturel …

… à la cellule

Travaux de thèse de Mélilotus THYSSEN

Diversité du phytoplancton étudiée cellule par cellule sur la base de leurs propriétés optiques (diffusion, fluorescence)

Analyse in situ = pas de modifications du système étudiéAnalyse individuelle des cellules = diversité et physiologie

Diversité des types cellulaires est variable en fonction des conditions environnementales Notion de groupe fonctionnel de réponse

Thyssen et al., 2008a, J. Plank. Res.

0.001

0.01

0.1

1

10

100

1 100 10000 1000000

Fluorescence rouge (u.a.)

Diffusion (u.a.)

Type cellulaire 2

Phytoplankton spatial and temporal high frequency analysis using automated and submersible flow cytometry

Type cellulaire 3

Type cellulaire 1

Point fixe côtier Méditerranée. Fréquence d’analyse 30 min. Données in situ.

Travaux de thèse 2/ L’hétérogénéité temporelle

L’observation à haute fréquence donne une estimation réaliste de la variation de leur biomasse, donc des flux de matière

02 07 12 Jours

103

cells

.cm

-3

010

2030

40

Jours

µg

chl a

.dm

3

01

23

45

6

02 07 1202 07 12 Jours

103

cells

.cm

-3

010

2030

40

Biomasse globale (fluorimétrie)Sur- sous estimation liées aux facteurs de conversion C/Chl

Si échantillonnage classique: sur ou sous estimation de la variation de la biomasse

Exemple de deux types phytoplanctoniques

Thyssen et al. 2008b, J. Plankt. Res.

17 h

8 h

14 000 échantillons!

Hétérogénéité en fonction:- du régime de vent,- du rapport N/P

Travaux de thèse 3/ L’hétérogénéité spatiale

Déconvolution entre cause interne (cycle cellulaire) ou

externe (hydrodynamisme) de la variation des abondances

Thyssen et al. 2008, BiogeosciencesThyssen et al. 2005, J. Geophy. Res.

ajustement des algorithmes de calcul de la biomasse autotrophe á

partir des images satellites avec des données in situ de même résolution

(1-2 km)

Projet ACYPHAR - radiale Açores - Lorient, Atl. Nord Est. Résolution ~2 km.Prélèvement automatisé des eaux de surface par cytométrie en flux

Chlorophylle de surface par téledétection Ex. de deux types phytoplanctoniques

Denis & Thyssen 2007. Quand océanologie et réinsertion sociale se concertent. Journal de l’INSU

Pour chaque type cellulaire et grâce à l’observation à haute fréquence

Temps t

010

2030

40

02 07 12

103

cells

.cm

-3Taux journalier de croissance et de

décroissance apparente

Production Nette = Δ Biomasse / Δt

Abo

ndan

ce

(Bio

mas

se)

Détermination de la production nette grâce à la haute fréquence Estimation adéquate de la variation des stocks de matière particulaire biogène

Travaux de thèse 4/ Détermination de la production communautaire nette

Nouvelle thèse sur l’Etang marin de BerreNouvelle thèse sur l’Etang marin de Berre

FRANC E

Berre

M arignane

M artigues

St C h am a s h yd ro e le ctricp ow e r s ta tion

(Figures David Nérini)

Particularités : - Forte stratification haline- Arrivées soudaines et massives d’eau douce (Centrale EDF)- Vent (Mistral) homogénéisation- Episodes d’eutrophie (anoxie)

- Un des plus grands étangs marins de Méditerranée.- Proche de l’agglomération Marseillaise, - Soumis à de fortes pressions d’origine anthropique (rejets d’eau douce de la centrale EDF, activités industrielles, forte population sur son bassin versant, etc.).

Très fort intérêt pour la Région

Etang sous haute surveillanceEtang sous haute surveillance

+ Hydrologie : -Température, - Salinité, - Turbidité, - Oxygène Dissous Données horairesDonnées horaires 5 niveaux de la colonne d’eau + Courantologie (XSurvey)

+ Chimie (Sels nutritifs…)

+ Météorologie

+ Biologie : - « gros » phytoplancton - algues et phanérogames - zooplancton - poissons

Et les micro-organismes dans tout ça?Et les micro-organismes dans tout ça?

Carte bathymétriquede l'Etang de Berre

Station automatique de prélèvements

Automatisation du traitement des Automatisation du traitement des données issues du Cytosubdonnées issues du Cytosub

• Problème : Discriminer des groupes sur la base de leur signature optique.

• Hypothèse : Information discriminante dans la forme que prennent les profils.

(Malkassian et al. En préparation)

• Description (Qui est là? Et quand?):– Caractériser spatialement et temporellement les composantes de

l’assemblage microbien en relation avec l’environnement biotique et abiotique

- d’après leurs propriétés optiques de diffusion et de fluorescence,- par analyse d’image (automatisée).

– Etudier les abondances avant, pendant et après les forçages :– Vent (Mistral) Rupture de la stratification haline – Apport d’eau de mer (passe de Caronte) Espèces marines– Apport soudain et massif d’eau douce (Centrale

hydroélectrique de Saint-Chamas) Espèces dulçaquicoles

Pourquoi ce sujet ? [Intérêt scientifique]Pourquoi ce sujet ? [Intérêt scientifique]

• Dynamique (Qui varie comment?)- Réponse des assemblages microbiens aux changements environnementaux biotiques et abiotiques (notions de groupes fonctionnels)- Modélisation

ConclusionConclusion

Cytométrie en flux autonome in situ:– Permettra de réaliser un suivi à haute fréquence et à l’échelle individuelle des

assemblages phytoplanctoniques.– Analyse réalisée grâce a un instrument immergé autonome permet de

s’affranchir de l’opérateur et des sorties en bateau dépendantes de la météorologie

– Ce système garantit des séries de données à haute fréquence, et continues (peu ou pas de données manquantes).

Appréhender la dynamique de l’écosystème suite à une perturbation soudaine (fort vent, apport massif d’eau douce, rupture de la stratification haline, etc.)

Répondre aux questions posées (cas de l’Etang de Berre par exemple)------------------------------------------------------------------------------------------------ Finalité de l’approche : le domaine marin côtier et ouvert (stations fixes et navires

d’opportunité (Méthaniers? Ferries? Portes-conteneurs?)- Etendre l’approche aux « bactéries » (AO INSU-CSOA & CETSM)

Observation = Constitution d’une base de données unique sur le phytoplancton en Mer Méditerranée

L’équipeL’équipe

• Michel DENIS (DR émérite CNRS)• Mélilotus THYSSEN (Post-doctorante)

• Anthony MALKASSIAN (Doctorant 2009)• Zhao LI (Doctorante 2009)

Ainsi que :

• Aude BARANI (plate-forme PRECYM)• Beatriz BECKER (identification du phytoplanton)• Nicole GARCIA (analyses sels nutritifs)• David NERINI (MCF, Statistiques)• Patrick RAIMBAULT (SO du COM)