07/12/2014
1
Pr. A. CALENDER - 2014
Pr. A. CALENDER - 2014
Toute variation de séquence est MUTATION, susceptible de conduire à l’expressiond’une protéine anormale ou une NON expression de celle-ci et de ce fait à une maladie
07/12/2014
2
http://www.hgvs.org/
Pr. A. CALENDER - 2014
General recommandations
Pr. A. CALENDER - 2014
07/12/2014
3
HGVS General recommandations (1)
Pr. A. CALENDER - 2014
Description of a variant should be preceded by a letter indicating the type of referencesequence used. Several different reference sequences can be used
• "c." for a coding DNA sequence (like c.76A>T)• "g." for a genomic sequence (like g.476A>T)• "m." for a mitochondrial sequence (like m.8993T>C)
• "n" for a non-coding RNA reference sequence (gene producing an RNA transcriptbut not a protein)
• "r." for an RNA sequence (like r.76a>u)• "p." for a protein sequence (like p.Lys76Asn)
DNA-levelin capitals, starting with a number referring to the firstnucleotide affected (like c.76A>T or g.476A>T)RNA-levelin lower-case, starting with a number referring to thefirst nucleotide affected (like r.76a>u)protein levelin capitals, starting with a letter referring to first theamino acid affected (like p.Lys76Asn)
Alanine Ala ACysteine Cys CAspartic AciD Asp DGlutamic Acid Glu EPhenylalanine Phe FGlycine Gly G HistidineHis H Isoleucine Ile ILysine Lys KLeucine Leu LMethionine Met MAsparagiNe Asn NProline Pro PGlutamine Gln QARginine Arg RSerine Ser SThreonine Thr TValine Val VTryptophan Trp WTYrosine Tyr Y
Pr. A. CALENDER - 2014
Coding DNA Reference Sequence
• there is no nucleotide 0
• nucleotide 1 is the A of the ATG-translation initiation codon
• the nucleotide 5' of the ATG-translation initiation codon is -1
• the nucleotide 3' of the translation stop codon is *1
• Intronic nucleotides
• beginning of the intron; the number of the last nucleotide of the preceding exon,a plus sign and the position in the intron, like c.77+1G, c.77+2T, etc.• end of the intron; the number of the first nucleotide of the following exon, aminus sign and the position upstream in the intron, like c.78-1G.• in the middle of the intron, numbering changes from "c.77+.." to "c.78-.."; forintrons with an uneven number of nucleotides the central nucleotide is the lastdescribed with a "+"
HGVS General recommandations (2)
07/12/2014
4
Specific changes
• ">" indicates a substitution at DNA level (like c.76A>T)
• "_" (underscore) indicates a range of affected residues, separating the first and last residue affected
(like c.76_78delACT)
• "del" indicates a deletion (like c.76delA)
• "dup" indicates a duplication (like c.76dupA); duplicating insertions are described as duplications,
not as insertions; ACTTTGTGCC to ACTTTGTGGCC is described as c.8dupG
• "ins" indicates a insertion (like c.76_77insG)
• "inv" indicates an inversion (like c.76_83inv)
• "con" indicates a conversion (like c.123_678 con « MEN1 »)
HGVS General recommandations (3)
Pr. A. CALENDER - 2014
Elles génèrent un codon STOP parmiles 3 possibles dans le système universeldu code génétique soit TAA, TGA ou TAG
Nomenclature
c. ou g.1624 C >T p.Gln542terp.Q542X
Une substitution d’une base a pourconséquence le changement de la signification
en amino acide du codon
Nomenclature
c. ou g.1324 A >C p.His542Prop.H542P
07/12/2014
5
Pr. A. CALENDER - 2014
Il peut s’agir de délétion (del), d’insertion (ins), deduplications (non multiples de 3) ou de
réarrangements plus complexes
c.924 ins Cg.1484 delGc.1213_1231del17pbg.692_693del / c.92_93del
Nomenclature
Les mutations “frameshift” aboutissentgénéralement à un codon STOP prématuré situé plusou moins loin en aval de la délétion ou de l’insertion
Pr. A. CALENDER - 2014
c.924 ins AAA ou c.924 ins 3bpg.2484 ins AAAp.312insLys
Nomenclature
Les mutations ‘dites’ en phase ne modifient pas en théorie le cadre de lecture, car basées sur une délétion ouinsertion d’un nombre “multiple de 3” de bases. Cela est vrai pour les petites insertions ou délétions, mais plus pour
les anomalies de grande taille (+ de 12 bp ??) car l’ajout ou la disparition d’un grand nombre d’acides aminés peutmodifier la structure de la protéine et induire une dégradation active de celle-ci (perte d’expression)
ATG CCC GAA GTGTAC GGG CTT CACM P E V
ATG AAA CCC GAA GTGTAC TTT GGG CTT CACM K P E V
07/12/2014
6
Ex: intra exonic deletion of the MeCP2 gene in RETT syndrome - MeCP2 DEL (exon4)
Pièges du diagnostic en biologie moléculaire (PCR), ces délétions doivent être envisagées dans lesmaladies avec haplo-insuffisance dès lors que les recherches conventionnelles en séquençage
s’avèrent négatives, notamment dans les exons
Pr. A. CALENDER - 2014
Nombre de loci, outre ceux liés au chromosome X peuvent se retrouver en hémizygotie dufait de la délétion du second allèle, notamment dans les génomes des tumeurs
PERTE D’HETEROZYGOTIE
Caractéristique retrouvée (analysée) au niveau des gènes impliqués dans lescancers et dont la fonction physiologique est la régulation physiologique négative
de la prolifération cellulairePr. A. CALENDER - 2014
07/12/2014
7
Loss of heterozygosity with polymorphic markerssurrounding the MEN1 locus in 11q13 suggests that
MEN1 is a growth suppressor gene (Knudson)
PYGM ‘caga’ repeatLocated 70 Kb downstream
of MEN1
Pr. A. CALENDER - 2014
Pr. A. CALENDER - 2014
MEN1 gene
07/12/2014
8
Pr. A. CALENDER - 2014
Pr. A. CALENDER - 2014
MUTATIONS PONCTUELLES DES SITES D’EPISSAGE (1)
Elles surviennent aux jonctions EXON-INTRON et INTRON-EXON constituées de 2 basesconsensus présentes chez tous les organismes supérieurs :
- EXONS-INTRON : site donneur GT- INTRON-EXON : site accepteur AG
L’analyse de l’ARNm est le seul moyen de confirmer l’effet fonctionnel de ces mutations : excisionaberrante de tout ou partie de l’exon pour les altérations Du site donneur, rétention partielle del’intron pour le site accepteur, ou toute autre modification conditionnée par les sites cryptiques
d’épissage adjacents
07/12/2014
9
Pr. A. CALENDER - 2014
MUTATIONS PONCTUELLES DES SITES D’EPISSAGE (2)
L’épissage n’est pas un phénomène passif mais controlé par le spliceosome, complexede proteines régulatrices et de snRNA (small RNA)
Il est possible que des mutations ponctuelles situées au delà des sites DONNEUR etACCEPTEUR puissent influer le phénomène d’épissage
Ex : mutation ponctuelle située au milieu d’un intron peut modifier une séquenceconsensus de fixation d’un facteur d’épissage
Nomenclature
N° nucléotide extrême de l’exon - IVS +/- nbre nucléotides > Nucléot.1>nucléot.2
c.612 ivs12+1 G > A
c.613 ivs12-2 A > C
EXON 12 EXON 13
Intron 12
GT AG
+ -
Nombre des mutations de type NON SENS, en décalage de cadre de lecture aveccodon STOP prématuré, et probablement des sites donneurs / accepteurs
d ’épissage confèrent à l ’ARN messager une conformation qui pourrait stimuler leprocessus de ‘ mRNA decay ’
Pr. A. CALENDER - 2014
07/12/2014
10
Pr. A. CALENDER - 2014
MUTATIONS « DYNAMIQUES » (1)
Maladies par expansion de “triplets”
EPM : épilepsie myocloniqueFRAXA : retard mental lié à l’X-fragileFRDA : ataxie de FriedreichHD : maladie de HuntingtonSCA(…) : ataxie spinocérébélleuses 1-7DM : dystrophie myotonique de Steinert
Ces séquences sont susceptibles de se déstabiliser par“slippage” et l’amplification anormale est à l’origine desyndrome cliniques graves
Pr. A. CALENDER - 2014
07/12/2014
11
MUTATIONS « DYNAMIQUES » (2)
normales malades
Nbre de répétitions
Maladies Séquence
11-34 40-200Huntington’s diseaseGène HD
CAG
6-54 200-1300Syndrome de l’X Fragilegène FMR-1
CGG
Maladies par expansion de “triplets”
Fils atteint
Normal
Pr. A. CALENDER - 2014
EFFETS FONCTIONNELS DES MUTATIONS EN FONCTION DELEUR POSITION DANS LE GENE (1)
Régions promotrices - 5’
D D
Région 3’ UTR
Gène
Exons Introns
Mutations dans les sites régulateurs / promoteurs
Sous expression du gène (méthylation, mutation affectant un siteconsensus de fixation du complexe d’initiation)
Fusion-dérégulation dans les réarrangement du type translocation,inversion, délétion ...
Pr. A. CALENDER - 2014
07/12/2014
12
EFFETS FONCTIONNELS DES MUTATIONS EN FONCTION DELEUR POSITION DANS LE GENE (2)
Régions promotrices - 5’
D D
Région 3’ UTR
Gène
Exons Introns
Mutations exoniques
Modification de la signification d’un aa avec induction d’effet dominant-négatif et/oumodification de substrat et /ou déviation métabolique
Truncations proteiques (effet délétère)
Effet de délocalisation intra-cellulaire de la protéine (F508 dans CFTR)
Effet de la maturation et/ou stabilité post-transcriptionnelle et/oupost-traductionnelle
Pr. A. CALENDER - 2014
Mutations des sites d’épissage et intronique
Inactivation d’un site donneur d’épissage avec lecture “traductionnelle” d’un intron
Inactivation d’un site donneur ou accepteur d’épissage avec excision aberrante d’un exon
Activation d’un site cryptique d’épissage avec gain ou perte d’une séquence codante(ivs1-110G>A de la -globine)
EFFETS FONCTIONNELS DES MUTATIONS EN FONCTION DELEUR POSITION DANS LE GENE (3)
Régions promotrices - 5’
D D
Région 3’ UTR
Gène
Exons Introns
Pr. A. CALENDER - 2014
07/12/2014
13
EFFETS FONCTIONNELS DES MUTATIONS EN FONCTION DELEUR POSITION DANS LE GENE (4)
Régions promotrices - 5’
D D
Région 3’ UTR
Gène
Exons Introns
Mutations des sites régulateurs en 3’ (mal connus)
Altération du codon de terminaison et élongation protéiqueanormale (Hb constant spring TAA > CAA)
Altérations des signaux de polyadénylation > instabilité de l’ARNm
Pr. A. CALENDER - 2014
EFFETS FONCTIONNELS DES MUTATIONS ENFONCTION DE LEUR POSITION DANS LE GENE (5)
Régions promotrices - 5’
D D
Région 3’ UTR
Gène
Exons Introns
Mutations extra-géniques ou effets trans
Mal identifiées, il s’agit de mutations intervenant sur un gène ou uneséquence proche ou distante du gène de la maladie et influant pareffet “trans” sur celui-ci. Ex : Méthylation de la région FRAXA > FMR-2 associées > Retard mentaux
Pr. A. CALENDER - 2014
07/12/2014
14
07/12/2014
15
Techniques de biologiemoléculaire utilisées dans
un cadre diagnostique
Pr. A. CALENDER – Jeudi 8 novembre 2012
07/12/2014
16
Introduction
Diagnostic clinique
Confirmation par l’analyse génétique
Traitement et suivi adapté Étude des apparentés
Exclusiondesapparentésnonporteurs dela mutation
Traitement etsuivi adapté etprécoce desapparentésporteurs de lamutation
Analyses génétiques
Etude du génome
Cytogénétique conventionnelle« Etude à l’échelle du chromosome »Etude du caryotypeFish …
Biologie moléculaire« Etude à l’échelle du nucléotide »SéquençagedHPLC, HRMMultiplex
Cytogénétique moléculaireCGH array
07/12/2014
17
Diagnostic génétique
Recherche d'anomalies au niveau de l'ADNgénomique des patients.
Anomalie pathogène → diagnostic etsuivi du patient
Variant non classifié → nécessité de testfonctionnel afin d'évaluer son caractèrepathogène
Biologie moléculaire
• Mutation de petite taille :
– Mutation ponctuelle
– Délétion / duplication /insertion de petite taille
• Grands réarrangements :
– Délétion/duplication totale d’un gène
– Délétion / duplication d’un ou plusieurs exons
07/12/2014
18
Plan
• Recherche de mutation de petite taille– Techniques de criblage
• Technique dHPLC• Technique HRM
– Technique de Confirmation = Séquençage
• Classification des variants– Analyse In silico– Analyse ARNm
• Techniques quantitatives et semi-quantitatives– PCR en temps réels
• Fluorophore lié à ADN double brin• Hydrolyse de sondes
– Techniques de recherche des grands réarrangements• MLPA• MPLC
Techniques de criblage
07/12/2014
19
Méthodes de criblage
QUAND?
• Pour les gènes de grande taille
• Pour les pathologies avec de nombreux patients
POURQUOI?
• Analyse plus rapide
• Lecture et analyse des résultats plus facile
• Gain de temps technique
• Gain sur les coûts de réactifs
Gène d’intérêt
Principe de formation des Hétéroduplexes 1/2
Amplification par PCRà partir d’amorcesspécifiques
Dénaturation de l’ADNdouble brin parChauffage à 95°C
Variant génétique
07/12/2014
20
Renaturation en ADN double brinpar refroidissement progressif
Homoduplexes
Principe de formation des Hétéroduplexes 2/2
Hétéroduplexes
Mésappariements
Conditions d’obtention des hétéroduplexes
• PCR très spécifique :
– Taq Polymerase proofreading
– protocole PCR Touchdown
• Analyses par comparaison entre deuxrésultats
• Propriétés thermiques différentes deshomoduplexes:
– dHPLC: Température d’analyse spécifique
– HRM: Courbe de dénaturation
07/12/2014
21
Technique dHPLC
• dHPLC: denaturing Hight PerformanceLiquid Chromatography
• Développée depuis 2000
• Un seul fournisseur : Transgenomic®
• Plusieurs conditions d’utilisation:– Dénaturantes (80°C) (simple-brin)
– Non dénaturantes (50°C) (double-brins)
– Semi dénaturantes (double-brins)
Principe de la technique dHPLC 1/2
Rétention sur Colonne dHPLC des acides nucléiques
Phase mobile:TEAA et ACN
Interactionhydrophobeentre PS-DVBet TEAA
PhaseStationnaire:PS-DVB
Interactionionique entreTEAA etADN
PS-DVB Phase stationnaire
PS-DVB
Homoduplexe Hétéroduplexe
Flot Flot
Flot dePhasemobile
Flot dePhasemobile
07/12/2014
22
Principe de la technique dHPLC 2/2
Élution des mésappariements et des homoduplexes
Augmentationprogressive dela concentrationen ACN
Élution ensecond deshomoduplexes
PS-DVB
ACN
ACN
ACN
ACN
Flot Flot
Flot Flot
ACN
ACN
Élution enpremier deshétéroduplexes
Appareils de dHPLC
07/12/2014
23
Principe de l’appareil dHPLC
• Chromatographieliquide
• Comme les HPLCclassique
• Phase solidespécifique aux acidesnucléiques
INJECTION
RETENTIONSEPARATION
DETECTION
Résultats dHPLC 1/2
A T C GA TCG
Hétéroduplexes Homoduplexes
Détection desADN par UV
Analyseinformatique
07/12/2014
24
Résultats dHPLC 2/2
• Analyse par comparaison avec le profil d’unéchantillon non atteint
• Choix des paramètres d’analyses très délicat
Avantages et inconvénients de la dHPLC
• Mise au point délicate (PCR et technique)
• Maintenance importante
• Analyse nécessite expérience de l’opérateur
• Pas de reproductibilité parfaite
• Très bonne sensibilité
• Préparation rapide
• Lecture rapide
• Appareil semi-automatique
• Plusieurs applications possibles
07/12/2014
25
Applications dHPLC
• Genotypage
• Criblage de mutations
• Gene mapping (par génotypage multiple)
• Détection de méthylation (après traitementau bisulfite)
Technique HRM
• HRM: Hight Resolution Melting
• Développée depuis 2003
• Plusieurs fournisseurs
• Mesure d’une fluorescence émise par desfluorophores (dyes)
07/12/2014
26
Appareils de HRM
Principe et caractéristiques duRotorGene Q
Gamme detempérature
25 - 99°C
Vitesse detempérature
+/- 2,5°C
Précision detempérature
+/- 0,02 °C
07/12/2014
27
Étapes
• Amplification en présence d’un fluorophoreintercalant l’ADN
• Formation des hétéroduplexes
• Dénaturation de l’amplicon avec mesurede la fluorescence en temps réel
• Analyse des courbes de fusion obtenues
Nécessité de dyes saturants
Dyes nonsaturants
Dyessaturants
Réincorporationdu dye
Fluorescencenon linéaire à lacourbe dedénaturation desADN
Réincorporation impossible Linéarité entre fluorescence et courbede dénaturation des ADN
07/12/2014
28
Principe de la HRM
1
2
3
Fluorescenceen %
Dye émet de la fluorescence quand:
•Incorporation sur ADN double-brins
•Excitation par une source d’énergie
ADN se dénature Relargage du dye Fin de la fluorescence
Températureen °C
Courbes de visualisation
des résultats 1/4
Courbes de fusion brutes
Permettent de voir:• Homogénéité entres les courbes• PCR inefficaces• Vérification « Blanc de PCR »
Standardisation de la fluorescence parrapport à la valeur la plus forte
Résultats sous forme de %
07/12/2014
29
Courbes dérivées
Permettent de :• Voir la spécificité de la PCR• Placer les fenêtres denormalisation
Courbes de visualisationdes résultats 2/4
Courbes normalisées
Courbes de visualisation
des résultats 3/4
• Obtenues aprèsnormalisation
• Permettent de comparerles courbes entres elles
07/12/2014
30
Courbes des différences
Courbes de visualisation
des résultats 4/4
Obtenues par comparaisoninformatique point par pointavec une ou plusieurscourbes de référence
Permettent de comparerles courbes avec uneréférence connue(généralement le WT)
Variant 1
Variant 2Variant 3
Résultats HRM
Dérivé mathématique des courbesnormalisées par rapport à une courbede référence
Analyse par comparaison avec le profil d’unéchantillon non atteint
Variant 1
Variant 2
Variant 3
Normalisation des courbes :mise à niveau des intensitésdes courbes
07/12/2014
31
Avantages et inconvénients de la HRM
• Très bonne sensibilité
• Lecture rapide
• Préparation rapide
• Maintenance simple
• Cadence importante
• Mise au point PCR délicate
• Analyse nécessite expérience de l’opérateur
• Moins performant sur fragments >300pb
• Appareils non polyvalents
Applications HRM
• Genotypage
• Criblage de mutations
• Diagnostic microbiologique
• Quantification ARN
• Etude de la compatibilité HLA
• Détection de méthylation (après traitement aubisulfite)
• Contrôle de l’amplification PCR
• Caractérisation de clones
• Détection d’hétéroplasmie de l’ADN mitochondrial
07/12/2014
32
Séquençage
Séquençage direct
07/12/2014
33
Principe séquençage 1/3
Cible et amplification de la région à étudier par PCR puis séquençage
Principe séquençage 2/3
Au vue du nombre de copie, au final, statistiquement, toutes les bases sont marquées
07/12/2014
34
Principe séquençage 3/3
07/12/2014
35
Séquenceurs 1/2
Séquenceur à 16 capillaires =16échantillons en même temps
Électrophorèse des fragments d’ADN dansun tube très fin (=capillaire) remplit de geld’acrylamide (=polymère)
Migration des fragments ADN chargé (–)grâce à leur phosphate vers l’electrode (+)
Détection par excitation au laser desfluorophores couplés aux ddNTP
Conversion des longueurs d’onde lues endonnées biologiques (1 longueur d’onde = 1nucléotide)
Séquenceurs 2/2
07/12/2014
36
Fonctionnement du séquenceurcapillaire 1/3
Fonctionnement du séquenceurcapillaire 2/3
07/12/2014
37
Injection électrocinétique
Fonctionnement du séquenceurcapillaire 3/3
Nappe decapillaires
Sens de l’electrophorèse
07/12/2014
38
Détection du signal 2/2
Détection du signal 1/2
07/12/2014
39
• Pour connaître la séquence des ADN, on fait synthétiser un brin d'ADN parune enzyme spécifique.
• L'enzyme commence son travail à partir de l'extrémité 3' d'une sondehybridée qui sert d'amorce. Elle ajoute des nucléotides complémentaires de ceuxdu brin d'ADN qu'elle copie.
• On lui donne pour substrats des désoxynucléotides triphosphates normauxmélangés avec des didésoxynucléotides dont la fonction alcool secondaire en 3'est réduite ce qui empêche la synthèse de se poursuivre au delà.
• Les didésoxynucléotides incorporés en dernier sont marqués spécifiquementpar des molécules fluorescentes (vert pour didésoxyA, bleu pour didésoxyC,jaune pour didésoxyG et rouge pour didésoxyT)
• On sépare ensuite les fragments synthétisés dans un champ électrique(électrophorèse : les ADN sont des anions, ils vont donc vers le pôle +), enfonction de leur longueur (les plus petits vont plus vite).
• On lit ensuite les taches successives, identifiées par leur couleur, ce qui révèlela séquence des fragments synthétisés.
Résultats du séquenceur
07/12/2014
40
Résultats du séquençage
Substitutionhétérozygotte
Substitutionhomozygotte
07/12/2014
41
Délétionhétérozygotte
Limites du séquençage 1/2
• On ne trouve que ce que l’on cherche
• Délétions ou duplications non mises en évidence
Exon 3
Exon 3
Allèle 1
Allèle 2
Zone étudiée
Exon 3Allèle 1
Allèle 2
Zone étudiée
07/12/2014
42
Limites du séquençage 2/2
• Mosaïques difficilement détectables
• Coûteux et très longs
Classification des variants
07/12/2014
43
Diagnostic des modifications non classifiées
• Sont considérées comme mutations pathogènes :
– Codon stop (décalage du cadre de lecture ou substitution)
– Variation au niveau des sites consensus d’épissage (10%
des mutations)
– Variation de novo
– Modification déjà décrite comme pathogène dans lalittérature.
• Problèmes :
– Séquençage principalement des séquences codantes etdes jonctions introns-exons.
– Comment considérer une modification non classifiée?
Exemples de variants non classifiés
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
c.30G>T p.L10L c.1314C>T p.T438TSilent/
PM
c.1-22C>Ac.1-16G>Ac.1-10G>A
UpstreamATG
Deepintronic
c.600C>T p.G200G
c.654+55delC
c.654+82C>T
c.825-41C>T
ATG TGA
Gène MEN1 : - 10 exons- exon 1 non codant- début de l’exon 2 non codant.
Effet potentiel sur le processus d’épissage
07/12/2014
44
Rappel des bases de l’épissage
Baralle &Baralle, J Med Genet, 2005
ARNprémessager
ARNm
Site donneurSite de
branchementSite accepteur
Rappel des bases de l’épissage
Wang & Cooper, Nature Reviews Genetics, 2007
Autres séquences consensus jouant un rôle dans l’épissage :• ESE (exonic splicing enhancer)• ESS (exonic splicing silencer)• ISE (intronic splicing enhancer)• ISS (intronic splicing silencer)
07/12/2014
45
Baralle &Baralle, J Med Genet, 2005
Mutations pouvant avoir un effet surl’épissage
Tous les variants peuvent potentiellementaffecter l’épissage
• Variants des sites consensus d’épissage (exonou intron)
• Variants introniques ou exoniques hors des sitesconsensus d’épissage
07/12/2014
46
Conséquences des variants sur le mécanismed’épissage
Houdayer & Stoppa-Lyonnet, med & sci, 2005
Conséquences des variants sur le mécanismed’épissage
Ars et al., hum mol genet, 2000
Gène NF1 : ~50% des mutations affectent le processus d’épissage
07/12/2014
47
Techniques d’étude des anomaliesd’épissage
• Analyse de l’ADN génomique
• Analyse in silico
• Analyse de l’ARNm
Analyse de l’ADN génomique
• Séquençage de l’ADN :
– Parties codantes
– Jonctions intron-exon.
• Avantages :
– Robustesse de la molécule d’ADN
– Facilité de l’extraction
– Systématisation des techniques de séquençage.
• Inconvénients :
– Anomalies hors zones séquencées non détectées
– Difficulté d’interprétation de certaines modifications(30% pour BRCA1).
07/12/2014
48
Analyses in silico
• Matrices permettant d’identifier les sites régulateursde l'épissage :
– Splice Site Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html)
– MaxEntScan(http://genes.mit.edu/burgelab/maxent/Xmaxentscan_scoreseq.html)
– GeneSplicer (http://www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html)
– Splice Site Finder (http://www.genet.sickkids.on.ca/~ali/splicesitefinder.html)
– ESE Finder (http://www.exon.cshl.org/ESE/index.html)
– Rescue ESE (http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-exe/)
– Human Splicing Finder (http://www.umd.be/HSF) .
• Avantages :
– Screening informatique rapide.
• Inconvénients :
– Relativement efficaces pour les modifications des sitesconsensus d’épissage
– Insuffisante pour les autres modifications.
Analyse de l’ARNm
• Méthodes d’analyse de l’ARN:
– Analyse directe de l’ARNm
– Utilisation de la technique des minigènes.
07/12/2014
49
Analyse directe de l’ARNm
Patient Témoin
• Technique d'étude :
– Extraction d'ARN total issu de sangou de cellules d’une lignéelymphoblastoïde établie à partir dusang du patient
– Reverse transcription de l'ARNm enADNc puis amplification par PCR
– Dépôt sur gel d’agarose afin dedétecter un (ou des) ADNc detaille(s) anormale(s)
– Séquençage des ADNc de tailleanormale.
Analyse directe de l’ARNm
Contrôle Exon 8Exon 7
Exon 8Patient Intron 7
149 nucléotides
Exon 7
La substitution d'un nucléotide du site donneur d'épissageentraîne la rétention de l'intron.
07/12/2014
50
Analyse directe de l’ARNm
• Avantages :
– Puissance diagnostique de l’ARNm
– Si l’ARNm est disponible, technique envisageable dansun laboratoire de diagnostic.
• Inconvénients :
– Fragilité de l’ARNm
– Impossible si le prélèvement est dégradé ou lorsd’envoi d’ADN déjà extrait
– Nécessité d’établir des lignées lymphoblastoïdes danscertains cas.
Analyse de l’ARNm par la technique desminigènes 1/2
• PCR du fragment d’intérêt à partir de l’ADN du patient
• Les amorces avec sites de clivage d’enzymes de restriction
• clonage dans un vecteur d’expression (pcDNA, pcINeo…).
Tournier et al., Hum Mutat, 2008
07/12/2014
51
Analyse de l’ARNm par la technique desminigènes 2/2
Baralle &Baralle, J Med Genet, 2005
•Transformation de bactériespour l’amplification du vecteur
•Extraction de l’ADNplasmidique à partir desbactéries
•Transfection transitoire(HeLa, HEK293…)
• Extraction de l’ARNm
• Analyse par RT-PCR.
Analyse de l’ARNm par la technique desminigènes
• Avantages :
– Robustesse de l’ADN
– Puissance diagnostique de l’ARN.
• Inconvénients :
– Technique longue
– Génération d’OGM
– Actuellement non envisageable dans un laboratoire dediagnostic.
07/12/2014
52
Classification des variants : conclusions
• L’analyse des séquences codantes de l’ADN n’est passuffisante pour détecter toutes les mutations.
• Dans certains cas, le processus d’épissage peut être affecté.
• Les outils bioinformatiques sont potentiellement prometteursmais non suffisants actuellement.
• L’analyse de l’ARNm par la technique des minigènes restedifficilement envisageable en diagnostic de "routine".
PCR en temps réel
07/12/2014
53
Principe de la qPCR
• Détection et quantification d’un émetteurfluorescent pendant le processusd’amplification
• Augmentation de la fluorescenceproportionnelle à la quantité d’ampliconproduite durant la réaction (lors de laphase exponentielle)
07/12/2014
54
PCR en temps réel 1/2
2 types de technologies de détection :
• Fluorophore lié à ADN double brin
= SybR Green
• Sondes fluorescentes par hydrolyse desondes = TaqMan
• Permet une mesure de la quantité d’ADN dans unéchantillon
• Mesure de la fluorescence en fin de chaque cycle
Phaseexponentielle
Sortie du bruit de fond : Cycle de sortie (Ct)
PCR en temps réel 2/2
07/12/2014
55
CT value
• CT “cycle treshold”
• Le CT est le nombrede cycles nécessairespour que lafluorescence atteigneun certain seuil
• Il existe une relationlinéaire entre la valeurdu Ct et le log dunombe de copies
CT
07/12/2014
56
SybR Green 1/2
• SybR Green va s’intercaler dans la double hélice ADN
• Réaction de PCR standard + SYBR Green• Émission de fluorescence uniquement quand intercalé à
l’ADN• Augmentation de la fluorescence à chaque cycle
• Mesure de la fluorescence en fin de chaque cycle
• Phase exponentielle = quantitatif avec un facteur 2 àchaque cycle
• Comparaison avec une gamme obtenue sur un gènetémoin Quantification
SybR Green 2/2
07/12/2014
57
Sonde TaqMan
Reporter Quencher5 ’ 3 ’Fluorescéine ou FAM TAMRA
488 nm
520 nm
570 nm
Principe: Lors de la PCR, 3 oligonucléotides simples brins sontajoutés au milieu réactionnel
• Les deux amorces permettant l’amplification (amorce directeet amorce inverse complémentaire
• Une sonde qui peut s’hybrider sur une séquencecorrespondant au produit de PCR amplifié (spécificité!!)
La sonde contient deux fluorophores: un reporter qui est excité par le laser,et un quencher dont la longueur d’onde d’excitation correspond à lalongueur d’onde d’émission du reporter. Lorsque les deux fluorophores sontà proximité, le quencher absorbe la fluorescence du reporter.
488 nm
FAM
570 nm
488 nm 520 nm
TAMRA
5’ 3’
5’
Hybridation
Elongation
Mesure à la fin de l’étaped’élongation
Pendant la PCR, la sonde s’hybride sur l’ADN simple brin lors del’étape d’hybridation des amorces
488 nm 570 nm
5’ 3’
3’ 5’
Taq: ADN polymérase5’-3’ et ActivitéExonucléase 5’-3’
07/12/2014
58
Sonde TaqMan
Exemple de TaqMan
07/12/2014
59
Autres techniques qPCR
• HybProbe
• Molecular Beacons
• Scorpion primers
• Eclipse probe
• Amplifluor Chemistry
• LUX primers
• BD Qzyme primers
• …
RT- PCR : Reverse Transcriptase PCR
ARN : matrice d'amplification
- transformation d’ARNm en cDNA sous l’action d’unetranscriptase reverse
- amplification du cDNA par PCR.
Trois types d’amorces :- oligo dT qui s’hybrident sur la queue poly A des ARNm- amorces d’hexanucleotides qui s’hybrident à différentsendroits de l’ARNm- amorce spécifique de l’ARNm à étudier
07/12/2014
60
AAAAAAAA
TTTTTTTTRT
AAAAAAAA
AAAAAAAA
RT
Trois types d’amorces
Applications qPCR
• Quantification d’ADN et ARN
• Détection et quantification microbienne
• Gene Expression
• Genotypage
07/12/2014
61
Techniques derecherche de grands
réarrangements
Grands réarrangements
• Délétion ou duplication
1 copie 2 copies 3 copiesdélétion duplication
07/12/2014
62
Only if ligation happened, a functional PCR strand appears, so that amplification only happens if target DNA ispresent in the sample. The amount of PCR product is proportional to the amount of target DNA present in the
sample, making the technique suitable for quantitative measurements. The stuffer sequences are varied in lengthso that a range of up to 50 targets can be amplified and separated in a single experiment
MLPA
Subtelomeric del1p36)detected by MLPA
07/12/2014
63
Résultats MLPA
Résultats MLPA
07/12/2014
64
Principe MPLC
• PCR multiplexe
• Sur appareil dHPLC
• Marquage par fluorescence : intégrationd’un fluorophore directement dans laphase mobile modules supplémentaires
• Séparation par des tailles différentes
Résultats MPLC 1/2
Exon 2 VHL Exon 3 VHL
Exon 1 VHL
Exon 24 NF1
Patient sain
Patient sain et patient muté délétion des exons 2 et 3
Patient sain et patient mutéaprès normalisation
07/12/2014
65
Exons 8 et 2 BHD
Exons 11 et 10 BHD
Exons 7 et 6 BHD
Exon 1 BHD
Exons 4 et 5 BHD
Exons 14, 12+13 et 9 BHD
Ti 305
MPLC BHD
Résultats MPLC 2/2
Conclusions
• Outils moléculaires utilisés doivent être adaptésà ce qui est recherché
• Certains variants nécessitent d’autres analyses :corrélation dans la famille, étude sur unepopulation témoin…
• Techniques de routine pour l’instant maisd’autres approches sont en développement :analyse génomique par MS, Next generationSequencing Plateform…
07/12/2014
66
MUTATION ?
AGT GGTAcide aspartique Glycine
07/12/2014
67
MUTATION, CONTAMINATION ?
DELETION DE 5 pb !
07/12/2014
68
07/12/2014
69
Top Related