1O.Lascols / Nov2007
GGéénnééralitralitéés sur les s sur les
voies de signalisationvoies de signalisation
Olivier LascolsOlivier LascolsFaculté de Médecine Pierre et Marie CurieFaculté de Médecine Pierre et Marie Curie
2O.Lascols / Nov2007
I.I. CaractCaractéérisation drisation d’’une voie une voie
de transduction dde transduction d’’un signalun signal
Exemple du Signal Exemple du Signal MitogéniqueMitogénique de l’EGFde l’EGF
1. Quel récepteur ?1. Quel récepteur ?2.2. Quels relais intracellulaires ?Quels relais intracellulaires ?33. . Spécificité de ces relais intracellulaires ?Spécificité de ces relais intracellulaires ?
1. Interactions et transducteurs1. Interactions et transducteurs2.2. PléïotropiePléïotropie d’un signald’un signal33. . Intégration de signaux par la celluleIntégration de signaux par la cellule
II. Le rII. Le rééseau de la signalisation cellulaireseau de la signalisation cellulaire
3O.Lascols / Nov2007
????
La transduction des signaux: gLa transduction des signaux: géénnééralitralitééss
�� Début des années 1980Début des années 1980
membrane R
ligand
Cibles cellulaires
Système d’amplificationSystème d’amplification
arrivée du signal
transduction par récepteur
émission intracellulaire du signal
• quels seconds messagers ?• quels relais ?
effets biologiqueseffets biologiques
4O.Lascols / Nov2007
La transduction des signaux aujourdLa transduction des signaux aujourd’’huihui
R
ligand 2
NOYAU
R
ligand 3
Transports
Métabolisme
Etablissement de réseauxcomplexes par les progrèsen biologie cellulaire etmoléculaire :
� Directe : ligand 1
� Modèles cellulaires :• Modification
d’expression de protéines
• Mutagénèsedirigée
� Modèles animaux :• Souris Knock-out• Souris Knock-in
ligand 1
R
Stratégie de signalisation :
� Clonage de gènes
� Indirecte: ligand 2 ou 3
5O.Lascols / Nov2007
I.I. CaractCaractéérisation drisation d’’une voie une voie
de transduction dde transduction d’’un signalun signal
Exemple du Signal Exemple du Signal MitogéniqueMitogénique de l’EGF (de l’EGF (EpidermalEpidermal GrowthGrowth FactorFactor))
1. Quel récepteur ?1. Quel récepteur ?Méthodologie d’étude des récepteursMéthodologie d’étude des récepteurs
localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/fonctionfonction
2.2. Quels relais intracellulaires ?Quels relais intracellulaires ?a. Méthodes d’étudea. Méthodes d’étude
test de protéines connues, recherche de nouveaux partenaires, localisation
b. La voie d’activation des MAP Kinases par l’EGFb. La voie d’activation des MAP Kinases par l’EGF
33. . Spécificité de ces relais intracellulaires ?Spécificité de ces relais intracellulaires ?a. Méthodes d’étudea. Méthodes d’étude
inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, transgénèsetransgénèse
b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, tempsb. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, temps
6O.Lascols / Nov2007
MMééthodologie dthodologie d’é’étude des rtude des réécepteurscepteurs
ETAPEETAPE MATERIELMATERIEL METHODESMETHODES RESULTATSRESULTATS
Localisation . tissus . Test de liaison. cellules -autoradiographie
- microscopie proliférationélectronique différenciation
. Effets biologiques apoptose …
Localisation .membranes . fractionnementCellulaire . cytosol subcellulaire capacité
. test de liaison spécificité
Sélection . récepteurs . chromatographiepurifiés d’affinité (Ab, ligand)
. test de liaison
Clonage . ADNc . Criblage de banque . Séquence protéique. Domaines spécialisés. Expression du récepteur
cystéine
transmb
TKtyrosines
Caractérisation protéines . solubilisation . Structure . Activitésolubilisées . test de liaison nature, taille enzyme…
. électrophorèse
. immunoprécipitation
. test d’activité
Structure / . récepteurs . Mutagénè se dirigée . Mode de transductionFonction mutés . transfection
. cellules
7O.Lascols / Nov2007
Interaction LigandInteraction Ligand••RRéécepteurcepteur
� Réversible
� Saturable : nombre de site récepteur défini = Ro
L + R LR
*L + R *LRfixation spécifique
LR� Spécificité
� *L : ligand radioactif
*L + R + X *LR + *LX
*L + L + X *LX + LX
� L : excès de ligand « froid »
fixation totale
totale
spécifique
fixation non spécifique
non spécifique
8O.Lascols / Nov2007
Etude de la structure du rEtude de la structure du réécepteurcepteur
� Structure fixant l’EGF
• liaison de 125I-EGF
125I-EGF + R 125I-EGF/R
• pontage covalent
125I-EGF + R 125I-EGF/R
DSS
• électrophorèse en SDS• autoradiographie
� Identification par Western blot
9O.Lascols / Nov2007
Séquence I en aade la protéine
Expression de la protéine
Mutagénèse dirigée
Production d’anticorps
Clonage dClonage d’’une protune protééineine
ARNm
ADNc
vecteur recombinant
Banque d’ADNc
Protéine purifiée
séquence nucléotidiqueAAGTCCTGCGGTGACAACGGTCG
= SONDE
séquence partielleen acides aminés
Lys-prol-trp-tyr-asp-ser-cys-ala
Criblage de la banque
ADNc du gène
Séquence nucléotidique complète
cellule
10O.Lascols / Nov2007
Etude structure fonctionEtude structure fonction
� Construction de mutants du récepteur à l’EGF
� Autophosphorylation desmutants EGFR
� Répétitions richeen leucine
� Domaine riches en cystéine
� Domaine Tyrosine Kinase
� Domaine C-terminal
11O.Lascols / Nov2007
Activation dActivation d’’un run réécepteur tyrosine kinase (TK)cepteur tyrosine kinase (TK)
TK
P
ATP
ADPY
1. Autophosphorylationsur des résidus tyrosinesdu récepteur
TK
P
ATP ADP
Y
substratY
substratP
Y
2. Phosphorylationsur des résidus tyrosinesde substrats endogènes
Mb
12O.Lascols / Nov2007
Activation par Activation par dimdiméérisation risation et transphosphorylation et transphosphorylation
a. Forme repliée d’EGFR:-faible affinité de liaison de l’EGF- pas d’activité kinase
� Apport de la cristallographie et de la bioinformatique :Structure 3D
b. Fixation de l’EGF:- changement conformationnel du monomère (allostérie)
- démasquage de la boucle de dimérisation.
b. Dimérisation:- dos à dos- activation de la tyrosine kinase
13O.Lascols / Nov2007
I.I. CaractCaractéérisation drisation d’’une voie une voie
de transduction dde transduction d’’un signalun signal
Exemple du Signal Exemple du Signal Mitogénique Mitogénique de l’EGFde l’EGF
1. Quel récepteur ?1. Quel récepteur ?Méthodologie d’étude des récepteursMéthodologie d’étude des récepteurs
localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/fonctionfonction
2.2. Quels relais intracellulaires ?Quels relais intracellulaires ?a. Méthodes d’étudea. Méthodes d’étude
test de protéines connues, recherche de nouveaux partenaires, localisation
b. La voie d’activation des MAP Kinases par l’EGFb. La voie d’activation des MAP Kinases par l’EGF
33. . Spécificité de ces relais intracellulaires ?Spécificité de ces relais intracellulaires ?a. Méthodes d’étudea. Méthodes d’étude
inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, transgénèsetransgénèse
b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, tempsb. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, temps
14O.Lascols / Nov2007
Etude des interactions : entre molEtude des interactions : entre moléécules connuescules connues
� Activation par le ligand
� Immunoprécipitation des complexes formésavec anticorps spécifique
� Séparation des constituants du complexe par électrophorèse
� Visualisation des protéinespar immunoblot avec des anticorps spécifiques
15O.Lascols / Nov2007
ApplicationApplication
Implication de Grb2 dans la voie de signalisation induite par EGImplication de Grb2 dans la voie de signalisation induite par EGFF
1. Le récepteur à l’EGF change de taille apparente
3. Induction d’une interaction entre EGFR et Grb2
IP : immunoprécipitation
IB : immunoblot
2. Le récepteur à l’EGF est phosphorylé sur une tyrosine
Lors de l’activation par EGF:
16O.Lascols / Nov2007
Clonage dClonage d’’un nouveau partenaireun nouveau partenaire
Expression de la protéine
Clones positifs radioactifs
Séquençage des ADN
Banque d’expression d’ADNcFragment EGFR marqué
Criblage de la banque
Y-125I
Production d’anticorps
Immunoprécipitation Immunoblot
17O.Lascols / Nov2007
SystSystèème double hybride me double hybride (1)(1)
BD : Binding DomainAD : Activating Domain
UAS : Upstream Activating Sequence
18O.Lascols / Nov2007
SystSystèème double hybride me double hybride (2)(2)
Criblage dCriblage d’’une librairie dune librairie d’’expressionexpression
19O.Lascols / Nov2007
Etude de la localisation dEtude de la localisation d’’un relaisun relais
stimulation par le ligand
Localisation de la protéine chimère
si TAG non fluorescent
Microscopie confocale en lumière fluorescente
si TAG fluorescent
Ex: GFPGreen Fluorescent Protein
Ab fluorescent anti-TAG
Expression de la protéine chimère
ADNc de protéine relais ADNc de protéine TAG
ADNc de protéine chimère
20O.Lascols / Nov2007
b. La voie db. La voie d’’activation des MAPK par lactivation des MAPK par l’’EGF : EGF :
recrutement drecrutement d’’un premier relais par EGFR activun premier relais par EGFR activéé
2. Interaction entre Tyr-P et SH2
Mb
P
TK
Y
TK
YP
Grb2sos
1. Complexe Grb2/sos
Grb2sos
Domaine SH2
Domaine SH3
Grb2 : Growth ReceptorBound Protein
sos : son of sevenless
3. Localisation à lamembrane de sos
Grb2sos
P
TK
Y
TK
YP
P
21O.Lascols / Nov2007
Activation dActivation d’’un 2un 2èème relais membranaireme relais membranaire
1. Interaction sos ras
Mb
ras : petite protéine Gmyristoyléelocalisation membranaire
Grb2sos
P
TK
Y
TK
YP
ras
GDP
2. Echange GDP-GTP
ras
GTP
P
22O.Lascols / Nov2007
Cycle dCycle d’’activationactivation--inactivation de la protinactivation de la protééine rasine ras
Protéine G : régulation allostériqueactivité GTPase
sos : protéine d’échangeRaf1 : protéine effectriceGAP : GTPase activating protein
ConductionConduction
du SIGNALdu SIGNAL
2. Echange GDP-GTP
1. ras.GDP inactive
ras
GTP
SIGNALSIGNAL
ras
GDP
GTP
GDP
Protéine
d’échange
Protéine
Effectrice
3. Ras GTP active
4. Interaction protéine effectrice
Pi
GAPGTPase
5. Hydrolyse du GTP
23O.Lascols / Nov2007
Structure de la Kinase RafStructure de la Kinase Raf--11
CR : conserved regionCRD : cystein rich domainRBD : ras binding domain
S : sérineT : thréonineY : tyrosine
24O.Lascols / Nov2007
ModModèèle dle d’’activation de Rafactivation de Raf--11
(Current Opinion in Cell Biology (1997) 9:174-179)
1. Ras et raf inactives
1
2. Activation ras - interaction raf
2
3. Activation de raf et déplacement de la protéine 14.3.3
3
4. raf: sérine/thréonine kinase,phosphorylable par Src ou prot X
4
25O.Lascols / Nov2007
Activation dActivation d’’une cascade de Kinasesune cascade de Kinases
P
Raf1
P
P
Noyau
activationde la transcription
3. Translocation MAPK nucléaire
MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase 2. MEK thr/tyr kinase sur MAPK
Thr
Tyr
Thr
Tyr
P
PATP ADP
MAPK
MEK : MAPK ou ERK Kinase 1. Raf1 ser/thr kinase sur MEK
Ser
Ser
Ser
Ser
P
PATP ADP
MEK
26O.Lascols / Nov2007
I.I. CaractCaractéérisation drisation d’’une voie une voie
de transduction dde transduction d’’un signalun signal
Exemple du Signal Exemple du Signal Mitogénique Mitogénique de l’EGFde l’EGF
1. Quel récepteur ?1. Quel récepteur ?Méthodologie d’étude des récepteursMéthodologie d’étude des récepteurs
localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/localisation, nature, spécificité, activité, clonage, structure/fonctionfonction
2.2. Quels relais intracellulaires ?Quels relais intracellulaires ?a. Méthodes d’étudea. Méthodes d’étude
test de protéines connues, recherche de nouveaux partenaires, localisation
b. La voie d’activation des MAP Kinases par l’EGFb. La voie d’activation des MAP Kinases par l’EGF
33. . Spécificité de ces relais intracellulaires ?Spécificité de ces relais intracellulaires ?a. Méthodes d’étudea. Méthodes d’étude
inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, inhibiteurs pharmacologiques, stratégie antisens, transgénèsetransgénèse
b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, tempsb. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, temps
27O.Lascols / Nov2007
Inhibition pharmacologique des voies de signalisationInhibition pharmacologique des voies de signalisation
� Points d’impact sur la voie mitogénique de l’EGF
RTK
Grb2, Shc
sos
Ras
Raf
MAPKK
MAPK
Noyau
Facteur de croissance
SH2
Anticorps
PLCg
PI3KPTP
Inhibiteur Tyrosine Kinase
Inhibiteur de SH2
Inhibiteur de SH3
Inhibiteur d’échange
Inhibiteur de farnésylationde Ras
Inhibiteur de Ras
Inhibiteur de Raf
Inhibiteur de MAPK
Inhibiteur de MAPKK
Inhibiteur Inhibiteur Inhibiteur
28O.Lascols / Nov2007
Inhibition pharmacologique des voies de signalisationInhibition pharmacologique des voies de signalisation
29O.Lascols / Nov2007
StratStratéégies de modification dgies de modification d’’une voie de signalisation une voie de signalisation (1)(1)
� Antisens� RNA silencing� Transfection cellulaire� Transgénèse chez l’animal
� Antisens
� RNA silencingThéorie du RNAi (RNA interférence)
Prix Nobel de médecine et de physiologie 2006 : Andrew Fire et Craig Mello.
� Éléments de régulation cellulaire� Outils d’étude
30O.Lascols / Nov2007
StratStratéégies de modification dgies de modification d’’une voie de signalisation une voie de signalisation (2)(2)
� RNA silencing Dicer: hélicase/RNase
RISC : RNA-induced silencing complexes
Application: synthèse in vitro de siRNA ciblé et transfection dans les cellules
31O.Lascols / Nov2007
StratStratéégies de modification dgies de modification d’’une voie de signalisation une voie de signalisation (3)(3)
� Transfection cellulaire
� Transfection d’un gène normal ou muté dans une cellule hôte
� Surexpression de forme mutée « dominant négatif »
32O.Lascols / Nov2007
StratStratéégies de modification dgies de modification d’’une voie de signalisation une voie de signalisation (4)(4)
� Transgénèse chez l’animal
� Surexpression d’un gène : transgénèse additive
� Invalidation d’un gène : transgénèse substitutive par recombinaison homologue : souris Knock-Out (KO)
Cellules ES : cellules souches embryonnaires
33O.Lascols / Nov2007
StratStratéégies de modification dgies de modification d’’une voie de signalisation une voie de signalisation (5)(5)
� Invalidation d’un gène : souris hétérozygotes et homozygotes
Processus de recombinaison sous contrôle d’un promoteur spécifique de tissu
� Knock-out conditionnel et spécifique de tissu: syst ème CRE-Lox
� Substitution d’un gène par un autre : souris Knock- in (KI)
34O.Lascols / Nov2007
b. Intégration des 3 dimensions : nature, lieu, tem ps
�� Car nombreux éléments communsCar nombreux éléments communs ::•• Principes d’activationPrincipes d’activation
•• Intermédiaires communs Intermédiaires communs
•• Interactions protéineInteractions protéine--protéineprotéine
•• Effets biologiquesEffets biologiques
� Régulation spatio-temporelle :• Compartimentalisation• Cinétique des activations
Quelle spécificité du signal ?Quelle spécificité du signal ?
35O.Lascols / Nov2007
•• Nature : spNature : spéécificitcificitéé des signaux et des rdes signaux et des réécepteurs (1)cepteurs (1)
� Diversité des ligands
� Dimérisation de diverses isoformes du récepteur à l’ EGF : - HER1 (ou EGFR ou erbB1), HER2, HER3 et HER4.
Rq: HER3 est dépourvu d’activité tyrosine kinase.
- Homo- ou hétérodimères- Expression variable
36O.Lascols / Nov2007
•• Nature : spNature : spéécificitcificitéé des signaux et des rdes signaux et des réécepteurs (2)cepteurs (2)
� Dimérisation et diversité des effets biologiques.
37O.Lascols / Nov2007
Nature : voies des MAPKsNature : voies des MAPKs
• Familles de MAPK :
– ERK1, 2, 3
– JNK1, 2, 3
– p38 α,β,γ,δ
• Activation par cascade de phosphorylation:
– MAPKKK (MEKK) : ser/thr kinase
– MAPKK (MEK): ser/thr et tyrkinases
• Signaux cellulaires :
– Cycle cellulaire
– Différenciation
– Survie/apoptose
• Localisation des cibles:
– Cytosolique
– Nucléaire
38O.Lascols / Nov2007
•• LIEU : SCAFFOLD, ANCHOR, DOCKING, ADAPTOR LIEU : SCAFFOLD, ANCHOR, DOCKING, ADAPTOR ProtProtééines dines d’’assemblage de complexes macromolassemblage de complexes macromolééculaires culaires
�� 3 rôles clés dans les voies de 3 rôles clés dans les voies de tranduction tranduction de signaux :de signaux :
1. Reproupe les composants de la voie de signalisation dans un complexe multiprotéique très spécifique
2. Efficacité : présente les substrats aux enzymes séquentiellement et dans une orientation idéale pour une efficacité optimum.
3. Cible le complexe et donc le signal vers une localisation cellulaire spécifique
39O.Lascols / Nov2007
• Localisation cytosolique
• KSR constitutivementassocié :
• MEK,
•14-3-3, •phosphatase inactive (PP2A)
•IMP (impedes mitogenic signal propagation)• kinases (C-TAK, etc…)
• Régulation par phosphorylation/déphos-phorylation
Complexe Complexe
multiprotmultiprotééiqueique avec avec
KSRKSR
40O.Lascols / Nov2007
�� Réponse Réponse spatiospatio--temporelle temporelle spécifique sur spécifique sur des fibroblastesdes fibroblastes
•• CompartimentalisationCompartimentalisation
et duret duréée du signale du signal
RRééponses ponses
diffdifféérentielles des rentielles des
ERK aux facteurs ERK aux facteurs
de croissance:de croissance:
EGF et PDGFEGF et PDGF
41O.Lascols / Nov2007
Bilan des rBilan des réégulations gulations
spatiospatio--temporelles temporelles
dd’’ERK et ERK et
des rdes rééponses ponses
cellulairescellulaires
Ebisuya, M. et al. J Cell Sci 2005;118:2997-3002
�� Effet spécifique dépend du Effet spécifique dépend du type cellulairetype cellulaire
� Fibroblastes� Cellules PC12 :
• EGF : prolfération cellulaire
• NGF : différentiation neuronale
�� Effet spécifique dépend de la Effet spécifique dépend de la durée, de l’intensité et de la durée, de l’intensité et de la localisation cellulaire du signal.localisation cellulaire du signal.
42O.Lascols / Nov2007
II. Le rII. Le rééseau de la signalisation cellulaireseau de la signalisation cellulaire
1. Interactions et transducteurs1. Interactions et transducteursa. Domaines spécialisés d’interactiona. Domaines spécialisés d’interaction
b. Familles de récepteursb. Familles de récepteurs
c. Diversité des relaisc. Diversité des relais
2.2. PléïotropiePléïotropie d’un signald’un signal
33. . Intégration de signaux par la celluleIntégration de signaux par la cellule
43O.Lascols / Nov2007
Domaines protDomaines protééiques pour des interactions spiques pour des interactions spéécifiquescifiques
-Y-X-X-hy-
PI
SH2
-hy-X-N-P-X-Y-
PI
PTB
Domaine « Src Homology 2 »100 aaSpécificité: phosphotyrosine etenvironnement côté C-terminal
Domaine « Phospho-Tyrosine Binding »
200 aaSpécificité: phosphotyrosine etenvironnement côté N-terminal
-E-S/T-D-V-COOH
PDZ
14.3.3
-R-S-X-S-X-P-
PI
Dimère de protéine 14.3.3Spécificité: phosphosérine
Domaine 100 aaSpécificité: extrémité C-terminale
SH3
-P-X-X-P-X-
WW
-P-P-X-Y-
PH
Phospholipides
Domaine avec Tryptophane (W)40 aaSpécificité: proline
Domaine « Src Homology 3 »60 aaSpécificité: proline
Domaine « Pleckstrin Homology »
100 aaSpécificité: interaction avec phospholipides membranaires
+++ +++ +++
Siteprimaire
Sitesecondaire
44O.Lascols / Nov2007
Familles de rFamilles de réécepteurscepteurs
45O.Lascols / Nov2007
ProtProtééines relais et Domaines dines relais et Domaines d’’InteractionInteraction
46O.Lascols / Nov2007
Activation de relais protActivation de relais protééiques sans activitiques sans activitéé catalytiquecatalytique
effecteur
effecteur
effecteur
� Adaptateur
effecteur
� Protéine G
effecteur
GDP
GTP
effecteur
GTP
Inactif
Activé
Interactions effectrices
12
34
� Amarrage« docking »
12
34
47O.Lascols / Nov2007
PI3K
Grb2-sos
PLCγ
Shc
PlPléïéïotropie otropie dd’’un signal un signal (1)(1)
Mb
YYYY
Y
YYY
P
P
P
P
P
P
P
P
� Récepteur à l’EGF : protéine d’amarrage
Prolifération
Différenciation Apoptose
Motilité
48O.Lascols / Nov2007
PlPléïéïotropie otropie dd’’un signal un signal (2)(2)
49O.Lascols / Nov2007
IntIntéégration de diffgration de difféérents signauxrents signaux
� Régulation dela croissancecellulaire
a. S/u Gαααα activée pourdifférents récepteurscouplés aux protéines G
b. Transactivation derécepteurs Tyrosinekinases par RCPG
Inter-relations entredifférentes voies designalisation :
c. Diversité liée àhétérodimérisation de RTK
d. Interaction nucléaire avec les signaux stéroïdiens
50O.Lascols / Nov2007
Requiem du cancerRequiem du cancer
Implication des voies de signalisation de la prolifImplication des voies de signalisation de la proliféération cellulaire.ration cellulaire.
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