Pr John DE VOS
Département d’Ingénerie Cellulaire et Tissulaire
INSERM 1183 - IRMB
Hôpital St Eloi - CHU de Montpellier
@_jdevos_ Montpellier ACLF 2016
CELLULES SOUCHES PLURIPOTENTES INDUITES (iPS) : APPLICATIONS AUX
PATHOLOGIES GÉNÉTIQUES ET LIMITES
CELLULES
SOUCHES
PLURIPOTENTES
Montpellier ACLF 2016
Induced pluripotent stem cells (iPS)
neurones
coeur
Sang
peau
OCT4
SOX2
cMYC
KLF4
2006 S Yamanaka – Nobel Price 2012
K. Takahashi and S. Yamanaka. Cell, 126:663, 2006.Montpellier ACLF 2016
1. Modélisation in vitro du développement normal et des maladies génétiques
2. Une source illimité de cellules pour la thérapie cellulaire potentiellement autologues
3. Un moyen de rajeunir des cellules âgées voire sénescentes
Applications
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MODELLISATION
DE PATHOLOGIES
GENETIQUES
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Montpellier ACLF 2016
iPS Progéniteurs neuronaux Neurones
BetaIII Tubulin
MAP2
11j 21j
Israel MA et al. Nature, 2012, 482: 216–220Montpellier ACLF 2016
Israel MA et al. Nature, 2012, 482: 216–220Montpellier ACLF 2016
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ESSAIS
CLINIQUES
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ESSAIS CLINIQUES
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Kimbrel EA et al. Nature Reviews Drug Discovery, 2015 14: 681–692.
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Menasche P et al. European Heart Journal, 2015 36: 2011–2017
LIMITES
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Q. Bai, R. Desprat, B. Klein, J.-M. Lemaitre, and J. De Vos, “Embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells? A DNA integrity perspective.,” Curr Gene Ther, vol. 13, pp. 93–98, Apr. 2013.
o Anomalies épigénétiques
o Anomalies génétiques secondaires à la reprogrammation
o N’est pas retrouvé par tous (sauf mutagénèse insertionnelle!): dépend du protocole de reprogrammation?
iPS = ES ?
[1] F. Rouhani,et al., “Genetic background drives transcriptional variation in human inducedpluripotent stem cells.,” PLoS Genet, vol. 10, no. 6, p. e1004432, Jun. 2014.
L’essentiel de la variabilité vient du fond génétique
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iPS = ES !
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ANOMALIES
GENETIQUES
INDUITES PAR LA
CULTURE
Montpellier ACLF 2016
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1. Chronologie et déterminants de cette instabilité
1. A quelle vitesse les anomalies apparaissent-elles?
2. Impact des conditions de culture (passage)
3. Anomalies de caryotype vs infra-caryotypique?
2. Quelles anomalies génétiques?
3. Conséquences?
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CHRONOLOGIE
ET DETERMINANTS
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Impact de la dissociation cellulaire : “adaptation”
Passage mécanique
Dissociation cellulaire (trypsine)
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Passage mécanique
Dissociation cellulaire (trypsine)
+ inhibiteur ROCK (ou forte concentration cellulaire
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Impact de la dissociation cellulaire : “adaptation”
“Adaptation” à la dissociation cellulaire
+ inhibiteur ROCK (ou forte concentration cellulaire
Après 5 à 10 passages : adaptation
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Anomalies génétiques
o Comparaison d’un passage mécanique vs. enzymatique
o 3 lignées ES humaines à passage précoce:o HD129: p16 et HD291: p13; HS306: p25
o Trois techniques d’analyse génétique:o Caryotype
o Puces à AND SNP 6.0 (Affymetrix)
o NGS
ETUDE DES ANOMALIES GENETIQUES INDUITES PAR LE STRESS DE LA DISSOCIATION CELLULAIRE
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Anomalies caryotypiques
Montpellier ACLF 2016 Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
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Anomalies caryotypiques
Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
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Copy Number Variation (CNV)
Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
NGS
o Analyse en cours
o Peu de mutations
o Hasard ou déterminisme de ces mutations de novo?
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Conclusion 1
o Instabilité génétique des CSP:
o Fortement dépendant du type de passage
o Peut-être très rapide (5 passages)
o Anomalies caryotypiques et CNV
o NB : anomalies de caryotype récurrent mais plutôt tardif, CNV non récurrent et précoce
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QUELLES
ANOMALIES
GENETIQUES?
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Nicolas Girault, Master 2
Said Assou, IR
Anthony Boureux, MCU
Thérèse Commes, PU
John De Vos, PUPH
Seadb.org (unpublished)
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Variants
Trisomy SNV CNV LOH Délétion Translocation Duplication
Inventaire de ces anomalies dans les CSP
Extraction
Etudes
Auteur PMID Année Journal Equipe
SEAdb
101
405735
Echantillons
Type d’échantillon
Paramètre de culture
Méthode de détection
905
SEAdb
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Zoom via a genome browser
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“HOTSPOT FINDER”
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“HOTSPOT FINDER”
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“HOTSPOT FINDER”
Translocations
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En
zym
ati
cM
ec
ha
nic
Impact de la méthode de passage sur la fréquence des variants
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Conclusion 2
o Les principales anomalies génétiques récurrentes:
o Aneuploïdies
o Et des gains > 1Mb
o Ce sont des anomalies « hyperrécurrentes »
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ALTERATION DU
TRANSCRIPTOME
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COPY NUMBER EFFECT
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COPY NUMBER EFFECT?
o 320 probesets avec au moins un FC > 4 dans une lignée (max : 119,04)
o 22 probesets localisées sur un CNV (max : 7,8)
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Signature transcriptionnelle caractéristique
EP15
MP15
P0
EP15
MP15
P0
mRNAseq
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Long non-coding RNA
EP15
MP15
P0
o Certains lncRNA induits massivement (> x50)
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si GFP
si 20-1
si 8-1
50K/cm²
25K/cm²
12,5K/cm²
- 91%
- 35%
o Knock-down par siRNA sur cellules adaptéesMontpellier ACLF 2016
Conclusion 3
o Modifications transcriptome plus importantes que ne le voudraient les anomalies génétiques
o Modifications du phénotype précèdent le changement génétique?
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Conclusion générale
o iPS : modèle prometteur d’étude des maladies génétiques
o Attention aux aneuploïdes induites par la culture
o surveillance régulière de la culture (caryotype, FISH?, puces? séquençage?)
o iPS « naïves »?
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CHU de
Montpellier
COLLABORATIONS
Franck PELLESTOR (CHROMOSTEM)Jean-Marc LEMAITREOuti HOVATTA
Present and past members :Engi AHMEDCaroline SANSACJulien BOUCKENHEIMERJean-Marie RAMIREZSaid ASSOUArnaud BOURDINJohn DE VOS
Mathilde PLINETNicolas AUSSELNicolas GIRAULTQiang BAIDoris CERECEDO
Montpellier ACLF 2016
Montpellier ACLF 2016
Montpellier ACLF 2016 Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
SWAP
Montpellier ACLF 2016 Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
SWAP
Montpellier ACLF 2016 Bai et al. Stem Cell Dev, 2015
Nombre de publications par année
Montpellier ACLF 2016
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