BIOTECHNOLOGIEPHARMACEUTIQUE
De l’éprouvette au produit final
La totalité du matériel présenté est disponible à l’adresse web:http://www.gch.ulaval.ca/agarnier/
PHA 2501: Sciences Pharmaceutiques II
Alain Garnier, Laboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB), génie chimique, PROTEO, Hiver 2010
Définition et contexte
Biotechnologie: l’application de la science et de la technologie aux organismes vivants, à d’autres matériaux vivants ou non vivants, pour la production de savoir, biens et services. (source: OCDE)
Traditionnelle: Utilisation de micro-organismes et d’enzymes sélectionnés pour produire des agents d’intérêt; Isolation d'agents à partir de sources biologiques.
Contemporaine: Utilisation de micro-organismes et d’enzymes modifiés, directement ou non, pour produire des agents d’intérêt.
Les médicaments d'origine biologique
Traditionnels: D'origine animale: produits sanguins,
hormones, stéroïdes, catécholamines, prostaglandines, anticorps, insuline, vaccins…
D'origine végétale: alcaloïdes, flavonoïdes, méthylxanthines, terpénoïdes, glycosides cardiotoniques et coumarines, ac salicylique…
D'origine microbienne: antibiotiques,
enzymes, protéases, vaccins, … D'origine virale: vaccins
Les médicaments d'origine biologique (suite)
Biopharmaceutique: substance utilisée à des fins thérapeutiques ou diagnostiques, à base d'acides nucléiques ou de protéines, produites par des moyens autre que l'extraction directe d'une source biologique non-modifiée.
Exemples: Facteurs sanguins (facteurs VIII et Factor IX) Agents trombolytiques (activateur tissulaire du plasminogène) Hormones (insuline, hormone de croissance, gonadotrophine, etc) Facteurs de croissance (cytokines, interférons (IFN), interleukines (IL),
érythropoïétine (EPO), facteur de croissance des colonies, …) Vaccins (méningocoque, influenza, antigène de surface de l'hépatite
B, …) Anticorps monoclonaux Autres (facteur de nécrose tumorale, plasmides, vecteurs viraux,
microARN, ARNi, …)
Seulement 12% des nouveaux médicaments sont produits par synthèse/extraction
34%
21% 22%
12% 12%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
%
Cell. Mam. Microbe Vaccins Extr/Synthèse Thérapiegénique
% de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)
Plan
Cibles Sources Produits/caractérisques Méthodes analytiques Développement de systèmes de production
Construction/sélection Procédés de production Procédés de séparation
Cibles des biopharmaceutiques
Francis Crick, 1958 (source: NCBI)
traduction
PROTÉINE
ARN
ADN Dépistage/thérapie génique
Transcriptome/ARNi
Protéome/Anticorps, hormones…
DIAGNOSTIC/THÉRAPIE
Syst immunitaire/vaccinMétabolisme/ Thérapie cellulaire
Sources de biopharmaceutiques
Virus Bactéries Levures Moisissures Cellules animales
Invertébrés Mammifères Primates non-humains Humaines Lignées établies Cultures primaires Cellules souches
Les virus
Influenza
Herpes Adenovirus
Vaccins ou vecteurs de thérapie génique
Vaccins - exemples: •Influenza (GSK)•Adénovirus 4 & 7 (Wyeth Pharma pour DoD, 105-106 doses•Aussi: variole, rubéole, rougeole, oreillons, varicelle, hépatite, polio, rage, fièvre jaune, encéphalite japonaise, cancer, etc
Maladies traitées par thérapie génique
Vecteurs utilisés
Type de gènes employés
Phases cliniques
La thérapie génique
AdénovirusRétrovirus
La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche.
Adénovirus: cycle d’infection
Adénovirus: les gènes
B Massie, IRB
Adénovirus: évolution des vecteurs
B Massie, IRB
Adénovirus: construction
R. Gilbert, IRB
Adénovirus: production et utilisation
B Massie, IRB
Rétrovirus
- Rétrovirus s’insère dans le génome de la cellule hôte- 3 familles de gènes: gag = capside, pol = polymérase, env = enveloppe- On manipule la protéine d’enveloppe pour altérer le tropisme du virus
Rétrovirus: cycle de réplication
Rétrovirus: construction de lignée de production
Les autres outils génétiques
Diagnostic Patron de digestion par enzymes de restriction Séquençage Hybridation FISH Gene chip qRT-PCR
Autres phénomènes Épigénétique ARNi
Techniques analytiques:L’identification de séquences d'ADN
La digestion de l'ADN avec des enzymes de restriction, suivi d'une électrophorèse permet une identification par la différence de taille des fragmentsTiré de Microbiology 101, WSU
L’identification de séquences (suite)
En réalisant des PCR sur des fragments d'ADN en présence de désoxynucléotides et une alternance de didésoxynucléotides, on parvient à complètement séquencer l'ADN
Hybridation fluorescente in situ (FISH)
LE FISH est une technique de biologie moléculaire d'hybridation in situ utilisant des sondes marquées à l'aide d'un marqueur fluorescent et utilisées sur des coupes en microscopie.
Ces sondes peuvent être utilisées sur de l'ADN ou de l'ARN (sonde ADN), ou sur des protéines (sonde anticorps). Le FISH est une technique de cytogénétique permettant de voir des éléments à l'intérieur de la cellule.
L'expression des gènes: les biopuces
1- Comparaison de l’expression génétique de 2 échantillons cellulaires
2- Extraction de l ’ARN3- Réverse transcription avec des
nucléotides marqués par des fluorochromes différents
4- Hybridation compétitive sur des lamelles contenant des milliers d’oligonucléotides différents connus
5- Lecture des lamelles6- Analyse des résultats
Les biopuces (suite)
Joe DeRisi et al., Stanford U., 6116 gènes (cliquez sur les images pour une explication détaillée).
quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)
Cliquez sur l'image pour un lien vers une simulation de la PCR
quantitative (RT)-PCR (qRT-PCR)
Épigénétique
• Le terme épigénétique définit les modifications transmissibles et réversibles de l'expression des gènes ne s'accompagnant pas de changements des séquences nucléotidiques. Les changements peuvent se produire spontanément, en réponse à l'environnement, à la présence d'un allèle particulier, même si celui-ci n'est plus présent dans les descendants
• Certains caractères épigénétiques hérités pouvaient être transmis lors de la réplication cellulaire (méiose), voire subsister d'une génération à l'autre pour des organismes multicellulaires.
• Les phénomènes épigénétiques constituent un programme qui déciderait quels gènes activer ou inhiber. L’environnement influence ces signaux épigénétiques qui peuvent ainsi subir de petits changements. Ces épimutations sont plus fréquentes que les mutations classiques de l’ADN.
Phénomènes épigénétiques
•Paramutations•Bookmarking•Imprinting•Gene silencing•X chromosome inactivation•Position effect•Reprogramming•Transvection•Effet maternel
L’ARN anti-sens, interférent, micro-ARN
(Pour plus de détails, cliquez ici)
Exemple 1: Infectio Diagnostic
Originalement Infectio Diagnostic, puis GeneOhm Sciences et maintenant Becton Dickinson (BD) Diagnostics à Québec: Identification génétique de bactéries
pathogènes, de gènes de toxines et de gènes de résistance (Strep B, SARM, …)
Basé sur la sensibilité, la spécificité et l'ubiquité de l'amorce PCR
Temps du test ≈1 hr
Exemple 2: Diagnocure
La plate-forme technologique PCA3, un gène dont l'ARN messager est détecté dans la majorité des cancers de la prostate chez l'humain. Le même ARN messager n'est exprimé qu'à un très faible niveau dans la prostate normale et est absent des autres tissus normaux. PCA3 peut donc servir de marqueur tumoral et les molécules dérivées de sa séquence, ARN messager ou peptide, peuvent servir à la mise au point de divers produits de diagnostic ou de thérapie. La découverte du gène PCA3 est le fruit d'une collaboration entre DiagnoCure et l'Université de Nijmegen et DiagnoCure détient des droits mondiaux sur cette plate-forme technologique.
La technologie DiagnoGeneMC est l'association de technologies pour la détection d'acides nucléiques et de séquences de gènes spécifiques au cancer. Les produits dérivés de cette plate-forme technologique contiennent trois trousses utilisées selon un protocole en trois phases. Une trousse contient des billes de silice pour la purification des acides nucléiques de la préparation cellulaire analysée. Une autre trousse contient des amorces, des séquences d'acides nucléiques spécifiques au cancer investigué, et les réactifs nécessaires à l'amplification isothermique des ARNs messagers isolés avec la première trousse et complémentaires aux amorces fournies. La troisième trousse sert à la détection immunoenzymatique du produit amplifié. Cette plate-forme technologique peut donc servir à la mise au point de trousses de détection de tout cancer pour lequel on connaît une séquence spécifique. Dans le cadre de l'accord de licence avec Organon Teknika, DiagnoCure détient des droits mondiaux sur les technologies Boom et NASBA, pour tous les cancers.
Les protéines recombinantes (PR)
1ère: insuline dans E. coli (1982, Ely Lilly)
73 sur le marché en 2004, >80 en essais cliniques
Croissance de 65% entre 2004 et 2010 (52G$/2010)
Insuline+EPO+IFN = 57% du marché Protéines glycosylées = 60% du marché
des PR, principalement mAb
Les anticorps
Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de polypeptides, l’une de 25kD (chaîne courte, domaine variable), l’autre de 50 kDa (chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de l’anticorps pour son antigène
Anticorps monoclonaux - applications
37% des nouvelles molécules thérapeutiques biologiques
Identification/diagnostic Thérapeutique:
Contre cancer, Crohn, Asthme, Psoriasis, SIDA,... Dirigés contre une protéine spécifique, ils
peuvent bloquer une interaction récepteur-ligand ou déclencher une réponse immunitaire.
Ils peuvent aussi être liés à un agent chemothérapeutique, radioactif ou autre pour augmenter leur effet.
Exemple: Agent anti-angiogénétique (Laboratoires Aeterna)
Le processus de l’angiogénèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de l’aileron de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans des micro-organismes.
Les cellules thérapeutiques
Cellules du sang: cellules souches hématopoïétiques, Lymphocytes, Mégakaryocytes, plaquettes (Hema-Québec)
Cellules musculaires (myoblastes, Jacques Tremblay, CHUL) Cellules épithéliales (peau, vaisseaux sanguins, Hopital du
Saint-Sacrement, LOEX) Cellules souches d'adulte et embryonnaire (Réseau
canadien sur les cellules souches, http://www.stemcellnet.ca): travaux sur le traitement du diabète, la maladie de Parkinson, l'insuffisance cardiaque, la dystrophie musculaire, la cécité, etc
Les cellules souches hématopoïétiques
Les cellules souches embryonnaires
Les cellules souches adultes
Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD)
• Prévalence: 1 garçon/3500• Espérance de vie ≈ 20 ans
Thérapie cellulaire de la DMD
Essais cliniques phase 1
3x1010 cellules/kg à traiter
Équivalent: 100g muscle donneur /kg à traiter
Multiplication in vitro incontournable
Volumes de culture: 30L/kg à traiter
Prérequis: Milieu de culture efficace et
sécuritaire
Bioprocédé à grande échelle (en développement)
Caractéristiques des protéines: épissage
Source: U Miami, cours BIL150
chip.html
Exemple: Nyman et al (1998), "Identification of nine interferon-a subtypes produced by Sendai virus induced human peripheral blood leucocytes". Biochem J, 329:295-302.
Caractéristiques des protéines: structure
Thèse PhD, François GUILLONNEAU, 2002
Caractéristiques des protéines: les modifications post-traductionnelles
•Clivage•Pont S•méthylation, phosphorylation, glycosilation•conformation•ajout de ligands spécifiques (lipid anchor)
Tiré de PHK
Analyses protéique et cellulaire Analyse de protéines
activité ELISA Électrophorèse 1D, 2D, capillaire Chromatographie liquide (HPLC) Spectrométrie de masse
Analyse cellulaire: Immuno-histo-chimie Cytométrie en flux Imagerie cellulaire en temps réel Systèmes robotisés
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Électrophorèse sur gel
SDS-PAGE
Transfert sur membrane de nitrocellulose et révélation avec marqueur spécifique:
Western: EP + anticorps spécifiques à protéines
Southern: EP + ADN marqué
Northern: EP + ARN marqué
Tiré de Segura, Garnier et al (2007). Figure 2. Fractionation of purified retroviral vector preparations by 1D Gel ElectrophoresisPurified virus preparations with (a) and without (b) subtilisin treatment were fractionated on a 4-12% Tris-Glycine polyacrylamide gel (Invitrogen) run under reducing conditions and visualized by silver staining. Protein bands from gel b were excised and subjected to in-gel tryptic digestion prior to MS/MS analysis. Bands containing statistically significant peptide identifications (A-L) are indicated on gel b. Figure 2c shows the protein profiles of samples a (green) and b (blue) superimposed. The theoretical migration positions of all MoMLV viral-encoded proteins are indicated in figure c.
Électrophorèse SDS-PAGE
Gel d’électrophorèse 2-D
(Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
Réservoir dePhase mobile
Pompe
Échantillon
Colonne
Échantilloneur
Détecteur
Collecteur de fraction
•Échange d’ions•Tamis moléculaire•Interaction hydrophobe•Phase inverse•Électrophorèse
•En fonctionde la colonne•Gradient
•UV/visible•Fluorescence•Infra-rouge•Indice de réfraction•Conductivité•Spectrométrie de masse
•Automatique•Réfrigéré
Hydrolysat trypsique de la BSA
Spectrométrie de masse (MS) - interface
L'électro-atomisation (electro-spray ionisation, ESI)
"Make elephants fly", Prix Nobel de Chimie 2002: John B Fenn
MS – domaines d'application
L'électro-atomisation à pression atmosphérique (API-electrospray) permet l'analyse de protéines
MS - analyseurs
Constitué de:1) une source
d'ionisation2) un ou plusieurs
analyseurs qui séparent les ions produits selon leur rapport m/z
3) un détecteur qui compte les ions et amplifie le signal
4) un système informatique pour traiter le signal
Secteur magnétique
MS - Quadrupole
m/z 10-4000 Précision :~m/z 0.1-0.2 Vitesse de balayage: 5000
m/z par sec Le temps de vie d’un ion
de sa formation à sa détection ~40-100 μs.
www.bris.ac.uk
MS - Temps d’envol (TOF)
L’incorporation d’un réflectron dans le tube du TOF ou une extraction ionique délayée (Cornish et
Cotter, 1994; Cotter et al., 2004) TOF est communément
employé avec MALDI, il peut aussi être utilisé avec un ESI (Boyle et
Whitehouse, 1992)
www.chemistry.adelaide.edu.au
LCMS – exemple d'appareil
Agilent 1100 MSD: API-ES, quadrupole
MS – exemple de résultat
•Myoglobine, MM= 16951 Da•Le résultat obtenu est un spectre de masse représentant les rapports m/z des ions détectés sur l'abscisse et l'abondance relative de ces ions sur l'ordonnée•Le spectre est le résultat de la distribution de charges sur la population moléculaire•Permet d'analyser qualitativement et quantitativement la protéine d'intérêt
Analyse de protéines par MSMS
(Yates, 1998; Westermeier et Naven, 2002; Graves, 2002)
MS spectrum
MS/MS ion spectrum
m/z
m/z
Nomenclature de la dissociation en fragments proposée par Roepstorff, 1984
Exemple d'analyse MSMS
Albumine
Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L), souvent utilisée en milieu de culture de cellules de mammifères
Exemple d'analyse MSMS
Albumine
Informations obtenues sur Expasy (www.expasy.org)
>P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus (Bovine). MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA
Number of amino acids: 594 Molecular weight: 68026.9 Theoretical pI: 5.77
position mass peptide sequence position mass peptide sequence
25-28 500,2463 DTHK 300-309 1177,5591 ECCDKPLLEK
29-34 712,3736 SEIAHR 310-318 1015,4877 SHCIAEVEK
37-44 974,4577 DLGEEHFK 319-336 1955,9596 DAIPENLPPLTADFAEDK
45-65 2435,2427 GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK 341-346 752,3573 NYQEAK
66-75 1163,6306 LVNELTEFAK 347-359 1567,7427 DAFLGSFLYEYSR
76-88 1349,546 TCVADESHAGCEK 361-371 1283,7106 HPEYAVSVLLR
89-100 1362,6722 SLHTLFGDELCK 375-386 1388,5708 EYEATLEECCAK
101-105 545,3405 VASLR 387-399 1497,6314 DDPHACYSTVFDK
106-117 1364,4803 ETYGDMADCCEK 402-412 1305,7161 HLVDEPQNLIK
118-122 658,3155 QEPER 413-420 1011,42 QNCDQFEK
123-130 977,4509 NECFLSHK 421-433 1479,7954 LGEYGFQNALIVR
131-138 886,4152 DDSPDLPK 438-451 1511,8427 VPQVSTPTLVEVSR
139-151 1519,7461 LKPDPNTLCDEFK 460-468 1052,4499 CCTKPESER
157-160 537,282 FWGK 469-482 1667,8131 MPCTEDYLSLILNR
161-167 927,4934 YLYEIAR 483-489 841,46 LCVLHEK
169-183 1888,9268 HPYFYAPELLYYANK 490-495 660,3563 TPVSEK
184-197 1633,6621 YNGVFQECCQAEDK 499-507 1024,455 CCTESLVNR
198-204 701,4014 GACLLPK 508-523 1823,8996 RPCFSALTPDETYVPK
205-209 649,3338 IETMR 524-528 609,2878 AFDEK
212-218 703,4097 VLASSAR 529-544 1850,8993 LFTFHADICTLPDTEK
223-228 649,3338 CASIQK 549-557 1014,6193 QTALVELLK
229-232 508,2514 FGER 558-561 509,3194 HKPK
236-241 689,3729 AWSVAR 562-568 818,4254 ATEEQLK
249-256 922,488 AEFVEVTK 569-580 1399,6926 TVMENFVAFVDK
257-263 789,4716 LVTDLTK 581-587 725,2593 CCAADDK
267-280 1578,5981 ECCHGDLLECADDR 588-597 1050,4924 EACFAVEGPK
281-285 517,298 ADLAK 598-607 1002,583 LVVSTQTALA
286-297 1386,6206 YICDNQDTISSK
Albumine: fragments trypsiques
Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsiqueANALYSE MS2, cliquez ici
Identification de protéine, cliquez ici(Logiciel Mascot, Matrix Science)
Protéomique du sérum sanguin
Tirumalai et al., 2003
•60 à 80 g/L de protéine (Tirumalai et al., 2003)
•10 000 protéines différentes
•22 protéines = 99% de la quantité protéinique du sérum (Zhang et al., 2005)
•12 log de variation de concentration (Anderson et Anderson, 2002; Zhang et al., 2005)
•325 protéines identifiées en 2003 (Pieper et al., Proteomics, 3: 1345-1364)
•3020 protéines identifiées en 2005 (Omenn et al., Proteomics, 5:…)
Protéomique du sérum sanguin
Anderson et Anderson, 2002
Analyse cellulaire
Le compteur de Coulter enregistre un signal provoqué par une modification du champ électrique établi au travers d’un orifice au travers duquel un fluide contenant les particules est aspiré. Ce signal est proportionnel au volume des particules.
Exemple: distribution de tailles de particules pour deux échantillons différents
Immuno-histo-chimie
Technique utilisant des anticorps spécifiques liés à des fluorochromes pour mettre en évidence une protéine présente sur une cellule ou un tissu. L'échantillon est par la suite observé en microscopie à fluorescence
Distribution d'histones, de peroxisomes, et d'actine dans une culture de cellules Vero, Olympus
Cytométrie en flux
Technique permettant d'analyser des cellules à grande vitesse en les faisant passer une à une dans le faisceau d'un laser. La lumière ré-émise (par diffusion ou fluorescence) permet de classer la population suivant plusieurs critères et de les trier.
En anglais: Flow cytometry ou Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)
Exemple de cytométrie en flux
Imagerie cellulaire en temps réel
Chambre thermostatée, humidifiée et à concentration en CO2 controlée, montée sur la platine du microscope
Exemple: suivi de la division et de la polyploïdisation de cellules mégakaryocytaires sur 12 hrs (cliquez ici)
Sytèmes robotisés
Composés: D'unités de gestion des liquides
(Liquid handling stations) De bras robotisés D'incubateurs automatisés De lecteurs
(Système Xiril, cliquez ici)
Développement de systèmes de production
Établissement de lignées cellulaires Construction/sélection Procédés de production Procédés de séparation
Types de cellules animales
Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC).
Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée de vie limitée (30-50 divisions).
Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.
Différentes lignées
MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhérentes, vaccins
HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche
CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension, versatile
Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile
Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression baculovirus
HEK-293: embryon de rein humain, transformée par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension (293S)
Exemple: historique du développement de la lignée HEK-293
Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977
La construction d'un système d'expression – transformation/transfection/transduction
• Introduction d'ADN exogène sous la forme d'un plasmide dans des cellules procaryotes (transformation) ou eucaryotes (transfection)
•Les cellules manipulées pour accepter un ADN étranger sont dites compétentes
• Différentes méthodes:• Phosphate de Calcium• Liposomes• Polycations (ex: polyéthylène
imine, PEI; DEAE-Dextran)• Électroporation• Gene gun
• Transduction: introduction d'ADN exogène par le biais d'un virus (procaryote)
• STABLE OU TRANSITOIREAccess Excellence
La cassette d'expression
• Composé de un ou plusieurs gènes et des séquences contrôlant leur expression
• Promoteur (constitutif; inductible: lac, cumate, T, etc; tissu spécifique)
• Phase ouverte de lecture (Open reading frame)
• Séquence de polyadénylation (PolyA)
• Transactivateurs
• Gènes de résistance ou reporteur (LacZ, GFP, …)
Des Internal Ribosome Entry Sites (IRES) peuvent être intercalés entre plusieurs ORFs
Autre exemple: la co-transfection d’un plasmide et d’un adénovirus dans la lignée cellulaire 293 pour produire un adénovirus recombinant:
B. Massie, IRB
Sélection (Screening)
• Commencer par une expression transitoire
• Sélectionner en fonction:
• Résistance à l'agent de sélection
• Le niveau d'expression du gène reporteur ou de la protéine d'intérêt
• La stabilité de l'expression
• La qualité du produit (analyse crystalographique, RMN, MS, patrons de glycosylation, activité, stabilité, pharmacocinétique)
Les systèmes d’expression
Bactéries (1-3 um)
Levures Fungi Cellules animales (10-20
um)
• Modifications post-traductionnelles + poussées
• Produit plus stable• Milieu de culture +
complexe• + grande fragilité des
cellules• Coûts + élevés• Produits à + haute valeur
ajoutée
Critère de sélection: choisir le système le plus simple qui va faire le travail!
Exemple de milieu de culture de cellules de mammifères: Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM)
Sels (mg/L) CaCl2 200.00 Fe(NO3)3.9H2O 0.10 KCl 400.00 MgSO4 97.67 NaCl 6400.00 NaHCO3 3700.00 NaH2PO4.H2O 125.00
Acides aminés (mg/L) Arginine 84.00 Cystine.2HCl 63.00 Glutamine 584.00 Glycine 30.00 Histidine 42.00 Isoleucine 105.00 Leucine 105.00 Lysine.HCl 146.00 Méthionine 30.00 Phenylalanine 66.00 Sérine 42.00
Méthionine 30.00 Phenylalanine 66.00 Serine 42.00 Thréonine 95.00 Tryptophane 16.00 Tyrosine.2Na.2H2O 104.00 Valine 94.00
Vitamines (mg/L) Ca.pantothénate 4.00 Chlorure de choline 4.00 Acide folique 4.00 Inositol 7.20 Niacinamide 4.00 Riboflavine 0.40 Thiamine.HCl 4.00 Pyridoxine.HCl 4.00
Autres (mg/L) Glucose 4500.00 Rouge de phénol 15.00 Na.Pyruvate 110.00
+ composants non-définis: sérum sanguin (5-15%), cocktail de facteurs de croissance, etc.
Comparaison des différents systèmes d’expression
X (densité cellulaire)
Oxygen respiration rate (OUR, mM/L)
Vitesse d’agitation
Coût du milieu
Bactéries 5-50 gMS/L 50-500 500-700 rpm 1-5$/L
Cellules animales
1-50 x106 cells/mL
(≈0,2-10 gMS/L)
0.1-10 20-120 rpm 25-1500$/L
Difficulté supplémentaire
Temps de division augmente avec la taille: Les cellules animales nécessitent des conditions
d’asepsie très strictes Adhésion obligatoire:
Certaines lignées de cellules de mammifères nécessitent un support pour être viables. Cela:
pose un problème de mise à l ’échelle les rend particulièrement susceptibles au cisaillement
Ex: tapis cellulaire de myoblastes
Culture sur microporteurs
Exemple: Culture de myoblastes - test de différents microporteurs
Comparaison de différents types de microporteurs
0,00E+00
5,00E+05
1,00E+06
1,50E+06
2,00E+06
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Temps (jour)
# c
ellu
les/
ml Cytodex 1
Cytodex 3
Texcel
Autosuture
Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin, M.F.,Garnier, A. (2001), "Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91 (1):63-74.
Culture de myoblastes - transfert de particule à particule
0 5 10
0.0
0.5
1.0
Time [d]
100-mL spinner flasks 500-mL spinner flasksM
yobl
ast
dens
ity [
x 10
6 cel
ls/m
L]
Boudreault, P., Tremblay, J.P., Pépin, M.F.,Garnier, A. (2001), "Scale-Up of a Myoblast Cell Culture Process". J. Biotechnol., 91 (1):63-74.
La production
Le bioréacteur Les paramètres Les cinétiques de croissance des
micro-organismes et de production
Les modes de production
Bioréacteurs
Gracieuseté B.BraunLaboratoire d’optimisation des bioprocédés (LOB, U. Laval)
Bioréaction: les paramètres
Température pH composition du milieu Agitation Aération Asepsie
Contrôle des paramètres
Contrôle
Lecture
RPMT
O
2
N
2
Air
CO2
TpHO
2
pH
F
Optimisation des paramètres
T=32°C T=35°C T=37°C T=39°C
Effet de la température sur la production d’adénovirus recombinant en 293S
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80
time (hpi)
R
ela
tiv
e ti
ter
Jardon et Garnier, 2000
Les cinétiques de croissance et de production
Xdt
dX
dt
dP
XYdt
dSSKs
S
Xdt
dX
sx
MAX
/
Le modèle le plus simple:
(bilan sur les cellules)
(bilan sur le substrat)
(cinétique de Monod)
(modèle de Luedeking-Piret pour le produit)
X: concentration cellulaire; S: concentration en substrat limitant; P: concentration en produit d’intérêt; : taux spécifique de croissance; max et Ks: paramètres de l ’expression de Monod; Yx/s: coefficient de rendement cellule/substrat; , : coefficient de la relation de Luedeking-Piret. S0 et X0, sont les concentrations en substrat et en cellules initialement. Xmax = Yx/s * S0+X0.
tXX
XX
X
YK
X
X
X
XYKMAX
MAX
MAX
MAX
SXS
MAX
MAXSXS
)(
)(lnln
0
/
0
/
00
/00 ln XXXX
XXYKXXPP
MAX
MAXsxS
MAX
La solution
Simulation à partir d’un modèle simple
X, S et P vs t
05
10152025
0 2 4 6 8
temps (h)
co
nc
en
tra
tio
n (
g/L
)
X
S
P
Cuvée, MAX = 1,16h-1, KS = 4 g/L, YX/S = 0,5 g/g, = 0,4 g/g, = g/(g.h)
Autres cinétiques
Inhibition par le substrat:
Inhibition par le produit:
...
iS
MAX
KSSK
S2
iS
MAX
KPSK
S
1
Les modes d’opération
filtrat
Perfusion
Chemostat
Cuvée-alimentée(fedbatch)
Cuvée (batch)
X, P
Culture en perfusion
0
200
400
600
800
1000
0 20 40 60 80
Time [ hpi ]
Rel
ativ
e F
luor
esce
nce
Uni
t
[ R
FU
]
Figure 4. Fluorescence of 293S cells during infection with adenovirus: , Control; , B1 Perfusion 35oC; , B2 Perfusion 35oC; , B3 Perfusion 37oC; X, T-flask.
Cortin et al., 2002
Le traitement en aval (downstream processing)
Les étapes séparation homogénéisation concentration purification
Séparation/Clarification
Objectif: séparer les cellules du surnageant et conserver la fraction d’intérêt selon que le produit est intracellulaire ou extracellulaireLes méthodes usuelles:
centrifugationmicro-filtration (0,1-0,45 um)
Filtres à fibres creuses (AG tech)
Principe de centrifugation en continu
Grande échelle = filtration tangentielle
Homogénéisation
Objectif: briser les cellules pour récupérer un produit intra-cellulaire
Moyen: Gel/dégel Ultrason contraintes (stress) hydrodynamiques
Concentration
Objectif: réduire le volume
Moyens:PrécipitationUltra-centrifugationUltra-filtration (5kDa - 500kDa)
AG technologies
Purification
Objectif: Isoler le produit d’intérêt
Moyen: chromatographie
Access Excellence
Purification (suite)
3 types de chromatographie:
Access Excellence
Le contrôle de qualité
Les molécules biopharmaceutiques sont soumises aux mêmes normes que la fabrication de molécules de synthèse: Bonnes pratiques de fabrication (GMP)
Protocoles d’opération normalisés (SOP) Validation des procédés Documentation
Ces normes sont appliquées de façon encore plus stricte pour les produits biologiques étant donné que les réactions menant à la formation du produit (le métabolisme cellulaire) ne sont pas bien définies.
Le contrôle de qualité (suite)
Toute une série de normes, lignes directrices et de «points à considérer » sont émis par le « Center for Biologics Evaluation and Research » (CBER) de la Food &Drug Administration » (FDA) http://www.fda.gov/cber/
Les sections 210, 211 et 600 du titre 21 du "Code of Federal Regulations" (CFR)
"Guidelines" et "point to consider » particulièrement pertinents: "Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy" "Point to consider on Plasmid DNA Vaccines for Preventative Infectious
Disease Indications" A proposed Approach to the Regulation of Cellular and Tissue-based
Products
Le contrôle de qualité (suite)
Classent le processus de production GMP en 7 catégories:
Installation Équipement Personnel Matériels Protocoles Tests Documentation
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