Virus pathogène de la VHDStructure déterminée aux rayons X .
• La capside que l’on voit est uniquement constituée d’une même protéine repétée plusieurs fois (VP60, 579 aminoacides).
• Le code est à l’intérieur sous la forme du brin d’ARN de 7437 b.
3/ Transcription en ADN
Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b)
Il est fragile.
Nous l’avonstraduit en ADNdouble brin, plusstable pourl’étudier et lemodifier.
ReverseTranscriptase-PCR
cDNA (ADN complémentaire) du virus Pascal Harlaud
F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050
BstBI BamH IBamH I AvrII
On n’a pas pu insérer le génome entier dans un plasmide,
on a donc décidé de le couper en 3 morceaux
F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050
Coupure par des ciseaux spécifiques (enzymes)
…G G A T C C …………………..C C T A G G …………
…C C T A G G …………………..G G A T C C …………Exemple
ADN viral
Ou plasmide
…G G A T C C …………………..C C T A G G …………
…C C T A G G …………………..G G A T C C …………
…G C T A G G …………
…C C T A G C …………
Ciseaux
Plasmide
Ouvert avec
Un brin en
Moins.
Colle…G C T A G G …………
…C C T A G C …………
Plasmide
Ouvert avec
Un brin en
Moins.
G A T C C …………………………………………..C
G……………………………………………G G A T C
Fragment
du génome
Du virus de
La VHD
Association
spontanée
…G G A T C C …………………………………………C C T A G G ……
…C C T A G G………………………………………….G G A T C C ……
Création de la
Liaison :
(ADN ligase
+ ATP)
…G G A T C C …………………………………………C C T A G G ……
…C C T A G G………………………………………….G G A T C C ……
Liaison à créer
Litmus 28i
Multi site de clonage
promoteurT7
RNA Viral RHDV
RT-PCR
F3F1
BamHIBamHIAvrII
BstBI
4/ DigestionBstBI-BamHI
1/ Digestion du plasmide 1 par BamHI-AvrII
pF3
pF1+F3
Construction d'un cloneInfectieux de RHDV
Plasmide 1
2/ ajout de F3 préparé
par RT-PCR
3/ Ligation de plasmide 1
et F3 par ADN ligase.5/ ajout de F1 préparé
par RT-PCR
6/ Ligation de pF3 et F1
par ADN ligase.
Nous avons déjà les 2/3
du génome complet
quelques mois de travaux supplémentaires
semblent nécessaires pour pouvoir insérer
Le troisième fragment F2 et avoir le génome
complet de la VHD dans un plasmide.
F2
Extraction du RNA viral
ReverseTranscriptase-PCR
cDNA (ADN complémentaire)
F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050
Clonage dans un plasmide
Séquençage pour confirmation des séquences
Mutagénèse dirigée
Transcription in vitro (ADN-ARN)
Transfection (cellules permissives, lapin)
BstBI BamH IBamH I
AvrII
Purification du virus VHDGénome viral complet
RNA 7437 b
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