Actualités diagnostiques des années 2010
en dermatomycologie
Dr Anne DEBOURGOGNELaboratoire de Parasitologie Mycologie
Journée Dermatophytes du 20 mai 2014
Technologies disponibles
Microscopie
Spectrométrie de masse
Biologie moléculaire
Les limites …
Examen direct
Culture
Identification
Sensibilité modérée
Sensibilité modéréeLente, pls semaines
ExpérienceSouches avec peu
ou pas de fructifications
Les attentes …
Délai
• Plus rapide que la culture
• Sur le prélèvement sans culture intermédiaire
Spécificité
• Espèces difficiles
• Culture sans fructifications
Typage
• Enquêtes épidémiologiques
• Phylogénie
• Nouvelles espèces
BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
Objectifs
• Détection d’un dermatophyte
• Identification genre ou espèce
Prélèvement primaire
• Identification
• Typage moléculaire
Culture
• PCR en point final
• Kit commercial
• PCR en duplex• pandermatophytes• Trichophyton rubrum
PCR en point final
PCR en point final
Révélation par électrophorèse en gel d’agarose avec un agent intercalant
Agent intercalant
Soit BET : toxique !
Nouvelles molécules : GelRed
Visualisation sous UV
T+ dermatophytes
T+ Trichophyton rubrum
T -
Exemples de patients
… conséquences sur la prise en charge
• Détection des dermatophytes (PCR)
• Identification par RFLP
PCR - RFLP
PCR suivie d’une digestion enzymatique par des enzymes de restriction
• Extraction automatique à partir ongles, peau, …
• Détection des dermatophytes par qPCR
• Identification Trichophyton rubrum / Trichophyton mentagrophytes par point de fusion
Extraction ADN
PCR SYBR Green
PCR en temps réel avec agent intercalant
PCR SYBR Green
Courbe de fusion � spécificité
• Détection dermatophytes par qPCR avec sonde TaqMan
PCR TaqMan
Sonde� Spécificité
Très large étude : 1437 prélèvements
Identification des cultures par hybridation in situ
Stratégie diagnostique
Stratégie diagnostique
• Etablir la position exacte de la PCR à partir des prélèvements primaires
• Identification moléculaire post culture si difficulté par techniques phénotypiques
� séquençage
Séquençage
Séquençage
SPECTROMÉTRIE DE MASSE
Principe
Spécificité
Délai
Création d’une base de données à partir de 50 souches de référence
(12 espèces de dermatophytes, 2 espèces de Neoscytalidium)
caractérisées par microscopie et biologie moléculaire)
Evaluation en routine sur 6 mois
• Pas d’effet de l’addition de cycloheximide dans les milieux de culture� Utilisation en pratique de routine sans repiquage
• Identification possible sur une colonie de petite taille, après seulement 3 à 6 jours de culture� Précocité par rapport à la microscopie
AUTRES TECHNIQUES
SP : échantillon
RP : réactifDP : détection
AP : absorption
Pré-traitement de l’échantillon dans une solution d’extraction pendant 5 min
RéactifConjugué marqué avec des particules d’or colloïdales
Anticorps spécifique fixé sur la bandeletteDirigé contre Trichophyton rubrum mais réaction avec les espèces des genre Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton
Durée 15 min
Perspectives intéressantes en routine …Perspectives intéressantes en routine …
• Examen direct � PCR ?• Identification microscopique � SM ?
Mais peu de plus values aujourd’hui …Mais peu de plus values aujourd’hui …
• Examen dermatologique et interrogatoire approfondi• Bonne qualité du prélèvement• Examen direct de qualité• Expérience en identification morphologique
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